CN104046674B - 一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产β‑胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和应用。该改良玉米浆是将玉米浆原料与Na₂S混合后充分反应后离心，上清液调pH=6.3‑6.7而得。本发明通过物理和化学手段预处理玉米浆，最终得到三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271（+）和三孢布拉氏霉负菌ATCC 14272（‑）可以充分利用的原料，利用本发明的改良玉米浆为原料发酵可获得较高的β‑胡萝卜素得率，干菌丝体中β‑胡萝卜素含量：2%‑6%（W/W）。

Description

一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于利用农副资源制备β-胡萝卜素的生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和应用。

背景技术

β-胡萝卜素(β-carotene)是类胡萝卜素的一种，其作为微生物A原被联合国粮农组织（AFO）和世卫组织（WHO）认定为无毒、安全、有营养的A类食品强化剂。另外，β-胡萝卜素作为抗氧化剂具有良好的抗氧化性，在预防和治疗心血管疾病、白内障及抗癌等许多由衰老引起的退化性疾病上有明显的功能。再者，β-胡萝卜素同时作为一种食品添加剂，由于其是脂溶性化合物，并且它不同浓度的显色差异，可涵盖由红色至黄色的所有色系，因此也是广泛使用的食品级色素。

β-胡萝卜素的生产方法主要有化学合成法、天然提取法、微生物发酵法。其中化学合成法主要采用化学原料化学合成β-胡萝卜素，但是化学合成的β-胡萝卜素为全反式结构，有微量的毒副作用且不能被人体完全吸收。天然提取法主要采用有机溶剂萃取或超临界流体萃取天然植物例如杜氏藻、番茄、棕榈、胡萝卜等中的β-胡萝卜素，但是使用有机溶剂萃取会造成一定程度的环境污染，且不易回收，存在许多的弊端。微生物发酵法通过微生物培养在其体内合成 β-胡萝卜素，然后从菌体内分离纯化得到β-胡萝卜素。目前国内外利用微生物发酵生产β-胡萝卜素主要集中在红酵母、三孢布拉霉菌和克拉克须霉菌上。三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）属于真菌门藻菌纲毛霉目笄霉科，利用三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素最重要的就是其易培养、产量高。三孢布拉氏霉菌有正负菌之分，研究发现，将正菌，负菌单独培养时，能产生无性孢子和少量的类胡萝卜素，而将正负菌混合培养时能大大提高类胡萝卜素的产量。这是因为在混合培养时负菌会产生酸性物(三孢酸、β-因子等),刺激类胡萝卜素的形成，相比于其他微生物,三孢布拉霉在生产β-胡萝卜素方面优势显著，因而其是目前生产β-胡萝卜素的首选菌株。

利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的培养基为无毒的天然培养基，且利用三孢布拉氏霉菌发酵制备的β-胡萝卜素是顺反式β-胡萝卜素混合物。然而利用化学试剂人工合成的β-胡萝卜素大部分都是反式异构体，例如中国专利CN101081829A公开了一种利用偶联反应得到β-胡萝卜素的新工艺，其在氧化剂存在下，在水相及与水不互溶的有机溶剂两相体系存在下进行偶联反应后得到β-胡萝卜素。又如中国专利CN101088989A公开了一种利用C₂₂二炔多烯化合物为原料生产β-胡萝卜素的方法。中国专利CN1935789A公开了一种全反式β-胡萝卜素的制备方法，质量比为1∶1～10的β-胡萝卜素与高沸点低毒的极性溶剂在70℃～160℃下混合,于氮气保护下避光 反应10小时～30小时,过滤并水洗、干燥得到全反式β-胡萝卜素。在提取方面，中国专利CN1948284A公开了一种以枸杞为原料通过粉碎、浸泡、离心粗分离、高速分离、真空冷冻干燥、萃取等步骤制备β-胡萝卜素的方法。

在利用微生物发酵制备β-胡萝卜素方面，中国专利CN1687446A公开了一种利用水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)采用液体深层发酵技术制备β-胡萝卜素的方法。其培养液经离心得菌体,菌体用丙酮等有机溶剂提取,真空浓缩除去有机溶剂或进一步进行硅胶柱层析等分离后,即可配制成不同含量、不同用途的β-胡萝卜素产品。中国专利CN101008000A公开了一种利用粘性红圆酵母生产β-胡萝卜素的方法。又如中国专利CN102757995A公开了一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，包括将三孢布拉氏霉菌ATCC14271（+）和ATCC14272（-）活化后，经过种子培养，在优选的发酵工艺条件下按一定的接种量和接种比接入发酵培养基中发酵，最终得到β-胡萝卜素含量较高的菌丝体，其创新点是采用麸皮浸提物为主要发酵培养基，然而麸皮浸提物制备需煮沸1小时，过滤较困难，会产生固体废弃物，造成生产效率低，增加能耗，影响环境。

玉米浆是指玉米粒经亚硫酸浸泡后浓缩而成的黄褐色液体，其中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，是氨基酸发酵中的重要复合原料。玉米浆含有丰富的有机氮、生长因子等营养成分，可用作微生物发酵培养基。中国专利CN103330050A公开了一种利用食品加工副产物玉米浆与水稻秸通过添加乳酸菌制剂生产混合发酵饲料的技术，稻秸通过与玉米浆的混合，使发酵饲料的粗蛋白质含量显著增加。中国专利CN103461654A公开了一种玉米浆生产酒糟蛋白饲料的方法，经过微生物发酵处理，并配合发酵全自动培养控制，可以得到与之等效的酒糟蛋白饲料，并增加了酒糟蛋白饲料的功能，实现了废物再利用的方法。但这只是用于一些粗放的、附加值低的发酵产品生产，其用量小，价值没有得到充分体现。

中国专利CN102373247B公开了一种改良玉米浆的制备方法及其应用，该专利利用蛋白质盐析的原理，将玉米浆与盐溶液混合使玉米浆中的蛋白质沉淀析出，加热使蛋白质变性并将变性的蛋白质进行分离，得到改良的玉米浆。此方法制备得到的改良的玉米浆应用于发酵赖氨酸的发酵液中，避免了因玉米浆中蛋白质含量过高而引起的对微生物发酵生产造成的不良影响，从而显著提高了赖氨酸的产率。

目前，随着玉米淀粉产量的不断增长，玉米浆的产量也相应增加，将其用作发酵产品生产的培养基，生产各类高附加值产品有着非常重要的意义，如何扩展玉米浆的用途就显得更为突出。由于玉米浆组分复杂，pH低，不能直接用于发酵产品生产，因此为实现将其作为发酵培养基组分的目的，其预处理方法研究显得十分必要。

发明内容

本发明解决的技术问题是将玉米浆通过预处理加以改良，然后利用改良后的玉米浆作为氮源和营养成分发酵生产β-胡萝卜素。因此，本发明的目的在于提供一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆及其制备方法和应用。

为了实现本发明，发明人通过大量试验反复研究，并最终获得了如下改良玉米浆及其制备工艺：

一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆，所述的改良玉米浆是将玉米浆原料与Na₂S混合后充分反应后离心，上清液调pH=6.3-6.7而得。

一种发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，该方法包括如下步骤：取玉米浆原料，加入0.1-0.8%（W/V）的Na₂S，搅拌使其充分反应，离心，上清液调pH=6.3-6.7，得改良玉米浆。

优选地，如上所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其中所述的离心步骤的条件是5000-8000rpm/min离心10-20min。

优选地，如上所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其中所述的上清液在调pH前进行抽虑处理，所述的抽滤步骤为：用装有7～9cm定性滤纸的布氏漏斗抽虑上清液。

优选地，如上所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其中采用强碱调节所述的上清液pH=6.5。

进一步优选地，如上所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其中所用的强碱为氢氧化钠。

本发明人通过试验研究发现，采用上述工艺改良后的玉米浆可以被三孢布拉霉正负菌充分利用，从而更为高产地发酵制备了天然优质的β-胡萝卜素。因此，本发明的还提供了一种工业新用途，即：上述改良玉米浆在发酵生产培养发酵三孢布拉霉正负菌制备β-胡萝卜素中的应用。

优选地，如上所述的三孢布拉霉正负菌为为三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271（+）和三孢布拉氏霉负菌ATCC 14272（-）。

与现有技术相比，本发明通过物理和化学手段预处理玉米浆，最终得到三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271（+）和三孢布拉氏霉负菌ATCC 14272（-）可以充分利用的原料，利用本发明的改良玉米浆为原料发酵可获得较高的β-胡萝卜素得率，干菌丝体中β-胡萝卜素含量：2.5%-6%（W/W）。

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施案例一：玉米浆的预处理

玉米浆购置于山东潍坊盛泰药业有限公司，生产日期2013年6月23号。

1、利用高效液相色谱（HPLC）、原子吸收光谱等仪器设备检测玉米浆中各组分含量。结果见表1。

表1 玉米浆中各组分含量

组分	含量（mg/kg）
		Ca	440
Cu	0.18
		Mg	3500
Zn	61
		Fe	396
Mn	28.8
		K	15200
葡萄糖	13.2
		麦芽糖	2.182
还原糖	7.55
		总糖	17.32
有机磷	9.261
		无机磷	4.553
氨基酸合计	101236
		总氮	42.715g/L

2、加入0.5%（W/V）的Na₂S处理玉米浆，使用搅拌器使其充分反应。

3、将所得玉米浆于8000rpm/min离心10min，将所得上清液再用装有7～9cm定性滤纸的布氏漏斗抽虑得滤液。

4、使用10-20%（W/V）的氢氧化钠调节抽虑后的玉米浆至pH6.5，得改良玉米浆。

⑤改良玉米浆经高效液相色谱（HPLC）、原子吸收光谱等仪器设备检测表明对发酵三孢布拉氏霉菌存在不利因素金属离子基本去除。

实施案例二：摇瓶中利用未处理玉米浆生产制备β-胡萝卜素

1.菌株：

三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）

2.培养基的配制：

种子培养基（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%、V_B1 0.001%、pH 6.5。

发酵培养基的配方（W/V）：未处理初始玉米浆8%（V/V），葡萄糖6%、MgSO₄0.02%，KH₂PO₄0.2%，大豆油1%（V/V），V_B10.001%，调pH6.5。

3.种子培养

将三孢布拉氏霉正菌（+）（－）分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装液量50ml/250mL三角瓶，培养温度为28℃，转速200 rpm，正菌培养时间为20小时，负菌培养时间为25小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。

4.发酵培养

将达到对数生长期的正负菌种子液按1:9的比例接入到发酵培养基中，接种量为6%（V/V），温度为28℃，摇床转速180rpm，初始pH6.5，装液量50mL/250 mL三角瓶条件下，发酵时间120h。

5.生物量和β-胡萝卜素含量的测定

发酵结束后将菌体用双层纱布过滤，清水洗至无色，将湿菌体在50℃真空干燥，恒重后称量；将获得的干菌体，用研磨法粉碎，准确称取0.01 g左右的菌丝体粉末加入体积为50mL的石油醚萃取，直至菌体粉末至无色为止，取萃取液稀释至适当倍数后于450 nm处采用分光光度计测取吸光值并用标准曲线回归方程计算出对应的β-胡萝卜素含量。

6.结果

（1）菌丝体干重：36.1g/L；

（2）干菌体中β-胡萝卜素含量：0.9%（W/W）。

实施案例三：摇瓶中利用预处理后玉米浆生产β-胡萝卜素

1.菌株：

三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）

2.培养基的配制：

种子培养基（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%、V_B1 0.001%、pH 6.5。

发酵培养基的配方（W/V）：实施例一制备的改良玉米浆8%（V/V），葡萄糖6%、MgSO₄0.02%，KH₂PO₄0.2%，大豆油1%（V/V），V_B10.001%，调pH6.5。

3.种子培养

将三孢布拉氏霉正菌（+）（－）分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装液量50mL/250mL三角瓶，培养温度为28℃，转速200 rpm，正菌培养时间为20小时，负菌培养时间为25小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。

4.发酵培养

将达到对数生长期的正负菌种子液按1:9的比例接入到发酵培养基中，接种量为6%（V/V），温度为28℃，摇床转速180rpm，初始pH6.5，装液量50mL/250 mL三角瓶条件下，发酵时间120小时。

5.生物量和β-胡萝卜素含量的测定

发酵结束后将菌体用双层纱布过滤，清水洗至无色，将湿菌体在50℃真空干燥，恒重后称量；将获得的干菌体，用研磨法粉碎，准确称取0.01 g左右的菌丝体粉末加入体积为50mL的石油醚萃取，直至菌体粉末至无色为止，取萃取液稀释至适当倍数后于450 nm处采用分光光度计测取吸光值并用标准曲线回归方程计算出对应的β-胡萝卜素含量。

6.结果

（1）菌丝体干重：34.1g/L；

（2）干菌体中β-胡萝卜素含量：2.5%（W/W）。

实施案例四：10L机械搅拌发酵罐中利用预处理后玉米浆生产制备β-胡萝卜素

1.菌株：

三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）

2.培养基的配制：

种子培养基（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%、V_B1 0.001%、pH 6.5。

发酵培养基的配方（W/V）：实施例一制备的玉米浆8%（V/V），葡萄糖6%、MgSO₄0.02%，KH₂PO₄0.2%，大豆油1%（V/V），V_B10.001%，调pH6.5。

3.种子培养

将三孢布拉氏霉正菌（+）（－）分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装液量50mL/250mL三角瓶，培养温度为28℃，转速200 rpm，正菌培养时间为20小时，负菌培养时间为25小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。

4.发酵培养

将种子培养基接入10L机械搅拌发酵罐中，其装液量为5-5.5L，转速为80-150rpm，通气量为1.5-2.0 VVM，罐压0.04-0.06MPa，灭菌后pH为6-7，罐温28℃，正负菌种子液按1:9接入，接种量为6%（V/V），培养时间为120-144小时。

5.生物量和β-胡萝卜素含量的测定

发酵结束后将菌体用双层纱布过滤，清水洗至无色，将湿菌体在50℃真空干燥，恒重后称量；将获得的干菌体，用研磨法粉碎，准确称取0.01 g左右的菌丝体粉末加入体积为50ml的石油醚萃取，直至菌体粉末至无色为止，取萃取液稀释至适当倍数后于450 nm处采用分光光度计测取吸光值并用标准曲线回归方程计算出对应的β-胡萝卜素含量。

6.结果

（1）菌丝体干重：27.1g/L；

（2）干菌体中β-胡萝卜素含量：3.8%（W/W）。

实施案例五：100L机械搅拌发酵罐中利用预处理后玉米浆生产制备β-胡萝卜素

1.菌株：

三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）

2.培养基的配制：

种子培养基（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.02%、V_B1 0.001%、pH 6.5。

发酵培养基的配方（W/V）：实施例一制备的玉米浆8%（V/V），葡萄糖6%、MgSO₄0.02%，KH₂PO₄0.2%，大豆油1%（V/V），V_B10.001%，调pH6.5。

3.种子培养

将三孢布拉氏霉正菌（+）（－）分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装液量50mL/250mL三角瓶，培养温度为28℃，转速200 rpm，正菌培养时间为20小时，负菌培养时间为25小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。

4.发酵培养

将种子培养基接入100L机械搅拌发酵罐中，其装液量为50-55L，转速为0rpm，通气量为1.5-2.0 VVM，罐压0.04-0.06MPa，灭菌后pH为6-7，罐温28℃，正负菌种子液按1:9接入，接种量为6%（V/V），培养时间为120-144h。

5.生物量和β-胡萝卜素含量的测定

发酵结束后将菌体用双层纱布过滤，清水洗至无色，将湿菌体在50℃真空干燥，恒重后称量；将获得的干菌体，用研磨法粉碎，准确称取0.01 g左右的菌丝体粉末加入体积为50mL的石油醚萃取，直至菌体粉末至无色为止，取萃取液稀释至适当倍数后于450 nm处采用分光光度计测取吸光值并用标准曲线回归方程计算出对应的β-胡萝卜素含量。

6.结果

（1）菌丝体干重：23.2g/L；

（2）干菌体中β-胡萝卜素含量：5.4%(W/W)。

Claims (8)

1.一种发酵生产β-胡萝卜素用的改良玉米浆，其特征在于：所述的改良玉米浆是将玉米浆原料与Na₂S混合后充分反应后离心，上清液调pH＝6.3-6.7而得。

2.一种发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：取玉米浆原料，加入质量体积比为0.1-0.8％的Na₂S，搅拌使其充分反应，离心，上清液调pH＝6.3-6.7，得改良玉米浆。

3.根据权利要求2所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其特征在于：所述的离心步骤的条件是5000-8000rpm离心10-20min。

4.根据权利要求2所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其特征在于：所述的上清液在调pH前进行抽虑处理，所述的抽滤步骤为：用装有7～9cm定性滤纸的布氏漏斗抽虑上清液。

5.根据权利要求2所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其特征在于：采用强碱调节所述的上清液pH＝6.5。

6.根据权利要求5所述发酵生产β-胡萝卜素用改良玉米浆的制备方法，其特征在于：所用的强碱为氢氧化钠。

7.权利要求1所述的改良玉米浆在发酵生产培养发酵三孢布拉霉正负菌制备β-胡萝卜素中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的三孢布拉霉正负菌为三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271(+)和三孢布拉氏霉负菌ATCC 14272(-)。