CN101705193B - 产虾青素海洋红酵母ys-185及其虾青素的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从海洋中选育得到的高产虾青素海洋红酵母YS-185，保藏在中国武汉CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M207077；以及由该海洋红酵母YS-185发酵培养制造虾青素的方法，由该海洋红酵母YS-185生产的虾青素为天然虾青素，可广泛应用于高级化妆品、食品和饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及高产虾青素海洋红酵母YS-185及其虾青素的制造方法。
背景技术
微生物是海洋生物的重要成员，而且海洋微生物的代谢类型极其多样化，可以完全在人工控制条件下以惊人的速度生长繁殖，且海洋微生物种源极其丰富，未知者众多，变异性大，容易选育出高产菌株，所以海洋微生物是当今世界获取未知菌株及其高产活性物质的新来源，尤其是为食品工业、药物工业提供可持续发展的广阔的途径，然而由于海洋独特的环境，包括高盐、高压、低营养、低温等，造就了海洋微生物有别于陆生微生物的许多特异性，因而从中发现新型生物活性物质，为人类利用，已成为自然科学中相当活跃的研究领域之一。
虾青素(3，3’-二羟基-β，β’-胡萝素4，4’-二酮)是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素。拥有艳丽的红色及极强的色素沉积能力，最初在欧美一些发达国家是作为色素被用做水产业的饵料添加剂。虾青素具有很强的抗氧化性，动物实验表明它有抑制肿瘤发生，增强免疫功能等多方面的生理作用，作为功能性色素在水产业，医药，食品，化妆品等行业有着广阔的应用前景。
目前市场上虾青素主要通过化学合成，主要用途还是作为鱼类饲料添加剂，但化学合成比较困难，由荷兰的帝斯曼公司控制，商品名为丽素粉红，虾青素含量为5-10％，几乎占有整个虾青素市场。目前为止美国食品卫生管理局(FDA)不准任何化学合成新产品进入保健食品市场。
天然虾青素存在于动植物及微生物中，尽管提取来源广泛，但含量极低。如在虾、蟹的废壳中的含量只有约80ug/g。法夫酵母(Phaffia rhodozyma)中含量一般在1500-5000ug/g之间，在淡水单细胞绿藻-雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中，虾青素的含量可达10000-40000ug/g，被认为是自然界中天然虾青素含量最高的生物。天然虾青素的工业化生产，目前也主要是采用法夫酵母的工业发酵和雨生红球藻的大规模养殖来进行的，例如已实现了工业化生产，美国红星公司(3000-4000g/t干酵母)及Igene Biotechnology Inc等，由于生产成本及技术难度高，天然虾青素的产量有限，国际市场上的价格很高，这也一定程度上制约了天然虾青素的应用。
能够产生虾青素的微生物菌株并不多。目前，国内外主要利用红发夫酵母生产虾青素。Yamane等人指出，红发夫酵母被普遍使用的主要原因是由于其所产生的类胡萝卜素物质中虾青素是主要的一种成份以及生产过程较易控制。一些文献也已报道其他微生物菌株。但有些菌生长较慢且虾青素含量低，无工业应用前景。在一些文献中提到的菌株尽管能产生较高的虾青素含量，如深红酵母(Phodotorala rubra)、粘红酵母(Rhodotorula glutins)、黄杆菌(Flavobacterium spp)CF-60等，但没有见到详细的研究报告。
微生物细胞内虾青素的生物合成基本上由它们的遗传特性所控制，通过诱变育种技术，改变微生物的遗传特征。得到高产虾青素的微生物菌株。
Girard等对红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)进行诱变处理，发现从无色到红色的诱变突变菌株。分析突变菌株的虾青素合成中间产物，可以发现，番茄红素环化形成β-胡萝卜素这一步骤不会受到诱变处理的影响，但诱变处理能影响到其他的步骤，即诱变处理主要影响β-胡萝卜素合成之前的步骤。
但是，微生物胞内虾青素的积累也受各种环境因子的影响，会随发酵培养基的改变而改变。
发明内容
本发明目的在于从丰富的海洋微生物资源中选育出新的高产虾青素的菌株，为我国食品、药物工业提供可持续发展的新途径，经发明人长期从事海洋微生物的开发研究，开发提供高产虾青素海洋红酵母YS-185及其虾青素的制造方法。
本发明提供的高产虾青素海洋红酵母YS-185是从海洋中选育获得的高产虾青素海洋红酵母YS-185(Rhodotorula glutinis(Fres.)Harrison)(简称海洋红酵母YS-185)，该海洋红酵母YS-185于2007年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M207077。
海洋红酵母YS-185培养制备
将海洋红酵母YS-185培养于产生虾青素的培养基中在摇床中发酵培养，其中摇床转速为120-284r/分，优选为180-280r/分，更优选这200r/分，培养基的碳原为葡萄糖、果糖及麦芽糖等，优选为葡萄糖，其浓度20-80mg/L，更优选为20mg/L，氮源为硫酸铵、尿素、氯化铵，蛋白胨、酵母膏、白蛋白、豆饼粉或豆渣等，优选为硫酸铵， 其质量浓度3-20mg/L，更优选为5-10mg/L，起始pH为5-8，接种量3-12质量体积％，培养温度18-22℃，培养时间60-90小时。取发酵液离心洗涤(去离子水)3次，冻干机上避光冷冻干燥后得海洋红酵母YS-185菌体粉末，-20℃避光保存。
色素粗品的制备与纯化
取上述制备得到海洋红酵母菌体粉末，加入二甲基亚砜(每克菌粉加入10-30ml，优选为20ml二甲基亚砜)置于35-45℃，优选为40℃水浴条件下破壁20-50min，优选为30min，加入等体积丙酮萃取至菌体呈白色，离心(1500r/min，10min)取上清液，室温避光氮气吹干浓缩得色素粗制品，-20℃避光保存。
取色素固体粗制品丙酮溶解后，上自装60硅胶层析柱(40～63μm，Qingdao HaiyangChemical Ltd.)进行线性梯度洗脱纯化。洗脱液：A液(石油醚)，B液(丙酮0～50min，0质量％～50质量％)进行线性梯度洗脱纯化，收集红色色素样品，氮气回流干燥。
色素成分的分析
取一定量的色素固体，丙酮溶解配制成溶液，UV3000紫外分光光度计上300～600nm光区扫描，以虾青素标准品(98％，Sigma)为对照，结果如图1所示
图1可看出色素溶液吸收峰和虾青素标准品吸收峰吻合，在480nm处有最大吸收峰，确定其主要成分为虾青素。
色素成分的薄层层析
薄层层析结果如图2所示，经初步纯化后的样品点样于硅胶板展开后有两明显的斑点，第一个斑点颜色较浅，Rf为0.81；第二个斑点颜色较深Rf为0.42，和虾青素标准品Rf值0.39相比较接近，可进一步判断该斑点主要成分为虾青素。薄板展开后在暗箱中晾干，用刀片刮下和虾青素比移值相近条带，-20℃，暗处保存。
色素成分的高压液相色普分析与鉴定
取经少许上述刮取制备得到的色素样品，甲醇溶解后，上高压液相色谱进行分析鉴定，结果如图3、图4所示，色素样品在7.52min保留时间上有最大吸收峰，和虾青素标准品在7.51min保留时间上有最大吸收峰相比较，可进一步确定海洋红酵母YS-185所产色素固体中主要成份为虾青素；同时取经初步纯化后的样品进高压液相色谱分析，通过峰面积计算得虾青素占总色素含量为67.5％。
本发明提供的虾青素制造方法包括下列步骤
①海洋红酵母YS-185菌体培养
将海洋红酵母YS-185培养于产生虾青素的培养基中在摇床中发酵培养，在摇床中摇床转速为120-284r/分，优选为180-280r/分，更优选这200r/分，培养温度18-22℃，培养时间60-90小时，起始pH为5-8，接种量3-12体积％，其中培养基的碳原为葡萄糖、果糖及麦芽糖等，优选为葡萄糖，其浓度20-80mg/L，更优选为20mg/L，氮源为硫酸铵、尿素、氯化铵，蛋白胨、酵母膏、白蛋白、豆饼粉或豆渣等，优选为硫酸铵，其质量浓度3-20mg/L，更优选为5-10mg/L。取发酵液离心洗涤(去离子水)3次，冻干机上避光冷冻干燥后得海洋红酵母YS-185菌体粉末。
②色素粗品制备
取步骤①得到的海洋红酵母YS-185菌体经发酵培养的菌体粉末经二甲基亚砜于40℃水浴条件下破壁处理20-50分，优选为30分，后加入等体积丙酮萃取至菌体呈白色，离心(例如1200-3000r/分，10-20分取上清液，浓缩得色素粗制品，-20℃避光保存。若根据需要可进行进一步纯化。
③将色素固体粗制品丙酮溶解后，上60硅胶层析柱进行线性梯度洗脱纯化。洗脱液：A液为石油醚，B液为丙酮0～50分，0质量％～50质量％进行线性梯度洗脱纯化，收集红色色素样品，氮气回流干燥。
按照本发明提供的虾青素的制造方法中，起始海洋红酵母YS-185是好氧菌，所产色素主要成分为虾青素，它是在细胞内合成为细胞内物质，在微生物细胞内积累除受微生物菌海洋红酵母YS-185本身影响以外，也会受到各种环境因子的影响，例如会随着培养基如发酵培养基的改变而变化，还受诸如温度、pH和溶氧等因素的影响。
在步骤①的海洋红酵母YS-185菌体培养中，因为海洋红酵母菌YS-185好氧微生物，可以通过摇床转速来调节种子培养液及发酵培养液中的溶氧量，摇床转速一般为120-280r/分，随着转速提高，生物量和虾青素合成量都呈上升趋势，当摇床转速为180转/分以上上升趋向平稳，优选取180-280r/分，更优选为200r/分。对于发酵罐进行间歇发酵中，发酵罐罐压和搅拌速率以及空气通气量等决定溶氧量，溶氧量越高，酵母进入对数生长期的时间越早，低溶氧条件下，细胞进入对数生长期较为缓慢，通常采用30-60质量％，优选为40-60质量％，更优选为45质量％的溶氧量。
在发酵培养中，所述培养基包括碳源、氮源及无机盐等，碳源是构成微生物的主要成分，是细胞内贮藏物质和生成各种代谢物来源，同时也是微生物生长中的主要能量来源，碳源通常采用例如蔗糖、葡萄糖、果糖及麦芽糖等，优选为葡萄糖作为培养基中的 碳源。葡萄糖质量浓度20-80g/L，优选20g/L。
氮源有有机氮源及无机氮源，常用为硫酸铵、尿素、氯化铵，蛋白胨、酵母膏、白蛋白、豆饼粉或豆渣等，优选为硫酸铵，其质量浓度3-20mg/L，更优选为5-10mg/L，其生物量和虾青素产量达到高值，当硫酸铵铵质量浓度超过10g/L时，海洋红酵母菌YS-185菌株和生物量和虾青素产量都有下降趋势，更优选为5g/L硫酸铵作为培养基的氮源。
培养基中的H+和OH-能对微生物代谢产生影响，它作用于胞外的可解离的弱酸，形成易透过细胞膜的游离态进入胞内再作用于参与代谢的各种酶类，从而影响菌体的生长合产物合成，通常采用起始pH值为5-8，优选起始pH为6.0。
接种量3-12体积％，随着接种量的增加，生物量及虾青素含量均呈上升趋势，但当接种量大于8体积％时，两者增加不太明显，优选接种量在5体积％～12体积％。
反应温度对发酵过程中产生的生物量及虾青素影响随着发酵温度的上升，细胞生物量及虾青素产量都不断的增加，温度20℃后两者均有下降，通常采用反应温度18-22℃优选20℃。
在发酵过程中培养基中的碳源如葡萄糖和氮源如硫酸铵以及pH值不断变化，由于环境pH值能影响细胞膜所带的电荷及培养基中营养物质的离子化作用程度，从而影响微生物海洋红酵母YS-185菌株(体)的生长与生产。例如葡萄糖在24h左右几乎消耗完全，且在78h以前虾青素含量一直处在不断上升的过程中，78h后因细胞出现大量自溶现象而导致生物量及虾青素产量下降，所以在发酵罐中发酵培养不断补加营养物质，同时控制培养最佳pH，可采用各种补加方式例如指数流加模式、恒pH葡萄糖-氨水流加，优选恒pH葡萄糖-氨水流加所得细胞干重和虾青素的量最大。
本发明提供的海洋红酵母YS-185及其虾青素的制造方法的特点：
本发明提供的海洋红酵母YS-185是稳定高产虾青素的海洋微物菌种，虾青素产量和生物量分别高达到60.5mg/ml和66.5μg/ml，继陆源红发夫酵母生产虾青素又一个可与此比美的一个新的海洋源高产虾青素的菌种及其虾青素制造方法。将成为生物合成法生产天然虾青素的一个新途径。
本发明提供的由海洋红酵母YS-185产虾青素-红色色素在一般理化环境作用下有着良好的稳定性，及较高的抗脂质过氧化特性，可用作高档化妆品及高级食品和饲料添加 剂。
附图说明
图1色素样品及虾青素标品的扫描图谱
图2初步纯化色素样品薄层层析分析
图3虾青素标准品HPLC图
图4样品HPLC图
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并非限于下列实施例
实施例1
海洋红酵母YS-185培养制备
将海洋红酵母YS-185的株体挑起菌苔一环接种于装有30ml种子培养基的250mL三角瓶中，20℃、200r/min条件摇床培养18h得种子液，以此种子液10mL接种于装有90mL种子液的500mL三角瓶中，20℃、200r/min条件摇床培养18h得二级种子液，再以5体积％接种量接种到发酵罐中(10L罐装有6L发酵培养基)于20℃条件下培养，采用恒pH葡萄糖-氨水流加方式保持溶氧45±2质量％、葡萄糖起始浓度3.0质量％，pH4.8-5.0。得细胞干重60.5mg/ml虾青素产量66.5μg/ml，
色素粗品的制备与纯化
取上述制备得到酵母菌体粉末，加入二甲基亚砜(每克菌粉加入20ml二甲基亚砜)置于40℃水浴条件下破壁30min，加入等体积丙酮萃取至菌体呈白色，离心(1500r/min，10min)取上清液，室温避光氮气吹干浓缩得色素粗制品，-20℃避光保存。
取色素固体粗制品丙酮溶解后，上自装60硅胶层析柱(40～63μm，Qingdao HaiyangChemical Ltd.)进行线性梯度洗脱纯化。洗脱液：A液(石油醚)，B液(丙酮0～50min，0质量％～50质量％)进行线性梯度洗脱纯化，收集红色色素样品，氮气回流干燥。
色素成分的薄层层析及高压液相色谱分析，红色色素样品主要成分为虾青素，虾青素占总色素含量为67.5质量％。
Claims (3)
1.一种产虾青素海洋红酵母（Rhodotorula glutinis（Fres.）Harrison）YS-185是从海洋中选育获得的产虾青素海洋红酵母，于2007年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M207077。
2.一种虾青素的制造方法，其特征在于包括下列步骤：
①发酵培养
将权利要求1的海洋红酵母YS-185培养于产虾青素的培养基中在摇床中发酵培养，培养温度18-22℃，培养时间60-90小时，起始pH为5-8，接种量3-12体积%,其中培养基的碳源为葡萄糖，其浓度20-80mg/L，氮源为硫酸铵，其质量浓度3-20mg/L；取发酵液离心洗涤，冻干机上避光冷冻干燥后得菌体粉未；
②色素粗品制备
取步骤①得到的海洋红酵母YS-185菌体经发酵培养的菌体粉末经二甲基亚砜于35-45℃水浴条件下破壁处理20-50分钟，后加入等体积丙酮萃取至菌体呈白色，离心取上清液，浓缩得色素固体粗制品，-20℃避光保存；
③将步骤②色素固体粗制品丙酮溶解后，上60硅胶层析柱进行线性梯度洗脱纯化,洗脱液：A液为石油醚，B液为丙酮0～50分钟,0～50质量%进行线性梯度洗脱纯化，收集红色色素样品，氮气回流干燥。
3.根据权利要求2的虾青素的制造方法，其特征在于所述步骤①中所述培养基中碳源葡萄糖浓度为20mg/L；氮源硫酸铵质量浓度为5-10mg/L；所述步骤②的破壁处理用二甲基亚砜量为10-30ml/克菌体粉末。
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