KR100411364B1 - 녹조류에서 아스타산틴 색소 추출방법 및 추출된 색소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연색소인 아스타산틴을 생성하는 조류인 헤마토코커스 균주를 배양한 후, 이를 물에 현탁시켜 마이크로웨이브로 처리함으로서 세포의 소기관 및 세포벽을 파괴한 후, 분무 건조시키거나 용매 추출함을 특징으로 하는 아스타산틴 색소의 추출방법 및 그방법에 따라 제조된 아스타산틴 색소를 제공하는 것이다. 또한, 상기 마이크로웨이브 처리방법은 테프론관을 통한 연속적 마이크로웨이브 처리 방법 또는 테프론 추출용기의 고정상의 마이크로웨이브 처리 방법을 통해 정격출력 50 ~ 1,000 와트와 주파수 916 또는 2450 메가헤르츠에서 10 ~ 500 초 처리하고, 상기 용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 유기용매로 용해시켜 추출한 후 원심분리를 통해 농축 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

녹조류에서 아스타산틴 색소 추출방법 및 추출된 색소{Process for extracting astaxanthin pigment from blue-green algae and extracted pigment thereof}

본 발명은 헤마토코커스(Haematococcus)속 균주을 배양하여 마이크로웨이브로 처리하여 세포 소기관 및 세포벽을 파괴한 후 건조시키거나, 에탄올, 메탄올, 아세톤 또는 이들의 혼합용매 등의 유기용매로 아스타산틴 색소를 효율적으로 추출하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 아스타산틴 색소에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 천연색소 아스타산틴의 생산성이 높은 헤마토코커스(Haematococcus)속 균주를 배양하여 얻은 배양액을 도면 1과 도면 2의 형태의 테프론 추출용기(Teflon extraction vessel)나 테프론 관(Teflon tube)을 통과시켜 정격출력 50 내지 1,000 와트(Watts)와 주파수 916 또는 2450 메가헤르쯔(MHz)에서 10 내지 500 초 처리하여 유기용매별, 추출시간별, 추출온도별, 추출용매의 부피별 등 최적의 추출조건으로 색소를 추출한 다음 원심분리 후 상등액을 진공감압 농축기(rotary vacuum evaporator)로 감압 농축하여 얻어지는 아스타산틴 색소를 추출하는 방법에 관한 것이다.

아스타산틴(3,3'-dihydroxy-β, β'- carotene-4,4'-dione)은 효모균주인 파피아 로드지마(Phaffia rhodozyma,Phytochemistry,15, 1009, (1976))와 조류인 헤마토코커스(Haematococcus species,Phytochemistry,20, 2561, (1981)) 그리고 박테리아(Brevibacterium,J. general and applied microbiology,15, 127, (1969))에서 생성되며, 또한 해양동물과 담수동물(Phytochemistry 15. 1003-1007 (1976))에 많이 분포되어 있다.

특히 새우나 가재의 갑각류, 조류의 부리, 난황, 송어 및 연어 등의 주홍색을 띄고(Critical Reviews in Biotechnology 11(4), 297-326(1991)), 색상의 증진, 풍미효과, 비타민 A의 전구체, 면역기능의 활성화, 산소 라디칼(Oxygen free radical scavenger)의 제거에 의한 항암작용(Pure Appl. Chem., 51. 649-660(1979),J. Korean. Soc. Food Sci. Nutr.27(1). 163-167(1998))과 노화(Internat. J. Vit. Nutr. Res.65. 79-86(1995)) 등에 중요한 대사적 역할을 가지고 있다.

다른 카로티노이드계 색소나 토코페롤 보다도 뛰어난 항산화(Fisheries Sci.,62. 134-140 (1996)) 효과를 보이고 있는 것이 증명되어 식용 색소뿐 만 아니라 의약적(Crit. Rev.Biotechnol.11. 297-326 (1991))으로 중요성을 지닌 것으로 간주된다.

새우나 가재의 갑각류 등에서 아스타산틴 색소추출은 색소함량이 적고 추출과정이 어려워 적용되지 않고 있으며, 파피아 로드지마 균주는 성장률이 높으나 균주의 색소 생산성이 적고 단단한 세포벽 때문에 색소 추출에도 많은 어려운 점이 있다.

한편 녹조류인 헤마토코커스는 성장이 느리며 배양시 오염이 잘되며 아스타산틴 색소의 추출이 잘 되지 않아, 고 순도의 아스타산틴 색소 추출물을 얻는 방법이 상업적인 정도로 개발되지 못하고 있다.

따라서, 상기 문제를 해결하기 위하여 당 발명자들은 이미 『효모 균주에서 아스타산틴 색소 추출방법 및 추출된 색소』 ( 출원번호 : 제 2000-23851호)에서 기술한 것처럼 마이크로웨이브를 적용하여 효모 균주에서 카로티노이드계열의 아스타산틴 색소를 효율적으로 추출하는 방법을 개시한 바 있다.

한편 아스타산틴 색소를 직접 사람이 섭취하는 식품이나 동물의 사료를 제조하는 데 적용하고자 할 때는 조류의 세포벽을 효율적으로 파괴하여 사용해야 한다.

그러나 처리비용에 따른 단가 상승으로 전처리 없이 분말 건조된 것(J. Applied phycology 4, 267-279(1992))을 사용하기도 한다. 이런 방법으로 양식사료나 가금사료 및 식품첨가물로 적용시 아스타산틴 색소의 생체 이용률이 매우 낮다.

따라서, 종래의 기술 중에는 헤마토코커스속에서 아스타산틴을 생합성 하여 세포내에 축적되므로 축적된 아스타산틴을 효과적으로 회수하기 위하여 세포벽을 파괴하는 여러 가지 방법들이 개발되어 왔다.

첫째, 기계적인 처리방법으로서 수분을 완전히 제거한 균주를 액체질소로 냉동시킨 후 임펙트 밀(high speed impact mill or jet mills)을 이용하여 분말화 하는 방법과 이를 통하여 균주의 세포벽을 부순 후 아스타산틴을 추출하는 방법이 있다( 미국특허 제4,871,551호, 제6,022,701호 ).

둘째, 물리적인 방법으로서 프레치 프레스(French pressure), 호모게나이저(Braun homogenizers)와 같은 기계를 이용하여 세포벽을 깨뜨린 후 용매로 추출하는 방법이 있다[Methods in enzymology 213, 386-391(1992);J. Agric. Food Chem.,46, 3371-3375(1998), 미국 특허 제5,744,502호].

셋째, 생물학적 처리방법으로 세포벽을 분해하는 효소, 즉 셀룰라아제, 헤미 셀룰라아제, 펙틴나아제를 처리하는 방법을 이용하고 있다[Appl. and Environ. Microbiol.35(6). 1155-1159(1978)].

넷째, 세포벽의 단백질을 분해하기 위하여 프로테아제를 처리하고 세포벽에 삼투압을 가하여 세포를 파괴(일본 공개특허 평5-68585호)하는 방법 등 이미 개시 된 바 있다.

상기와 같은 여러 가지 방법을 사용하여 세포벽을 파괴하여 카로티노이드(carotenoids) 색소를 추출할 경우 낮은 색소 추출율과 높은 색소의 파괴율, 그리고 산업적 적용 시 많은 노동력과 높은 처리비용이 드는 문제점들이 존재한다.

그리고 균체을 직접적으로 에탄올, 아세톤 등의 유기용매로 카로티노이드를 추출하는 제조방법들은 추출효율이 매우 나쁘고 처리비용이 높기 때문에 실용화에 이르고 있지 않다.

본 발명에서 헤마토코커스속 세포에 함유되어 있는 총 카로티노이드(Total carotenoids)를 기준으로 기존의 물리적, 화학적 방법 또는 효소적 방법으로 효모 세포벽을 분해시키지 않고 도면 1과 도면 2의 마이크로웨이브로 처리하여 에탄올, 메탄올, 아세톤 등의 유기용매로 추출효율을 높이는 것을 목적으로 하는 아스타산틴 색소를 추출하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 헤마토코커스속 균주를 발효 배양하여 획득한 배양물에서 도면1과 도면 2의 마이크로웨이브를 조사하여 적절한 유기용매로 추출조건을 확립하여 아스타산틴 색소의 추출효율을 극대화 하고자 함이다. 궁극적으로 간단한 장치, 저 비용의 처리, 높은 생산성을 가지는 아스타산틴의 산업적인 활용과 이용을 목적으로 한다. 즉, 마이크로웨이브를 적용하여 처리시간의 단축, 적은 비용, 장치의 간편화, 그리고 색소의 파괴가 적으며 추출효율이 높고 천연색소 아스타산틴을 대량적으로 적용할 수 있는 새로운 추출방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 배양한 균주를 연속적으로 마이크로웨이브를 조사하는 방법을 설계한 개략도이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 배양한 균주를 테프론 추출용기로 마이크로웨이브를 조사하는 방법으로 설계한 개략도이다.

도 3은 본 발명의 방법에 따라 헤마토코커스(Haematococcus)속 균주를 배양 후 도1에서 나타난 바와 같이 마이크로웨이브로 처리한 균주(C)와 처리하지 않은 녹색 균주(A)와 붉은 균주(B)를 광학 현미경으로(400 x 배율) 관찰한 사진이다

도 4는 본 발명의 방법에 따라 헤마토코커스(Haematococcus)속 균주를 마이크로웨이브로 처리하고 에탄올로 추출한 추출물의 HPLC로 분석 데이터이다.

따라서 본 발명의 목적은 조류 균주를 배양한 후, 이를 물에 현탁시켜 마이크로웨이브로 처리하여 세포의 소기관 및 세포벽을 파괴한 후, 분무건조기, 진공드럼 건조기 및 판 건조기에서 선택된 건조기를 이용하여 건조시키거나, 용매로 추출함을 특징으로 하는 아스타산틴 색소의 추출방법 및 그 방법에 의해 추출된 아스타산틴 색소를 제공하기 위한 것이다.

또한 이때, 상기 조류 균주는 아세타불라리아 메디테라니아(Acetabularia mediterranea), 클라미도모나스 니발리스(Chlamydomonas nivalis),유글레나 루비다(Euglena rubida),헤마토코커스 플루비알러스(Haematococcus pluvialus),헤마토코커스 라커스트리스(Haematococcus lacustris) 및 헤마토코커스 드로에아비센시스(Haematococcus droeabicensis)에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로하고, 상기 마이크로웨이브 처리 방법은 테프론관을 통한 연속적 마이크로웨이브 처리 방법 또는 테프론 추출용기의 고정상의 마이크로웨이브 처리방법을 통해 정격출력은 50 ∼ 1,000 와트와 주파수는 916 또는 2450 메가헤르츠에서 10 ∼ 500 초 처리함을 특징으로 한다.

한편 상기용매는 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 유기용매로 용해시켜 추출한 후 원심분리를 통해 농축 분리함을 특징으로 하고, 상기방법을 통해 수득된 색소의 함량은 조류 균체에 함유되어 있는 총 카로티노이드를 기준으로 5 ∼ 95 중량%가 추출되고, 그 추출물의 구성성분 중에서 아스타산틴 색소의 함량이 50 ∼ 95 중량%임을 특징으로 한다.

또한 상기 추출용매는 배양액 부피의 5 ∼ 20 배로 사용하거나, 건조 조류 중량의 5 ∼ 10 배(L/Kg)로 사용함을 특징으로 한다.

한편 본 발명은 상기 건조균체 또는 아스타산틴 색소를 화장품용도, 사료용 또는 식품첨가물에 사용하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 천연색소 아스타산틴의 생산성이 높은 헤마토코커스속 균주를 배양하여 도면 1과 도면 2의 마이크로웨이브로 적당하게 조사하면 세포내의 자유 수(Free water)나 그 밖의 쌍극자 물질(dipoles)이 전기장의 교류에 따라 회전하면서 마이크로파의 에너지가 열에너지로 전환되고 따라서 내부가열(Internal heating)에 의한 내부압력이(Internal pressures) 상승되어 세포내의 소기관(세포핵, 미토콘드리아, 골지체, 소포체 등)과 세포벽 구조의 변화 또는 파괴되므로 달리 장시간의 물리적인 방법으로 세포벽을 파괴하는 방법을 적용하지 않아도 유기용매들의 세포내 이동이 용이하여 색소가 쉽게 추출될 수 있는 원리를 이용하였다.

따라서 기존의 추출방법과 비교하여 적은 에너지를 이용하여 단시간에 목적하는 성분을 추출할 수 있는 마이크로웨이브 공정[Trends in analytical chemistry 13(4). 176-184(1994),Anal. Chem.66. 1097-1106(1994), 미국특허 제5,002,784호, 미국특허 제5,458,897호]을 자체 설계로 이용하여 헤마토코커스속의 아스타산틴 색소를 빠른 시간에 용이하게 얻을 수 있었다. 또한 이러한 공정에 의해 세포벽이 파괴된 헤마토코커스속을 이용하여 양식어류나 닭사료로 사용한다면 색소의 생체이용률을 높일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 도면 1과 도면 2의 마이크로웨이브를 헤마토코커스속 균주에 적절하게 조사함을 특징으로 한다.

본 발명자는 도면 1의 연속식 마이크로파 시스템의 설계 및 제작을 다음과 같이 하였다.

전자레인지의 외벽과 내벽에 구멍을 뚫고 테프론 관(teflon tube)을 삽입해 넣었으며 테프론 관의 길이와 직경은 원하는 조사시간(holding time)과 처리용량(treatment capacity)에 맞추어 조정하였다.

배양액은 유속조절이 가능한 Variable speed peristaltic pump(모델 AS-90361, WON Corporation, Korea)를 통해 테프론 관 내부를 순환하게 하였다. 도면 2의 고정식 마이크로파 시스템은 연속식 시스템에서 테프론 관 및 펌프를 제거하고 테프론 추출용기(Teflon extraction vessel)에 일정량의 배양액을 담아 전자렌지의 중앙에 고정시켰다.

마이크로웨이브의 정격출력을 적게는 50 내지 크게는 1,000 와트(Watts)로 하고 발진주파수(Frequency)범위는 916 와 2450 메가헤르츠(MHz)로 설계하고 테프론 추출용기(Teflon extraction vessel)를 두는 방법과 테프론 관(Teflon tube)을 연속적으로 통과시켜 10 내지 500 초 조사하는 방법으로 본 발명을 완성하였다.

상기 마이크로파 시스템을 적용함에 따라, 본 발명에 이용한 녹조류인 헤마토코커스속의 특징은 10 - 50㎛이고 담수에서 서식하는 플랑크톤이며 2개의 편모를 가지고 있다. 또한 세포벽은 고등식물이나 다른 조류와는 달리 당 단백질로 구성되어 있어 세포벽이 두껍고 호기성 조건하에서 광합성을 하는 조류이다.

본 발명에 사용한 조류는Acetabularia mediterranea,Chlamydomonas nivalis, Euglena rubida, Haematococcusspecies(Haematococcus pluvialus flotow와Haematococcus lacustris)를 CCAG; Gottingen, CCAP; UK, CCAT; USA, NIES; Tsukuba Japan, SCCAP; Denmark, UTEX; USA에서 각각 분양 받았고 상기 균주 중 아스타산틴 색소를 많이 생산하는 헤마토코커스를 아래와 같이 배지 및 성장조건으로 배양하여 실험에 적용한 결과를 설명하고자 한다.

멸균수에 초산 나트륨(Sodium acetate) 14.6mM, 엘-아스파라진(L-asparagine) 2.7mM, 효모분말(Yeast extract) 2.0g/L, 염화마그네슘(MgCl_{2`</sub>6H<sub>2</sub>O) 0.985mM, 황산 제일철(FeSO<sub>4`}7H₂O) 0.036mM, 염화칼슘(CaCl_2`2H₂O) 0.135mM의 성분을 첨가하고 pH를 6.5 ~ 8.0 범위로 조절하고 바람직하게는 6.8로 한다.

배양기에서 이산화탄소의 농도의 1.5%으로 공기방울을 주입하면서 빛은 흰 형광등(white fluorescent lamp)으로 20??Em^-2S^-1밝기로 하면서 온도는 18-28도, 바람직하게는 25도로 배양한 다음 초산 나트륨(Sodium acetate)을 45mM와 황산제일철(FeSO_4`7H₂O)을 450??M을 첨가하고 빛을 120??Em^-2S^-1밝기로 조절하여 4일간 온도는 18 ~ 28도, 바람직하게는 20도로 배양하면 녹색에서 점차적으로 붉은 색을 띄는 헤마토코커스 균주가 된다.

아스타산틴을 함유한 세포의 평균 지름을 20-80㎛, 균주 밀도(cell density)는 10⁶~ 10⁷/ml로 배양하고, 세포건조 중량은 단위 리터당 0.5 ~ 3.0g으로 되도록 5L 발효조에서 3L의 조업부피로 상기의 조건으로 배양 후 연속식 원심분리기(continuous flow centrifuges)를 이용하여 균체을 획득한 후 마이크로웨이브로 조사하여 색소추출이 용이하도록 하고 추출용매 및 부피를 결정하고 추출시간별, 온도별 효과를 측정하여 아스타산틴 색소추출이 가장 효과적인 방법을 제공하고자 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 아스타산틴을 생성하는 헤마토코커스를 대량 배양시, 마이크로웨이브를 조사하여 천연색소인 아스타산틴을 유기용매로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 실시예, 제조예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 제조예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가이들 내용에 의하여 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 고정식, 연속식의 마이크로웨이브 시스템을 적용한 추출율 실험

마이크로웨이브의 출력을 50 ~ 1,000 와트와 주파수는 916, 2450 메가헤르츠 그리고 마이크로파 조사는 10 ~ 500 초 사이에서 아스타산틴 색소 추출율을 확인하였다. 배양 균주를 도면 1의 연속식과 도면 2의 고정식으로 마이크로웨이브를 처리 후 배양액 기준 10배로 에탄올을 첨가하고 40도에서 24시간 추출 후 지방을 제거 하기 위해 영하 20도에서 30분 이상 방치 후 원심분리기(10,000 X g)로 원심분리 후 상등액을 진공감압 농축하여 아스타산틴 색소 추출물을 얻는다. 색소 추출율을 확인하기 위하여 아세톤을 가하여 478nm에서 흡광도(UV/VIS Spectrophotometer Biochrom 4060, pharmacia, German)를 측정하였다.

대조군은 먼저 클로로필을 제거 하기 위하여 배양균주를 원심분리기로 3500 X g로 5분 동안 하여 농축하고 30% 메탄올 용액에 5% 수산화 칼륨을 첨가하여 70도에서 5분간 가열 후 다시 원심 분리하여 상등액을 버리고 초산을 3 ~ 5방울 첨가 한 다음 55℃에서 미리 가온 한 디메틸설폭사이드 원액 1ml을 넣고 세게 흔들어 조류 세포가 충분히 파괴되도록 한다. 색소를 추출하기 위해 순차적으로 아세톤, 석유에테르, 염화나트륨(20%)을 각각 1ml씩 순차적으로 첨가 후 냉동고에 저장한 다음 10,000 X g에서 5분간 원심 분리 후 조심스럽게 색소가 녹아있는 석유 에테르 층을 취하여 진공감압으로 석유에테르를 휘발시키고 아세톤 1ml을 가하여 478nm에서 흡광도를 측정하여 색소 추출율을 확인하였다. 색소 추출율은 디메틸설폭사이드(DMSO; dimethylsulfoxide)로 세포벽을 파괴하여 추출된 색소량(추출율을 100%로 기준함)에서 마이크로웨이브 조사 후 유기용매로 추출된 색소량으로 계산하였다.

상기 마이크로웨이브를 조사후 헤마토코커스로부터 색소 추출율의 실험은 3회 반복하고 평균값의 결과는 하기 표 1과 같다

주파수(MHz)	조사시간(초)	출 력(와트)
		50	500	1,000
916	10	3	3	4
	30	28	43	42
	60	54	89	83
	120	57	87	80
	240	49	75	76
	500	48	71	69
2450	10	2	3	4
	30	26	47	46
	60	59	95	94
	120	61	92	89
	240	47	82	85
	500	54	74	75

단위 : %

색소 추출율(%) = B/A ×100

A : DMSO으로 세포벽 파괴 후 대조군의 478nm의 흡광도;

B : 마이크로웨이브 조사후 유기용매로 추출 후 실험군의 478nm에서 흡광도;

(실시예 2) 마이크로웨이브 조사 후 추출용매와 시간에 따른 추출효과 실험

실시예 1의 실험결과 색소 추출율이 가장 높은 마이크로웨이브 시스템에서 주파수는 2450 메가헤르츠와 출력은 500 와트 그리고 조사시간은 60 초로 설정하고 추출용매는 각각 10 배 부피로 하고 추출온도는 40도로 암실에서 흔들면서 색소를 추출하여 진공감압 농축기로 농축하여 아스타잔틴 색소를 함유한 추출물을 얻는다. 색소 추출물에서 진공감압으로 추출용매를 휘발시키고 아세톤을 첨가하여 478nm에서 흡광도를 측정하여 색소 추출율을 확인하였다.

상기 마이크로웨이브 조사 후 추출용매와 추출시간에 따른 색소 추출율의 실험은 3회 반복하고 평균값의 결과로 하기 표 2와 같다.

추출용매	추출 시간(시간)
	0	6	12	24
대조군	0	1	2	2
에탄올	2	45	87	95
메탄올	3	35	67	80
아세톤	2	21	52	65
단위 : %

* 대조군은 마이크로웨이브로 조사하지 않은 배양액에서 에탄올로 추출한 값

(실시예 3) 마이크로웨이브 조사 후 추출온도와 시간에 따른 추출효과 실험

실시예 2의 마이크로웨이브 조사와 동일하며 사용된 추출용매로서 에탄올로 사용배수는 10배 부피로 추출온도와 시간을 변화하여 암실에서 흔들면서 색소 추출율을 확인하였다.

상기 마이크로웨이브 조사 후 에탄올로 색소추출 시 추출온도와 시간에 따른 색소 추출율을 실험은 3회 반복하고 평균값의 결과는 하기 표 3와 같다.

추출온도	추출 시간(시간)
	0	6	12	24
20	4	11	35	59
40		45	87	95
80		39	73	80
단위 : %

(실시예 4) 마이크로웨이브 조사 후 추출 용매부피에 따른 추출효과 실험

실시예 2의 마이크로웨이브로 조사 후 에탄올을 첨가하여 추출하되 에탄올의 사용배수를 달리하였다. 추출시간은 24시간, 추출온도는 40도 암실에서 흔들면서 추출하였다.

상기 마이크로웨이브 조사 후 에탄올 부피에 따른 색소 추출율의 실험은 3회 반복하고 평균값의 결과를 하기 표 4와 같다.

에탄올 : 배양액 (V/V)	추출율(%)
1 : 1	6
5 : 1	68
10 : 1	95
단위 : %

(실시예 5) 색소 추출후 아스타산틴 색소함량 분석

배양한 균주의 총 카로티노이드 양은 기 개시된 방법으로 클로로필을 제거하기 위하여 배양 균주 1ml을 원심분리기로 3500 X g 로 5분 동안 하여 농축하고 30% 메탄올 용액에 5% 수산화 칼륨을 첨가하여 70도에서 5분간 가열 후 다시 원심 분리하여 상등액을 버리고 초산을 3 ~ 5방울 첨가 한 다음 배양액을 원심 분리한 다음 침전물을 멸균수로 2회에 세척하고 55℃에서 미리 가온 된 디메틸설폭사이드 원액 1ml을 넣고 세게 흔들어 조류 세포가 충분히 파괴되도록 한다.

색소를 추출하기 위해 순차적으로 아세톤, 석유에테르, 염화나트륨(20%)을 각각 1ml씩 순차적으로 첨가 후 냉동고에 저장한 다음 10,000 X g에서 5분간 원심 분리후 상등액을 474nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 4의 색소 추출물 1ml를 취하여 용매를 진공감압으로 휘발시킨 다음 석유에테르를 1ml을 가하여 474nm에서 흡광도를 측정하여 디메틸설폭사이드로 추출한 색소량을 100%으로 비교하여 색소 추출율을 확인하였다. 상기에서 얻은 흡광도의 균체 건조중량은 1% 흡광계수(2,100)를 이용하여 하기 식에 의해 총 카로티노이드를 정량 하였다(Appl. and Environ. Microbiol.,55. 116-124(1989)). 에탄올 추출물에서 아스타산틴 색소의 함량을 분석하기 위하여 추출물에서 추출용매를 진공감압으로 휘발시키고 피리딘에 녹여 HPLC(Waters 486, 미국)로 분석하였다(도면 3). 분석조건은 이동상은 에틸아세테이트/노르말-헥산(3:7), 고정상은 실리카(4.0 X 250mm), 용매는 피리딘, 유속은 1 ml/min, 흡광도는 476 nm로 하였다. 표준물질로는 아스타산틴(시그마, 98% 이상)을 피리딘에 일정량 녹여서 사용하였다.

총 카로티노이드 양( mg/g 조류건조중량) = ( A x M x 100 ) / (21 x D)

A : 474nm에서 측정된 색소의 흡광도;

M : 추출에 사용된 용매의 양(ml):

D : 사용된 헤마토코커스(Haematococcusspecies)균주의 건조 중량;

21 : 균체중량으로 부터 1% 흡광계수(extinction coefficient) = 2,100

상기 마이크로웨이브 조사후 에탄올 추출 시 총카로티노이드의 함량과 아스타산틴 함량을 분석한 실험은 3회 반복하고 평균값의 결과는 하기 표 5와 같다.

추출방법사용균주	DMSO파쇄 후 색소추출	마이크로웨이브 조사후 색소추출
헤마토코커스(Haematococcus species)	총카로티노이드양(mg/g yeast)	추출율(%)	총카로티노이드양(mg/g yeast)	추출율(%)	아스타산틴(mg/ml)
	48.01	100	45.61	95	43.33

* 아스타산틴 함량은 마이크로웨이브 조사 후 용매 추출물의 구성성분 함량기준임

(제조실시예 1)

헤마토코커스(Haematococcusspecies) 건조물의 제조예는 다음과 같다

상기 실시예 2의 마이크로웨이브 조건으로 배양한 헤마토코커스 균주에 조사 후 연속식 윈심분리기(continuous flow centrifuges)로 원심분리(7,000 X g) 후 균체를 회수한 다음 깨끗한 물로써 2회 세척 후 균체의 건조를 원활히 하기 위하여 수분함량을 10% 미만으로 한 다음 분무 건조기(spray dryers), 드럼 건조기(vacuum drum dryers) 그리고 판 건조기(trays dryers)를 통하여 헤마토코커스 균주를 상법에 의해 목적하는 건조물을 제조하였다.

본 발명의 효과는 기존의 추출방법과 비교하여 적은 에너지로 단시간에 목적하는 성분을 추출할 수 있는 마이크로웨이브 공정을 이용하여 헤마토코커스의 아스타산틴 색소를 빠른 시간에 용이하게 얻을 수 있다. 마이크로웨이브 추출방법으로 헤마토코커스 균주에 함유된 아스타산틴 색소의 용이한 추출과 더욱 효과적인 마이크로웨이브 추출조건을 설정하기 위해 주파수는 916 와 2450 메가헤르츠이며 출력은 50 ~ 1,000 와트이고 처리시간을 10 ~ 500 초 처리하여 에탄올, 메탄올, 아세톤으로 추출하는 조건을 확립하여 헤마토코커스 균체에 함유되어 있는 총 카로티노이드를 기준으로 세포 내 총 색소의 5 ~ 95 중량%으로 추출하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

Claims (8)

1. 조류 균주를 배양한 후, 이를 물에 현탁시켜 테프론관을 통한 연속적 마이크로웨이브 처리 방법 또는 테프론 추출용기의 고정상의 마이크로웨이브 처리방법을 통해 정격출력 50 ∼ 1,000 와트에서 주파수 916 또는 2450 메가헤르츠로 10 ∼ 500 초 마이크로웨이브로 처리하여 세포의 소기관 및 세포벽을 파괴한 후, 분무건조기, 진공드럼 건조기 및 판 건조기에서 선택된 건조기를 이용하여 건조시키거나, 에탄올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 유기용매로 추출한 후 원심분리를 통해 농축 분리함을 특징으로 하는 아스타산틴 색소의 추출방법
2. 제 1항에 있어서, 상기 조류 균주는 아세타불라리아 메디테라니아(Acetabularia mediterranea), 클라미도모나스 니발리스(Chlamydomonas nivalis),유글레나 루비다(Euglena rubida),헤마토코커스 라커스트리스(Haematococcus lacustris) 및 헤마토코커스 드로에아비센시스(Haematococcus droeabicensis)에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로하는 아스타산틴 색소의 추출방법
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기방법을 통해 수득된 색소의 함량은 조류 균체에 함유되어 있는 총 카로티노이드를 기준으로 5 ∼ 95 중량%가 추출되고, 그 추출물의 구성성분 중에서 아스타산틴 색소의 함량이 50 ∼ 95 중량%임을 특징으로 하는 아스타산틴 색소의 추출방법
6. 제 1항에 있어서, 상기 추출용매는 배양액 부피의 5 ∼ 20 배로 사용하거나, 건조 조류 중량의 5 ∼ 10 배(L/Kg)로 사용함을 특징으로 하는 아스타산틴 색소의 추출방법
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8. 삭제