CN101812497B - 一种虾青素的工业制备方法 - Google Patents

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一种虾青素的工业制备方法，涉及虾青素的制备方法。提供一种利用优选的高产菌种，结合生物技术与发酵工程技术，低成本、高产量地生产天然虾青素的方法。所说的制备方法如下：按体积比菌种∶培养基为1∶(5～10)，将菌种在摇瓶中培养到发酵液中细胞干重为6～8g/L，然后再按8～12％的接种量接种到1000L种子发酵罐中培养到发酵液中细胞干重为18～20g/L，最后按8～12％的接种量接种到8000L种子发酵罐，经过5天培养，在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到80～100g/L，虾青素达到400mg/L，虾青素生产率达到80毫克/(升·天)。其生产成本低、产量高，比已见报道的虾青素生产率高出20倍以上。且发酵过程工艺控制简单，适用于虾青素的发酵法产业化生产。

Description

一种虾青素的工业制备方法
技术领域
本发明涉及虾青素的制备方法。
背景技术
虾青素(astaxanthin)化学名称为3，3`-二羟基础-β，β-胡萝卜素-4，4`-二酮，又称虾黄质、虾黄素、龙虾壳色素，分子式为C4OH52O4，是一种非维生素A源类胡萝卜素，广泛存在于生物界中，特别是水产动物的虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛中。虾青素具有水溶性和亲脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂。
虾青素为极具发展前景的营养色素和抗氧化剂类的物质，能吸收活性纯态氧而防止其它分子或组织的过氧反应。它具有强抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗机体着色等多种生物活性，在医药、功能性食品、化妆品、饲料添加剂、化工等行业已有着广阔的市场需求并具有广阔的开发前景。虾青素是一种极具潜力的类胡萝卜素添加剂，具有以下几方面的功能：具有独特的着色功能，在进入动物体内后可以不经修饰或生物转化而直接储存、沉积在组织中，从而使鱼类的肉质、虾壳和家禽的表皮及卵黄着色，使其色泽鲜艳；其次虾青素还具有许多重要的生理功能，其在促进抗体的产生、增强动物的免疫功能、抗氧化、清除自由基的产生等方面的能力均强于β-胡萝卜素；另外，养殖方面的研究也表明，虾青素对鱼类的生长繁殖有重要的作用，可作为激素促进鱼卵受精，减少胚胎发育的死亡率，促进个体生长，增加成熟度和生殖力，如瑞士罗氏公司的研究者们注意到高色素鱼卵比低色素鱼卵对光敏感度低，且繁育率高。而虾青素具有的免疫刺激作用对于解决当今集约化生产引起的疾病问题具有重要的意义。
目前，进入市场的虾青素根据其生产来源可分为：
1、化学合成的虾青素
用化学法生产虾青素不仅生产成本高，难以在饲料中推广应用，而且还存在一定残留毒性，FDA(美国食品和药物管理局)只批准其在饲料工业中应用，不能应用于药品及食品领域。而且，在欧盟已经开始质疑化学合成虾青素对水产养殖的安全性，并拟就是否允许其继续在饲料中运用展开讨论。
2、天然来源的虾青素，其中天然虾青素的生产方法主要有三种：
1)从水产下脚料(虾、蟹的壳等)中提取，但从水产下脚料(虾、蟹的壳等)中提取虾青素常由于原料不稳定、虾青素含量低及工艺复杂等而无实际生产意义。
2)从露天养殖的藻类中提取，藻类养殖法生产虾青素主要是利用雨生红球藻，该藻不仅虾青素含量较高[折0.16％～1.61％(干藻体)]，而且具有耐高温，耐极端pH值，易在户外培养等优点，因而被认为是一种具有产业化前景的天然虾青素资源。但是该藻生长及合成、积累虾青素需要强光照、高温、高渗透压，需采用露天大水面(海水)养殖，因此这种养殖方法存在如下弱点：
①受地理和气候条件的限制，如：只有少数地区具备相对适宜气候环境，且受季节、天气等变化的影响明显；如养殖期间遇到暴雨因养殖水体渗透压急剧降低导致藻体细胞破溃死亡等；②雨生红球藻生长极慢，养殖周期长(一个培养周期常需一个月)，生产效率低；③在营养生长期内抵抗细菌和原生动物污染的能力差，不易建立稳定、高效的生产技术体系；④占用场地大，养殖水体中藻体密度小，折算为，且含有其它浮游生物杂质；⑤雨生红球藻中的虾青素是以酯化的形式存在的，动物的消化利用率及生物活性都偏低。
3)利用微生物发酵生产，微生物发酵法生产天然虾青素，具有使用场地小，不受地理和气候条件限制，发酵液中虾青素合成积累快，含量高(浓度大)、杂质少，生产周期短，效率高，虾青素产品活性强、安全等许多优势。通过高产菌种的选育及发酵工艺控制等可提高虾青素的产量。
发明内容
本发明的目的旨在于提供一种利用优选的高产菌种，结合生物技术与发酵工程技术，低成本、高产量地生产天然虾青素的方法。
所说的虾青素的制备方法如下：
1)按体积比菌种：培养基为1∶(5～10)，将菌种接种至装有培养基的250ml摇瓶中，在20～25℃的摇床中以200rpm的转速，培养20～30小时；然后按照8～12％的接种量接种至装有培养基的1000ml的摇瓶，在20～25℃的摇床中以200rpm的转速，培养20～30小时，测定发酵液中细胞干重为6～8g/L；
2)按照8～12％的接种量接种到装有培养基的1000L种子发酵罐，整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度20～25℃，通气量12m3/h，培养20～30小时，测定发酵液中细胞干重为18～20g/L；
3)按照8～12％的接种量接种到装有培养基的8000L种子发酵罐，整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度20～25℃，通气量37m3/h，溶氧控制在10％～60％，葡萄糖浓度维持在5g/L以下；通过流加碳源发酵培养120～130小时，放罐，测定发酵液中细胞干重为80～100g/L，虾青素含量达到400mg/L。
上述菌种为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌种。
上述摇瓶培养基配方为：葡萄糖：25～35g/L，酵母粉：20～30g/L。
上述1000L种子罐培养基配方为：葡萄糖：20～25g/L；蔗糖：9.8～12g/L；酵母膏：14～16g/L；乙酸铵：2.3～2.5g/L；硫酸镁：2.0～2.4g/L；磷酸二氢钾：5.7～6.1g/L。
上述8000L种子发酵罐培养基配方为：葡萄糖：20～25g/L；蔗糖：9.8～12g/L；酵母膏：14～16g/L；乙酸铵：2.3～2.5g/L；硫酸镁：2.0～2.4g/L；磷酸二氢钾：5.7～6.1g/L；氯化钙：0.19～0.21g/L；硫酸铵：5.4～5.6g/L；硫酸锰：4.9～5.1g/L；七水硫酸锌：6.9～7.1mg/L；五水硫酸铜：2.6～3.0mg/L；钼酸钠：0.16～0.19mg/L；维生素B6：2.9～3.1mg/L；甘氨酸：3.9～4.1g/L；谷氨酸：2.0～2.2g/L；色氨酸：1.7～2.0g/L；赖氨酸：0.6～0.8g/L。
本发明选用红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)通过优化培养基和优化培养条件，采用传统的发酵方法，经过5天培养，在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到80～100g/L，虾青素达到400mg/L，虾青素生产率达到80毫克/(升·天)，比已见报道的虾青素生产率高出20倍以上。其生产成本低、产量高，发酵过程工艺控制简单，适用于虾青素的发酵法产业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
1)按葡萄糖：30g/L，酵母粉：25g/L配制摇瓶培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
2)取保藏于超低温冰箱的甘油管红法夫酵母菌种5ml，接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中，在22℃的摇床中以200rpm的转速，培养24小时；然后按照10％的接种量接种至装有300ml培养基的1000ml的摇瓶，在22℃的摇床中以200rpm的转速，培养24小时。测定发酵液中细胞干重为7g/L。
3)按葡萄糖：23g/L，蔗糖：10g/L，酵母膏：15g/L，乙酸铵：2.4g/L，硫酸镁：2.2g/L，磷酸二氢钾：5.8g/L配制1000L种子罐培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
4)将摇瓶种子按照10％的接种量接种到装有500L培养基的1000L种子发酵罐后，整个发酵过程利用28％氨水控制pH在5.5～6.0之间，培养温度22℃，通气量12m3/h，培养24小时后，测定发酵液中细胞干重为20g/L。
5)按照葡萄糖：23g/L，蔗糖：10g/L，酵母膏：15g/L，乙酸铵：，硫酸镁：2.2g/L，磷酸二氢钾：5.8g/L，氯化钙：0.20g/L，硫酸铵：5.5g/L，硫酸锰：4.9g/L，七水硫酸锌：7mg/L，五水硫酸铜：2.6mg/L，钼酸钠：0.17mg/L，维生素B6：3mg/L，甘氨酸：4.0g/L，谷氨酸：2.1g/L，色氨酸：1.9g/L，赖氨酸：0.7g/L进行8000L发酵罐的培养基配制，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
6)将1000L种子罐按照10％接种量接种至装有5000L培养基料液的8000L发酵罐，整个发酵过程培养温度22℃，通气量37m3/h；用28％氨水控制pH在5.5～6.0之间，利用搅拌转速控制溶氧在10％～60％之间；通过流加碳源进行发酵，始终使发酵罐内葡萄糖浓度维持在5g/L以下，在以上培养条件下发酵培养5天，放罐。在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到100g/L，虾青素含量达到400mg/L，虾青素生产率达到80毫克/(升·天)。
实施例2：
1)按葡萄糖：35g/L，酵母粉：20g/L配制摇瓶培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
2)取保藏于超低温冰箱的甘油管红法夫酵母菌种10ml，接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中，在25℃的摇床中以200rpm的转速，培养30小时；然后按照12％的接种量接种至装有300ml培养基的1000ml的摇瓶，在22℃的摇床中以200rpm的转速，培养24小时。测定发酵液中细胞干重为8g/L。
3)按葡萄糖：25g/L，蔗糖：9.8g/L，酵母膏：14g/L，乙酸铵：2.3g/L，硫酸镁：2.0g/L，磷酸二氢钾：6.1g/L，配制1000L种子罐培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
4)将摇瓶种子按照8％的接种量接种到装有500L培养基的1000L种子发酵罐后，整个发酵过程利用30％氨水控制pH在5.5～6.0之间，培养温度25℃，通气量12m3/h，培养30小时后，测定发酵液中细胞干重为18g/L。
5)照葡萄糖：25g/L，蔗糖：9.8g/L，酵母膏：14g/L，乙酸铵：2.5g/L，硫酸镁：2.4g/L，磷酸二氢钾：5.7g/L，氯化钙：0.21g/L，硫酸铵：5.4g/L，硫酸锰：5.0g/L，七水硫酸锌：6.9mg/L，五水硫酸铜：2.9mg/L，钼酸钠：0.19mg/L，维生素B6：3.1mg/L，甘氨酸：3.9g/L，谷氨酸：2.2g/L，色氨酸：1.8g/L，赖氨酸：0.8g/L，进行8000L发酵罐的培养基配制，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
6)将1000L种子罐按照8％接种量接种至装有5000L培养基料液的8000L发酵罐，整个发酵过程培养温度25℃，通气量37m3/h；用30％氨水控制pH在5.5～6.0之间，利用搅拌转速控制溶氧在40％～60％之间；通过流加碳源进行发酵，始终使发酵罐内葡萄糖浓度维持在5g/L以下，在以上培养条件下发酵培养5天，放罐。在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到80g/L，虾青素含量达到400mg/L，虾青素生产率达到80毫克/(升·天)。

Claims (1)

1.一种虾青素的工业制备方法，其特征在于所说的虾青素的制备方法如下：
1)按体积比菌种：培养基为1∶5～10，菌种为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌种，将菌种接种至装有培养基的250ml摇瓶中，摇瓶培养基配方为：葡萄糖：25～35g/L，酵母粉：20～30g/L，在20～25℃的摇床中以200rpm的转速，培养20～30小时；然后按照8～12％的接种量接种至装有培养基的1000ml的摇瓶，在20～25℃的摇床中以200rpm的转速，培养20～30小时；
2)按照8～12％的接种量接种到装有培养基的1000L种子发酵罐，1000L种子发酵罐培养基配方为：葡萄糖：20～25g/L；蔗糖：9.8～12g/L；酵母膏：14～16g/L；乙酸铵：2.3～2.5g/L；硫酸镁：2.0～2.4g/L；磷酸二氢钾：5.7～6.1g/L；整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度20～25℃，通气量10～12m3/h，培养20～30小时；
3)按照8～12％的接种量接种到装有培养基的8000L种子发酵罐，8000L种子发酵罐培养基配方为：葡萄糖：20～25g/L；蔗糖：9.8～12g/L；酵母膏：14～16g/L；乙酸铵：2.3～2.5g/L；硫酸镁：2.0～2.4g/L；磷酸二氢钾：5.7～6.1g/L；氯化钙：0.19～0.21g/L；硫酸铵：5.4～5.6g/L；硫酸锰：4.9～5.1g/L；七水硫酸锌：6.9～7.1mg/L；五水硫酸铜：2.6～3.0mg/L；钼酸纳：0.16～0.19mg/L；维生素B6：2.9～3.1mg/L；甘氨酸：3.9～4.1g/L；谷氨酸：2.0～2.2g/L；色氨酸：1.7～2.0g/L；赖氨酸：0.6～0.8g/L；整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度20～25℃，通气量35～37m3/h，溶氧控制在10％～60％，葡萄糖浓度维持在5g/L以下；通过流加碳源发酵培养120～130小时，放罐。 
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