WO2007114461A1 - カロテノイドの製造方法 - Google Patents

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WO2007114461A1
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Tomoyuki Ishizaki
Satoru Ishikawa
Akira Tsubokura
Kazuaki Hirasawa
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Asahi Kasei Pharma Corporation
Nippon Oil Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing carotenoids, and more particularly, to an industrially suitable method for producing austaxanthin used as a food, pharmaceutical composition, or cosmetic ingredient.
  • the present invention also provides a carotenoid-containing composition obtained by the above method, and further
  • the present invention relates to a food, a pharmaceutical composition, or a cosmetic containing the carotenoid-containing composition.
  • Carotenoids are natural pigments that exist widely in nature, and are polyen pigments that range from yellow to red or purple. Astaxanthin is one of the carotenoids found in nature, and exists in the free state or as an ester, and also exists as various chromoproteins by binding to proteins.
  • Astaxanthin is widely used as a deep-fried fish and chicken egg color. It is also recognized as a food additive and is widely used in processed oily foods, proteinaceous foods, and aqueous liquid foods. Furthermore, because of its antioxidant activity against lipid peroxidation induced by free radicals and singlet oxygen scavenging action that reaches several hundred times that of ⁇ -tocopherol, it has functions that make use of its strong antioxidant activity. Expected to be used as food, cosmetics, or pharmaceuticals.
  • Astaxanthin is widely distributed in nature such as salmon, trout, red sea bream fish, crustacean, shrimp, krill and other crustaceans, as well as bacteria belonging to the genus Agrobacterium, Brevi pacteria, Paracoccus, It is also produced by microorganisms such as Hematococcus green algae and Phaffia yeast.
  • Carotenoids such as wastaxanthin and zeaxanthin are industrially produced by chemical synthesis methods, but those derived from natural products are required because of safety concerns. In particular, many methods for producing carotenoids containing austaxanthin derived from algae and microbes that are considered to be suitable for mass production have been reported.
  • cultivated algal cyst cells are treated with heat acetone to elute chlorophyll, which is a contaminant, and then spray-dried the cyst cells.
  • chlorophyll which is a contaminant
  • the crude oily extract obtained by extracting the broken cells of the yeast with an organic solvent and concentrating the extract is purified by ion exchange chromatography, adsorption chromatography, etc. Go to the astaxanthin Although a method to obtain (Reference 4) has been reported, it is carried out by a non-industrial method, such as purification of a low-concentration crude astaxanthin by multiple column chromatography. As another method, a method of producing a crystallization by adding a hydrocarbon solvent to a crude oily substance obtained by extracting cells after cultivation of Phaffa yeast with acetone and concentrating the obtained extract ( Reference 5) has been reported.
  • the resulting composition has a carotenoid content of only about 70 to 73% (36% to 42% astaxanthin content), and has a low purity of carotenoids with less biological impurities.
  • it is also unsatisfactory in that there are concerns about the presence of acetone and hydrocarbon solvents in carotenoids.
  • E-39 6 strain (FERM BP-4283: dated April 27, 1993) (the original deposit date), which is a production strain of austaxanthin, adonixanthin, etc.
  • the center Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1-chome, 1-chome, Ibaraki, Japan
  • extraction is performed by contacting the cells with cyclic hydrophilic organic compounds that may be used in food production.
  • (6) or a method using supercritical fluid extraction (Reference 7) as in Reference 3 has been reported.
  • a method of performing liquid-liquid extraction by contacting E-396 strain with a water-soluble organic solvent, a nonpolar solvent and water has been reported (Reference 8).
  • the present invention provides a carotenoid-rich composition using a high-purity, inexpensive and safe solvent and an industrial production method thereof, and further a functional food, pharmaceutical composition, or cosmetic containing the composition.
  • the purpose is to provide.
  • the present inventor tried to obtain high-purity carotenoids by the conventional liquid-liquid extraction method. In many respects, it is industrially inefficient, as is the case with conventional purification technology in a low-concentration solution state. 2) Solvent recovery with fractionation from mixed organic solvents is not possible. 3) We found a new problem that the solvent to be used remains in the product and the safety is low.
  • precipitation was obtained by extracting the microorganism culture containing carotenoide, its concentrate, or these dried products with lower alcohols, and then concentrating the extract.
  • the present inventors have found that a high-purity carotenoid composition can be obtained by washing a product with water-containing lower alcohols or a combination of water-containing lower alcohols and hydrocarbon solvents, thereby completing the present invention.
  • the microorganism culture is extracted with at least one of lower dialkyl ketones and ethers, and then the precipitate obtained by concentrating the extract is treated with at least one of lower alcohols and lower dialkyl ketones or a mixture thereof. It has been found that a high-purity carotenoid composition can be obtained by washing, and the present invention has been completed. That is, the present invention has the following configuration. .
  • a method for producing a carotenoid-containing composition comprising the following steps 1) to 3):
  • a method for producing a carotenoid-containing composition comprising the following steps 1) to 3):
  • a method for producing a carotenoid-containing composition comprising the following steps 1) to 3):
  • a method for producing a carotenoid-containing composition comprising the following steps 1) to 3):
  • carotenoid-containing composition is a composition containing 80% or more of carotenoid.
  • the base sequence of the DNA corresponding to the 16 S ribosomal RNA of the microorganism is substantially homologous to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (1) to (8) The manufacturing method as described in.
  • a highly pure, inexpensive and safe carotenoid-rich composition derived from a natural product and an industrial production method thereof are provided, and further, a functional food, a pharmaceutical composition, or a cosmetic containing the composition.
  • the present invention extracts a culture of a microorganism, such as a microorganism culture containing a carotenoid, with at least one selected from the group consisting of lower alcohols, water-containing lower alcohols, lower dialkyl ketones and ethers.
  • the present invention relates to a carotenoid production method.
  • the method of the present invention has a carotenoid content of not less than 80%, preferably a carotenoid content of 90%, containing istaxanthin with a small amount of contaminants derived from living organisms and an extremely low content of organic solvents other than lower alcohols.
  • the above composition can be obtained.
  • the microorganism that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism that produces carotenoids, and examples thereof include Noracoccus bacteria, Haematococcus algae, and Phaffia yeasts. Especially the rapid growth rate, caroteno
  • a bacterium in which the base sequence of DNA corresponding to 16 S liposome RNA is substantially homologous to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is preferable.
  • Substantial homology means that the sequence is 94% or more, preferably 96% or more, more preferably 98% or more, considering the error frequency of DNA sequencing and spontaneous mutation in microorganisms. It means having sex.
  • E-396 strain (FERM BP-4283) is particularly preferable. Also, it is a very suitable example to use a carotenoid high-producing strain selected for mutation treatment of these microorganisms to improve carotenoid productivity.
  • the E-396 strain has been deposited internationally at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary as follows.
  • the method of mutation treatment is not particularly limited as long as it induces mutation.
  • chemical methods using mutagen such as V_methyl -12 tallow V—ditrosoguanidine (NT G), ethyl methanesulfonate (EMS), physical methods such as UV irradiation, X-ray irradiation, genes Biological methods such as recombination and transposon can be used.
  • This mutation treatment may be performed once, or, for example, a mutation of a castaxanthin-producing microorganism may be obtained by this mutation treatment, and further mutation treatment may be performed, such as further mutation treatment.
  • the microorganism culture used in the present invention is a culture obtained by using a method capable of efficiently culturing the above-mentioned microorganisms, for example, a liquid culture, a solid culture, or a combination thereof using the following medium: If so, there is no limitation.
  • a nutrient medium used for culturing the microorganisms used in the present invention a nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic salt necessary for the growth of the producing bacteria is sufficient. It may be preferable. In addition, it may be preferable to further add an amino acid, a nucleic acid base or the like.
  • Carbon sources include glucose, sucrose, lactose, fructose, trenosose, mannose, mannitol, manoletos and other moss, acetic acid, fumaric acid, citrate, propionic acid, malic acid, malonic acid, pyruvic acid, etc.
  • the nitrogen source for example, one or more of potassium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonia, urea and the like are used.
  • the addition ratio varies depending on the type of nitrogen source and may be adjusted as appropriate, but is usually 0.1 g to 30 g, preferably 1 to 10 g, relative to 1 L of the medium.
  • Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, iron sulfate, iron chloride, manganese sulfate, manganese chloride, zinc sulfate, lead chloride, copper sulfate, chloride
  • potassium dihydrogen phosphate dipotassium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate
  • magnesium sulfate magnesium chloride
  • iron sulfate iron chloride
  • manganese sulfate manganese chloride
  • zinc sulfate lead chloride
  • copper sulfate chloride
  • One or more of calcium, calcium carbonate, sodium carbonate, etc. are used.
  • the addition ratio varies depending on the type of inorganic salt and may be adjusted as appropriate, but is usually from 0.001 to 10 g per 1 L of medium.
  • the amount of vitamins to be added varies depending on the type of vitamins and may be adjusted as
  • Amino acid, nucleobase, yeast extract, peptone, meat extract, malt extract, corn steep liquor, dry yeast, soybean meal, etc. may be added as appropriate depending on the type of substance. 0.2 to g to 20 ° g, preferably 3 to: LOO g.
  • the pH of the medium is adjusted to 2 to 12, preferably 6 to 9.
  • the culture conditions are 15 to 80 ° C, preferably 20 to 35 ° C, and the culture is usually performed under aerobic conditions for 1 to 20 days, preferably 2 to 8 days. Examples of the aerobic condition include shaking culture or aeration stirring culture.
  • the culture solution is generally obtained by microbial cell concentrate obtained by membrane filtration concentration, centrifugation, pressurization or vacuum filtration, etc.
  • wet cells obtained by the conventional filtration method are subjected to the following extraction using dry cells obtained by a generally known drying method such as spray drying, fluidized drying, rotary drum drying or freeze drying.
  • a more preferred example is given.
  • chemical treatment with alkaline reagents or surfactants, lytic enzymes, lipolytic enzymes, and so on at the stage of the culture solution cell concentrate, wet cells or dry cells.
  • proteolytic enzymes One or more of the biochemical treatments used, or physical treatments such as ultrasonic or flour may be performed.
  • the dried cells it is considered that about 1 Omg of aboutaxanthin is usually contained in 1 g.
  • extraction solvent used for extraction from cultured microorganisms (culture of microorganisms), concentrates of cultures, or dried products thereof (also referred to herein as “cultured microorganisms” or “microorganism cultures”) used in the present invention
  • solvent include one selected from the group consisting of lower alcohols, lower dialkyl ketones and ethers, or one or a combination thereof.
  • the lower alcohols are preferably methanol, ethanol, n-propanol and isopropanol, more preferably ethanol and isopropanol, and particularly preferably ethanol.
  • the temperature of the solvent at the time of extraction is preferably from 0 ° C. to the boiling point of the solvent used, and more preferably around 20 ° C. lower than the boiling point of the solvent used. In the case of ethanol, 25 ° C to 60 ° C is preferred, 40 ° C to 55 ° C is more preferred, and 45 ° C to 52 ° C is even more desirable.
  • the amount of the extraction solvent may be an amount that can dissolve the amount of wastaxanthin contained in the microbial cells. For example, when extracting from dry cells using ethanol, the astaxanthin contained in the microbial cells is sufficient. For 1 g; -90 kg, preferably 6-20 kg.
  • ethanol when extraction from 1 g of dry cells containing about 2 Omg of astaxanthin obtained from the above-mentioned cultured microorganisms used in the present invention is carried out with ethanol at 50 ° C, about 70 to 1800 g, preferably It is preferable to use ethanol in an amount of about 150 g to 700 g, more preferably about 250 g to 500 g.
  • a lower dialkyl ketone or ether is used as the extraction solvent, for example, acetone, methyl ethinoleketone, or tetrahydrofuran is preferred. Acetone 'or tetrahydrofuran is more preferred, and caseone is particularly preferred.
  • the temperature of the solvent at the time of extraction is preferably from o ° c to the boiling point of the solvent used, as described above, and more preferably around 5 ° C lower than the boiling point of the solvent used.
  • acetone 25 ° (: ⁇ 55 ° C is preferred, 40 ° C to 55 ° C is more preferred, and 45 ° C to 52 ° C is more preferred.
  • Amount of extraction solvent As long as the amount of astaxanthin contained in the cells can be dissolved, for example, when extracting from dry cells with acetone, 1 g of istaxanthin contained in the cells 0.2 to 18 kg, preferably 0.9 to 3 kg.
  • the extraction time does not need to be particularly limited, but when extracting at room temperature or higher, a short time treatment is preferable in order to reduce a decrease in yield due to thermal decomposition.
  • a short time treatment is preferable in order to reduce a decrease in yield due to thermal decomposition.
  • it is preferably within 12 hours, more preferably within 8 hours, further preferably within 6 hours, particularly preferably within 4 hours, and most preferably within 3 hours.
  • extracting with acetone at 50 ° C it is preferably within 12 hours, more preferably within 6 hours, more preferably within 3 hours, particularly preferably within 2 hours, and most preferably within 1 hour.
  • Examples of a method for concentrating an extract obtained by extracting a microorganism culture or the like with lower alcohols include heating and vacuum concentration.
  • the concentration may be 10 to 100 times the weight of the extract, preferably 30 times. ⁇ 500 times, more preferably 50 times to 400 times, particularly preferably 100 times to 200 times.
  • Examples of the method for concentrating the extract obtained by extracting cultured microorganisms or the like with at least one of lower dialkyl ketones and ethers include heating and / or reduced-pressure concentration as described above. Further, it may be carried out in an inert gas atmosphere such as nitrogen gas in order to prevent carotenoid oxidation as much as possible during concentration.
  • the degree of concentration may be appropriately determined in consideration of the amount and purity of the resulting precipitate.
  • the concentration may be 3 to 100 times the weight of the extract, preferably 7 to 50. Times, more preferably 15 times to 40 times, and particularly preferably 20 times to 30 times.
  • the distillate obtained by concentrating the extract can be reused as it is for extraction from cultured microorganisms.
  • the concentrated solution obtained after the concentration may be appropriately cooled in consideration of the amount and purity of the obtained precipitate to further promote precipitation.
  • the cooling temperature at this time is, for example, a temperature 20 ° C. or more lower than the temperature at the time of extraction, or 5 ° C., 0 ° C., 15 ° (:, 10 ° C., etc.)
  • seed precipitation (substance that causes precipitation, for example, a carotenoid solid such as carotenoid crystal) may be added for the purpose of smoothly generating a precipitate.
  • Precipitates are collected using a vacuum or pressure filter or centrifuge. At this time, if necessary, the collected precipitate may be washed with a small amount of the same solvent as the extraction solvent. In addition, when it is desired to prevent carotenoid oxidation as much as possible, it may be performed in an inert gas atmosphere such as nitrogen gas. Furthermore, considering that the solvent used for washing the precipitates to be purified after this will be recovered and reused multiple times, the solvent used in the extraction will remain as little as possible. It is preferable to devise a method for collecting precipitates under various conditions.
  • the solvent is recovered from the filtrate containing biological contaminants generated when collecting the precipitate using a method such as distillation or distillation under reduced pressure, and is again used for extraction from cultured microorganisms and washing of the precipitate. Can be used.
  • the undried product may be used for washing as it is, or a once dried product may be used.
  • powdered powder may be used to increase the washing efficiency, or powdered powder may be added during washing.
  • the solvent used for washing examples include any one of lower alcohols, water-containing lower alcohols, hydrocarbon solvents, lower dialkyl ketones, or combinations thereof.
  • the method of the present invention when extraction is performed with a lower alcohol from a microorganism culture or the like, it is preferable to use a water-containing lower alcohol or a combination of a water-containing lower alcohol and a hydrocarbon solvent in the washing step.
  • at least one of lower dialkyl ketones and ethers was extracted from a microorganism culture or the like.
  • the precipitate obtained by concentrating the extract is washed with a lower alcohol (for example, an alcohol-containing solvent having 1 to 3 carbon atoms) or a lower dialkyl ketone (for example, a ketone-containing solvent having 3 to 6 carbon atoms).
  • a lower alcohol for example, an alcohol-containing solvent having 1 to 3 carbon atoms
  • a lower dialkyl ketone for example, a ketone-containing solvent having 3 to 6 carbon atoms
  • the lower alcohols include alcohols having 1 to 3 carbon atoms such as methanol, ethanol, n-propanol, and isopropanol. Ethanol or isopropanol is preferable, and ethanol is particularly preferable.
  • the water content in the lower alcohols is preferably from 5 to 95%, more preferably from 10 to 50%, particularly preferably from 20 to 40%.
  • Examples of the lower dialkyl ketones include ketones having 3 to 6 carbon atoms such as acetone, methyl ethyl ketone, ethyl ketone, and methyl isobutyl ketone. Acetone or methyl ethyl ketone is preferable, and acetone is particularly preferable. Good.
  • the present invention can further include a step of washing the precipitate obtained in the washing step with a hydrocarbon-based solvent.
  • the hydrocarbons include alkyl having 5 to 7 carbon atoms such as pentane, hexane, cyclohexane, and heptane. Hexane or heptane is preferable, and hexane is particularly preferable.
  • the combination of water-containing lower alcohols and hydrocarbon solvents is a mixture of water-containing lower alcohols (for example, water-containing ethanol) and hydrocarbon solvents (for example, hexane).
  • water-containing lower alcohol After washing with a solvent (eg water-containing ethanol), followed by washing with a hydrocarbon solvent (eg hexane), the latter is preferred from the standpoint of washing efficiency.
  • the lower limit amount of the solvent used for washing is preferably selected in such a small amount that it can be industrially considered in consideration of the purity of the precipitate. For example, when 25% water-containing ethanol is used, it is dried. When washing the dried sediment, it is based on its weight; when washing the undried sediment, the correlation between the volume or weight of the undried material and the dried sediment is set in advance. 2 times or more, preferably 4 times or more, more preferably 6 times or more, more preferably 10 times the dry weight calculated using the conversion factor that can be calculated.
  • Double amount or more is preferable, and if necessary, 20 times or more amount may be used.
  • the maximum amount is sufficient if it is 200 times the maximum amount, and in particular, from the viewpoint of industrial efficiency, it is preferably 1 to 0 times or less, more preferably 80 times or less, and 40 times the amount. The following is more preferable, and if the conditions are set in detail, a 20-fold amount or less, and in some cases a 10-fold amount is sufficient.
  • hexane or acetone for example, when washing the dried precipitate, it is based on its weight; when washing the undried precipitate, It should be more than 30 times the weight of the dry matter calculated using the conversion factor that can be set by examining and setting the correlation with the dried precipitate in advance. Double amount or more, more preferably 40 times amount or more, and if necessary, 40 times amount or more may be used. In addition, as the upper limit, a maximum of 200 times is sufficient, especially from the viewpoint of industrial efficiency. Double amount or less is preferable, 80 times or less is more preferable, 60 times or less is more preferable, and about 50 times or less is sufficient if the conditions are set in detail.
  • the method of washing is not limited at all, but for example, a method of filtering after suspension stirring or a method of passing the liquid from above the precipitate can be mentioned as a practically preferable method.
  • the temperature at the time of washing is usually The temperature is preferably 1 ° C to 30 ° C, but may be 1 ° C or lower or 30 ° C or higher depending on the situation. However, the upper limit temperature is around the boiling point of the solvent used for washing (for example, 78 ° C for ethanol and 56 ° C for acetone). If it is desired to prevent carotenoid oxidation as much as possible, it may be performed in an inert gas atmosphere such as nitrogen gas.
  • the solvent used by methods such as distillation and vacuum distillation can be recovered from the waste liquid generated by washing to obtain high purity carotide from the precipitate, and the obtained solvent can be reused in the washing process.
  • a step of washing with water at the end of washing is added if necessary.
  • a method of adding a step of washing with a small amount of low-temperature water ethanol at the end may be mentioned as a preferable example.
  • the carotenoid content in the carotenoid-containing composition obtained by using the above production method and the main component content such as panaxanthin are determined under the conditions of the purification process (for example, the extraction solvent and the washing solution) so that the yield is maximized. Type) can be adjusted as appropriate.
  • the carotenoid content in the carotenoid-containing composition of the present invention is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, 9 1% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, '97% or more is particularly preferable, and 98 ° / 0 or more is most preferable.
  • the astaxanthin content in the carotenoid is preferably 40% or more, more preferably 45% or more, still more preferably 46% or more, particularly preferably 47% or more, and 50% or more. Is more preferably 55% or more, and most preferably 60% or more.
  • a composition having a carotenoid content of 95% or more can be obtained.
  • the precipitate obtained by concentrating the extract is washed with acetone, whereby a composition having a high tenotide content of 90% or more can be obtained.
  • the production method of the present invention is a precipitate obtained by extracting from a microorganism culture or the like with at least one selected from the group consisting of lower alcohols, lower dialkyl ketones and ethers, and then concentrating the extract.
  • the product is washed with lower alcohols, hydrocarbon solvents, or a combination thereof.
  • Carotenoids can be obtained with high purity only by these extremely simple operations.
  • the method of the present invention 1) does not require complicated operations, 2) is inefficient in the state of a low concentration solution of 1% or less such as column purification or liquid-liquid extraction. This is a significant advantage from an industrial point of view in that no purification operation for purification is required.
  • 3) a high-purity carotenoid composition containing a high content of istaxanthin can be provided at low cost, and the potent rotenoid-containing composition obtained by the method of the present invention does not contain a halogen-based organic solvent. 4) Provide an excellent industrial production method in that the solvent used in each step can be easily recovered.
  • a food, pharmaceutical composition or cosmetic containing the carotenoid-containing composition of the present invention is also within the scope of the present invention.
  • Examples of the dosage form of a pharmaceutical containing a high purity carotenoid with a high content of austaxanthin produced by the production method of the present invention include powders, granules, pills, soft capsules, hard capsules, tablets, chewable tablets, fast disintegrating Tablets, syrups, solutions, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, adhesives, inhalants, injections, etc. These preparations are prepared according to conventional methods. However, since carotenoide is poorly soluble in water, it can be dissolved in non-hydrophilic organic solvents such as vegetable oils and animal oils, or emulsifiers, dispersants or surfactants.
  • Additives that can be used for formulation include animal and vegetable oils such as soybean oil, safflower oil, olive oil, germ oil, sunflower oil, beef tallow, sardine oil, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, Surfactants such as polyhydric alcohols such as sorbitol, sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, polyglycerin fatty acid esters, purified water, lactose, starch, crystalline cellulose, D-mannitol, lecithin, arabi gum, Examples include excipients such as sorbitol solution and sugar solution, other sweeteners, coloring agents, pH adjusting agents, and flavoring agents.
  • the liquid preparation may be dissolved or suspended in water or other suitable medium when taken. Tablets and granules may be coated by a known method.
  • Intravenous administration may be either intravenous infusion or porous administration.
  • the dosage and dosage are 1 mg to 3 g, preferably 3 mg to lg, more preferably 10 mg to 67 Omg per day for an adult. In terms of 1 kg body weight, they are 1 7 ⁇ g to 50 mg, 5 4 g to 17 mg, and 1 60 ⁇ g to l 2 mg, respectively.
  • the pharmaceutically effective amount, the administration method or administration means, and the administration period can be appropriately set by those skilled in the art according to the clinical state, sex, age, weight, etc. of the administration subject.
  • Examples of the form of food containing the high purity carotenoide with a high content of austaxanthin of the present invention include supplements (powder, granules, soft capsules, hard strength pushells, tablets, chewable tablets, quick-disintegrating tablets, syrups, liquids, etc.) , Beverages (tea, carbonated drinks, lactic acid drinks, sports drinks, etc.), confectionery (gummy, jelly, gum, chocolate, cookies, candy, etc.), oils, fats and oils (mayonnaise, dressing, butter, cream, margarine, etc.) ), Seasonings (ketchup, sauce, etc.), liquid foods, dairy products (milk, yogurt, cheese, etc.), breads, rice cakes (udon, soba, ramen, pasta,
  • Functional foods containing the high astaxanthin-rich carotenoid of the present invention include various nutrients, various vitamins (vitamin A, vitamin Bl, vitamin B2, vitamin B6, vitamin (:, Vitamin E, etc.), various minerals, dietary fiber, polyunsaturated fatty acids, other nutrients (Coenzyme Q10, carnitine, sesamin, ⁇ -lipoic acid, inositole, D-kaileunositol, pinitonore, phosphatidinole Serine, phosphatidinore DHA, phosphatidinoreinositol, taurine, darcosamine, chondroitin sulfate, S-adnosylmethionine, etc., dispersants, stabilizers such as emulsifiers, sweeteners, taste ingredients (queenic acid, malic acid, etc.), flavor, royal jelly, Propolis, agaritas, etc.
  • harps such as peppermint, bergamot, force montmeal, and lavender may be blended.
  • materials such as theanine, dehydroepiandosterone, and melatonin may be blended.
  • the cosmetics containing the high-pure carotenoid having a wastaxanthin content of the present invention include creams, emulsions, lotions, microemanoleo essences, bathing agents, etc., and fragrances may be mixed. .
  • carotenoid is used as a food or supplement, there is no particular limitation on the usage and dose, but it is 17 At g to 50 nig, preferably 54 ⁇ g to l 7 mg, more preferably in terms of 1 kg body weight.
  • an amount of 10 g to 5 g, preferably 10 ig to 2 g, more preferably 10 / g to lg per 100 g of cosmetic can be blended.
  • astaxanthin and carotenoide were quantified using fast liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC fast liquid chromatography
  • two Wa kosil-II SIL-100 ( ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were connected and used. Elution was performed by flowing 1.OmL / min of a mobile phase n-hexane-tetrahydrobrane-methanol mixture (40: 20: 1) at a constant temperature near room temperature.
  • 20 ⁇ L of a sample dissolved in tetrahydrofuran diluted 100-fold in the mobile phase was used as the injection volume, and the column eluent was detected at a wavelength of 470 nm.
  • astaxanthin (Cat. No. A9335) manufactured by Sigma was used as a standard for quantification. Astaxanthin concentration in the standard solution is set by the absorbance at 477 nm (A) of the standard solution. After measuring the area percentage% (B) of the astaxanthin peak when H'PLC analysis was performed under the conditions described above, the following formula was used.
  • Example 1 Production of high-purity carotenoid with a content of astaxanthin ⁇ 1 Step 1: Culture process of E-396 strain
  • Step 3 of this example About 80 g of the cooled concentrated solution obtained in Step 3 of this example was filtered under reduced pressure to obtain a precipitate cake containing carotenoid. 20 g of eta from the top of the cake After adding a sol and filtering and washing, it was dried under reduced pressure at 35 ° C. overnight to obtain 1.5 g of a dried precipitate. The contents of astaxanthin and carotenoide in the dried product were 38% and 64%, respectively.
  • Process 5 Ethanol containing 25% water, hexane washing process, and drying process
  • Example 1 To this dried product was added ethanol containing 37.5 g of ethanol recovered in Step 6 of Example 1 and 12.5 g of water, and 25% water-containing ethanol was added, and in accordance with Step 5 of Example 1. 20.5 g of 0.5% water-containing ethanol-washed and dried product was obtained. To the obtained 25% water-containing ethanol-washed dry product, 40 g of hexane recovered in Step 6 of Example 1 was added, and washing and drying were performed according to Step 5 of Example 1. 4 4 g was obtained.
  • Example 3 Production of high-purity carotenoide with high content of astaxanthin 2
  • the culture, extraction, concentration and precipitation steps of the bacterium are carried out in the same manner as in Step 1 to Step 3 of Example 1, and further in the step of Example 1.
  • Step 3 about 80 g of the cooled concentrated liquid obtained in step 3 was filtered under reduced pressure to obtain a precipitate cake containing carotenoid.
  • 20 g of ethanol was added from the top of the cake, and after filtration and washing, a portion of the cake was collected in order to examine the precipitation force rotenoid content.
  • the drying step was omitted, and 100 g of ethanol containing 25% water was added from the top of the cake, followed by filtration and washing.
  • This filtration washing cake was dried under reduced pressure at 35 ° C. overnight to obtain 1.5 g of a 25% water-containing ethanol washed dried product.
  • the contents of wastaxanthin and carotenoide in the vacuum dried product before washing with ethanol containing 25% water were 3% each.
  • the contents of wastaxanthin and carotenoide in the ethanol-dried dried product containing 25% water were 52% and 88%, respectively, while 8% and 64 '%.
  • 85 g of ethanol was recovered from about 1 ° 0 g (about 120 ml) of the filtrate obtained by the precipitate filtration performed in accordance with Step 4 of Example 1.
  • Example 3 9 kg of the distillate (ethanol) obtained in Example 3 was added to 1 g of the dry cells 31 used in Example 3, and carotenoid extraction and cell filtration according to Step 2 of Example 1 were performed. And 9 kg of extract was obtained.
  • the extract was concentrated under reduced pressure according to Step 3 of Example 1, and about 40 g of a cooled concentrate was obtained.
  • a precipitate was collected from the cooled concentrate according to Step 4 of Example 1. Further, the drying step was omitted in the same manner as in Example 3, and 37.5 g of the recovered ethanol obtained in Example 3 was mixed with 12.5 g of water. g was added over the precipitate cake and washed by filtration. This filter washing cake was dried under reduced pressure at 35 ° C.
  • the astaxanthin composition obtained in Example 1 was added to vegetable oil so as to be 5% by weight of margarine, and then stirred uniformly with an emulsifier, etc. Margarine was prepared by the method described above. This margarine had a light red color due to the presence of wastaxanthin compared to normal margarine.
  • Food example 2 Artificial salmon roe
  • Example 2 After adding 0.6% of the astaxanthin composition obtained in Example 1 to a 1% aqueous sodium alginate solution and dispersing with a homogenizer, 5. / 0 Dropped into salted calcium coagulation solution and molded into a spherical shape with a diameter of 5 mni. The appearance was close to nature, and it was very similar to Ikura in terms of shape, color, and taste.
  • Example 2 Using 1 part by weight of the tenoride-containing composition obtained in Example 1, 330 parts by weight of crystalline cellulose, 15 parts by weight of carmellose monocalcium, 10 parts by weight of hydroxypropyl cellulose and 60 parts by weight of purified water After blending and drying by a usual method, 10 parts by weight of magnesium stearate was added, and the mixture was beaten to obtain 100 mg tablets containing 20 mg of carotenoid-containing composition per tablet. .
  • the wastaxanthin-containing composition obtained in Example 1 was added to white petrolatum so as to be 10% by weight, and stirred uniformly with a fragrance and the like to prepare a cream by a usual method.
  • a medium consisting of glucose 2 g / L, meat extract 3 g / L, peptone I 0 g / L, sodium chloride 5 gZL 10 ml in a 18 mm diameter test tube 1 Steam sterilized at 21 ° C for 15 minutes. E-396 strain (FERM BP-4283) was inoculated with 1 platinum ear, and reciprocal shaking culture at 300 rpm was performed at 30 ° C for 6 days. 200 cultures (2 L) of this culture broth were centrifuged and then lyophilized to obtain dry cells containing 16 mg of astaxanthin in lg. Process 2: ASETON extraction process
  • Carotenoids including austaxanthin were extracted while stirring at 50 ° C for 1 hour. Next, the cells are removed by filtration, and the cell cake is further washed with acetone to give wastaxanthin 0.034% (w tZw t), carotenoid weight concentration 0.0.
  • Example 5 40 g of ethanol recovered in Step 6 of Example 5 was added to this dried product, and washing and drying were performed according to Step 5 of Example 5 to obtain 0.72 g of an ethanol-washed dried product.
  • the content of wastaxanthin and carotenoide in the vacuum-dried product before ethanol washing was 33% and 70%, respectively, while that of wastaxanthin and carotenoid in the ethanol-washed product was 46% and 97%, respectively. Met.
  • Example 7 Production of high-purity carotenoid with high content of astaxanthin 4
  • the culture, extraction, concentration and precipitation steps of the fungus are the same as steps 1 to 3 in Example 5.
  • Step 4 of Example 5 about 80 g of the cooled concentrated liquid obtained in Step 3 was filtered under reduced pressure to obtain a precipitate cake containing carotenoid. Further, 20 g of acetone was added from the top of the cake, and after filtering and washing, a portion of the cake was collected to examine the carotenoid content of the precipitate.
  • the drying step was omitted, and 80 g of ethanol was added from the top of the cake, followed by filtration and washing. This filter washing cake was dried under reduced pressure at 35 ° C.
  • acetone was recovered from about 100 g (about 120 ml) of the filtrate obtained by precipitation filtration performed in accordance with Step 4 of Example 5, and the process of Example 5 was performed. From about 80 g (about 100 mL) of the filtrate obtained in the ethanol washing step performed according to 5, 75 g of ethanol slightly mixed with acetone was recovered.
  • Example 1 1.1 kg of the distillate (acetone) obtained in Example 7 was added to 25 g of the dried cells used in Example IV, and carotenoid extraction and cells in accordance with Step 2 of Example 5 were performed. Filtration was performed to obtain 1.1 kg of an extract. The extract was concentrated under reduced pressure according to Step 3 of Example 5, and about 40 g of a cooled concentrate was obtained. A precipitate was collected from this cooled concentrated solution according to Step 4 of Example 5. Next, 10 g of the recovered acetone obtained in Example 7 was added from above the cake of the precipitate, washed by filtration, and the ethanol recovered in Example 7 without the drying step as in Example 7. 40 g was added and further filtered and washed. This filter washed cake was dried overnight at 35 ° C.
  • Example 9 Production of high-purity carotenoid having a high content of wastaxanthin 5 The same as in Example 5 except that acetone cleaning was performed instead of ethanol cleaning. The contents of astaxanthin and carotenoid were 45% and 91%, respectively.
  • the method of the present invention is a method using solidification / solid washing rather than liquid-liquid distribution.
  • a solvent that can be used safely and dissolves only at a concentration of 1% or less is used, a conventional method is used for liquid separation. While it is sometimes necessary to use a large amount of dilute liquid, and therefore, very large equipment is required and inefficient, the method of the present invention can be said to be small in scale.
  • Example 5 carotenoids were treated with about 1.8% (w tZw t) of the carotenoid suspension, while in Comparative Example 1, the carotenoid concentration was about 0.07. It was necessary to contact a 5 L aqueous layer with 3.7 L of a hexane solution with a low carotenoid concentration of% (wt / wt). From this point, the present invention is industrially more efficient than the method of Comparative Example 1. It became clear.
  • the total volume of aceton and petanol used in Example 5 was 2.925 L, while that used in Comparative Example 1 was aceton, hexane, and hexane.
  • the total volume of 1% saline was 8.725 L, and the amount of process liquid handled was about three times as large. Therefore, it was revealed that the method of the present invention is industrially more efficient.
  • the astaxanthin composition obtained in Example 5 was added to vegetable oil so as to be 5% by weight of margarine, and then stirred uniformly with an emulsifier. Margarine was prepared by the method. This margarine had a light red color due to the presence of wastaxanthin compared to normal margarine.
  • Example 5 The astaxanthin composition obtained in Example 5 was added to a 1% sodium alginate aqueous solution at 0.6%, dispersed with a homogenizer, dropped into a 5% saline-calcium coagulation solution, and spherical with a diameter of 5 mm. Molded into. The appearance was close to nature and was very similar to icyra in terms of shape, color, and taste.
  • the composition containing forceps theotide obtained in Example 5 is 30 parts by weight of crystalline cellulose, 30 parts by weight of carmellose monocalcium, 15 parts by weight of hydroxypropyl cellulose, and 6 parts of purified water. After blending and drying by 0 parts by weight in a usual manner, 10 parts by weight of magnesium stearate is added, tableting is performed, and 20 mg of a carotenoid-containing composition is contained per tablet. 0 mg of formulation was obtained.
  • Example 5 Suspended in 1 part by weight of the tenoride-containing composition obtained in Example 5 in 5 parts by weight of soybean oil, mixed well to be homogeneous, and then filled into capsules by a capsule filling machine. About 300 mg of reddish brown capsules were obtained.
  • Example 5 The wastaxanthin-containing composition obtained in Example 5 was added to white petrolatum so as to be 10% by weight, stirred uniformly with a fragrance and the like, and the cream agent was added by a normal method. Produced. Industrial applicability
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Abstract

微生物の培養物、該培養物の濃縮物、又はこれらの乾燥物を低級アルコール類、水含有低級アルコール類、低級ジアルキルケトン類及びエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも１種で抽出した後、抽出液を濃縮して得られる沈殿物を低級アルコール類、水含有低級アルコール類、炭化水素系溶媒類及び低級ジアルキルケトン類からなる群から選ばれる少なくとも１種で洗浄することを特徴とするカロテノイド含量が８０％以上の組成物の製造方法、並びに該カロテノイド含有組成物を含有する食品、医薬組成物、又は化粧品。

Description

. カロテノイドの製造方法 技術分野
本発明は、 カロテノイドの製造方法に関し、 特に、 食品、 医薬組成物、 又は 化粧品の成分として用いるァスタキサンチンの工業的に適した製造方法に関す る。 また、 本発明は、 上記方法で得られるカロテノイド含有組成物、 さらには 明
該カロテノィド含有組成物を含有する食品、医薬組成物、又は化粧品に関する。
田 背景技術
カロテノィドは自然界に広く存在する天然色素であり、 黄色から赤色又は紫 色に及ぶポリェン色素である。 ァスタキサンチンは天然に見出されるカロテノ イドの 1種であり、 遊離の状態あるいはエステルとして存在するほか、 タンパ ク質と結合して種々の色素タンパク質として存在する。
ァスタキサンチンは、 魚類、 鶏卵の色揚げ剤として広く使用されている。 ま た、 食品添加物としても認められており、 油脂加工食品、 タンパク質性食品、 水性液状食品などに幅広く使用されている。 さらに、 フリーラジカルによって 誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、 α—トコフェロールの数百倍に 達する一重項酸素消去作用などから、 ァスタキサンチンは、 その強力な抗酸化 活性を生かした機能性食品、 化粧品、 又は医薬品としての用途が期待されてい る。
ァスタキサンチンは、 サケ、 マス、 マダイ等の魚類、 力-、 ェビ、 ォキアミ 等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、 ァグロバクテリウム属、 ブレビ パクテリゥム属、 パラコッカス属に属する細菌類、 へマトコッカス属緑藻類、 ファフィァ属酵母類等の微生物によっても生産されている。 ァスタキサンチン ゃゼアキサンチン等のカロテノィドは、 化学合成法により工業的に生産されて いるが、 安全面の不安から天然物由来のものが求められている。 こうした背景から特に、 大量生産に適していると考えられている藻類ゃ微生 物由来のァスタキサンチンを含有するカロテノィド類の製造方法が数多く報告 されている。
例えば、 へマトコッカス藻類の場合、 培養後の藻類のシスト細胞を熱ァセト ン処理し、 夾雑物であるクロロフィルを溶出させた後、 該シス ト細胞をスプレ 一ドライし、 得られた乾燥細胞からエタノールでカロテノィドを抽出する方法
(文献 1 ) などが報告されている。 しかし、 このような製造方法で得られる組 成物には、 まだ多くの生体由来の夾雑物が多く含まれており、 1 ) カロテノィ ドの含量、 2 ) ァスタキサンチンの含量、 等の点で満足のいくものではない。 ァスタキサンチン高含量の組成物を得るために、 上述の方法に準じて得た粗 キサントフィルを、 水存在下でリパーゼを作用させて夾雑物のひとつである中 性脂質を分解し、 そのリパーゼ酵素処理液を油水分離し、 次いで分取した油層 から遊離脂肪酸を蒸留にてァスタキサンチンと分離して濃縮精製する方法 （文 献 2 ) などが報告されている。 しかし、 このような複雑な処理工程を施しても ァスタキサンチン含量として 3 0 %を超えたものが得られていない。 また、 超臨界流体抽出法を用いて 0 . 5〜6 0 %含量のァスタキサンチンを 得る方法 （文献 3 ) も報告されているが、 必ず同時に副生産される目的含量未 満のァスタキンサンチン分画は、 廃棄するか含量を上げるために別のさらなる 濃縮操作が必要となる。 したがって、 本製造方法も簡便性と経済性の点で生体 由来の夾雑物が少ないァスタキサンチンを高含量に含む高純度カロテノィドを 製造する工業的方法として満足できるものではない。 また、 ファフィァ属酵母を用いる方法として、 該酵母の破碎菌体を有機溶媒 で抽出し、 抽出液を濃縮して得られた油状の粗抽出エキスをイオン交換クロマ トグラフィー、 吸着クロマトグラフィ一等の精製を行ってァスタキサンチンを 得る方法 （文献 4) が報告されているが、 低濃度のァスタキサンチンの粗液を 複数のカラムクロマトグラフィーにて精製を行うといった非工業的な方法で行 つている。 また、別の方法として、ファフィァ属酵母培養後の菌体をアセトンで抽出し、 得られた抽出液を濃縮して得られる粗油状物に炭化水素系溶剤を加えて晶析さ せる製造方法 （文献 5) が報告されている。 この製造方法は簡便性が高いが、 得られる組成物はカロテノィド含量が 70〜 73%程度 （ァスタキサンチン含 量としては 36〜42%) しかなく、 生体由来の夾雑物の少ない髙純度カロテ ノィドの製造方法として満足できるものではないことに加え、 カロテノィド中 にァセトン及び炭化水素系溶剤が残留することが危惧される点でも満足できる ものではない。
一方、 ァスタキサンチン、 アドニキサンチンなどの生産菌株である E— 39 6株 （FERM BP— 4283 ： 1993年 4月 27日付 （原寄託日） 、 独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) ) においては、安全面から、食品の製造では使 用することが危惧される環状親水性有機化合物と菌体を接触させて抽出する方 法 （文献 6) 、 あるいは文献 3と同様に超臨界流体抽出を用いた方法 （文献 7) が報告されている。 さらに、 E— 396株を水溶性有機溶媒、 非極性溶媒及び 水と接触させ、 液液抽出を行う方法 （文献 8) が報告されている。
こうした状況から、 特殊な設備や複雑な操作などを必要としない簡便な方法 であって、 食品製造に安全な溶剤によってァスタキサンチンを高含量で含む高 純度カロテノィドを工業的に製造する方法の確立が切望されていた。 参照文献
文献 1 ：特開平 1 1— 56346号公報
文献 2 ：特開 2002— 218994号公報
文献 3 :特開 2004— 41 147号公報 文献 4 特開平 1 0 - 2 7 6 7 2 1号公報
文献 5 特開 2 0 0 4— 2 0 8 5 0 4号公報
文献 6 特開平 7— 2 4 2 6 2 1号公報
文献 7 特開平 8— 8 9 2 8 0号公報
文献 8 特開平 8— 2 5 3 6 9 5号公報
発明の開示
本発明は、 高純度、 安価かつ安全な溶剤を使用したカロテノイド高含有組成 物及びその工業的な製造方法を提供し、 さらには該組成物を含有する機能性食 品、 医薬組成物、 又は化粧品を提供することを目的とする。 本発明者は、 上記課題を解決するために微生物培養物に注目して研究した結 果、 従来技術である液液抽出法で高純度カロテノイドを得ようとしても、 1 ) 取り扱う工程に用いる溶液が多くなる点で、 従来の低濃度溶液の状態での高純 度化精製を行う技術と同様に工業的には非効率であり、 2 ) 混合有機溶媒から の分画操作を加えた溶媒回収が必要なことからも簡便性が低い、 3 ) 使用する 溶剤が製品中に残留し安全性が低いとの課題を新たに見出した。 これらの課題 の解決も含めてさらに鋭意研究を重ねた結果、 カロテノィドを含有する微生物 培養物、その濃縮物あるいはこれらの乾燥物を低級アルコール類で抽出した後、 抽出液を濃縮して得られる沈殿物を水含有低級アルコール類又は水含有低級ァ ルコール類と炭化水素系溶媒類の組み合わせで洗浄することにより、 高純度の カロテノィド組成物が得られることを見出し、 本発明を完成するに至った。 また、 微生物培養物を低級ジアルキルケトン類及びエーテル類の少なくとも 一方で抽出した後、 抽出液を濃縮して得られる沈殿物を低級アルコール類及び 低級ジアルキルケトン類の少なくとも 1種又はそれらの混合液で洗浄すること により、 高純度のカロテノイド組成物が得られることを見出し、 本発明を完成 するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下の構成を有する。 . '
(1) 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物を低級アルコ ール類、 水含有低級アルコール類、 低級ジアルキルケトン類及ぴエーテル類か らなる群から選ばれる少なくとも 1種で抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物を低級アルコール類、 水含有低級アルコール類、 炭化水素系溶媒 類及ぴ低級ジアルキルケトン類からなる群から選ばれる少なくとも 1種で洗浄 する工程
(2) 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をエタノール 又はアセトンで抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物をエタノール、 水含有エタノール又はアセトンで洗浄する工程
(3) 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をエタノール で抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3 ) 沈殿物を水含有ェタノールで洗浄する工程
(4) 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をアセトンで 抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物をエタノールで洗浄する工程 (5) 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をアセトンで 抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物をエタノールで洗浄する工程
(6) 上記 （1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の製造方法の工程に、 さら に以下の 1工程を合む力口テノィド合有組成物の製造方法。
4) 工程 3) で得られた沈殿物をさらにへキサンで洗浄する工程
(7) カロテノイド含有組成物が、 カロテノイドを 80%以上含有する組成物 である （1) 〜 （6) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(8) カロテノイ ドが、 ァスタキサンチンを 40%以上含有するカロテノィ ド である （1) 〜 （7) のいずれか 1項に記載の製造方法。
(9) 微生物の 16 Sリボソーム RNAに対応する DNAの塩基配列が、 配列 番号 1に記載の塩基配列と実質的に相同のものである '（1) 〜 （8) のいず れか 1項に記載の製造方法。
(10) 微生物が、 E— 396株 （FERM BP— 4283) 又はその変異 株である （1) 〜 （9) のいずれか 1項に記載のカロテノイドの製造方法。
(1 1) 上記 （1) 〜 （10) のいずれか 1項に記載の製造方法で得られる力 口テノィドを含有する組成物。
(12) 上記 （1 1) に記載のカロテノィド含有組成物を含有する食品、 医薬 組成物、 又は化粧品。 本発明により、 天然物由来の高純度、 安価かつ安全なカロテノイド高含有組 成物及びその工業的な製造方法を提供し、 さらには該組成物を含有する機能性 食品、 医薬組成物、 又は化粧品を提供することができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本願発明について具体的に説明する。 本発明の範囲はこれらの説明に 拘束されることはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわな い範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願 2006-87223号及ぴ特願 2006-149794号明細書の全体を包含する。 また、 本明糸,田書において引用された 全ての刊行物、 例えば先行技術文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特許文 献は、 参照として本明細書に組み込まれる。 本発明は、 微生物の培養物等、 例えばカロテノイドを含有する微生物培養物 等を低級アルコール類、 水含有低級アルコール類、 低級ジアルキルケトン類及 ぴエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも 1種で抽出した後、 抽出液を 濃縮して得られる沈殿物を低級アルコール類、 水含有低級アルコール類、 炭化 水素系溶媒類、 及び低級ジアルキルケトン類からなる群から選ばれる少なくと も 1種で洗浄することを特徴とするカロテノィドの製造方法に関する。 本発明 の方法は、 生体由来の夾雑物が少なく、 且つ、 低級アルコール類以外の有機溶 媒含量が極めて少ないァスタキサンチンを含有するカロテノィド含量が 8 0 % 以上、好ましくはカロテノィド含量が 9 0 %以上の組成物を得ることができる。 本発明に用いることができる微生物としては、 カロテノィド類を生産する微 生物であれば何ら限定されないがノ ラコッカス細菌、へマトコッカス属藻類、 ファフィァ属酵母などを用いることができる。 特に増殖速度の速さ、 カロテノ ィド類の生産性から、 16 Sリポソーム RN Aに対応する DN Aの塩基配列が 配列表配列番号 1記載の塩基配列と実質的に相同である細菌が好ましい。 実質的に相同であるとは、 DNAの塩基配列決定のエラー頻度、 微生物にお ける自然変異等を考慮し、 配列が、 94%以上、 好ましくは 96%以上、 より 好ましくは 98 %以上の相同性を有することを意味する。 このような細菌の中 でも E— 396菌株 （FERM BP— 4283) が特に好ましい。 また、 こ れらの微生物を変異処理してカロテノィド生産性を向上させるために選択した カロテノィド高生産株を用いることも大変に好適な例として挙げられる。 なお、 E— 396菌株は、 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託 センターに以下の通り国際寄託されている。
国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
(旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所） 〒 305- 8566
茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 識別のための表示： E— 396
受託番号： FERM B P-4283
原寄託日 ：平成 5年 （1993年） 4月 27日 ここで、 変異処理する方法は、 突然変異を誘発するものであれば特に限定さ れない。 たとえば、 V_メチル一 一二トロー V—二トロソグァ二ジン （NT G)、 ェチルメタンスルホネート （EMS)、 などの変異剤による化学的方法、 紫外線照射、 X線照射などの物理的方法、 遺伝子組換え、 'トランスポゾンなど による生物学的方法などを用いることができる。 この変異処理は 1回でもよい し、 また、 例えばこの突然変異処理によりァスタキサンチン生産微生物の変異 体を得て、 これをさらに突然変異処理するというように 2回以上の変異処理を 行ってもよレヽ。 本発明に用いる微生物培養物等は、 上記微生物を効率良く培養できる方法、 例えば、 下記の培地を用いて、 液体培養、 固体培養、 又はそれらの組み合わせ によって培養する方法を用いることで得られる培養物であれば何ら限定されな レ、。 本発明に用いる微生物の培養に使用される栄養培地としては、 生産菌の生育 に必要な炭素源、 窒素源及び無機塩を含む栄養培地であれば十分であるが、 ビ タミン類を添加するとさらに好ましい場合がある。 また、 さらにアミノ酸、 核 酸塩基等を添加すると好ましい場合もある。 その他として、 酵母エキス、 ぺプ トン、 肉エキス、 麦芽エキス、 コーンスチープリカー、 乾燥酵母、 大豆粕等を 適宜添加しても良い。 炭素源としてはグルコース、 シユークロース、 ラク トース、 フルク トース、 トレノヽロース、 マンノース、 マンニトール、 マノレトース等の糠類、 酢酸、 フマ ル酸、 クェン酸、 プロピオン酸、 リンゴ酸、マロン酸、 ピルビン酸等の有機酸、 エタノーノレ、 プロパノーノレ、 プタノ一ノレ、 ペンタノ一ノレ、 へキサノーノレ、 イソ ブタノール、 ク"リセノ一ル等のアルコ一ル類、 大豆油、 ヌカ油、 オリーブ油、 トウモロコシ油、 ゴマ油、 アマ二油等の油脂類などが挙げられ、 1種又は 2種 以上の炭素源を用いることができる。 添加割合は炭素源の種類により異なり適 宜調整すれば足りるが、 通常、 培地 1 L当たり 1〜1 0 0 g、 好ましくは 2〜 5 0 gである。
窒素源としては、 例えば硝酸カリウム、 硝酸アンモニゥム、 硫酸アンモ-ゥ ム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 アンモニア、 尿素等の 1種又は 2種以上が用いられる。 添加割合は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば 足りるが、 通常、 培地 1 Lに対し 0 . 1 g〜3 0 g、 好ましくは 1〜1 0 gで ある。 無機塩としてはリン酸二水素カリウム、 リン酸水素二カリウム、 リン酸水素 ニナトリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化マグネシウム、 硫酸鉄、 塩化鉄、 硫酸 マンガン、 塩化マンガン、 硫酸亜鉛、 塩化鉛、 硫酸銅、 塩化カルシウム、 炭酸 カルシウム、 炭酸ナトリウム等の 1種又は 2種以上が用いられる。 添加割合は 無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地 1 Lに対し 0 . 0 0 1〜 1 0 gである。 ビタミン類を加える場合における量としては、 添加割合はビタミン類の種類 により異なり適宜調整すれば足りるが、 通常、 培地 1 Lに対し 0 . 1〜 1 0 0 O m gで、 好ましくは：！〜 1 0 O m gである。 アミノ酸、 核酸塩基、 酵母エキス、 ペプトン、 肉エキス、 麦芽エキス、 コー ンスチープリカー、 乾燥酵母、 大豆粕等の添加割合は、 物質の種類により異な り適宜調整すれば足りるが、 通常、 培地 1 Lに対し 0 . 2 .g〜 2 0◦ g、 好ま しくは 3〜： L O O gである。
培地の p Hは 2〜 1 2、 好ましくは 6〜 9に調整する。 培養条件は 1 5〜 8 0 °C、 好ましくは 2 0〜 3 5 °Cの温度であり、 通常 1日〜 2 0日間、 好ましく は 2〜8日間、 好気条件で培養を行う。 好気条件としては、 例えば、 振とう培 養又は通気撹拌培養等が挙げられる。 本発明に用いる培養微生物が産生したァスタキサンチンを抽出するに際して は、 培養後、 培養液を膜濾過濃縮で得られる菌体濃縮液もしくは、 遠心分離、 加圧もしくは減圧濾過などの一般的に知られている濾過方法で得られる湿菌体 を嘖霧乾燥、 流動乾燥、 回転式ドラム乾燥もしくは凍結乾燥など一般的に知ら れている乾燥方法によって得られる乾燥菌体を以下の抽出に供する方法がより 好適な例としてあげられる。 また、 以下の抽出を行う前に、 培養液、 菌体濃縮 液、 湿菌体もしくは乾燥菌体の段階において、 アルカリ試薬や界面活性剤など を用いた化学的処理、 溶菌酵素や脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素などを 用いた生化学的処理、 又は超音波もしくは粉碎などの物理的処理のうち 1つ又 は 2つ以上の処理を行うことも良い。 尚、 該乾燥菌体とした場合にはその 1 g 中には、 通常、 約 2 Omg程度のァスタキサンチンが含有されていると考えら れる。 本発明に用いる培養微生物 （微生物の培養物） 、 培養物の濃縮物、 又はこれ らの乾燥物 （本明細書において 「培養微生物等」 又は 「微生物培養物等」 とも いう）からの抽出に用いる溶媒（以下、抽出溶媒ということがある） としては、 低級アルコール類、 低級ジアルキルケトン類及ぴエーテル類からなる群から選 ばれるレ、ずれか 1種又はこれらの組合せが挙げられる。 低級アルコール類は、 メタノール、 エタノール、 n—プロパノール、 イソプ ロパノールが好ましく、 エタノール、 ィソプロパノールがより好ましく、 エタ ノールが特に好ましい。
抽出時の溶媒の温度は、 0°Cから使用する溶媒の沸点までが好ましく、 さら に好ましくは使用する溶媒の沸点から 20 °C程度低い温度付近が良い。 ェタノ ールの場合は、 25°C〜60°Cが好ましく、 40°C〜55°Cがより好ましく、 45°C〜52°Cがさらに望ましい。 抽出溶媒の量としては、 菌体中に含有され るァスタキサンチン量を溶解できる量であれば良く、 例えば乾燥菌体からエタ ノールを用いて抽出する場合は、 菌体に含まれるァスタキサンチン 1 gに対し て；！〜 90 k g、 好ましくは 6〜20 k gである。
例えば、 前記した本発明に用いる培養微生物等から得た約 2 Omgのァスタ キサンチンを含む乾燥菌体 1 gからの抽出を 50°Cのエタノールで行う場合は、 70 g〜1800 g程度、 好ましくは 150 g〜700 g程度、 さらに好まし くは 250 g〜500 g程度の量のエタノールを用いると良い。 また、 抽出溶媒として低級ジアルキルケトン類又はエーテル類を用いるとき は、 例えばアセトン、 メチルェチノレケトン、 又はテトラヒ ドロフランが好まし く、 アセトン'、 又はテトラヒドロフランがより好ましく、 ァセ'トンが特に好ま しい。
抽出時の溶媒の温度は、 上記と同様、 o °cから使用する溶媒の沸点までが好 ましく、 さらに好ましくは使用する溶媒の沸点から 5 °C程度低い温度付近が良 い。 アセトンの場合は、 2 5 ° (：〜 5 5 °Cが好ましく、 4 0 °C〜5 5 °Cがより好 ましく、 4 5 °C〜5 2 °Cがさらに好ましい。 抽出溶媒の量としては、 菌体中に 含有されるァスタキサンチン量を溶解できる量であれば良く、 例えば乾燥菌体 からアセトンを用いて抽出する場合は、 菌体に含まれるァスタキサンチン 1 g に対して 0 . 2〜 1 8 k g、 好ましくは 0 . 9〜3 k gである。
例えば、 前記した本発明に用いる培養微生物等から得た約 2 O m gのァスタ キサンチンを含む乾燥菌体 1 gからの抽出を 5 0 °Cのアセトンで行う場合は、 7 g〜 1 8 0 g程度、 好ましくは 1 5 g〜 7 0 g程度、 さらに好ましくは 2 5 g〜5 0 g程度の量のァセトンを用いると良い。 抽出操作中においてカロテノィドの酸化を極力防止したい場合には、 窒素ガ スなどの不活性ガス雰囲気下で処理することができ、 また、 医薬品や食品で用 いられている酸化防止剤を選択して抽出溶媒に加えて処理してもよく、 あるい は、 これらの処理を組み合わせてもよい。 上記酸化防止剤は、 最終的にはカロテノィド糸且成物から除くことが好ましい が、 用いる酸化防止剤の種類によっては除去不要である。 また、 抽出時間については特に制限する必要はないが、 室温以上で抽出する 場合には熱分解による収量低下を少なくするためにも短時間処理が好ましい。 例えば、 5 0 °Cのエタノールで抽出する場合には、 1 2時間以内が好ましく、 8時間以内がより好ましく、 6時間以内がさらに好ましく、 4時間以内が特に 好ましく、 3時間以内が最も好ましい。 また、 5 0 °Cのアセトンで抽出する場 合には、 1 2'時間以内が好ましく、 6時間以内がより好ましく.、 3時間以内が さらに好ましく、 2時間以内が特に好ましく、 1時間以内が最も好ましい。 微生物培養物等を低級アルコール類で抽出して得られた抽出液の濃縮方法と しては、 加熱及ぴ 又は減圧濃縮が挙げられる。 また、 濃縮時にカロテノィド の酸化を極力防止するために窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で行つても良 い。 濃縮の程度としては、 得られる沈殿物の量と純度を考慮して適宜決定すれ ば良いが、 例えば、 抽出液の重量の 1 0倍〜 1 0 0 0倍濃縮で良く、 好ましく は 3 0倍〜 5 0 0倍、 さらに好ましくは 5 0倍〜 4 0 0倍、 特に好ましくは 1 0 0倍〜 2 0 0倍である。
培養微生物等を低級ジアルキルケトン類及びエーテル類の少なくとも一方で 抽出して得られた抽出液の濃縮方法としては、 上記と同様、 加熱及び/又は減 圧濃縮が挙げられる。 また、 濃縮時にカロテノイ ドの酸化を極力防止するため に窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で行っても良い。 濃縮の程度としては、 得られる沈殿物の量と純度を考慮して適宜決定すれば良いが、 例えば、 抽出液 の重量の 3倍〜 1 0 0倍濃縮で良く、 好ましくは 7倍〜 5 0倍、 さらに好まし くは 1 5倍〜 4 0倍、 特に好ましくは 2 0倍〜 3 0倍である。 また、 抽出液の濃縮で得られた留去液は、 そのまま培養微生物等からの抽出 に再利用することができる。
濃縮後に得られる濃縮液を、 得られる沈殿物の量と純度を考慮して適宜冷却 して、 さらに沈殿を促進させても良い。 このときの冷却温度は、 例えば、 抽出 時の温度より 2 0 °C以上低い温度、 或いは 5 °C、 0 °C、 一 5 ° (：、 一 1 0 °Cなど である。 或いは、 濃縮を沈殿物が生成する直前で停止した後、 該濃縮液を、 得 られる沈殿物の量と純度を考慮して適宜冷却して、 沈殿物を得る方法が好まし い態様もある。 冷却温度は上記と同様である。 この際、 沈殿物の生成を円滑に 行う目的で種沈殿 （沈殿を引き起こす種となる物質、 例えばカロテノイド結晶 等のカロテノイド固体） を添加してもよい。 沈殿物は、 減圧式もしくは加圧式の濾過器もしくは遠心分離機などを用いて 採集する。 この時、 必要に応じて抽出溶媒と同じ溶媒を少量用いて、 採集した 沈殿物を洗浄しても良い。また、カロテノィドの酸化を極力防止したい場合は、 窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気下で行っても良い。 さらに、 これ以降で実施 する高純度化のために行う沈殿物の洗浄で使用する溶媒に、 該洗浄溶媒を複数 回回収して再利用することを考慮すると、 抽出で使用した溶媒がなるべく残留 しない様な条件で沈殿物を採集する工夫を行うことが好ましい。 また、 沈殿物を採集する時に発生する生体由来夾雑物を含んだ濾液から蒸留 や減圧留去などの方法を用いて溶媒を回収し、 再度培養微生物等からの抽出及 ぴ沈殿物の洗浄に再利用することができる。 得られた沈殿物から高純度力口テノィドを得るために以下の洗浄を行うにあ たっては、 そのまま未乾燥物を洗浄に供してもよく、 一旦乾燥させたものを供 してもよい。 また、 沈殿物の粉碎も特に必要としないが、 洗浄効率を上げるた めに粉辟したものを供してもよく、 洗浄中に粉碎を加えてもよい。 洗浄は、 以 下に記載の溶媒を使用することが重要であり、 詳細な洗浄条件は得られた沈殿 物の純度に応じて適宜決定すれば良い。 洗浄に用いる溶媒としては、 低級アルコール類、 水含有低級アルコール類、 炭化水素系溶媒類、 低級ジアルキルケトン類のいずれか 1種、 又はこれらの組 合せが挙げられる。 本発明の方法において、 微生物培養物等から低級アルコールにより抽出を行 つたときは、 洗浄工程は水含有低級アルコール類又は水含有低級アルコール類 と炭化水素系溶媒類の組み合わせを用いることが好ましい。 また、 微生物培養 物等から低級ジアルキルケトン類及びエーテル類の少なくとも一方で抽出した ときは、 該抽出液を濃縮して得られる沈殿物を低級アルコール類 （例えば炭素 数 1〜 3のアルコール含有溶媒） 又は低級ジアルキルケトン類 （例えば炭素数 3〜 6のケトン含有溶媒） で洗浄することが好ましい。 低級アルコール類としては、 メタノール、 エタノール、 n—プロパノール、 又はィソプロパノール等の炭素数 1〜 3のアルコールが挙げられるが、 ェタノ ール、 又はイソプロパノールが好ましく、 エタノールが特に好ましい。 また、 水含有低級アルコール類を使用するときは、 低級アルコールに含まれる水は 5 一 9 5 %が好ましく、 1 0— 5 0 %がより好ましく、 2 0— 4 0 %が特に好ま しい。 低級ジアルキルケトン類としては、 ァセトン、 メチルェチルケトン、 ジェチ ルケトン、 又はメチルイソブチルケトン等の炭素数 3〜 6のケトンが上げられ るが、 アセトン、 又はメチルェチルケトンが好ましく、 ァセトンが特に好まし い。
また、 洗浄力を落とさない程度に水もしくは他の有機溶媒を含有させた混合 溶媒で洗浄することも好ましい一態様である。 さらに、本発明においては、洗浄工程で得られた沈殿物をさらに炭化水素系溶' 媒で洗浄する工程を含めることができる。 炭化水素類としては、 ペンタン、 へキサン、 シク口へキサン、 又はへプタン 等の炭素数 5— 7のアルキルが挙げられるが、 へキサン、 又はへプタンが好ま しく、 へキサンが特に好ましい。 本発明において、 水含有低級アルコ一ル類と炭化水素系溶媒類の組み合わせ とは、 水含有低級アルコール類 （例えば水含有エタノール） と炭化水素系溶媒 類 （例えばへキサン） とを混合して用いること、 あるいは、 水含有低級アルコ ール類（例えば水含有エタノール）で洗浄した後、続いて炭化水素系溶媒類（例 えばへキサン) で洗浄することをいうが、 洗浄効率の点から後者のほうが好ま しい。
また、 洗浄力を落とさない程度に他の有機溶媒を含有させた混合溶媒で洗浄 することも好ましい一態様であるが、 得られるカロテノィドを含有する組成物 中の残留量を考慮しなければならない。 洗浄に用いる溶媒の下限量としては、 沈殿物の純度を考慮しながら工業的に 耐え得る程度に少量の量を選択することが好ましく、 例えば、 2 5 %水含有ェ タノールを用いる場合、 乾燥された沈殿物を洗浄する時はその重量に対して； また、 未乾燥の沈殿物を洗浄する時は、 未乾燥物の容量又は重量と乾燥された 沈殿物との相関関係を予め検討して設定することができる換算係数を用いて算 出された乾燥物重量に対して； 2倍量以上あれば良いが、 好ましくは 4倍量以 上、 より好ましくは 6倍量以上、 さらに好ましくは 1 0倍量以上が好ましく、 必要に応じて 2 0倍量以上を用いてもよい。 また、 上限量としては最大でも 2 0 0倍量あれば十分であり、 特に工業的な 効率性の観点から 1◦ 0倍量以下が好ましく、 8 0倍量以下がより好ましく、 4 0倍量以下がさらに好ましく、 条件を詳細に設定すれば 2 0倍量以下、 場合 によっては 1 0倍量程度で十分である。 また、 洗浄に例えばへキサン又はアセトンを用いる場合、 乾燥された沈殿物 を洗浄するときはその重量に対して；また、未乾燥の沈殿物を洗浄するときは、 未乾燥物の容量又は重量と乾燥された沈殿物との相関関係を予め検討して設定 することができる設定した換算係数を用いて算出された乾燥物重量に対して； 3 0倍量以上あれば良いが、 好ましくは 3 5倍量以上、 より好ましくは 4 0倍 量以上で、 必要に応じて 4 0倍量以上を用いても良い。 また、 上限量としては 最大でも 2 0 0倍量あれば十分であり、 特に工業的な効率性の観点から 1 0 0 倍量以下が好ましく、 8 0倍量以下がより好ましく、 6 0倍量以下がさらに好 ましく、 条件を詳細に設定すれば 5 0倍量以下程度で十分である。 洗浄の手法は何ら限定されないが、 例えば、 懸濁攪拌後に濾取する方法もし くは沈殿物の上から通液する方法等が実用的に好ましい方法として挙げられる, 洗浄時の温度は、 通常、 1 °C〜 3 0 °Cが好ましいが、 状況に応じて 1 °C以下や 3 0 °C以上の温度としても良い。 但し上限温度としては、 洗浄に用いる溶媒の 沸点付近 （例えば、 エタノールでは 7 8 °C、 アセトンでは 5 6 °C) が挙げられ る。 また、 カロテノイ ドの酸化を極力防止したい場合は、 窒素ガスなどの不活 性ガス雰囲気下で行っても良い。 さらに、 沈殿物から高純度カロティドを得るための洗浄で発生する廃液から 蒸留や減圧留去などの方法で使用した溶媒を回収し、 得られた溶媒を、 洗浄ェ 程に再利用することができる。 さらに、 洗浄、 乾燥後の本発明のカロテノイド含有組成物中における残存溶 媒量を低減することを目的として、 洗浄の最後に水で溶媒置換的に洗浄するェ 程などを必要に応じて加えることも大変に好ましい方法である。 例えば、 少量 の低温の水ゃェタノールで洗浄する工程を最後に加える方法などが好ましい一 例として挙げられる。 上記の製造方法を用いて得られるカロテノィド含有組成物におけるカロテノ イド含量、 及ぴァスタキサンチン等の主成分含量は、 収量が最大となる様に上 記精製工程の条件 （例えば抽出溶媒及び洗浄液の種類） を適宜調整することが できる。 本発明のカロテノィ ド含有組成物におけるカロテノ ド含量としては、 8 0 % 以上が好ましく、 8 5 %以上がより好ましく、 9 0 %以上がさらに好ましく、 9 1 %以上がさらに好ましく、 9 5 %以上がさらに好ましく、' 9 7 %以上が特 に好ましく、 9 8 °/0以上が最も好ましい。 また、 該カロテノイ ド中におけるァ スタキサンチン含量としては、 4 0 %以上が好ましく、 4 5 %以上がより好ま しく、 4 6 %以上がさらに好ましく、 4 7 %以上が特に好ましく、 5 0 %以上 がさらに好ましく、 5 5 %以上が特に好ましく、 6 0 %以上が最も好ましい。 具体的には、 例えば、 微生物培養物等をアセトンで抽出した後、 抽出液を濃 縮して得られる沈殿物をエタノールで洗浄することにより、 カロテノィド含量 として 9 5 %以上の組成物が得られ、 又、 微生物培養物等をアセトンで抽出し た後、 抽出液を濃縮して得られる沈殿物をアセトンで洗浄することにより、 力 口テノィド含量として 9 0 %以上の組成物が得られる。 本発明の製造方法は、 上記の通り、 微生物培養物等から低級アルコール類、 低級ジアルキルケトン類及びエーテル類からなる群から選ばれる少なくとも 1 種で抽出後、 該抽出液を濃縮して得られる沈殿物を低級アルコール類、 炭化水 素系溶媒類、 又はこれらの組み合わせで洗浄することを特徴とする。
これらの極めて簡便な操作のみにより、 カロテノィドを高純度で得ることが できる。 本発明の方法は、 従来技術に比較して、 1 ) 複雑な操作を必要としない点、 2 ) カラム精製や液液抽出のような 1 %以下の低濃度溶液の状態での非効率な 高純度化の精製操作を必要としない点において、 工業的な観点から著しく有利 である。 そして本発明の効果として、 3 ) ァスタキサンチンを高含量で含む高 純度カロテノィド組成物を安価に提供でき、 しかも本発明の方法で得られる力 ロテノイド含有組成物はハロゲン系有機溶媒を含有しない点、 4 ) 各工程で使 用した溶媒の回収が容易になる点で優れた工業的製造方法を提供するものであ る。 ' 本発明のカロテノイド含有組成物を含有する食品、 医薬組成物、 又は化粧品 も本発明の範囲内である。
本発明の製造方法により製造されるァスタキサンチン高含量の高純度カロテ ノイドを含有する医薬品の剤型としては、 散剤、 顆粒剤、 丸剤、 ソフトカプセ ル、ハードカプセル、錠剤、チユアブル錠、速崩錠、 シロップ、液剤、懸濁剤、 座剤、 軟膏、 クリーム剤、 ゲル剤、 粘付剤、 吸入剤、 注射剤等が挙げられる。 これらの製剤は常法に従って調製されるが、 カロテノィドは水に難溶性である ため、 植物性油、 動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、 乳化剤、 分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー） を用いて水溶液中に分散、 乳化させて用いる。 更に、 カロテノイ ドの吸収性を 高めるために、 平均粒子系を 1 ミクロン程度まで微粉碎し用いることも可能で ある。 製剤化のために用いることができる添加剤としては、 例えば大豆油、 サフラ 一油、 ォリーブ油、 胚芽油、 ひまわり油、 牛脂、 いわし油等の動植物性油、 ポ リエチレングリコール、 プロピレングリコール、 グリセリン、 ソルビトール等 の多価アルコール、 ソルビタン脂肪酸エステル、 ショ糖脂肪酸エステル、 グリ セリン脂肪酸エステル、 ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、 精製 水、 乳糖、 デンプン、 結晶セルロース、 D—マンニトール、 レシチン、 ァラビ ァガム、 ソルビトール液、 糖液等の賦形剤、 その他甘味料、 着色料、 p H調整 剤、 香料などをあげることができる。 尚、 液体製剤は、 服用時に水又は他の適 当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。 また、 錠剤、 顆粒剤は周知の 方法でコーティングしても良い。
注射剤の形で投与する場合としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、 関節内、 滑液嚢内、 胞膜内、 骨膜内、 舌下、 口腔内等に投与することが好まし く、 特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましレ、。 静脈内投与は、 点滴投与、 ポ 一ラス投与のいずれであってもよい。 カロテノィドを医薬品として使用する場合、 用法及び用量として、 大人 1 日 あたり、 lmg〜3 g 、好ましくは 3mg 〜l g 、 より好ましくは 10mg ~67 Omgである。 体重 1 k g換算では、 それぞれ 1 7 ^ g〜50mg 、 5 4 g〜1 7mg 、 1 60 ^ g〜l 2mgとなる。上記用量で 1から数回に分 けて投与される。 伹し、 薬学的な有効量、 投与方法または投与手段および投与 期間は、 投与対象の臨床状態、 性別、 年齢、 体重などに応じて当業者により適 宜設定することができる。 本発明のァスタキサンチン高含量の高純度カロテノィドを含有する食品の形 態としては、 例えばサプリメント （散剤、 顆粒剤、 ソフトカプセル、 ハード力 プセル、 錠剤、 チユアブル錠、 速崩錠、 シロップ、 液剤等） 、 飲料 （お茶、 炭 酸飲料、 乳酸飲料、 スポーツ飲料等） 、 菓子 （グミ、 ゼリー、 ガム、 チョコレ ート、 クッキー、 キャンデー等） 、 油、 油脂食品 （マヨネーズ、 ドレッシング、 バター、 クリーム、 マーガリン等) 、 調味料 (ケチャップ、 ソース等) 、 流動 食、 乳製品 （牛乳、 ヨーグルト、 チーズ等） 、 パン類、 麵類 （うどん、 そば、 ラーメン、 パスタ、 やきそば、 きしめん、 そ一めん、 ひやむぎ、 ビーフン等） 等が挙げられる。 本発明のァスタキサンチン高含量の髙純度カロテノィドを含有する機能性食 品としては、 必要に応じて各種栄養素、 各種ビタミン類 （ビタミン A、 ビタミ ン Bl、 ビタミン B2、 ビタミン B6、 ビタミン (：、 ビタミン E等） 、 各種ミネ ラル類、食物繊維、多価不飽和脂肪酸、その他の栄養素（コェンザィム Q 1 0、 カルニチン、セサミン、 α—リポ酸、イノシトーノレ、 D—カイロイノシトール、 ピニトーノレ、 ホスファチジノレセリン、 ホスファチジノレ DHA、 ホスファチジノレ イノシトール、 タウリン、 ダルコサミン、 コンドロイチン硫酸、 S—アドノシ ルメチォニン等） 、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クェン酸、 リンゴ酸等） 、 フレーバー、 ローヤルゼリー、 プロポリス、 ァガリタス等を配 合することができる。 また、 ペパーミント、 ベルガモッ ト、 力モンミール、 ラ ベンダーなどのハープ類を配合してもよい。 また、 テアニン、 デヒドロェピア ンドステロン、 メラトニンなどの素材を配合してもよい。 本発明のァスタキサンチン髙含量の高純度カロテノィドを含有する化粧料と しては、 クリーム、 乳液、 ローション、 マイクロエマノレジョンエッセンス、 入 浴剤などが挙げられ、 香料等を混合してもよい。 カロテノィドを食品又はサプリメントとして使用する場合、 用法及び用量と して特に限定されるものではないが、体重 1 k g換算で、 1 7 At g〜50nig 、 好ましくは 54 μ g〜l 7mg 、より好ましくは 1 60 g〜 1 2m gである。 また、 カロテノィドを化粧品として使用する場合、 化粧品 100 gあたり 1 0 g〜 5 g 、 好ましくは 10 i g〜2 g 、 より好ましくは 10 / g〜l g の量を配合することができる。 実施例
本発明を実施例、 参考例、 製剤例及び試験例に基づいて説明するが、 本発明 の範囲は以下の例に限定されることはない。
なお、 実施例及ぴ比較例におけるァスタキサンチン及びカロテノィドの定量 は髙速液体クロマトグラフィー （HPLC) を用いて行った。 カラムは Wa k o s i l— II S I L— 100 (φ 4. 6 X 250 mm) (和光純薬社製） を 2 本連結して使用した。 溶出は、 移動相である n—へキサンーテトラヒドロブラ ンーメタノール混合液 （40 : 20 : 1) を室温付近一定の温度にて毎分 1. OmL流すことで行った。 測定においては、 サンプルをテトラヒドロフランで 溶解したものを移動相にて 100倍希釈した液 20 μ Lを注入量とし、 カラム 溶離液の検出は波長 470 nmで行った。 また、 定量のための標準品としては シグマ社製ァスタキサンチン （C a t. No. A9335) を用いた。 標準液 のァスタキサンチン濃度の設定は、 標準液の 477 nmの吸光度 （A) 及ぴ上 記条件で H 'PLC分析を行つた時のァスタキサンチンピークの面積百分率％ (B) を測定した後に、 以下の式を用いて行った。
ァスタキサンチン濃度 （mgZL) =A÷ 2150XBX 100
[実施例 1] ァスタキサンチン髙含量の高純度カロテノィドの製造 1 工程 1 ： E— 396菌株の培養工程
グルコース 2 g/L、 肉エキス 3 g/L、 ペプトン 10 gZL、 塩化ナトリ ゥム 5 gZLの組成からなる培地 1 Om lを直径 18 mmの試験管に入れ、 1 21°C、 15分間蒸気殺菌した。 これに E— 396菌株 （FERM BP— 4 283) を 1白金耳植菌し 30°Cで 6日間、 300 r pmの往復振とう培養を 行った。 この培養液 200本分 （2L) を遠心分離した後凍結乾燥し、 l g中 に 16 mgのァスタキサンチンを含む乾燥菌体を得た。 工程 2 ：エタノール抽出工程
本実施例の工程 1で得られた乾燥菌体 62 gにエタノールを 18 k g加え、 50°Cにて 3時間攪拌しながらァスタキサンチンを含めたカロテノィドの抽出 'を行った。 次に、 濾過にて菌体を除き、 さらに菌体ケークをエタノールで洗浄 してァスタキサンチン 0· 0028% (wtZwt) 、 カロテノイド重量濃度 0. 0050% (w t /w t ) の抽出液 18 k gを得た。 工程 3 ：抽出液濃縮、 及び析出工程
本実施例の工程 2で得られた抽出液 18 k gを、 エバポレーターを用いて減 圧濃縮して沈殿物を含んだ濃縮液 （約 80 g) と留去液 （約 17 k gのェタノ ール） を得た。 この濃縮液を外温 5 °Cにて 1時間冷却しながら撹拌した。 工程 4 ：沈殿物濾取、 及び乾燥工程
本実施例の工程 3で得られた冷却された濃縮液約 80 gを減圧濾過してカロ テノィドを含んだ沈殿物のケークを得た。 さらにケークの上から 20 gのエタ ノールを加'えて滤過洗浄した後に、 一晩 35 °Cにて減圧乾燥'して 1. 5 gの沈 殿物の乾燥物を得た。 この乾燥物中のァスタキサンチン及びカロテノィドの含 量はそれぞれ 38 %と 64 %であった。 工程 5 ： 25%水含有エタノール、 へキサン洗浄工程、 及び乾燥工程
本実施例の工程 4で得られた沈殿物の乾燥物 1. 5 gに 100 gの 25 %水 含有エタノールを加え、 0. 96%相当のカロテノイドが懸濁した状態で室温 下 1時間攪拌洗浄を行った。得られた洗浄物を減圧濾過にて採取し、一晩 35°C にて減圧乾燥を行い、 25 %水含有エタノール洗浄乾燥物を 1. 02 g得た。 この 25 %水含有ェタノール洗浄乾燥物中のアスクキサンチン及ぴカ口テノィ ドの含量はそれぞれ 52 %と 88 %であった。
次に得られた 25 %水含有エタノール洗浄乾燥物 1. 02 gに 80 gのへキ サンを加え、 1. 1%相当のカロテノイドが懸濁した状態で室温下 1時間攪拌 洗浄を行った。 得られた洗浄物を減圧濾過にて採取し、 一晩 35°Cにて減圧乾 燥を行い、 へキサン洗浄乾燥物を 0. 88 g得た。 このへキサン洗浄乾燥物中 のァスタキサンチン及ぴカロテノィドの含量はそれぞれ 56%と 94%であつ た。 工程 6 ：減圧留去による溶媒の回収
工程 4で発生した濾液約 100 g (約 120 m L) から減圧留去により留去 液側に 80 gのエタノールを回収した。 また、 工程 5で発生するへキサン濾液 約 80 g (約 118mL) から減圧留去により留去液側に 74 gのへキサンを 回収した。
[実施例 2] 回収溶媒を用いたァスタキサンチン高含量の高純度カロテノィ ドの製造 1
実施例 1の工程 1で得られた乾燥菌体 31 gに実施例 1の工程 3で得られた 留去液 （エタノール） を 9 k g加え、 実施例 1の工程 2に準じたカロテノイド の抽出と菌体濾過を行い、 抽出液 9 k gを得た。 この抽出液を実施例 1の工程 3に準じて減圧濃縮した後、 冷却された濃縮液約 4 0 gを得た。 この冷却され た濃縮液から実施例 1の工程 4に準じて沈殿物を濾取した。 次に、 実施例 1の 工程 6で回収したエタノール 1 0 gを、 沈殿物のケークの上から加えて濾過洗 浄した後に、 乾燥を行い 0 . 7 5 gの乾燥物を得た。 この乾燥物に実施例 1の 工程 6で回収したエタノール 3 7 . 5 gと水 1 2 . 5 gを混和して作成した 2 5 %水含有エタノールを加えて実施例 1の工程 5に準じて行い 2 5 %水含有ェ タノール洗浄乾燥物 0 . 5 1 gを得た。 得られた 2 5 %水含有ェタノール洗浄 乾燥物に実施例 1の工程 6で回収したへキサン 4 0 g加えて実施例 1の工程 5 に準じて洗浄及び乾燥を行い、 へキサン洗浄乾燥物 0 . 4 4 gを得た。 2 5 % 水含有エタノールとへキサン洗浄前の減圧乾燥物のァスタキサンチン及び力口 テノイドの含量がそれぞれ 3 8 %と 6 4 %に対して、 2 5 %水含有ェタノール とへキサン洗浄乾燥物でのァスタキサンチン及ぴカロテノィドの含量がそれぞ れ 5 6 %と 9 4 %であつた。
以上のことより、 回収された溶媒の再利用は何ら支障がないことが確認でき た。
[実施例 3 ] ァスタキサンチン高含量の高純度カロテノィドの製造 2 菌の培養、 抽出、 並びに濃縮及び析出工程は、 実施例 1の工程 1〜工程 3と 同様に行い、 さらに実施例 1の工程 4に準じて、 工程 3で得られた冷却された 濃縮液約 8 0 gを減圧濾過してカロテノィドを含んだ沈殿物のケークを得た。 さらにケークの上から 2 0 gのエタノールを加えて濾過洗浄した後に沈殿物力 ロテノイド含量を調べるためにケークの一部を採取した。 次いで、 乾燥するェ 程を省略して、 ケークの上から 1 0 0 gの 2 5 %水含有エタノールを加えてさ らに濾過洗浄した。 この濾過洗浄ケークを一晩 3 5 °Cにて減圧乾燥し、 2 5 % 水含有ェタノール洗浄乾燥物を 1 . 5 g得た。 この 2 5 %水含有ェタノール洗 浄前の減圧乾燥物のァスタキサンチン及びカロテノィドの含量は、 それぞれ 3 8 %と 6 4'%であるのに対して、 2 5 %水含有エタノール洗浄乾燥物中のァス タキサンチン及びカロテノィドの含量はそれぞれ 5 2 %と 8 8 %であった。 また、 実施例 1の工程 4に準じて行われる沈殿物濾取で得られる滤液約 1◦ 0 g (約 1 2 0 m L ) から、 エタノール 8 5 gを回収した。
[実施例 4 ] 回収溶媒を用いたァスタキサンチン高含量の高純度力口テノィ ドの製造 2
実施例 3で用いた乾燥菌体 3 1 gに、 実施例 3で得られた留去液 （エタノー ル） を 9 k g加え、 実施例 1の工程 2に準じたカロテノイ ドの抽出と菌体濾過 を行い、 抽出液 9 k gを得た。 この抽出液を実施例 1の工程 3に準じて減圧濃 縮した後、 冷却された濃縮液約 4 0 gを得た。 この冷却された濃縮液から実施 例 1の工程 4に準じて沈殿物を濾取した。 さらに実施例 3と同様に乾燥するェ 程を省略し、 実施例 3で得られた回収エタノール 3 7 . 5 gと水 1 2 . 5 gを 混和して作成した 2 5 %水含有エタノール 5 0 gを、 沈殿物のケークの上から 加えて濾過洗浄した。 この濾過洗浄ケークをー晚 3 5 °Cにて減圧乾燥を行い 2 5 %水含有ェタノール洗浄乾燥物を 0 . 5 8 g得た。 2 5 %水含有ェタノール 洗浄前の減圧乾燥物のァスタキサンチン及びカロテノィドの含量はそれぞれ 3 8 %と 6 4 %であるのに対して、 2 5 %水含有ェタノール洗浄乾燥物中のァス タキサンチン及ぴカロテノィドの含量はそれぞれ 5 2 %と 8 8 %であった。 以上のことより、 実施例 4において減圧留去で回収されたエタノールを用い ても、 洗浄能力の低下は認められないことが確認できた。
[食品例 1 ] マーガリン
抗酸化剤及ぴ着色剤として、 実施例 1で得たァスタキサンチン組成物を、 マ ーガリンの 5重量％になるように植物油に添加した後、 乳化剤などとともに均 —になるよう攪拌し、 通常の方法によりマーガリンを作製した。 このマーガリ ンは、 通常のマーガリンと比較して、 ァスタキサンチンの存在により、 薄い赤 色を呈していた。 [食品例 2] 人工イクラ
実施例 1で得たァスタキサンチン組成物を、 1 %アルギン酸ナトリウム水溶 液に 0. 6%添加し、 ホモジナイザーで分散後、 5。/0塩ィ匕カルシウム凝固液に 滴下し、 直径 5mniの球状に成型した。 外観は自然に近く、 形状、 色調、 及ぴ味 の観点でィクラと酷似していた。
[製剤例 1] ァスタキサンチン含有錠剤
実施例 1で得た力口テノィド含有組成物 1 20重量部に対して結晶セルロー ス 330重量部、 カルメロース一カルシウム 1 5重量部、 ヒドロキシプロピル セルロース 1 0重量部及び精製水 60重量部を用いて通常の方法にて配合、 乾 燥した後、 1 0重量部のステアリン酸マグネシウムを添カ卩し、 打定を行い、 1 錠あたりカロテノィド含有組成物を 20 m g含有する 100 m gの錠剤を得た。
[製剤例 2] ァスタキサンチン含有ソフトカプセル ！ 実施例 1で得たカロテノィド含有組成物 1重量部に、 5倍重量部の大豆油に 懸濁し、 均質になる様に十分に混合した後、 カプセル充填機にてカプセル充填 し、 内容物約 300 m gの赤褐色状のカプセルを得た。
[化粧品例] ァスタキサンチン含有クリーム剤 （化粧品）
実施例 1で得たァスタキサンチン含有組成物を、 白色ワセリンに 10重量％ になるように添加し、 芳香剤などとともに、 均一になるように攪拌し、 通常の 方法によりクリーム剤を作製した。
[実施例 5] ァスタキサンチン高含量の高純度カロテノィドの製造 3 工程 1 ： E— 396菌株の培養工程
グルコース 2 g/L、 肉エキス 3 g/L、 ペプトン I 0 g/L、 塩化ナトリ ゥム 5 gZLの組成からなる培地 1 0m lを直径 18 mmの試験管に入れ、 1 21°C、 15分間蒸気殺菌した。 これに E— 396菌株 （FERM BP— 4 283) を 1白金耳植菌し 30°Cで 6日間、 300 r pmの往復振とう培養を 行った。 この培養液 200本分 （2 L) を遠心分離した後凍結乾燥し、 l g中 に 16 mgのァスタキサンチンを含む乾燥菌体を得た。 工程 2 ： ァセトン抽出工程
本実施例の工程 1で得られた乾燥菌体 50 gにアセトンを 2. 2 k g加え、
50°Cにて 1時間攪拌しながらァスタキサンチンを含めたカロテノィドの抽出 を行った。 次に、 濾過にて菌体を除き、 さらに菌体ケークをアセトンで洗浄し てァスタキサンチン 0. 034% (w tZw t )、 カロテノイド重量濃度 0. 0
77 % (w t /w t) の抽出液 2. 3 k gを得た。 工程 3 ：抽出液濃縮、 及び析出工程
本実施例の工程 2で得られた抽出液 2. 3 k gを、 エバポレーターを用いて 減圧濃縮して沈殿物を含んだ濃縮液 （約 80 g) と留去液 （約 2 k gのァセト ン） を得た。 この濃縮液を外温 5 °Cにて 1時間冷却しながら撹拌した。 工程 4 ：沈殿物濾取、 及び乾燥工程
本実施例の工程 3で得られた冷却された濃縮液約 80 gを減圧濾過してカロ テノィドを含んだ沈殿物のケ一クを得た。 さらにケ一クの上から 20 gのァセ トンを加えて濾過洗浄した後に、 ー晚 35 °Cにて減圧乾燥して 2. 13 gの沈 殿物の乾燥物を得た。 この乾燥物中のァスタキサンチン及ぴカロテノィドの含 量はそれぞれ 34 %と 71 %であった。 工程 5 ：エタノール洗浄工程、 及び乾燥工程
本実施例の工程 4で得られた沈殿物の乾燥物 2. 13 gに 80 gのエタノ一 ルを加え、 1. 8 %相当のカロテノィドが懸濁した状態で室温下 1時間攪拌洗 浄を行った。 得られた洗浄物を減圧濾過にて採取し、 ー晚 35°Cにて減圧乾燥 W 200 を行い、 ェタノール洗浄乾燥物を 1. 49 g得た。 このエタノール洗浄乾燥物 中のァスタキサンチン及びカロテノィドの含量はそれぞれ 47%と 98%であ つた。 工程 6 ：減圧留去による溶媒の回収
工程 4で発生した濾液約 100 g (約 12 OmL) から減圧留去により留去 液側に 80 gのァセトンを回収した。また、工程 5で発生する濾液約 80 g (約 10 OmL) から減圧留去により留去液側に 76 gのエタノールを回収した。
[実施例 6 ] 回収溶媒を用いたァスタキサンチン高含量の高純度力口テノィ ドの製造 3
実施例 5の工程 1で得られた乾燥菌体 25 gに実施例 5の工程 3で得られた 留去液 （アセトン） を 1. 1 k g加え、 実施例 5の工程 2に準じたカロテノィ ドの抽出と菌体濾過を行い、 抽出液 1. 2 k gを得た。 この抽出液を実施例 5 の工程 3に準じて減圧濃縮した後、 冷却された濃縮液約 40 gを得た。 この冷 却された濃縮液から実施例 5の工程 4に準じて沈殿物を濾取した。 次に、 実施 例 5の工程 6で回収したァセトン 10 gを、 沈殿物のケークの上から加えて濾 過洗浄した後に、 乾燥を行い 1. O O gの乾燥物を得た。 この乾燥物に実施例 5の工程 6で回収したエタノールを 40 g加えて実施例 5の工程 5に準じて洗 浄及び乾燥を行い、 ェタノール洗浄乾燥物 0. 72 gを得た。 ェタノール洗浄 前の減圧乾燥物のァスタキサンチン及びカロテノィドの含量がそれぞれ 33% と 70%に対して、 ェタノ一ル洗浄乾燥物でのァスタキサンチン及びカロテノ ィドの含量がそれぞれ 46%と 97%であった。
以上のことより、 回収された溶媒の再利用は何ら支障がないことが確認でき た。
[実施例 7] ァスタキサンチン高含量の高純度カロテノィドの製造 4 菌の培養、 抽出、 並びに濃縮及び析出工程は、 実施例 5の工程 1〜工程 3と 同様に行い、 さらに実施例 5の工程 4に準じて、 工程 3で得られた冷却された 濃縮液約 8 0 gを減圧濾過してカロテノィドを含んだ沈殿物のケークを得た。 さらにケークの上から 2 0 gのアセトンを加えて濾過洗浄した後に沈殿物カロ テノイド含量を調べるためにケークの一部を採取した。 次いで、 乾燥する工程 を省略して、ケークの上から 8 0 gのエタノールを加えてさらに濾過洗浄した。 この濾過洗浄ケークをー晚 3 5 °Cにて減圧乾燥し、エタノール洗浄乾燥物を 1 . 5 0 g得た。 このエタノール洗浄前の減圧乾燥物のァスタキサンチン及びカロ テノィドの含量は、 それぞれ 3 3 %と 7 0 %であるのに対して、 エタノール洗 浄乾燥物中のァスタキサンチン及ぴカロテノィドの含量はそれぞれ 4 6 %と 9 7 %であった。
また、 実施例 5の工程 4に準じて行われる沈殿物濾取で得られる濾液約 1 0 0 g (約 1 2 0 m L ) からアセトン 8 5 gを回収するとともに、 実施例 5のェ 程 5に準じて行われるエタノール洗浄工程で得られる濾液約 8 0 g (約 1 0 0 m L ) から、 僅かにアセトンが混入したエタノール 7 5 gを回収した。
[実施例 8 ] 回収溶媒を用いたァスタキサンチン高含量の高純度力口テノィ ドの製造 4
実施例 Ίで用いた乾燥菌体 2 5 gに、実施例 7で得られた留去液（アセトン） を 1 . 1 k g加え、 実施例 5の工程 2に準じたカロテノイ ドの抽出と菌体濾過 を行い、 抽出液 1 . 1 k gを得た。 この抽出液を実施例 5の工程 3に準じて減 圧濃縮した後、 冷却された濃縮液約 4 0 gを得た。 この冷却された濃縮液から 実施例 5の工程 4に準じて沈殿物を濾取した。 次に、 実施例 7で得られた回収 アセトン 1 0 gを、 沈殿物のケークの上から加えて濾過洗浄し、 さらに実施例 7と同様に乾燥工程を省略して実施例 7で回収したェタノール 4 0 gを加えて さらに濾過洗浄した。 この濾過洗浄ケークを一晩 3 5 °Cにて減圧乾燥し、 エタ ノ一ル洗浄乾燥物を 0 . 7 3 g得た。 ェタノール洗浄前の減圧乾燥物のァスタ キサンチン及ぴカロテノィドの含量はそれぞれ 3 4 %と 7 1 %であるのに対し て、 エタノール洗浄乾燥物中のァスタキサンチン及びカロテノィドの含量はそ れぞれ 4 6 %と 9 7 %であった。 ' 実施例 8において減圧留去で回収されたァセトンが混入したエタノ一ル 用 いても洗浄能力の低下は認められないことが確認できた。 但し、 複数回回収し て再利用することを考慮すると、 ェタノール洗浄工程前にァセトンがなるベく 残留しない様な条件で、 沈殿物を濾取する工夫をすることは好ましい態様と考 えら; Hる。
[実施例 9 ] ァスタキサンチン高含量である高純度カロテノィ ドの製造 5 実施例 5におけるエタノール洗浄の代わりにアセトン洗浄を行うこと以外は 実施例 5と同様に実施したところ、 得られた乾燥物中のァスタキサンチン及び カロテノィドの含量はそれぞれ 4 5 %と 9 1 %であった。
[参考例 1 ] ァスタキサンチンの室温における溶解濃度測定
ァスタキサンチン (シグマ製） の室温における溶解濃度を測定し、 表 1に示 した。
表 1
種類 溶媒名 濃度 % ( w t /w t ) 炭化水素類 へキサン 0 . 0 0 3
シクロへキサン 0 . 0 0 1
トルェン 0 . 0 3
ベンゼン 0 . 0 5
アルコール類 メタノ一ル 0 . 0 0 3
ェタノール 0 . 0 0 2
イソプロパノール 0 . 0 0 2
ケトン類 ァセ トン 0 . 0 2
メチルェチルケトン 0 . 0 3
メチルイソプチルケトン 0 . 0 2
シクロへキサノン 0 . 2
エーテル類 1， 4一ジォキサン 0 . 3
テトラヒ ドロフラン 0 . 7
ノヽ口ゲン類 ジクロロメタン 2 . 3
ク π πホノレム 0 . 7 表 1から明らかなとおり、 発ガン性や変異原性を有するハロゲン溶媒以外の 溶媒における溶解濃度は 1 %以下という低濃度であることが分かつた。 このこ とから、 従来技術の液液分配において比較的に有害性の低い一般的有機溶媒を 用いている限りは、 1%を超えるカロテノィド濃度の溶液で高純度化の処理を することは極めて困難であり、 工業生産性上、 大変に問題があることが明らか となった。
すなわち、 本発明の方法は、 液液分配ではなく固化/固体洗浄を用いる方法 である力 1%以下の濃度しか溶解しない安全に使用し得る溶媒を用いる場合、 従来方法であれば、 分液操作時に希薄液を大量に使用する必要が生じ、 従って 非常に大きな設備が必要であり非効率的であるのに対し、 本発明の方法はスケ ールが小さくて済むといえる。
[比較例 1 ] 特開平 8— 253695号公報の実施例 1一 1に準じた製法 実施例 5の工程 1〜2と同様にして得たァスタキサンチン濃度 0. 034%
(w t Zw t)、 カロテノイド濃度 0. 077% (w t/w t) の抽出液 2. 3 k g (2. 9 L) にへキサン 1. 9 k g (2. 9 L) と 1 %食塩水 2. 9 k g
(2. 9 L) を加えて 1時間攪拌した。 静置後、 2層分離して上層のへキサン 層 3. 7 L (2. 5 k g) と下層の水層 5 L (4. 6 k g) を得た。 得られた へキサン層をエバポレーターにて減圧濃縮し約 0. 3 Lの濃縮液を調製した後 に 4°Cにて 12時間放置後、 沈殿物を減圧濾過し、 沈殿物の上から 25mLの へキサンを加えて濾過洗浄し、 減圧乾燥にてー晚乾燥してァスタキサンチン含 量 47%、 カロテノィド含量 98 %の 1. 45 gの乾燥物を得た。 カロテノィドの高純度化処理時の条件において、 例えば実施例 5では約 1. 8% (w tZw t) のカロテノイド懸濁液で取り扱えたのに対して、 比較例 1 ではカロテノイド濃度が約 0. 07% (w t/w t) という低いカロテノイド 濃度のへキサン溶液 3. 7 Lに対して 5 Lの水層を接触させる必要があった。 この点から、 本発明は、 比較例 1の方法と比較して工業的にさらに高効率であ ることが明らかとなった。 . また、 取り扱い総液量の点においても、 例えば実施例 5において使用したァ セトン及ぴェタノールの合計容量 2 . 9 2 5 Lに対して、 比較例 1では使用し たァセトン、 へキサン及ぴ 1 %食塩水の合計容量は 8 . 7 2 5 Lであり、 約 3 倍も工程液の取扱量が多いものであった。 従って、 本発明の方法は、 工業的に より高効率であることが明らかとなった。
さらに、 抽出に使用したァセトン約 2 . 9 Lの回収は、 例えば実施例 5及ぴ 7においては、 製造工程中の抽出液の減圧濃縮と同時に留去液としてアセトン 約 2 . 8 Lが回収できた。 これに対して、 比較例 1においては、 へキサン層の 減圧濃縮で得られたアセトンとへキサンからなる留去液約 3 . 4 Lから新たに 分画してァセトンとへキサンをそれぞれ回収する操作、 及ぴ水層約 5 Lから新 たにアセトンを回収する操作が必要であった。このことから、本発明の方法は、 溶媒の回収工程がより簡便であることが明らかとなった。
[食品例 3 ] マーガリン
抗酸化剤及び着色剤として、 実施例 5で得たァスタキサンチン組成物を、 マ ーガリンの 5重量％になるように植物油に添加した後、 乳化剤などとともに均 一になるよう攪拌し、 通常の方法によりマーガリンを作製した。 このマーガリ ンは、 通常のマーガリンと比較して、 ァスタキサンチンの存在により、 薄い赤 色を呈していた。
[食品例 4 ] 人工イクラ
実施例 5で得たァスタキサンチン組成物を、 1 %ァルギン酸ナトリウム水溶 液に 0 . 6 %添加し、 ホモジナイザーで分散後、 5 %塩ィ匕カルシウム凝固液に 滴下し、 直径 5 mmの球状に成型した。 外観は自然に近く、 形状、 色調、 及び 味の観点でィクラと酷似していた。 [製剤例 3 ] ァスタキサンチン含有錠剤
実施例 5で得た力口テノィド含有組成物 1 2 0重量部に対して結晶セルロー ス 3 3 0重量部、 カルメロース一カルシウム 1 5重量部、 ヒ ドロキシプロピル セルロース 1 0重量部及び精製水 6 0重量部を用いて通常の方法にて配合、 乾 燥した後、 1 0重量部のステアリン酸マグネシウムを添加し、 打錠を行い、 1 錠あたりカロテノィド含有組成物を 2 0 m g含有する 1 0 0 m gの定剤を得た。
[製剤例 4 ] ァスタキサンチン含有ソフトカプセル
実施例 5で得た力口テノィド含有組成物 1重量部に、 5倍重量部の大豆油に 懸濁し、 均質になる様に十分に混合した後、 カプセル充填機にてカプセル充填 し、 内容物約 3 0 0 m gの赤褐色状のカプセルを得た。
[化粧品例] ァスタキサンチン含有クリーム剤 （化粧品）
実施例 5で得たァスタキサンチン含有組成物を、 白色ワセリンに 1 0重量％ になるように添加し、 芳香剤などとともに、 均一になるように攪拌し、 通常の 方法によりクリ一ム剤を作製した。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 天然物由来の高純度、 安価かつ安全なカロテノイド高含有 組成物及ぴその工業的な製造方法を提供することができ、 その結果、 該組成物 を含有する機能性食品、 医薬組成物、 又は化粧品を提供することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1
Unknownの情報： E.396
nは a， c, g又は tである （存在位置： 1350)

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物を低級アルコ ール類、 水含有低級アルコール類、 低級ジアルキルケトン類及びエーテル類か らなる群から選ばれる少なくとも 1種で抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物を低級アルコール類、 水含有低級アルコール類、 炭化水素系溶媒 類及び低級ジアルキルケトン類からなる群から選ばれる少なくとも 1種で洗浄 する工程
2. 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をエタノール 又はァセトンで抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物をエタノール、 水含有エタノール又はアセトンで洗浄する工程
3. 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をエタノール で抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物を水含； エタノールで洗浄する工程
4. 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をアセトンで 抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物をエタノールで洗浄する工程
5. 以下の 1) 〜3) の工程を含むカロテノイド含有組成物の製造方法。
1) 微生物の培養物、 該培養物の濃縮物、 又はこれらの乾燥物をアセトンで 抽出する工程
2) 得られた抽出液を濃縮して沈殿物を得る工程
3) 沈殿物をエタノールで洗浄する工程
6. 請求項 1〜5 のいずれか 1 項に記載の製造方法の工程に、 さらに以下の 1工程を合む力口テノィド合有 成物の製造方法。
4) 工程 3) で得られた沈殿物をさらにへキサンで洗浄する工程
7. カロテノイド含有組成物が、 カロテノイドを 80%以上含有する組成物で ある請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の製造方法。
8. カロテノイドが、 ァスタキサンチンを 40%以上含有するカロテノィ ドで ある請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の製造方法。
9·. 微生物の 16 Sリポソーム RN Aに対応する DN Aの塩基配列が、 配列番 号 1に記載の塩基配列と実質的に相同のものである請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の製造方法。
10. 微生物が、 E— 396株 （FERM BP— 4283) 又はその変異株 である請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のカロテノィドの製造方法。
1 1. 請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の製造方法で得られるカロテノィ ドを含有する組成物。 2 · 請求項 1 1に記載のカロテノィド含有組成物を含有する食品、 医薬組成 物、 又は化粧品。
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