JP3242531B2 - カロチノイド色素の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カロチノイド色素の微
生物学的製造方法に関する。本発明のカロチノイド色素
は天然赤色色素として飼料添加物、食品添加物等として
有用である。特にアスタキサンチンは養殖魚であるサ
ケ、マス、マダイ等の体色改善剤のごとき飼料添加物と
して、また安全な天然食品添加物として産業上価値が高
い。また、アドニキサンチンは、工業的製造方法が確立
されることにより、アスタキサンチンと同様に飼料添加
物、食品添加物としての使用が期待される。

【０００２】さらに、β−カロテンは食品添加物、飼料
添加物、医薬等として使用されており、エキネノンは食
品添加物、飼料添加物等としての用途が期待され、カン
タキサンチンは食品添加物、飼料添加物、化粧品等とし
て使用されており、そしてゼアキサンチンは食品添加
物、飼料添加物等として使用されている。

【０００３】

【従来の技術】アスタキサンチンは、マダイ、サケ、マ
スなどの魚類およびエビ、カニ、ザリガニ、オキアミな
どの甲殻類などに存在していることが知られている（水
産動物のカロチノイド、日本水産学会編、１９７８）。
また微生物が生産する例としては赤色酵母ファフィア・
ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）
（Phytochemistry, 15, 1009, 1976) 、ブレビバクテリ
ウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生
物（Journal of General and Applied Microbiology,
15, 127, 1969)および緑藻類のヘマトコッカス・プルビ
アリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌ
ｉｓ）（Phytochemistry，20, 2561, 1981)が知られて
いる。また化学合成法ではβ−カロテンの変換により合
成する方法（Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985)および
Ｃ₁₅ホスホニウム塩から合成する方法（Helv. Chim. Ac
ta, 64, 2436, 1981) が知られている。

【０００４】しかしながら、アスタキサンチンの製造に
おいては、天然物のオキアミやザリガニからの抽出によ
る製造では含有量が極めて少なくしかも抽出が困難なこ
とからコストが高い。さらに資源の確保が困難であるこ
とも問題である。また赤色酵母ファフィア・ロドチーマ
（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）は増殖速度が
小さい、生産量が少ない、強固な細胞壁を持つためアス
タキサンチンを抽出することが困難であるなどの短所を
有するため工業化には問題が多い。

【０００５】緑藻類ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈ
ａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）も増
殖速度が極めて遅い、雑菌汚染を起こし易い、抽出が困
難などの欠点を有するため工業化には問題が多い。アド
ニキサンチンは金魚やコイなどの魚類に存在しているこ
とが知られている（水産動物のカロチノイド、日本水産
学会編、１９７８）が、化学合成による製造は困難と思
われる。アドニキサンチンの工業的製造方法は知られて
いない。

【０００６】β−カロテンの製造方法としては、β−ヨ
ノンからの合成（Pure & Appl.Chem., 63(1), 45, 199
1) 、ニンジン、サツマイモ、カボチャ等緑黄色野菜か
らの抽出（天然着色料ハンドブック、光琳（１９７
９）、天然着色料ハンドブック編集委員会編）が知られ
ているが、製造コストが高い。微生物によるβ−カロテ
ンの生産については、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌ
ａ）属藻類による生産（Journal of Applied Bacteriol
ogy, 70, 181, 1991)及びブラケスラ（Ｂｌａｋｅｓｌ
ｅａ）属のカビによる生産（Journal of Applied Bacte
riology, 70, 181, 1991)が知られている。しかしなが
ら、細菌によるβ−カロテンの生産は知られていない。

【０００７】エキネノンはオニヒトデなどのヒトデ類、
マダイ等の魚類の内蔵、ウニ類、イセエビ等の甲穀類の
内蔵等、天然物から抽出されている（水産動物のカロチ
ノイド、日本水産学会編、1978）。しかしながら、微生
物によるエキネノンの生産は知られていない。カンタキ
サンチンは、ある種のきのこ（Botanical Gazette, 11
2, 228-232, 1950)、魚類および甲穀類などに存在して
いることが知られている（水産動物のカロチノイド、日
本水産学会編、1978）。

【０００８】また微生物が生産する例としてはブレビバ
クテリウム属に属する微生物（Applied and Environmen
tal Microbiology, 55(10), 2505, 1989) 、ロドコッカ
ス属に属する微生物（特開平２−１３８９９６）が知ら
れている。また化学合成法ではβ−カロテンの酸化によ
り合成する方法（J.Amer.Chem.Soc., 78, 1427, 1956）
および新規な３−オキソ−Ｃ₁₅ホスホニウム塩から合成
する方法（Pure Appl.Chem., 51, 875, 1979)が知られ
ている。

【０００９】ゼアキサンチンの製造方法としては、オキ
ソイソホロンの不斉還元により得た光学活性なヒドロキ
シケトンを原料として用いる化学合成法（Pure & Appl.
Chem., 63(1), 45, 1991) 、トウモロコシの種子から抽
出する方法（生体色素、１９７４、朝倉書店）、及びフ
ラボバクテリウム属細菌を用いる方法（Carotenoids,In
Microbial Technology, 2nd edn, Vol.I, 529-544, Ne
w York ：AcademicPress)が知られている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アスタキサ
ンチン、アドニキサンチン、β−カロテン、エキネノ
ン、カンタキサンチン及びゼアキサンチンからなる群か
ら選択されたカロチノイド色素を簡便な方法で工業的に
製造することができる新規な方法を提供しようとするも
のである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく種々検討した結果公知の属に属さない新
規細菌株が種々のカロチノイド色素を生産することを見
出し、本発明を完成した。従って、本発明は、アスタキ
サンチン、アドニキサンチン、β−カロテン、エキネノ
ン、カンタキサンチン及びゼアキサンチンから成る群か
ら選択されたカロチノイド色素の製造方法において、該
カロチノイドの少なくともいずれか１種を生産する能力
を有する細菌を培養し、そしてその培養物から前記カロ
チノイド色素の１種又はそれらの混合物を採取すること
を特徴とする方法を提供する。

【００１２】

【具体的な説明】本発明の方法により製造されるカロチ
ノイド色素は、次の式により表わされる。

【００１３】

【化１】

【００１４】

【化２】

【００１５】本発明においては、前記カロチノイド色素
を生産することができる細菌であればいずれも使用する
ことができるが、その一例として、前記カロチノイド色
素のいずれかを生産することができ、且つ下記に記載し
た性質を具備する属に属する細菌群を挙げることができ
る。これらの性質を具備する細菌群は、バージーズ・マ
ニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) に記
載されている既知のいずれの属にも該当せず全く新規な
属に属する細菌群である。

【００１６】

【表２】 その中の具体的な微生物としてはＥ−３９６株を挙げる
ことができる。この菌株は、本発明者らが新しく単離し
たものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平
成５年４月２７日にＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３として寄
託された。この菌株は、次の菌学的性質を有する。

【００１７】

【表３】

【００１８】

【表４】

【００１９】

【表５】

【００２０】

【表６】

【００２１】

【表７】

【００２２】

【表８】 １６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基
配列 配列番号：１に示す。

【００２３】以上の結果からＥ−３９６株は好気性のグ
ラム陰性の桿菌で周毛を有していることからアグロバク
テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌と思わ
れたが色素産生能とスライム形成能、およびＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ相同性の結果から否定された。また集落の色調から
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌
や光合成細菌の可能性も考えられたが、スフィンゴ脂質
およびバクテリオクロロフィルが検出されずいずれの属
の菌株でもないことが分かった。

【００２４】集落の色調、周毛、ＧＣ含量、キノン系か
らＥ−３９６株と近縁と推定される各菌種の保存菌株と
ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を調べたが高い相同値を示した属
は得られなかった。さらにＥ−３９６株の１６Ｓリボソ
ームＲＮＡの塩基配列から近隣結合法により分子系統樹
（図６）を作成した。その結果Ｅ−３９６株は近縁のい
ずれの属とも系統的に独立していることが分かった。よ
ってＥ−３９６株は既知の属ではない全く新規な属に属
する細菌であることが確認された。

【００２５】さらに具体的な他の微生物としてはＡ−５
８１−１株を挙げることができる。この菌株は、本発明
者らが新しく単離したものであり、工業技術院生命工学
工業技術研究所に平成６年５月２０日にＦＥＲＭ ＢＰ
−４６７１として寄託された。この菌株は、次の菌学的
性質を有する。

【００２６】

【表９】

【００２７】

【表１０】

【００２８】

【表１１】

【００２９】

【表１２】

【００３０】

【表１３】

【００３１】以上の結果からＡ−５８１−１株はＥ−３
９６株と同様に下記の性質を具備することおよびＥ−３
９６株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が高いことからＥ−３
９６株と同一の新規な属に属する細菌であると判断され
た。

【００３２】

【表１４】

【００３３】カロチノイドを本菌株により製造するため
の培地は、例えば次の通りである。すなわち、生産菌が
生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、および必要であ
れば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核
酸塩基等）を含む。炭素源としてはグルコース、シュー
クロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、
マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢
酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マ
ロン酸、ピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノ
ール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソ
ブタノール、グリセロール等のアルコール類、大豆油、
ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、アマニ
油等の油脂類等が挙げられる。添加割合は炭素源の種類
により異なるが、通常培地１Ｌ当たり１〜１００ｇ、好
ましくは２〜５０ｇである。

【００３４】窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の１種ま
たは２種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類に
より異なるが、通常培地１Ｌに対し０．１ｇ〜３０ｇ、
好ましくは１〜１０ｇである。無機塩としてはリン酸二
水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸
鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、
塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭
酸ナトリウム等の１種または２種以上が用いられる。添
加割合は無機塩の種類により異なるが、通常培地１Ｌに
対し０．００１〜１０ｇである。

【００３５】特殊な要求物質としてはビタミン類、核酸
類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕、等の１種また
は２種以上が用いられる。添加割合は物質の種類により
異なるが、通常、培地１Ｌに対し０．２ｇ〜２００ｇ、
好ましくは３〜１００ｇである。培地のpHは２〜１２、
好ましくは６〜９に調整する。培養条件は１５〜８０
℃、好ましくは２０〜３５℃の温度であり、通常１日〜
２０日間、好ましくは２〜８日間振とう培養あるいは通
気攪拌培養を行う。

【００３６】最後に培養物より分離精製して本発明の化
合物を得る。すなわち培養物より直接または遠心分離、
濾過等により菌体を分離したのち菌体から溶剤で抽出す
る。また、培養上清にも色素が若干溶解しているので、
それらも回収することができる。ここで用いる溶剤は本
発明の化合物が溶解する化合物であればいずれの溶剤を
使用することができる。

【００３７】例えばアセトン、クロロホルム、ジクロロ
メタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メタノール、エタ
ノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、二硫化炭
素、ジエチルエーテル等の有機溶剤が用いられ、好まし
くはクロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、メタノ
ール、エタノール、イソプロピルアルコールが用いられ
る。精製には吸着、溶出、溶解などの通常の方法を用い
ることができる。

【００３８】本発明の方法によれば、多くの場合、アス
タキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン、エキ
ネノン、カンタキサンチン及びゼアキサンチンは同時に
生産され、培養物中に共存している。従って、本発明の
１つの態様によれば、前記の精製法により、前記カロチ
ノイド色素を単独で得ることができる。他方、前記カロ
チノイド色素を相互に分離することなく、それらを含む
混合物として得ることができる。この様に、前記の個々
のカロチノイド色素を単独に製造する方法に加えて、前
記カロチノイド色素２種類以上を含む混合物としてカロ
チノイドを製造する場合も、本願発明のカロチノイド色
素の製造方法に含まれる。

【００３９】アスタキサンチンとアドニキサンチンの相
互分離は、カロチノイド色素成分の相互分離に常用され
ている方法、例えば吸着分離カラムクロマトグラフィー
法、分別抽出法、向流分配抽出法、分別結晶法等を用い
て行うことができる。また、個々のカロチノイド色素を
製造するためには、培地組成、培養条件等を調整するこ
とにより、所望のカロチノイド色素を優先的に生産させ
ることができる。

【００４０】例えば、培養における好気性条件を変える
ことにより、カロチノイド色素の生成量比を変えること
ができる。例えばフラスコ振とう培養においては液量や
振とう速度を変えることにより、また通気・攪拌培養に
より通気や攪拌条件を変えることによりカロチノイド色
素の生成比を変えることができる。一例としてフラスコ
振とう培養において、フラスコ当りの液量を増加するこ
とによりアスタキサンチンの生成量は増加する傾向にあ
り、アドニキサンチンの生産量は減少する。

【００４１】他の方法として、カロチノイド色素の特定
のものを優先的に製造するためには、生産菌株を変異、
例えば人為的変異処理により、一方の成分を他方の成分
より優先的に生産するように改良することができる。こ
の様な変異処理としては、例えばＸ線照射、紫外線照射
のごとき物理的方法、化学的変異剤、例えばＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、
エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等による変異処理
のごとき化学的方法、遺伝子組換え法等の生物学的方法
を用いることができる。これらの方法、又は他の方法に
より改良された生産株を用いるカロチノイド色素の製造
方法も、本発明に属する。

【００４２】前記のごとき本発明の方法により製造され
たアスタキサンチンは（３Ｓ，３′Ｓ）−アスタキサン
チンでありその純度はほぼ１００％である。天然物であ
るザリガニ、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）、サケ、マス、マダイに存在するアスタキサンチ
ンは（３Ｓ，３′Ｓ）体の含有率が高いことが知られて
いる。一方ファフィア・ロドチマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒ
ｈｏｄｏｚｙｍａ）は（３Ｒ，３′Ｒ）体の含有率が高
く天然に多く存在するアスタキサンチンとは反対の絶対
配置を持つことが知られている。

【００４３】本微生物により生産したアスタキサンチン
は１００％の（３Ｓ，３′Ｓ）−アスタキサンチンであ
り天然において多数を締めるアスタキサンチンと同じ絶
対配置を有することは産業上価値が高い。また化学合成
法による（３Ｓ，３′Ｓ）−アスタキサンチンの製造法
（Helv. Chim. Acta, 61, 2609, 1978) が知られている
が光学活性な（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，
２，６−トリメチルシクロヘキサノンを原料とするため
コストが高く工業化には問題がある。

【００４４】また本微生物により生産したアスタキサン
チンはａｌｌ−ｔｒａｎｓ体のアスタキサンチンの含有
率が高いことが特徴でａｌｌ−ｔｒａｎｓ：ｃｉｓの比
は９２：８〜９６：４である。ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体の
アスタキサンチンは天然型であり本微生物は天然型のア
スタキサンチンを生産する点ですぐれている。ｃｉｓ体
のアスタキサンチンが必要であれば公知の方法によりａ
ｌｌ−ｔｒａｎｓ体から合成できる。しかしｃｉｓ体か
らａｌｌ−ｔｒａｎｓ体のアスタキサンチンを合成する
ことは困難である。

【００４５】本発明により製造される化合物アスタキサ
ンチンの¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを図１に、そして質
量スペクトルを図２に示す。また、アドニキサンチンの
¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを図３に、そして質量スペク
トルを図４に示す。

【００４６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるも
のではない。

【００４７】実施例１．グルコース２ｇ／Ｌ、肉エキス
３ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／
Ｌの組成からなる培地１０mLを直径１８mmの試験管に入
れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。これにＥ−３９６
株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）を１白金耳植菌し３０
℃で６日間、３００rpm の往復振とう培養を行った。こ
の培養液１００本分（１Ｌ）を遠心分離し得た菌体をア
セトン５００mLで抽出した後、ヘキサン５００mLおよび
０．８５％食塩水５００mLを加え攪拌し、上層を分取し
た後、溶剤を３５℃、減圧下で留去した。

【００４８】得られた色素抽出物をシリカゲルのカラム
に吸着させ、ベンゼン：酢酸エチル：メタノール（１
５：４：１）の溶剤でアスタキサンチン画分を溶出させ
溶剤を減圧下で留去した。抽出物を少量のピリジンに溶
解し水を滴下してアスタキサンチンを結晶化させ、アス
タキサンチンの結晶１．２mgを得た。このようにして得
られたアスタキサンチンは赤外吸収スペクトル、質量分
析、¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトル、吸収スペクトルにおい
て公知のものと一致した。実施例２． 表１５の組成からなる培地１０mLを直径１８
mmの試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。

【００４９】

【表１５】

【００５０】これにＥ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
２８３）を１白金耳植菌し３０℃で２日間、３００rpm
の往復振とう培養を行った。この培養液１０mLを上と同
組成の培地が１００mL入った５００mL容量の坂口フラス
コに植菌し３０℃、２日間、１００rpm の往復振とう培
養を行った。次にこの培養液１００mLを上と同組成の培
地が３．０Ｌ入った５．０Ｌ容量の発酵槽に植菌し３０
℃、５００rpm 、１．０vvm の好気培養を５２時間行っ
た。

【００５１】次にこの培養液３Ｌを上と同組成（ただし
酵母エキス１０ｇ／Ｌ、シュークロース２０ｇ／Ｌ、Ｎ
Ｈ₄ ＮＯ₃ ２．５ｇ／Ｌ）の培地が３５Ｌ入った５０
Ｌ容量の発酵槽に植菌し３０℃、２５０rpm 、１．０vv
m の好気培養を１８時間行った。得られた培養液３３Ｌ
を遠心分離し湿菌体７９０ｇを得、これをメタノール
１．３Ｌで洗浄し０．８Ｌのクロロホルムで３回抽出し
た。色素抽出物からのアスタキサンチンの精製は実施例
１と同様の方法により行い、アスタキサンチンの結晶１
０mgを得た。

【００５２】このようにして得られたアスタキサンチン
は赤外吸収スペクトル、質量分析、 ¹³Ｃ核磁気共鳴スペ
クトル、吸収スペクトルにおいて公知のものと一致し
た。さらに得られたアスタキサンチンの絶対配置を公知
の方法（J. High Resolut. Chromatogr. Chromatogr Co
mmun.,２, 195, 1979)により決定し（３Ｓ，３′Ｓ）−
アスタキサンチンが１００％でありａｌｌ−ｔｒａｎｓ
体とｃｉｓ体との比は９５：５であることが確認され
た。比較のために他の製法により製造したアスタキサン
チンの分析結果を次の表１６に示す。

【００５３】

【表１６】

【００５４】実施例３．表１５の組成からなる培地（た
だしシュークロース３０ｇ／Ｌ）１０mLを直径１８mmの
試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。これに
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３を）を１白金
耳植菌し２５℃で５日間、３００rpm の往復振とう培養
を行った。この培養液の遠心分離によって得た菌体１０
mL分をアセトン１０mLで抽出した後、ヘキサン１０mLお
よび０．８５％食塩水１０mLを加え攪拌し、上層を分取
した後溶剤を３５℃、減圧下で留去した。

【００５５】得られた色素抽出物のカロチノイド量を高
速液体クロマトグラフィーにより分析したところ表１７
のようになった。分析条件は、カラムにＷａｋｏｓｉｌ
５ＳＩＬ−１２０（和光純薬工業株式会社製）４．６
mmI.D.×２５０mmを二連結して用い、移動相はヘキサ
ン：ジクロロメタン：メタノール（１０：８：１）を用
いた。カロチノイドの検出は４７０nmにおける吸収で行
い、定量は試料と標準物質のアスタキサンチンとの高速
液体クロマトグラフィーにおけるピーク面積比から算出
した。さらに得られたアスタキサンチンの絶対配置を実
施例２に示した方法で決定し（３Ｓ，３′Ｓ）−アスタ
キサンチンが１００％でありａｌｌ−ｔｒａｎｓ体とｃ
ｉｓ体との比は９５：５であることが確認された。

【００５６】

【表１７】

【００５７】実施例４．表１５の組成からなる培地（た
だしシュークロース３０ｇ／Ｌ）１０mLを直径１８mmの
試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。これに
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）を１白金耳
植菌し２５℃で２日間３００rpm の往復振とう培養を行
った。この培養液を上と同組成の培地が２５〜２００mL
入った５００mL容量の三角フラスコに１容量％になるよ
うに植菌し２５℃、５日間１２０rpm の回転振とう培養
を行った。培養液からのカロチノイドの抽出および分析
は実施例３の方法により行ったところアスタキサンチ
ン、アドニキサンチンおよび総カロチノイド量は表１８
のようになった。

【００５８】

【表１８】

【００５９】実施例５．実施例２で得られた色素抽出物
をシリカゲルのカラムに吸着させ、ベンゼン：酢酸エチ
ル：メタノール（１５：４：１）の溶剤でアドニキサン
チン画分を溶出させ溶剤を減圧下で留去した。抽出物を
エタノールに５０℃で溶解し４℃で１日間放置すること
により結晶化させ、アドニキサンチンの結晶１９０mgを
得た。このようにして得られたアドニキサンチンは赤外
吸収スペクトル、質量分析、¹³Ｃ核磁気共鳴スペクト
ル、吸収スペクトルにおいて公知のものと一致した。

【００６０】実施例６．表１５の組成からなる培地（た
だしシュークロース３０ｇ／Ｌ）１０mLを直径１８mmの
試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。これに
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）を１白金耳
植菌し２８℃で５日間振とう培養した。この培養液から
実施例３の方法によりカロチノイドを抽出し、高速液体
クロマトグラフィーにより分析したところ、ピークの溶
出時間、及び各ピークの溶離剤と同じ溶剤中での極大吸
収波長は、表１９に示す通りであった。なお、この場合
の溶出のプロフィールを図５に示す。

【００６１】

【表１９】

【００６２】β−カロテン及びカンタキサンチンについ
ては標準物質を用い、それらの前記と同一条件での溶出
時間及び極大吸収波長を測定したところ、これらの測定
値はピークNo. １及びピークNo. ３の測定値とよく一致
し、ピークNo. １はβ−カロテンを示し、そしてピーク
No. ３はカンタキサンチンを示すものと同定された。ま
た、エキネノン及びゼアキサンチンについては、前記の
結果と文献〔Davies B.H.1976, Carotenoids, 38-165,
In T.W.Goodwin(ed.), Chemistry and Biochemistry of
Plant Pigments, Vol.2, Academic Press, Inc.(Londo
n), Ltd., London. 〕記載の極大吸収とを比較したとこ
ろ、ピークNo. ２はエキネノンを示し、そしてピークN
o. ４はゼアキサンチンを示すものと同定された。

【００６３】実施例７．ブレインハートインフュジョン
ブイヨン培地（栄研化学株式会社製、ただしＮａ₂ ＣＯ
₃ でpHを１０に調整）１０mLを直径１８mmの試験管に入
れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。これにＡ−５８１
−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６７１）を１白金耳植菌し
３３℃で４日間振とう培養した。この培養液から実施例
３の方法によりカロチノイドを抽出し、高速液体クロマ
トグラフィーにより定量分析したところ表２０のように
なった。

【００６４】

【表２０】 さらに得られたアスタキサンチンの絶体配置を実施例２
に示した方法で決定し（３Ｓ，３′Ｓ）−アスタキサン
チンが１００％でありａｌｌ−ｔｒａｎｓ体とｃｉｓ体
の比は９５：５であることが確認された（表２１）。

【００６５】

【表２１】 実施例８．下記の表の組成からなる培地１０mLを直径１
８mmの試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌した。

【００６６】

【表２２】 これにＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６７１）
を１白金耳植菌し２８℃で４日間振とう培養した。この
培養液から実施例３の方法によりカロチノイドを抽出
し、高速液体クロマトグラフィーにより定量分析したと
ころ表２３のようになった。

【００６７】

【表２３】

【００６８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ AGTTTGATCC TGGCTCAGAA CGAACGCTGG CGGCAGGCTT AACACATGCA 50 AGTCGAGCGA GACCTTCGGG TCTAGCGGCG GACGGGTGAG TAACGCGTGG 100 GAACGTGCCC TTCTCTACGG AATAGCCCCG GGAAACTGGG AGTAATACCG 150 TATACGCCCT TTGGGGGAAA GATTTATCGG AGAAGGATCG GCCCGCGTTG 200 GATTAGGTAG TTGGTGGGGT AATGGCCCAC CAAGCCGACG ATCCATAGCT 250 GGTTTGAGAG GATGATCAGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC 300 CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATCTTAGA CAATGGGGGC AACCCTGATC 350 TAGCCATGCC GCGTGAGTGA TGAAGGCCTT AGGGTTGTAA AGCTCTTTCA 400 GCTGGGAAGA TAATGACGGT ACCAGCAGAA GAAGCCCCGG CTAACTCCGT 450 GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GGAGGGGGCT AGCGTTGTTC GGAATTACTG 500 GGCGTAAAGC GCACGTAGGC GGACTGGAAA GTCAGAGGTG AAATCCCAGG 550 GCTCAACCTT GGAACTGCCT TTGAAACTAT CAGTCTGGAG TTCGAGAGAG 600 GTGAGTGGAA TTCCGAGTGT AGAGGTGAAA TTCGTAGATA TTCGGAGGAA 650 CACCAGTGGC GAAGGCGGCT CACTGGCTCG ATACTGACGC TGAGGTGCGA 700 AAGCGTGGGG AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA 750 CGATGAATGC CAGACGTCGG CAAGCATGCT TGTCGGTGTC ACACCTAACG 800 GATTAAGCAT TCCGCCTGGG GAGTACGGTC GCAAGATTAA AACTCAAAGG 850 AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC 900 AACGCGCAGA ACCTTACCAA CCCTTGACAT GGCAGGACCG CTGGAGAGAT 950 TCAGCTTTCT CGTAAGAGAC CTGCACACAG GTGCTGCATG GCTGTCGTCA 1000 GCTCGTGTCG TGAGATGTTC GGTTAAGTCC GGCAACGAGC GCAACCCACG 1050 TCCCTAGTTG CCAGCAATTC AGTTGGGAAC TCTATGGAAA CTGCCGATGA 1100 TAAGTCGGAG GAAGGTGTGG ATGACGTCAA GTCCTCATGG GCCTTACGGG 1150 TTGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGTGGTG ACAGTGGGTT AATCCCCAAA 1200 AGCCATCTCA GTTCGGATTG TCCTCTGCAA CTCGAGGGCA TGAAGTTGGA 1250 ATCGCTAGTA ATCGCGGAAC AGCATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC 1300 TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCATGGGAG TTGGTTCTAC CCGACGACGN 1350 TGCGCTAACC TTCGGGGGGC AGGCGGCCAC GGTAGGATCA GCGACTGGGG 1400 TGAAGTCGTA ACAAGGTAGC CGTAGGGGAA CCTGCGGCTG GATCACCTCC 1450 TT 1452

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の方法により製造したアスタキ
サンチンの¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。

【図２】図２は、本発明の方法により製造したアスタキ
サンチンの質量スペクトルを示す図である。

【図３】図３は、本発明の方法により製造したアドニキ
サンチンの¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを示す図である。

【図４】図４は、本発明の方法により製造したアドニキ
サンチンの質量スペクトルを示す図である。

【図５】図５は、本発明のカロチノイド色素の高速液体
クロマトグラフィーにおける溶出の様子を示す図であ
る。

【図６】図６は、Ｅ−３９６株と近縁種の系統樹を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 清田 隆 神奈川県横浜市中区千鳥町８番地 日本 石油株式会社 中央技術研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 23/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アスタキサンチン、アドニキサンチン、
   β−カロテン、エキネノン、カンタキサンチン及ゼアキ
   サンチンから成る群から選択されたカロチノイド色素の
   製造方法において、該カロチノイド色素の少なくともい
   ずれか１種を生産する能力を有し、１６ＳリボソームＲ
   ＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列が配列番号：１に記
   載の配列である細菌を培養し、そしてその培養物から前
   記カロチノイド色素の１種又はそれらの混合物を採取す
   ることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 アスタキサンチン、アドニキサンチン、
   β−カロテン、エキネノン、カンタキサンチン及ゼアキ
   サンチンから成る群から選択されたカロチノイド色素の
   製造方法において、該カロチノイド色素の少なくともい
   ずれか１種を生産する能力を有し、且つ下記の性質を有
   する細菌を培養し、そしてその培養物から前記カロチノ
   イド色素の１種又はそれらの混合物を採取することを特
   徴とする方法。 【表１】
3. 【請求項３】 前記細菌がＥ−３９６株（ＦＥＲＭ Ｂ
   Ｐ−４２８３）またはＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ Ｂ
   Ｐ−４６７１）であることを特徴とする請求項１又は２
   に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記細菌がＥ−３９６株（ＦＥＲＭ Ｂ
   Ｐ−４２８３）の変異株またはＡ−５８１−１株（ＦＥ
   ＲＭ ＢＰ−４６７１）の変異株であることを特徴とす
   る請求項１又は２に記載の方法。