CN109673815B - 发酵制备富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料以及制备方法 - Google Patents

发酵制备富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料以及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵制备富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料以及制备方法，涉及饲料制备技术领域。该制备方法包括发酵步骤：将产花生四烯酸的A菌和产β胡萝卜素的B菌接种至同一固体发酵培养基中进行发酵。通过该制备方法将产花生四烯酸的A菌和产β胡萝卜素的B菌接种至同一固体发酵培养基中进行发酵，可以提高生产效率，减少花生四烯酸和β胡萝卜素被氧化的概率，提高产物中的花生四烯酸和β胡萝卜素的含量。

Description

发酵制备富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料以及制 备方法
技术领域
本发明涉及饲料制备技术领域，具体而言，涉及一种发酵制备富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料以及制备方法。
背景技术
花生四烯酸(ARA)是一些长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中的一种。它是许多生物活性化合物的一种主要的前体(在鱼和高等陆地脊椎动物中)，所述生物活性化合物以类二十烷酸而知名，包含前列腺素、血栓烷、白细胞三烯。海洋鱼、小虾(shrimp)和各种陆地动物(如猪)，缺少Δ-5脱氢酶活性，因此不能把脂肪酸18：2(n-6)(亚油酸)转换为ARA。由于花生四烯酸是产生类二十烷酸所必需的，它是这类动物必需的脂肪酸，必须在其食物中供给。
胡萝卜素(BC)是由某些生物有机体天然产生的、颜色在黄色至红色范围内的有机色素，上述生物有机体包括光合有机体(例如，植物、藻类、蓝藻)和一些真菌。类胡萝卜素是使胡萝卜呈橙色的原因，同时也是使龙虾与小虾呈红色的原因。然而，动物无法产生类胡萝卜素并且必须通过它们的饮食来接收类胡萝卜素。
工业上将β胡萝卜素色素用作食品和饲料原料的成分，从而起到营养功能和增强消费者的可接受性两种作用。例如，β胡萝卜素广泛用于蛋鸡养殖中以使其所产鸡蛋蛋黄呈现着色特征。另外，β胡萝卜素还提供潜在的健康益处，例如作为维生素A前体或抗氧化剂，例如，应用在家禽和家畜饲料中以起到抗炎症，增强免疫力的作用。
但现有花生四烯酸和β胡萝卜素的生产方法：产ARA菌种和产BC菌种分别发酵，获得单一产品，生产两个产品需要两条生产线；而BC和ARA非常容易被氧化，而液体发酵需要更长的干燥时间或者温度，使得BC和ARA被氧化的几率大大提高；另外，液体发酵液干燥后造粒困难，得到产品颗粒过细。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料。该功能性饲料含有花生四烯酸和β胡萝卜素。
本发明的另一目的在于提供一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料的制备方法。采用该制备方法可以制得富含花生四烯酸和β胡萝卜素的饲料。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料，其包括含有如下成分：β胡萝卜素2wt％-10.5wt％、花生四烯酸8wt％-35wt％、蛋白质40wt％-76wt％以及粗纤维低于10wt％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述功能性饲料颗粒度为0.8-6mm、水分含量不超过10wt％、碳氮比为(11-30)：1。
一方面，本发明提供了一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料的制备方法，其包括如下步骤：
发酵步骤：将产花生四烯酸的A菌和产β胡萝卜素的B菌种至同一固体发酵培养基中进行发酵。
本发明的制备方法将产花生四烯酸的A菌和产β胡萝卜素的B菌接种在同一固体发酵培养基，使两种菌在同一培养基中发酵，这样产物中可同时积累花生四烯酸和β胡萝卜素。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，将A菌接种至所述固体发酵培养基中发酵培养48-72h后，再将B菌接种至所述固体发酵培养基进行发酵培养。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，A菌为高山被孢霉。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，B菌为三孢布拉氏霉菌；
优选的，B菌为三孢布拉氏霉正菌和三孢布拉氏霉负菌的混合。
进一步地，在本发明地一些实施方案中，所接种的高山被孢霉通过如下方法得到：
将高山被孢霉菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基平板上，在25℃下培养9天至孢子生成并成熟，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成孢子悬浮液。将孢子悬浮液接种到ARA液体培养基中进行培养，接种量为10％(体积比)，培养温度25℃，摇床振摇转速为120转/分钟，培养时间48h，然后离心浓缩，收集浓缩后的高山被孢霉菌菌体，即可用于发酵培养。
其中，所用ARA液体培养基含有3wt％-6wt％的葡萄糖和1wt％-3wt％的酵母粉，余量为水，pH6.5-7.5。
进一步地，在本发明地一些实施方案中，所接种的三孢布拉氏霉菌通过如下方法得到：
1)分别取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
2)分别从斜面培养基上用接种铲铲取一铲的三孢布拉氏霉正菌和三孢布拉氏霉负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。
所述种子培养基包括：葡萄糖10-15g/L，玉米淀粉30-50g/L，玉米浆干粉30-50g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，pH6.5-7.5。
3)将步骤2)中的三孢布拉氏霉正菌种子液和三孢布拉氏霉负菌种子液以1:5的质量比接种至含BC培养基的发酵摇瓶中培养12-24h。然后离心浓缩，收集浓缩后的三孢布拉氏霉菌体，即可用于发酵培养。
其中，BC培养基的成分与种子培养基相同。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，A菌的接种量为0.1wt％-1wt％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，B菌的接种量为0.1wt％-1wt％。
按上述优选的接种量接种，可使固体培养基与菌体达到最佳平衡，避免出现菌体发酵所需的营养物质过多或过少导致发酵效果和发酵产物欠佳的情况。
其中接种的菌为将种子液离心浓缩后收集的菌体。
其中先接种高山被孢霉再接种三孢布拉氏霉的原因在于，高山被孢霉发酵周期长；而三孢布拉氏霉分正负菌，在接种到固体培养基之前，需要先将正菌和负菌单独培养48h，再混合发酵12-24小时，才有利于正负菌结合，这两种霉菌的特性结合，正好需要高山被孢霉先接种使得发酵效率更高，得到的产品β胡萝卜素(BC)和花生四烯酸(ARA)的含量更高。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵步骤中，发酵培养的温度为20-30℃，接种产β胡萝卜素的B菌后共同发酵时间为100-140h(A菌和B菌都接种到固体培养基共同发酵时间)。
固体培养基的成分可以包括蛋白类物质、无机盐和维生素。优选地，蛋白类物质例如可以包括玉米、小麦和黄豆及其衍生物和加工副产物，在本发明实施例中，玉米可以以玉米淀粉以及玉米浆干粉为例，小麦可以以小麦麸皮为例，黄豆可以以黄豆饼粉为例。此外，蛋白类物质还可以包括原料来源相对容易且成本较低的木糖渣、螺旋藻粉和羽毛粉中的至少一种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述固体发酵培养基的原料按质量百分数计包括：玉米淀粉20％-40％、小麦麸皮38％-42％、黄豆饼粉10％-20％、玉米浆干粉10％-20％以及无机盐0.6％-1.5％，其中无机盐包含磷酸二氢钾和硫酸镁，即二者质量比为5：1的比例组成无机盐。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵的过程中，每间隔10-14小时翻动固体发酵培养基一次，每次翻动持续5-10min。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵步骤之后，该制备方法还包括：将发酵所得的培养基与其中的菌体一起微波干燥机进行干燥、粉碎，然后造粒，以制得功能性饲料。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，微波干燥的功率为5-15kw，温度为90-110℃，干燥时间0.5～2h。
另一方面，本发明提供了一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料，其由上述的制备方法所制得。
本发明提供的制备方法解决了两个不同类型菌种(高山被孢霉菌和三孢布拉氏霉菌)混合发酵共生的问题，先将两种菌种在液体培养基中培养，富集菌体得到高浓度菌液，然后在固体培养基中，利用两个菌种对营养物质的需求不同，同时通过调控两个菌种接种的接种量和接种的先后顺序，使两个菌种互利共生，三孢布拉霉生长速度快，能够累积一定的油脂，该油脂与高山被孢霉产出油脂形成功能特异性油脂，为高山被孢霉发酵提供营养物质传输条件，能够保护高山被孢霉发酵过程以及后续干燥过程中多不饱和脂肪酸的氧化，最终使得花生四烯酸和β胡萝卜素的产量都有所提高。此外，本发明选择将高山被孢霉率先接种，解决了产高山被孢霉的生长周期长，与三孢布拉氏霉混合固体培养时速度难以匹配，造成ARA含量难以达标的问题，并且，本发酵方法后处理干燥能耗低，功能性物质被氧化的概率降低，菌体与固体培养基一同粉碎造粒，解决了液体发酵干菌体直接造粒难的问题。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的功能性饲料的制备方法，如下：
1制备发酵用的菌体种子：
1.1三孢布拉氏霉(B菌)种子制备
1)斜面培养：配制PDA斜面培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。
取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养7天；
2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所用种子培养基包括：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3)将步骤2)中的三孢布拉氏霉正菌种子液和三孢布拉氏霉负菌种子液以1:5的质量比接种至含BC培养基的发酵摇瓶中培养24h。然后然后离心浓缩，收集浓缩后的三孢布拉氏霉菌体。
其中，BC培养基的成分与种子培养基相同。
1.2高山被孢霉(A菌)种子制备
将高山被孢霉菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基平板上，在25℃下培养9天至孢子生成并成熟，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成孢子悬浮液。将孢子悬浮液接种到ARA液体培养基中进行培养，接种量为10％(体积比)，培养温度25℃，摇床振摇转速为120转/分钟，培养时间48h，然后离心浓缩，收集浓缩后的高山被孢霉菌菌体，即可用于发酵培养。
其中，所用ARA液体培养基含有：5wt％的葡萄糖和1wt％的酵母粉，余量为水，pH6.8。
2制备功能性饲料
2.1制备发酵用固体培养基
按干物质质量百分比为20％：38％：18％：16％：8％的比例，取玉米淀粉、小麦麸皮、黄豆饼粉、玉米浆干粉、无机盐混合，其中无机盐包含磷酸二氢钾和硫酸镁(即二者质量比为5：1的比例组成无机盐)，再按水与玉米淀粉的重量比为10:18的比例加入水，于95℃的条件下蒸煮20min，灭菌20min，制得发酵用的固体发酵培养基。
2.2接种发酵
第一次接种发酵，先按接种量为0.1wt％将浓缩后的高山被孢霉菌体转接于固体发酵培养基中，于20℃的条件下进行发酵培养，发酵时间48h；期间，每隔10h翻动固体培养基一次，每次翻动例如可以持续5min。翻动过程中按固体发酵培养基的5wt％向固体发酵培养基中补充无菌水。
第二次接种发酵，发酵结束后，再按接种量为0.1wt％的比例将浓缩后的三孢布拉氏霉菌体转接于同一固体发酵培养基中，于20℃的条件下再继续共同发酵时间140h。期间，每隔10h翻动固体发酵培养基一次，每次翻动例如可以持续5min。翻动过程中按固体发酵培养基的5wt％向固体发酵培养基中补充无菌水。
发酵结束后，将发酵所得的培养基与菌体在干燥功率为8kw、干燥温度为95℃的微波干燥机中干燥粉碎1.5h，然后造粒，即得富含花生四烯酸(ARA)和β胡萝卜素(BC)的功能性饲料。
实施例2-7
实施例2-7的制备方法与实施例1基本相同，各实施例涉及的不同的相关参数和条件见表1。
表1
Figure BDA0001932220260000081
Figure BDA0001932220260000091
对比例1
方法与实施例2基本相同，不同之处在于高山被孢霉和三孢布拉氏霉同时接种至固体发酵培养基上。
对比例2
方法与实施例2基本相同，不同之处在于高山被孢霉固体培养86小时后即接种三孢布拉氏霉。
对比例3
方法与实施例2基本相同，不同之处在于高山被孢霉在接种至固体发酵培养基培养32小时后即接种三孢布拉氏霉。
对比例4
方法与实施例2基本相同，不同之处在于三孢布拉氏霉正菌和负菌未经过混合液体共培养，而是在经种子培养步骤后离心得到浓缩菌液后直接接种至固体发酵培养基。
对比例5
高山被孢霉菌和三孢布拉氏霉分开培养，然后混合制成饲料。
采用实施例2中的ARA液体培养基培养高山被孢霉，采用实施例2中的BC培养基培养三孢布拉氏霉正负菌；高山被孢霉发酵194小时候后放罐，三孢布拉氏霉培养130h后放罐，分别将二者的发酵液喷雾干燥后，以质量比为1：1的比例直接混合制备成饲料。
上述实施例1-7制得的功能性饲料的各指标检测结果见表2。
表2
Figure BDA0001932220260000101
Figure BDA0001932220260000111
上述对比例1-5制得的功能性饲料的各指标检测结果见表3。
表3
Figure BDA0001932220260000112
通过表2和表3的结果可以看出，先接种三孢布拉氏霉后接种高山被孢霉菌，产物中的ARA含量较低，而先接种高山被孢霉菌后接种三孢布拉氏霉，可以有效提高终产物中的ARA含量；此外，三孢布拉氏霉正菌和负菌经过了在BC培养基中共培养的步骤后再接种固体发酵培养基与高山被孢霉菌共同培养基，其得到的产物中的β胡萝卜素(BC)含量明显得到提高。此外，相较于三孢布拉氏霉菌和高山被孢霉分开培养再直接混合的方法，本发明将三孢布拉氏霉菌和高山被孢霉置于同一固体培养基中培养，减少花生四烯酸和β胡萝卜素被氧化的概率，其得到的饲料的POV值更低，有效提高了花生四烯酸和β胡萝卜素的含量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
发酵步骤：将产花生四烯酸的微生物A菌接种至固体发酵培养基中发酵培养48-72小时后，再将产β胡萝卜素的微生物B菌接种至同一固体发酵培养基中进行发酵，发酵培养的温度为20-30℃，接种产β胡萝卜素的微生物B菌后共同发酵时间为100-140h；
产花生四烯酸的微生物A菌为高山被孢霉，接种量为0.1wt%-1wt%；
产β胡萝卜素的微生物B菌为三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉负菌的混合，接种量为0.1wt%-1wt%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养基的原料按质量百分数计包括：玉米淀粉 20%-40%、小麦麸皮38%-42%、黄豆饼粉10%-20%、玉米浆干粉10%-20%以及无机盐0.6%-1.5%。
3.根据权利要求1所述的制备方法其特征在于，该制备方法还包括将发酵所得的培养基与其中的菌体一起在微波干燥机中进行干燥、粉碎，然后造粒，以制得功能性饲料；微波干燥的功率为5-15kw，温度为90-110℃，干燥时间0.5～2h。
4.一种富含花生四烯酸和β胡萝卜素的功能性饲料，其特征在于，其由权利要求1-3任一项所述的制备方法所制得；
所述功能性饲料包括含有如下成分：β胡萝卜素2wt%-10.5wt%、花生四烯酸8wt%-35wt%、蛋白质40wt%-76wt%以及粗纤维低于10wt%；
所述功能性饲料的颗粒度为0.8-6mm、水分含量不超过10wt%、碳氮比为（11-30）：1。
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