RU2785792C1 - Способ приготовления питательной среды для культивирования дрожжей xanthophyllomyces dendrorhous (phaffia rhodozyma) на основе соевой мелассы и дрожжевого экстракта - Google Patents
Способ приготовления питательной среды для культивирования дрожжей xanthophyllomyces dendrorhous (phaffia rhodozyma) на основе соевой мелассы и дрожжевого экстракта Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785792C1 RU2785792C1 RU2022123587A RU2022123587A RU2785792C1 RU 2785792 C1 RU2785792 C1 RU 2785792C1 RU 2022123587 A RU2022123587 A RU 2022123587A RU 2022123587 A RU2022123587 A RU 2022123587A RU 2785792 C1 RU2785792 C1 RU 2785792C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- yeast
- astaxanthin
- medium
- yeast extract
- nutrient medium
- Prior art date
Links
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 35
- 241000081271 Phaffia rhodozyma Species 0.000 title claims abstract description 31
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 19
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 title claims abstract description 15
- 241000222057 Xanthophyllomyces dendrorhous Species 0.000 title claims abstract description 13
- 240000007842 Glycine max Species 0.000 title description 2
- MQZIGYBFDRPAKN-QISQUURKSA-N 6-hydroxy-3-[(1E,3E,5E,7E,9E,11E,13E,15E,17E)-18-(4-hydroxy-2,6,6-trimethyl-3-oxocyclohexen-1-yl)-3,7,12,16-tetramethyloctadeca-1,3,5,7,9,11,13,15,17-nonaenyl]-2,4,4-trimethylcyclohex-2-en-1-one Chemical compound CC=1C(=O)C(O)CC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-QISQUURKSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 claims abstract description 50
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract 3
- 239000002609 media Substances 0.000 claims description 55
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 6
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 5
- 230000018867 autolysis Effects 0.000 claims description 5
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 17
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 17
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 abstract 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 17
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 10
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 10
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 4
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 235000019529 tetraterpenoid Nutrition 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 4
- 241000168517 Haematococcus lacustris Species 0.000 description 3
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 2
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 239000010794 food waste Substances 0.000 description 2
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 239000007221 ypg medium Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209134 Arundinaria Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229960002747 Betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 229940057059 Monascus purpureus Drugs 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006750 UV protection Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003178 anti-diabetic Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000019463 artificial additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical Effects 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-VYAWBVGESA-N beta-Carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C/C=C/C(/C)=C\C=C\C=C(\C)/C=C/C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-VYAWBVGESA-N 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- 231100000693 bioaccumulation Toxicity 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large scale production Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000978 natural dye Substances 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000485 pigmenting Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000013597 soy food Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003735 xanthophylls Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению астаксантина, и может быть использовано в микробиологической промышленности. Предложен способ приготовления питательной среды для культивирования дрожжей Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). В качестве компонентов ферментационной среды для культивирования используют соевую мелассу в количестве, обеспечивающем общее содержание сахаров в питательной среде 14–21 г/л, и остаточные пивные дрожжи в количестве, обеспечивающем содержание 2±0.2 г сухих веществ дрожжевого экстракта на литр питательной среды. Изобретение обеспечивает увеличение количества биомассы на 34%, а концентрации астаксантина (г/л) – на 13%. 3 табл.
Description
Техническая область: Настоящее изобретение относится к способу приготовления питательной среды для культивирования дрожжей Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), продуцирующих астаксантин, в котором используются такие возобновляемые ресурсы как соевая меласса и остаточные пивные дрожжи в качестве недорогих компонентов питательной среды.
Предпосылки: Астаксантин (3,3'-дигидрокси-4,4'-дикето-β-β-каротин; C40H52O4) представляет собой красно-оранжевое жирорастворимое ксантофилловое производное β-каротина, продуцируемое почти исключительно микроорганизмами, преимущественно Haematococcus pluvialis, в значительной степени Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), а также некоторыми бактериями. Он также накапливается в большом количестве в морских организмах, таких как лососевые и ракообразные, в результате биоаккумуляции из корма. Астаксантин является одним из наиболее важных микробных каротиноидов в промышленном и экономическом отношении. Особенно он известен благодаря своей выдающейся антиоксидантной активности. Кроме того, было показано, что астаксантин проявляет и другие виды биологической активности как in vitro, так и in vivo, включая кардио- и нейропротекторные эффекты, антидиабетическую и противораковую активность, иммуномодуляцию, а также противовоспалительную активность и активность против перекисного окисления липидов. Благодаря этим свойствам астаксантин является привлекательным веществом с точки зрения здоровья и питания человека, благодаря чему он пользуется большим спросом в качестве нутрицевтика. Несколько исследований на животных показали, что астаксантин полезен для кожи, поскольку он обеспечивает защиту от ультрафиолетового излучения и обладает омолаживающими свойствами, поэтому он также представляет большой интерес в косметической промышленности. Помимо этого, астаксантин является отличным пигментирующим веществом, и имеет ценность в пищевой промышленности в качестве натурального красителя и, в частности, в аквакультуре для окрашивания мяса лососевых рыб и экзоскелета ракообразных. Также астаксантин применяется для получения полноценных кормов для сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей.
В настоящее время доступный на мировом рынке астаксантин в основном производится путем химического синтеза, он в основном используется для аквакультуры и состоит из всех трех стереоизомеров астаксантина: (3S,3'S), (3R,3'S)/(3S,3'R) и (3R,3'R). Смесь изомеров в сочетании с растущими опасениями по поводу синтетических добавок делает химически синтезированный астаксантин непривлекательным для потребления человеком. Следовательно, существует растущий спрос на астаксантин из природных источников в пищевой, нутрицевтической и косметической промышленности. В настоящее время основным коммерческим источником природного астаксантина являются очень требовательные пресноводные водоросли Haematococcus pluvialis, которые продуцируют в основном (3S,3’S) изомер астаксантина, преобладающий в природе. Наряду с пресноводными водорослями менее требовательными являются красные базидиальные дрожжи Xanthophyllomyces dendrorhous, которые продуцируют главным образом изомер (3R,3’R) в качестве основного каротиноида. Хотя их продуктивность по астаксантину относительно низка, Xanthophyllomyces dendrorhous привлекли большое внимание как подходящий источник природного астаксантина. При этом, по сравнению с Haematococcus pluvialis, Phaffia rhodozyma имеет более высокие темпы роста и более простые условия культивирования, плюс дрожжи способны использовать различные источники углерода. Таким образом, благодаря своей способности использовать различные источники углерода и азота Xanthophyllomyces dendrorhous можно выращивать на дешевых альтернативных источниках среды, чтобы немного снизить себестоимость производства природного астаксантина. С этой целью многообещающим подходом является использование агропищевых отходов/побочных продуктов в качестве недорогих альтернатив среды для выращивания этих дрожжей и последующего производства астаксантина. Помимо потенциального снижения себестоимости производства природного астаксантина, выращивание P. rhodozyma на агропищевых отходах служит альтернативным способом утилизации этих отходов, что снижает воздействие на окружающую среду, связанное с утилизацией этих отходов/побочных продуктов.
В качестве источника углерода в питательной среде для культивирования P. rhodozyma чаще всего применяется глюкоза, в качестве источников азота - коммерческий дрожжевой экстракт и пептон. Стандартной средой для культивирования P. rhodozyma считается среда YPG, содержащая 0,2% дрожжевого экстракта, 1% пептона и 2% глюкозы.
Известен способ культивирования различных штаммов P. rhodozyma и получения астаксантина (US 6413736 B1), в котором в качестве источника углерода в питательных средах используется техническая глюкоза, в качестве источника азота - дрожжевой экстракт и/или пептон. Также в состав питательной среды добавляются различные витамины и минеральные вещества. Показано, что возможной является частичная замена глюкозы глицерином.
В патенте US 2005/0124032 А1 описан метод культивирования дрожжей P. rhodozyma на питательной среде в состав которой входит глюкоза, дрожжевой экстракт и мука семян хлопка, витамины биотин, тиамин, пантотенат кальция и соли KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O, (NH4)2SO4, NaCl, CaCl2, СаСО3.
Известен способ культивирования высокопродуктивных штаммов P. rhodozyma (EP 1 479 777 A1) с применением сред, содержащих в основе дрожжевой экстракт, муку семян хлопка, глюкозу и кукурузный экстракт, а также витамины биотин, тиамин, пантотенат кальция и большое количество различных минеральных солей.
В патенте RU2529715C2 представлен метод культивирования P. rhodozyma с применением питательных сред, на основе ферментолизата крахмала, полученного дроблением некондиционного зерна с последующим разделением на фракции и отхода крахмалопаточного производства - кукурузного экстракта в качестве источника органического азота, а также сульфата аммония.
Наиболее близким настоящему изобретению является метод, описанный в патенте CN103820520B, где для культивирования высокопродуктивного штамма используется питательная среда, содержащая в качестве источников углерода сопутствующие продукты и отходы сельского-производства, такие как початки кукурузы, семена риса и тростниковую патоку, предварительно обработанные и осахаренные.
Настоящее изобретение описывает способ использования соевой мелассы и остаточных пивных дрожжей в качестве дешевых компонентов ферментационной среды для культивирования продуцирующих астаксантин дрожжей Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). Следует отметить, что в связи с активным развитием рынка сои и индустрии соевых пищевых продуктов в перспективе количество отходов, в том числе соевой мелассы, будет возрастать.
Краткое изложение изобретения: Настоящее изобретение раскрывает способ дешевого культивирования Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) и биосинтеза астаксантина. В частности, изобретение относится к культивированию красных дрожжей Phaffia rhodozyma в ферментационной среде, состоящей исключительно из соевой мелассы (SM) и дрожжевого экстракта (YE), полученного из остаточных пивных дрожжей. Изобретение включает стадии: 1) Приготовление и стерилизация ферментационных сред на основе соевой мелассы, содержащих 3-10 % масс./об. соевой мелассы (предпочтительно 4-6 %), которые содержат 30-35 % масс./об. общего сахара, и 0,2 % масс./об. дрожжевого экстракта. 2) Получение дрожжевого экстракта может быть осуществлено из остаточных пивных дрожжей, включая следующие стадии: центробежное отделение остаточных дрожжевых клеток от избыточного пива, промывка клеток несколько раз водой, суспендирование клеток в воде, экстракция растворимых компонентов дрожжей путем автолиза, обработки ультразвуком или автоклавирования, центробежного отделения клеточного дебриса и сушки экстракта. 3) Инокуляция ферментационной среды в питательную среду, приготовленную на стадии (1) 48-часовой посевной культурой штамма Phaffia rhodozyma. 4) Инкубация культуры на роторном шейкере в течение 5 дней при 12°C при постоянном освещении и встряхивании со скоростью 150 об/мин. 5) Сбор клеток центрифугированием суспензионной культуры, двукратное центрифугирование клеток с водой для промывки. 6) Извлечение продукта ферментации, астаксантина, из клеток дрожжей, включающее стадии: разрушение клеток, экстракцию астаксантина, выпаривание растворителя и количественное определение астаксантина.
Настоящее изобретение раскрывает метод получения дешевой питательной среды, пригодной для роста Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). Настоящее изобретение также направлено на создание альтернативного способа повышения ценности соевой мелассы и остаточных пивных дрожжей, чтобы снизить воздействие этих промышленных отходов на окружающую среду.
Подробное описание: Настоящее изобретение описывает способ дешевого культивирования продуцента астаксантина - Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) в культуральной среде, состоящей из соевой мелассы в качестве единственного источника углерода и дрожжевого экстракта. Техническая схема настоящего изобретения, описанная ниже, относится к культурам во встряхиваемых колбах. Однако настоящее изобретение может быть адаптировано для крупномасштабного производства специалистами в данной области с использованием соответствующих технологий, устройств и оборудования, известных в данной области. Объем настоящего изобретения не должен ограничиваться приведенными ниже описаниями и может быть соответствующим образом изменен без отклонения от сущности настоящего изобретения. Для достижения цели изобретение принимает следующую техническую схему:
Приготовление среды на основе глюкозы: среда на основе глюкозы (YPG) состоит из 0,2% дрожжевого экстракта, 1% пептона и 2% глюкозы. Два раствора, один из которых содержал желаемое количество пептона и дрожжевого экстракта, растворенных примерно в 20% от общего количества необходимой воды, а другой состоял из глюкозы, растворенной в оставшейся части от общего количества необходимой воды, готовили в отдельных конических колбах с ватными пробками и автоклавировали при 121°C в течение 20 мин. После охлаждения до комнатной температуры два раствора смешивали в стерильных условиях, получая среду YPG, содержащую на литр 20 г глюкозы, 2 г дрожжевого экстракта и 10 г пептона. При необходимости добавляется стерильная вода для компенсации потери объема во время стерилизации. Эту среду использовали для приготовления посевной культуры и в качестве контрольной среды в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.
Приготовление среды на основе соевой мелассы: желаемое количество соевой мелассы (SM) точно отвешивают в коническую колбу с ватным тампоном. Добавляют около трех четвертей от общего количества воды, необходимого для достижения желаемой концентрации, и тщательно перемешивают. Требуемое количество дрожжевого экстракта для получения конечной концентрации 0,2 % мас./об. полученной среды точно взвешивают и растворяют в оставшейся части воды в отдельной конической колбе с ватным тампоном. Два раствора автоклавируют и смешивают в стерильных условиях, чтобы получить среду на основе SM. При необходимости добавляется стерильная вода для компенсации потери объема жидкости во время стерилизации. Конечная концентрация сахара в среде предпочтительно должна составлять 14-21 г/л, наиболее предпочтительно 17,5 г/л. В этом отношении общая концентрация сахара в используемой мелассе не является критической для изобретения при условии, что концентрация сахара в конечной среде находится в предпочтительных пределах. Кроме того, пропорция общего объема воды, необходимая для приготовления раствора глюкозы и дрожжевого экстракта, не является критической для настоящего изобретения, при условии, что желаемая концентрация каждого компонента достигается при смешивании двух растворов. Кроме того, среды на основе СМ могут быть дополнены витаминами и минералами. Необязательно, но меласса может быть предварительно обработана для удаления примесей и осахаривания. Кроме того, в процессе промышленного масштаба пеногаситель может быть добавлен к среде до и/или во время процесса ферментации. Кроме того, дрожжевой экстракт можно дешево получить из остаточных дрожжей и использовать для приготовления этой среды.
Приготовление дрожжевого экстракта из остаточных пивных дрожжей: Что касается приготовления среды на основе SM, описанной выше, дрожжевой экстракт может быть получен из коммерческих источников или, что более предпочтительно, дрожжевой экстракт может быть дешево получен из остаточных дрожжей после промышленной ферментации с Saccharomyces cerevisiae, где дрожжевая биомасса является побочным продуктом. Наиболее предпочтительны остаточные пивные дрожжи. Однако источник остаточных дрожжей для производства дрожжевого экстракта не является критическим для настоящего изобретения, при условии, что остаточные дрожжевые клетки не лишены основных компонентов, характерных для коммерческого дрожжевого экстракта, и при условии, что остаточные дрожжи не накапливают вещества, вредные для роста Xanthophyllomyces dendrorhous, биосинтеза астаксантина или здоровья человека и животных, например, таких как тяжелые металлы.
Для предварительной обработки остаточные дрожжи отделяли от оставшегося пива центрифугированием (4470×g в течение 10 мин). Осадок клеток несколько раз промывали дистиллированной водой до тех пор, пока надосадочная жидкость после центрифугирования не становилась прозрачной.
Метод 1. (Автолиз) Готовили клеточную суспензию, содержащую 40 г влажных остаточных клеток дрожжей в 400 мл дистиллированной воды. Для определения массы сухих клеток отбирали 5 мл суспензии. Затем рН оставшейся суспензии доводили до 6. Суспензию клеток распределяли по 13 коническим колбам с ватными пробками (вместимостью 250 мл) и инкубировали при 50°С при постоянном перемешивании при 150 об/мин в течение 24 часов. Через 24 часа суспензию объединяли и нагревали при 80° в течение 30 минут на магнитной мешалке, а затем охлаждали до комнатной температуры. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием (4470×g в течение 10 мин). Водный экстракт обезвоживали с использованием вакуумного ротационного испарителя при 65°С. Высушенный экстракт взвешивали и затем хранили в герметичной таре для последующего использования. Определяли содержание общего белка, общего содержания сахара, а также элементный анализ дрожжевого экстракта.
Метод 2 (Автоклавирование) Готовили суспензию клеток, содержащую 40 г влажных остаточных клеток дрожжей в 400 мл дистиллированной воды. Для определения массы сухих клеток отбирали 5 мл суспензии. Суспензию распределяли по 4 коническим колбам (вместимостью 1 л) и автоклавировали при 115°С в течение 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры водный экстракт отделяли центрифугированием (4470×g, 10 мин) и обезвоживали с использованием вакуумного ротационного испарителя при 65°С. Высушенный экстракт взвешивали и затем хранили в герметичной таре для последующего использования. Определяли содержание общего белка, общего содержания сахара, а также элементный анализ дрожжевого экстракта.
Метод 3 (Ультразвуковая обработка) Готовили суспензию клеток, содержащую 40 г влажных остаточных клеток дрожжей в 400 мл дистиллированной воды. Для определения массы сухих клеток отбирали 5 мл суспензии. Суспензию подвергали ультразвуковой обработке (80 кГц, 100% мощность, 30-50°C) в течение 30 мин, по 200 мл за раз. После охлаждения до комнатной температуры водный экстракт отделяли центрифугированием (4470×g, 10 мин) и обезвоживали с использованием вакуумного ротационного испарителя при 65°С. Высушенный экстракт взвешивали и затем хранили в герметичной таре для последующего использования. Определяли содержание общего белка, общее содержания сахара, а также проводили элементный анализ дрожжевого экстракта.
Приготовление посевной культуры: две-три бактериологической петли свежевыращенного (возрастом менее 1 недели) штамма Phaffia rhodozyma на чашке с агаризованной средой (2% глюкозы, 1% пептона, 0,2% дрожжевого экстракта и 0,9% агара) суспендировали в стерильной дистиллированной воде. Один миллилитр этой клеточной суспензии использовали для инокуляции каждых 50 мл питательной среды (содержащей 2% глюкозы, 1% пептона и 0,2% дрожжевого экстракта) в конической колбе с ватно-марлевой пробкой. Затем полученную суспензию инкубировали на орбитальном шейкере в течение 48 часов при 18°С при постоянном освещении белым светом и перемешивании со скоростью 150 об/мин. Далее суспензия использовали как посевную культуру. Подготовка посевной культуры не обязательно ограничивается использованием YPG, ее можно получить путем ферментации на среде, приготовленной на основе SM.
Культивирование Phaffia rhodozyma и продукция астаксантина: Вышеупомянутую посевную культуру инокулировали в стерильную среду на основе SM при 10% об./об. Полученную культуру инкубировали при 12°C при постоянном освещении (белый свет) и перемешивании при 150 об/мин в течение 5-7 дней, предпочтительно 5 дней. В некоторых вариантах осуществления этот процесс повторяли со средой YPG для сравнения. В конце периода ферментации количественно определяли содержание астаксантина, сухую массу клеток и остаточный сахар в среде. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения были использованы штаммы Phaffia rhodozyma Y1655, Y1654 и Y989, приобретенные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», г. Москва. Что касается настоящего изобретения, то условия культивирования (температура и свет) специфичны для этих штаммов. Различные штаммы Phaffia rhodozyma можно культивировать на средах на основе SM, раскрытых в настоящем изобретении, где используются условия культивирования, оптимальные для продукции астаксантина указанным штаммом (штаммами). В соответствии со способом по настоящему изобретению также могут быть использованы мутантные штаммы с повышенной продуктивностью астаксантина. Количество остаточного сахара в конце периода ферментации должно составлять приблизительно менее 40% от исходной общей концентрации сахара, наиболее предпочтительно близко к нулю. Содержащая астаксантин биомасса Phaffia rhodozyma, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может быть использована непосредственно, как клеточный концентрат, влажные клетки, сухие клетки и клеточный лизат. Также из полученной биомассы, может быть получен экстракт астаксантина или кристаллический астаксантин путем экстракции, очистки и т.п. Экстракцию астаксантина из биомассы Phaffia rhodozyma и/или ее очистку можно проводить с использованием любого метода, позволяющего эффективно и стабильно собирать каротиноид. Биомасса, продукты полученные на ее основе, экстракт астаксантина или очищенный астаксантин, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы отдельно в качестве источника каротиноида или могут быть смешаны и использованы в заданных пропорциях.
Определение массы высушенных клеток. Клетки из 5 мл культурального бульона отделяли центрифугированием при 4470×g в течение 10 мин. Осадок клеток дважды промывали водой, каждый раз отделяя клетки центрифугированием при 4470×g в течение 10 мин, а затем сушили при 50°C в сушильном шкафу до постоянной массы.
Определение содержания сахара: аликвоту супернатанта культурального бульона после отделения клеток центрифугированием соответствующим образом разбавляли до 10 мл. Два миллилитра разведенного образца переносили в пробирку и смешивали с 50 мкл 80%-ного водного раствора фенола. Добавляли 5 мл концентрированной серной кислоты, направляя струю кислоты против поверхности жидкости, перемешивали и выдерживали в темноте 10 мин. Полученную смесь охлаждали в воде при 25°C в течение 10 минут и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при 487 нм относительно холостого опыта, при этом вместо образца использовали 2 мл дистиллированной воды. Остаточный сахар определяли количественно, используя калибровочную кривую для глюкозы, принимая во внимание фактор разбавления образца.
Определение содержания астаксантина. Клетки собирали из 10 мл культурального бульона центрифугированием при 4470×g в течение 10 мин с последующим центробежным промыванием клеточного осадка дважды водой. Клетки суспендировали в 2 мл диметилсульфоксида и помещали в ультразвуковую ванну при мощности 60 Вт на 15 мин для разрушения клеток. Полученную смесь экстрагировали в течение 5 мин петролейным эфиром (фракция 40-60). Органическую фазу, содержащую астаксантин, собирали после центрифугирования при 4470×g в течение 10 мин. процесс экстракции повторяли до тех пор, пока фаза петролейного эфира после центрифугирования не перестает быть окрашенной. Фазы петролейного эфира, содержащие астаксантин, объединяли и растворитель отгоняли на вакуумном ротационном испарителе. Экстракт растворяли в ацетонитриле и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при 478 нм относительно ацетонитрила в качестве контроля. Содержание астаксантина определяли количественно с помощью калибровочной кривой.
Вариант 1. Для этого эксперимента 100 мл посевной культуры штамма Y1655 Phaffia rhodozyma готовили в стерильной конической колбе на 250 мл с ватно-марлевой пробкой. Стерильные среды на основе SM, состоящие из 5% соевой мелассы (с общим содержанием сахара 35%) и 0,2% коммерческого дрожжевого экстракта, готовили, как описано выше. Полученная ферментационная среда содержала общий сахар 21 г/л. Три конические колбы по 250 мл с ватно-марлевыми пробками, содержащие по 100 мл питательной среды на основе соевой мелассы, инокулировали 10 мл 48-часовой посевной культуры штамма Y1655 Phaffia rhodozyma, содержащей приблизительно 1,76×10^8 клеток на мл. Затем культуры инкубировали при 12°С при постоянном освещении (белый свет) и перемешивании при 150 об/мин в течение 5 дней. Для сравнения параллельно проводили аналогичный эксперимент со средой на основе глюкозы YPG, содержащей 2 % глюкозы, 1 % пептона и 0,2 % дрожжевого экстракта. В последний день ферментации количественно определяли содержание астаксантина, массу сухих клеток и остаточный сахар в среде. Количество астаксантина и биомассы, полученных с использованием среды на основе SM, составляло 1,92 мг/л и 6,32 г/л соответственно, что сравнимо с количеством, полученным с YPG, 2,12 мг/л и 6,24 г/л для астаксантина и биомассы соответственно.
Вариант 2. 100 мл посевной культуры штамма Y1655 Phaffia rhodozyma готовили в стерильной конической колбе с ватным тампоном объемом 250 мл. Стерильные среды на основе SM, состоящие из 0,2 % коммерческого дрожжевого экстракта и разной концентрации 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % и 10 % соевой мелассы (с общим содержанием сахара 35 %). готовили, как описано выше. Полученная ферментационная среда содержала на литр общее количество сахара 10,5 г, 14 г, 17,5 г, 21 г, 24,5 г, 28 г, 31,5 г и 35 г соответственно. Для каждой среды на основе SM в три конические колбы на 250 мл с ватно-марлевыми пробками, каждая из которых содержала 100 мл среды, инокулировали 10 мл 48-часовой посевной культуры штамма Y1655 Phaffia rhodozyma, содержащей прибл. 1,5×10^8 клеток на мл. Затем культуры инкубировали при 12°С при постоянном освещении (белый свет) и перемешивании при 150 об/мин в течение 5 дней. Для сравнения параллельно проводили аналогичный эксперимент со средой на основе глюкозы YPG, содержащей 2 % глюкозы, 1 % пептона и 0,2 % дрожжевого экстракта. В последний день ферментации измеряли содержание астаксантина, сухую массу клеток, а также содержание остаточного сахара в средах. В таблице 1 показаны результаты.
Вариант 3. Для этого эксперимента 100 мл посевной культуры штамма Y1655 Phaffia rhodozyma готовили в стерильной конической колбе на 250 мл с ватно-марлевой пробкой. Дрожжевой экстракт из остаточных пивных дрожжей готовили автолизом (А), автоклавированием (В) или обработкой ультразвуком (С), как описано выше. Стерильные среды на основе SM, состоящие из 5% соевой мелассы (с общим содержанием сахара 35%) и 0,2% различных дрожжевых экстрактов из остаточных пивных дрожжей, приготовленных, как описано выше. Полученная питательная среда содержит 17,5 г/л общего сахара. Для каждой среды на основе SM в три конические колбы на 250 мл с ватно-марлевыми пробками, каждая из которых содержала 100 мл среды, инокулировали 10 мл 48-часовой посевной культуры штамма Y1655 Phaffia rhodozyma, содержащей прибл. 2,26×10^8 клеток на мл. Для сравнения аналогичный эксперимент с 5% средой на основе SM с использованием коммерческого дрожжевого экстракта (S). В последний день ферментации измеряли содержание астаксантина, массу сухих клеток, а также содержание остаточного сахара в средах. В таблице 2 показаны результаты.
Таблица 2.
Вариант 4. Для этого эксперимента 100 мл посевной культуры штаммов Y1655, Y1654 и Y989 Phaffia rhodozyma готовили отдельно в стерильной конической колбе с ватным тампоном на 250 мл. Стерильные среды на основе СМ, состоящие из 5% соевой мелассы (с общим содержанием сахара 35%) и 0,2% различных дрожжевых экстрактов из остаточных пивных дрожжей (полученных путем автолиза), готовили, как описано выше. Полученная ферментационная среда содержит общий сахар 17,5 г/л. Для каждого штамма в три 250-мл конических колбы с ватными пробками, каждая из которых содержала 100 мл среды, инокулировали 10 мл 48-часовой посевной культуры, содержащей прибл. 1,01×10^8 клеток/мл (для штамма Y1655), 1,0×10^8 клеток/мл (для штамма Y1654) и 1,25×10^8 клеток/мл (для штамма Y989). Для сравнения аналогичный эксперимент с 5% средой на основе СМ с использованием коммерческого дрожжевого экстракта. Содержание астаксантина, массу сухих клеток, а также содержание остаточного сахара в средах определяли в последний день ферментации. В таблице 3 показаны результаты.
Claims (1)
- Способ приготовления питательной среды для культивирования дрожжей, продуцирующих астаксантин, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) на основе отходов пищевых производств, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют соевую мелассу с известным содержанием сахаров, добавленную в количестве, обеспечивающем общее содержание сахаров в питательной среде 14–21 г/л, наиболее предпочтительно 17,5 г/л, и источник азота в виде дрожжевого экстракта коммерческого или приготовленного из остаточных пивоваренных дрожжей методом автолиза, автоклавирования или ультразвуковой обработкой с последующим определением содержания сухих веществ, добавленного в количестве, обеспечивающем содержание 2±0.2 г сухих веществ дрожжевого экстракта на литр питательной среды.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2785792C1 true RU2785792C1 (ru) | 2022-12-13 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2273667C2 (ru) * | 2001-06-25 | 2006-04-10 | ООО Научно-производственная компания "Фермтек" | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Xanthophyllomyces dendrorhous - ПРОДУЦЕНТ АСТАКСАНТИНА |
RU2529715C2 (ru) * | 2011-03-22 | 2014-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ФБТ" | Способ культивирования дрожжей phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин |
CN103820520B (zh) * | 2014-03-06 | 2017-02-01 | 浙江皇冠科技有限公司 | 一种高产天然虾青素的发酵方法 |
RU2631803C2 (ru) * | 2015-09-04 | 2017-09-26 | Людмила Сергеевна Герман | Способ культивирования клеток дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки, содержащей каротиноид астаксантин |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2273667C2 (ru) * | 2001-06-25 | 2006-04-10 | ООО Научно-производственная компания "Фермтек" | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Xanthophyllomyces dendrorhous - ПРОДУЦЕНТ АСТАКСАНТИНА |
RU2529715C2 (ru) * | 2011-03-22 | 2014-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ФБТ" | Способ культивирования дрожжей phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин |
CN103820520B (zh) * | 2014-03-06 | 2017-02-01 | 浙江皇冠科技有限公司 | 一种高产天然虾青素的发酵方法 |
RU2631803C2 (ru) * | 2015-09-04 | 2017-09-26 | Людмила Сергеевна Герман | Способ культивирования клеток дрожжей Phaffia rhodozyma для получения белково-витаминной добавки, содержащей каротиноид астаксантин |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102787158B (zh) | 一种发酵法生产天然β-胡萝卜素的方法和应用 | |
Bhosale et al. | β-carotene production in sugarcane molasses by a Rhodotorula glutinis mutant | |
CN107287252B (zh) | 一种ω-7脂肪酸合成物及培养黄丝藻生产该合成物的方法与应用 | |
US20040077036A1 (en) | Process to produce astaxanthin from haematococcus biomass | |
CN101705193B (zh) | 产虾青素海洋红酵母ys-185及其虾青素的制造方法 | |
CN101680015A (zh) | 通过发酵组成性过产类胡萝卜素的选定菌株或突变体生产高纯度类胡萝卜素的方法 | |
WO2010044469A1 (ja) | カロテノイドの発酵法 | |
CN104404118B (zh) | 一种利用海水促进雨生红球藻生产天然虾青素的方法 | |
CN105506048B (zh) | 一种利用三孢布拉霉菌制备β-胡萝卜素的发酵方法 | |
EP0608172B1 (fr) | Mutants de Phaffia Rhodozyma, procédé de production de beta-carotène et utilisation de biomasse riche en beta-carotène | |
AU2010208932B2 (en) | Method for separating carotenoid | |
CN101812497B (zh) | 一种虾青素的工业制备方法 | |
Elsanhoty et al. | Production of carotenoids from Rhodotorula mucilaginosa and their applications as colorant agent in sweet candy | |
Zheng et al. | Large-scale production of astaxanthin by Xanthophyllomyces dendrorhous | |
Zhang et al. | High-density cultivation of Phaffia rhodozyma SFAS-TZ08 in sweet potato juice for astaxanthin production | |
CN100447233C (zh) | 一种中温型虾青素产生菌及其培养方法 | |
CN1124350C (zh) | 草酸青霉亚美尼亚变种的菌株及其应用 | |
RU2785792C1 (ru) | Способ приготовления питательной среды для культивирования дрожжей xanthophyllomyces dendrorhous (phaffia rhodozyma) на основе соевой мелассы и дрожжевого экстракта | |
CN113512504B (zh) | 一株产虾青素菌株及其应用 | |
CN104046674B (zh) | 一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和应用 | |
CN103436585A (zh) | 一种通过发酵乳杆菌生产虾青素的方法 | |
CN103849575A (zh) | 一种单细胞蛋白的生产方法 | |
RU2529715C2 (ru) | Способ культивирования дрожжей phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин | |
CN112143770A (zh) | 一种海洋红酵母及其在以秸秆为原料生产β-胡萝卜素中的应用 | |
CN109673815B (zh) | 发酵制备富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料以及制备方法 |