CN112167131B - 红色嗜盐古菌盐红菌菌株及其强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用 - Google Patents

红色嗜盐古菌盐红菌菌株及其强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了红色嗜盐古菌盐红菌菌株及其强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用，属于水产养殖技术领域。本发明将卤虫无节幼体置于盐度50～100g·L‑1的卤水中，调整密度至100～250ind·mL‑1，在25～30℃条件下投加红色嗜盐古菌盐红菌(Halorubrum sp.)菌体进行强化12～24h，投加量为0.2～0.5g·DW·L‑1，卤水的溶解氧不低于5.0mg·L‑1；强化结束后用所述卤水冲洗并收集卤虫，得到强化卤虫。将红色嗜盐古菌盐红菌菌株或其强化的卤虫应用于对虾养殖或育苗中，显著提高了对虾对抗环境胁迫的能力，该产品和技术方法的应用将促进对虾产业的健康发展。

Description

红色嗜盐古菌盐红菌菌株及其强化卤虫在水产育苗或养殖中 的应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及红色嗜盐古菌盐红菌菌株及其强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用。
背景技术
类胡萝卜素是一类具有长碳链的异戊二烯类化合物，通常根据其化学结构分为不含氧和含氧类胡萝卜素。类胡萝卜素的抗氧化性能与其化学结构密切相关，例如共轭双键的数目、末端基团种类和含氧取代基(Stahl and Sies,1996)。类胡萝卜素对动物健康至关重要(Eggersdorfer and Wyss,2018)。但是动物本身不能从头合成类胡萝卜素，必须从食物中获取。类胡萝卜素除了提高动物体色，还能提高机体的抗氧化能力和免疫力。例如类胡萝卜素有助于增强马氏珠母贝(Pinctadafucata)的抗氧化能力从而提高其在高温下的存活率(Meng et al.,2017)。膳食中类胡萝卜素的补充在提高水生动物的抗氧化能力和免疫力方面发挥了重要作用(Liu et al.,2019；Pham et al.,2014；Wang et al.,2006；Yanget al.,2010)。饲料中添加合成虾青素能提高日本对虾(Marsupenaeus japonicus)的血细胞数和细胞吞噬活性(Wang et al.,2018a)。虾青素改善三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的色泽和营养价值，提高了细胞谷胱甘肽的含量，降低脂质过氧化水平(Han et al.,2018)。雨生红球藻添加到饲料中也可显著影响中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性、一氧化氮(NO)和MDA含量等抗氧化指标，增强雌蟹的酚氧化酶(PO)活性(Long et al.,2017)。
嗜盐古菌(Halophilic archaea)是一类高度嗜盐、好氧或兼性厌氧、化能异养型原核微生物，分布于盐湖、盐矿和日晒盐场等高盐水环境，在盐度为20％～35％(w/v)时生长最佳(Oren,2019)。基于其独特的细胞膜结构、组成和渗透压调节机制，大多数嗜盐古菌细胞积累大量类胡萝卜素、PHB/PHA和EPS等生物活性物质，加之高盐条件下极低的发酵污染风险和简单高效的产物回收(通过渗透压变化破碎细胞)优势，使之成为具有生物技术应用前景的新型微生物资源。红色嗜盐古菌细胞膜中富含类胡萝卜素，包括番茄红素，β-胡萝卜素和菌红素等，其中菌红素是其主要的类胡萝卜素(Naziri et al.,2014)。作为一类少见的羟基化C50类胡萝卜素，菌红素属于长链类胡萝卜素，分子中包含13个共轭双键且末端含有羟基，其清除DHHP自由基的能力高于β-胡萝卜素34倍，是一种有效的自由基清除剂(Yatsunami et al.,2014)。然而，嗜盐红色古菌及其类胡萝卜素在水产养殖中的应用尚未见报道。
目前，类胡萝卜素作为饲料添加剂在水产育苗和水产养殖中的应用，主要是含C45类胡萝卜素单细胞藻类(如雨生红球藻)及其主要色素(如虾青素)，主要养殖效果是色素的抗氧化活性对水产动物抗氧化和免疫能力的提升作用。将微藻或色素添加方式均为直接添加到颗粒饲料中，育苗阶段颗粒饲料的使用极为有限，且添加物在水体中会有溶失，降低了微藻或色素的利用率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红色嗜盐古菌盐红菌菌株在水产育苗或养殖中的应用，将富含C50类胡萝卜素的红色嗜盐古菌盐红菌菌株的全细胞应用于水产育苗中，大大提高水产幼苗存活率。
本发明的目的还在于提供一种红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫的制备方法，强化后的卤虫具有较高的存活率和理想的生物包裹菌体效果。
本发明的目的还在于提供上述制备的红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化的卤虫在水产育苗或养殖中应用，有效提高水产动物的抗胁迫能力。
本发明提供了一种红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫的制备方法，包括以下步骤：
将卤虫无节幼体置于盐度50～100g·L-1的卤水中，调整密度至100～250ind·mL-1，在25～30℃条件下投加红色嗜盐古菌盐红菌(Halorubrum sp.)菌株HRM-150的菌体进行强化12～24h，投加量为0.2～0.5g·DW·L-1，在整个强化过程维持充气，使卤水的溶解氧不低于5.0mg·L-1；强化结束后用所述卤水冲洗卤虫无节幼体，得到红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化的卤虫；
所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No.17350。
优选的，所述卤水的盐度为50～80g·L-1。
优选的，所述卤虫无节幼体的密度为120～180ind·mL-1。
优选的，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的投加量为0.2～0.4g·DW·L-1。
优选的，所述卤水的溶解氧为5.5～7.0mg·L-1。
优选的，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的培养方法，包括以下步骤：
将所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的菌种接种到发酵培养基中进行连续发酵培养，收集菌体；
所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250g·L-1；
所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵。
优选的，所述卤虫无节幼体的培养方法，包括以下步骤：
将卤虫卵在28℃，盐度30g·L-1和连续充气条件下孵化24h后，除去空壳和未孵化卤虫卵，收集卤虫无节幼体。
本发明提供了红色嗜盐古菌盐红菌菌株或所述制备方法制备的红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用；
所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No.17350。
优选的，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150联合硅藻或所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150和硅藻联合强化的卤虫在水产育苗或养殖中的应用。
优选的，所述硅藻包括三角褐指藻。
本发明提供了一种红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫的制备方法，将卤虫无节幼体在卤水盐度50～100g·L-1、溶解氧不低于5.0mg·L-1、25～30℃条件下投加红色嗜盐古菌盐红菌(Halorubrum sp.)菌株HRM-150的菌体进行强化12～24h，无节幼体的密度为100～250ind·mL-1，红色嗜盐古菌盐红菌菌株的投加量为0.1～0.5g DW·L-1；强化结束后用所述卤水冲洗卤虫无节幼体，得到红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫；所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No.17350。采用本发明提供的方法强化卤虫，使卤虫存活率达到80％以上；观察卤虫肠道发现，12～24h后强化组卤虫肠道内积累了菌体且卤虫存活率较高，而24h后强化卤虫存活率有所下降。因此，本发明提供的方法实现最大程度的生物包裹菌体效果。
本发明提供了红色嗜盐古菌盐红菌菌株或所述制备方法制备的红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用；所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No.17350。
本发明提供了红色嗜盐古菌盐红菌菌株或所述制备方法制备的红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用。卤虫无节幼体是对虾育苗和养殖必需和常用的生物饵料，采用卤虫强化的方式，使卤虫肠道携带(生物包裹)红色嗜盐古菌盐红菌(Halorubrum sp.)，对虾在摄食卤虫无节幼体的同时将红色嗜盐古菌盐红菌菌株摄入体内，该方法适用于海水鱼和对虾育苗，保证了红色嗜盐古菌的有效应用。以凡纳滨对虾的育苗为例，对虾营养成分方面，与对照相(摄入经未强化的卤虫)比，强化后卤虫的粗蛋白、粗脂肪含量和脂肪酸含量，尤其是PUFA含量普遍较高；强化卤虫脂肪酸的组成和含量与红色嗜盐古菌盐红菌菌株密切相关。在盐胁迫条件下，投喂古菌强化卤虫的对虾存活时间更长，表明投喂古菌强化卤虫的对虾对盐度耐受能力更强。在氨氮胁迫下，投加强化卤虫的对虾存活率(97.50％)显著高于对照组(65.00％)，且Halorubrum菌体和硅藻联合共同摄入降低了氨氮胁迫下对虾肝胰腺的脂质过氧化水平。因此，本发明的应用能有效提高水产动物对环境胁迫的抗性。
附图说明
图1为盐度50g·L-1下强化12h、18h和24h卤虫存活率结果；
图2为盐度75g·L-1下强化12h、18h和24h卤虫存活率结果；
图3为盐度100g·L-1下强化12h、18h和24h卤虫存活率结果；
图4为不同投加量下强化12h后卤虫肠道观察结果；
图5为不同投加量下强化24h后卤虫肠道观察结果；
图6为红色嗜盐古菌盐红菌菌株在不同盐度卤水中存活情况；
图7为不同强化密度下强化24h后卤虫存活率结果；
图8为不同组对虾存活率和体长统计结果；
图9为不同组对虾在80g·L-1高盐度水体中的存活时间结果；
图10为氨氮胁迫24h和48h后不同组对虾的存活率结果；
图11为氨氮胁迫48h后不同组对虾肝胰腺抗氧化酶活力和MDA含量结果。
具体实施方式
本发明提供了一种红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫的制备方法，包括以下步骤：
将卤虫无节幼体置于盐度50～100g·L-1的卤水中，调整密度至100～250ind·mL-1，在25～30℃条件下投加红色嗜盐古菌盐红菌(Halorubrum sp.)菌株HRM-150的菌体进行强化12～24h，投加量为0.1～0.5g·DW·L-1，在整个强化过程维持充气，使卤水的溶解氧不低于5.0mg·L-1；强化结束后用所述卤水冲洗卤虫无节幼体，得到红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫；
所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No.17350。
在本发明中，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150在公开号CN110144315A、专利名称为盐红菌Halorubrum sp.HRM-150及其发酵生产类胡萝卜素的方法的专利中记载。所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的培养方法，优选包括以下步骤：
将所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的菌种接种到发酵培养基中进行连续发酵培养，收集菌体；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250g·L-1；所述发酵培养的条件为：起始转速200rpm，至对数生长期转速升高至400rpm，发酵至50～54h时补加碳源，80～84h结束发酵。所述发酵培养基优选为含有10g L-1酵母提取物，7.5g L-1酸水解酪蛋白和10g L-1葡萄糖的水溶液。所述培养基的盐度优选为200g L-1。所述发酵的温度优选为37℃，发酵期间的pH值为7.2，发酵时转速优选为300～500rpm。发酵84h后优选在4℃、8000rpm离心10min收集菌体，冻干，得到菌粉。所述培养方法有利于使所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150菌体内大量代谢和积累C50类胡萝卜素(菌红素及其衍生物)。
在本发明中，所述卤虫无节幼体的培养方法，优选包括以下步骤：在28℃连续充气条件下，将卤虫卵置于盐度30g·L-1的水体中孵化24h，除去空壳和未孵化卤虫卵，收集卤虫无节幼体。所述连续充气使水体的溶解氧不低于5.0mg L-1。所述培养参见现有技术(Sorgeloos,P.,Dhert,P.,Candreva,P.,2001.Use ofthe brine shrimp,Artemia spp.,in marine fish larviculture.Aquaculture.200,147-159.)。
在本发明中，所述卤水的盐度优选为50～100g·L-1，更优选为50g·L-1。卤水盐度是影响强化效果的重要因素，过低盐度容易使嗜盐古菌细胞由于渗透压变化而破裂；过高盐度易造成卤虫死亡。
在本发明中，卤虫无节幼体的密度优选为120～180ind·mL-1，更优选150ind·mL-1。卤虫无节幼体的密度也是影响强化效果的重要因素。实验表明，过低密度强化生产上不够经济；过高密度强化卤虫易导致卤虫死亡率较高，强化效果不佳。
在本发明中，红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的投加量优选为0.2～0.4g·DW·L-1，更优选0.3g·DW·L-1。此处强化卤虫的生物包裹量是卤虫强化的重要目标，过低的红色嗜盐古菌盐红菌菌株的投加量容易导致卤虫生物包裹量低，由于红色嗜盐古菌盐红菌菌株的添加不仅会造成卤虫水体的溶解氧降低而且也会造成pH值略微降低，过高的红色嗜盐古菌盐红菌菌株的投加量不仅使红色嗜盐古菌盐红菌菌株不能充分利用造成浪费，而且还会影响卤虫生长水体的环境，进而影响卤虫的活力。
在本发明中，所述卤水优选包括采用天然海水配制的卤水和人工配制的卤水。所述卤水的溶解氧优选为5.0～7.0mg·L-1。在卤虫强化过程中，如果不控制卤水的溶解氧或溶解氧的含量，易导致卤虫死亡。
在本发明中，在盐度50g·L-1、75g·L-1和100g·L-1下分别测定12h、18h和24h卤虫存活率，整个强化过程卤虫存活率均在78％以上。50g·L-1下卤虫生长较好，且投加量0.2～0.5g DW L-1卤虫肠道内均可以充满菌体。强化卤虫的目的是使其携带大量的菌体但投加量过大会造成菌体的浪费，因此，0.3g DW L-1的投加量可以在保证存活率的同时达到强化的效果。不同强化时间的存活率显示，强化12h的卤虫的存活率高于18h和24h，且观察卤虫肠道发现，强化12h卤虫肠道内充满了菌体。而18h和24h强化的卤虫存活率有所下降，因此，强化时间优选12～18h或者将红色嗜盐古菌盐红菌菌株优选每隔12h投喂一次。
本发明提供了所述制备方法制备的红色嗜盐古菌盐红菌菌株强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用。
本发明采用卤虫强化的方式，使卤虫肠道携带(生物包裹)红色嗜盐古菌盐红菌菌株，水产动物在摄食卤虫无节幼体的同时将红色嗜盐古菌摄入体内，该方法适用于海水鱼和对虾育苗及养殖，保证了红色嗜盐古菌的有效应用。常见的海水鱼优选包括石斑鱼、半滑舌鳎、大菱鲆等，所述对虾优选包括凡纳滨对虾、斑节对虾等。为了举例说明强化卤虫对水产动物生长及应对环境胁迫的作用，本发明以凡纳滨对虾育苗为例具体说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。
在本发明中，初始投加量优选为280～320个卤虫/尾虾/天，更优选为300个卤虫/尾虾/天。每天投喂三次。投加量优选按每天10％～12％增加，以满足对虾生长的营养需求。在虾苗养殖期间，水温优选27～29℃，更优选为28℃。水体的溶解氧优选为5.5～6.1mg L-1，更优选为5.8mg L-1。pH值优选为7.4～7.8。盐度优选为20g L-1。每天定时换水1/3。
在本发明中，与对照(未强化卤虫)相比，古菌强化后卤虫组中对虾的粗蛋白、粗脂肪含量和脂肪酸含量，尤其是PUFA含量普遍较高。投加古菌强化卤虫组对虾脂肪酸的组成和含量与古菌和古菌强化的卤虫的脂肪酸密切相关。说明古菌强化卤虫对对虾的粗蛋白、粗脂肪含量和脂肪酸的提高有显著影响。
在本发明中，对虾存活和生长方面，古菌强化卤虫组的对虾有更高的存活率(92.23％)和生长(14.27mm)，但与其他组相比无显著差异(P>0.05)。
在本发明中，由于对虾养殖水体中氨氮含量超标、盐度变化和细菌感染等造成对虾氧化应激是其高密度养殖过程中的常见问题，容易导致组织损伤、免疫力下降和病害爆发。降低氨氮胁迫对动物机体造成的氧化损伤至关重要。在盐度胁迫条件下，投喂含古菌的卤虫的对虾存活时间更长，表明古菌强化卤虫使对虾对盐度耐受能力更强。在氨氮胁迫下，对虾存活率(97.50％)显著高于对照组(未强化的卤虫)(65.00％)(P＜0.05)，说明添加古菌提高了对虾抵抗氨氮胁迫的能力。在氨氮胁迫下，测定不同组对虾肝胰腺抗氧化酶活力，结果显示，古菌强化卤虫的对虾，其肝胰腺中SOD和CAT活性与硅藻强化卤虫组无显著差异，但都显著低于对照组(未强化卤虫组)；在氨氮胁迫下，检测脂质过氧化的标志性产物-丙二醛(MDA)含量，结果显示，投喂古菌强化卤虫的对虾，其肝胰腺内MDA含量均显著低于对照组(未强化卤虫组)(P<0.05)，表明古菌体的摄入降低了对虾肝胰腺的脂质过氧化水平。
在本发明中，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150和硅藻联合的强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用。本发明为了举例说明硅藻与红色嗜盐古菌盐红菌菌株的联合强化卤虫在水产养殖和/或育苗中的应用，以水产动物常摄食的三角褐指藻为例，加以说明其应用效果，但不能理解为对本发明保护范围的限制。所述硅藻和红色嗜盐古菌盐红菌菌株的数量比优选为1：1。
在本发明中，在盐度胁迫条件下，投喂含古菌/硅藻的卤虫的对虾存活时间更长，表明古菌/硅藻强化卤虫使对虾对盐度耐受能力更强。在氨氮胁迫下，投喂古菌/硅藻强化卤虫的对虾，其存活率显著高于对照组(未强化的卤虫)(65.00％)(P＜0.05)，说明添加古菌和硅藻提高了对虾抵抗氨氮胁迫的能力。在氨氮胁迫下，测定不同组对虾肝胰腺抗氧化酶活力，结果显示，古菌强化卤虫的对虾，其肝胰腺中SOD和CAT活性与硅藻强化卤虫组无显著差异，但都显著低于对照组(未强化卤虫组)；在氨氮胁迫下，检测脂质过氧化的标志性产物-丙二醛(MDA)含量，结果显示，投喂古菌/硅藻强化卤虫的对虾，其肝胰腺内MDA含量均显著低于对照组(未强化卤虫组)(P<0.05)，表明古菌和硅藻的摄入降低了对虾肝胰腺的脂质过氧化水平。
本发明提供了红色嗜盐古菌盐红菌菌株在水产育苗或养殖中的应用，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No.17350。
在本发明中，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的培养方法与上述记载的红色嗜盐古菌盐红菌菌株的培养方法相同，在此不做赘述。
下面结合实施例对本发明提供的红色嗜盐古菌盐红菌菌株及其强化卤虫在水产育苗或养殖中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.实验材料
红色嗜盐古菌盐红菌(Halorubrum sp.)菌株HRM-150(CGMCC No.17350)菌体在含有10g L-1酵母提取物，7.5g L-1酸水解酪蛋白和10g L-1葡萄糖的培养基中进行发酵，盐度为200g L-1。发酵条件为温度37℃，pH值7.2，转速300～500rpm。发酵84h后在4℃、8000rpm离心10min收集菌体，冻干，得到菌粉。保存于4℃用于后续卤虫强化。
2.实验内容
2.1卤虫孵化、收集与分组
称取2.0g左右卤虫卵于1L锥形管中，加入提前预温好的30g·L-1的卤水，孵化室条件下孵化24h。孵化结束后，快速除去空壳和未孵化卤虫卵，收集卤虫无节幼体。将卤虫无节幼体分别收集到盐度为50g·L-1、75g·L-1和100g·L-1卤水中。分别将适量卤虫加入到1L锥形管，调整卤虫密度为200ind/mL。
50g·L-1、75g·L-1和100g·L-1三组，投加量分别为0.1，0.2，0.3和0.5g·DW·L-1，分别在12、18和24h测定卤虫存活率。
2.2卤虫存活率测定
在强化12h，18h和24h三个时间点，在1L锥形管的不同区域取100μL液体于培养板中，每管取4次，解剖镜下计数活卤虫数量，并在光学显微镜下观察不同投加量下卤虫的肠道是否充满嗜盐古菌。
3.实验结果与分析
3.1卤虫存活率
盐度50g·L-1、75g·L-1和100g·L-1条件下分别测得的12h、18h和24h卤虫存活率。
在强化卤虫过程中保证其较高存活率是强化技术的关键之一。在投加量0.2～0.5g·DW·L-1情况下，盐度50g·L-1组卤虫的存活率要高于盐度75g·L-1和100g·L-1组，达到92％的存活率；在几组强化实验中，卤虫存活率均在78％以上。相比于强化12h，强化18h和强化24h后卤虫存活率有所下降，因此12h是红色嗜盐古菌强化卤虫的最优时间(见图1、图2和图3)。
由于大量红色嗜盐古菌菌体加入会造成水体溶解氧降低，因此，需加大充气，保证溶解氧在5.0mg·L-1以上。
3.2强化后卤虫肠道观察
结果见图4和图5。观察卤虫肠道发现，投加量为0.2，0.3，0.5g·DW·L-1的组别的卤虫在12h后肠道内充满菌体，而投加量为0.1g·DW·L-1的卤虫肠道内菌体积累不明显，因此菌体投加量至少高于0.2g·DW·L-1。
对比例1
将实施例1采用的红色嗜盐古菌盐红菌菌株分别置于不同盐度(30g·L-1、40g·L-1、50g·L-1、60g·L-1、70g·L-1、80g·L-1、90g·L-1和100g·L-1)的卤水中，观察该菌的细胞形态。
结果如图6所示。红色嗜盐古菌细胞在盐度50g·L-1以下的卤水中，细胞完整度下降(完整细胞的数量减少)。细胞完整度结果表明，盐度较低的卤水不适合红色嗜盐古菌细胞的存活，因此，选择卤虫强化时，选择盐度高于50g·L-1的卤水。
实施例2和3
采用实施例1的方法强化卤虫，区别在于卤虫的密度为150ind·mL-1和250ind·mL-1。统计强化24h后卤虫的存活率。
不同强化密度下强化24h后卤虫存活率结果见图7。卤虫密度为150～250ind/mL的条件下，强化后卤虫的存活率达到84％以上。结果如150～250ind·mL-1不同强化密度下卤虫均有较高存活率，其中200ind·mL-1强化密度较优。
实施例4
1.将无节幼体分为四组：对照组(Ctrl)不进行强化；Hrm组用Halorubrum菌体作为强化剂；Pht组用三角褐指藻干粉作为强化剂；Hrm/Pht组用50％Halorubrum菌体+50％三角褐指藻干粉作为强化剂，将收集的卤虫放入装有8L稀释卤水(盐度50g·L-1)的锥形桶中进行强化，强化密度为200ind·mL-1，温度为28℃。强化期间强化剂的投加量分别是0.3g DW·L-1，强化12h后收集卤虫。在4℃下充气保存，以维持卤虫存活和营养质量。
2.对虾养殖
将PL5期凡纳滨对虾虾苗暂养3天后，分为4组Ctrl；Hrm；Pht；Hrm/Pht组，依次投喂饥饿卤虫、古菌强化的卤虫、三角褐指藻强化的卤虫、50％古菌+50％三角褐指藻强化的卤虫。每组设3个平行。随机挑选健康且大小均匀的虾苗(平均体长0.5cm)进行实验。单位养殖水体20L，养殖密度50ind·L-1。养殖期间维持水温28±1.0℃，溶解氧5.8±0.2mg·L-1，pH值7.6±0.2和盐度20g·L-1。每天投喂三次。初始投加量为300个卤虫/尾虾/天，投加量按每天10％增加。采用内部循环过滤养殖系统，采用海绵过滤食物残渣和对虾粪便，每天定时换水1/3。养殖周期为10天。
3.指标测定
养殖10天后，测定对虾存活率，并从每个平行箱中随机取10尾虾测量其体长(自对虾眼柄基部至尾节末端)。利用全自动凯氏定氮仪分别测定卤虫和对虾粗蛋白含量。用索氏抽提法测定粗脂肪含量。采用Sui等人(Sui,L.Y.,Sun,H.X.,Wu,X.G.,Wille,M.,Cheng,Y.X.,Sorgeloos,P.,2011.Effect of dietary HUFA on tissue fatty acidcomposition and reproductive performance of Chinese mitten crabEriocheirsinensis(H.Milne-Edwards)broodstock.Aquacult Int.19,269-282.)的方法对卤虫和对虾脂肪酸甲酯(FAME)进行GC-MS分析验证。
为测定对虾的健壮程度，从每个平行箱中各取出20尾虾，立刻将其转移到盐度80g·L-1的水体中，每隔10min测定对虾的死亡数量。当对虾没有运动，并且用塑料吸管刺激对虾没有反应时，就可以判定对虾死亡。
养殖结束后在每个平行箱中随机取20尾虾，转移到氨氮浓度30mg·L-1(非离子氨浓度0.8mg·L-1)的水体中进行氨氮胁迫，每隔24h测定对虾存活率。胁迫48h后将存活的对虾肝胰腺解剖加入无菌的0.86％氯化钠溶液制备10％(W:V)匀浆液，4℃，2500rpm离心10min。立即用上清液进行酶活性和脂质氧化分析。采用南京建成试剂盒测定肝胰腺中SOD、CAT活性和MDA含量。SOD活性用黄嘌呤氧化酶法测定(Elstner,E.F.,Heupel,A.,1976.Inhibition ofnitrite formation from hydroxylammoniumchloride:A simpleassay for superoxide dismutase.Analytical Biochemistry.70,616-620.)。CAT活性是在405nm用过氧化氢还原后测定(Aebi,H.,1984.Catalase in vitro.Methods inEnzymology.105,121-126.)，并以每毫克蛋白的单位表达。采用硫代巴比妥酸法测定MDA(Buege,J.A.,Aust,S.D.,1978.Microsomal lipid peroxidation.Methods inEnzymology.52,302-310.)。
4.统计分析
数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(one-wayANOVA)确定统计学显著性，然后采用Tukey多重范围检验，P<0.05(SPSS20.0软件)。
5.结果
5.1对虾营养成分
与对照相比，强化后卤虫组粗蛋白、粗脂肪含量和脂肪酸含量，尤其是PUFA含量普遍高于对照组。强化卤虫的脂肪酸的成分和含量与强化剂的脂肪酸一致。用三角褐指藻强化的卤虫富含大量的EPA(表1)。
表1不同强化剂强化卤虫的粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸组成
Figure BDA0002712259940000121
Figure BDA0002712259940000131
对虾粗蛋白含量在67.02％到68.97％之间，各组之间无显著差异(P>0.05)。Hrm/Pht组的脂肪含量显著高于对照组。Pht组对虾的EPA含量显著高于对照组，其他组之间无显著差异(表2)。
表2不同组对虾的粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸组成
Figure BDA0002712259940000132
5.2对虾存活和生长
养殖10天后，PL凡纳滨对虾的总存活率在74.90％以上，平均体长在13.05mm以上。与其他组相比，投喂古菌强化卤虫的对虾有更高的存活率(92.23％)和生长(14.27mm)，但无显著差异(P>0.05)(图8)。
5.3盐度胁迫
把对虾从盐度20g·L-1的水体中转移到盐度80g·L-1的水体中，投喂饥饿卤虫的对虾和投喂三角褐指藻强化的卤虫的对虾只存活了50分钟，而投喂含古菌的卤虫的对虾存活时间更长，包括Hrm组和Hrm/Pht组(图9)，表明Hrm组和Hrm/Pht组对虾对盐度耐受能力更强。
5.4氨氮胁迫
在30mg·L-1氨氮浓度水体中暴露24h，大部分虾依旧存活且各组之间存活率没有显著性差异(P>0.05)。暴露48h后，Hrm组对虾存活率(97.50％)显著高于对照组(65.00％)(P＜0.05)，说明饲料中添加古菌提高了对虾抵抗氨氮胁迫的能力(图10)。
氨氮胁迫48h后测定不同组对虾肝胰腺抗氧化酶活力(图11)，结果显示，Hrm组、Pht组和Hrm/Pht组对虾肝胰腺的SOD和CAT活性无显著差异，但都显著低于对照组。丙二醛MDA是脂质过氧化的标志性产物，氨氮胁迫48h的结果显示，投喂强化卤虫的对虾，肝胰腺内MDA含量均显著低于对照组(P<0.05)，表明Halorubrum sp.菌体和三角褐指藻的摄入降低了对虾肝胰腺的脂质过氧化水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150或红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150强化卤虫在水产养殖中的应用；所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150或红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150强化卤虫在水产养殖中能有效提高水产动物对环境胁迫的抗性；所述环境胁迫为氨氮胁迫;
所述水产动物为对虾；
所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的生物保藏编号为CGMCC No. 17350；
所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150强化卤虫的制备方法，步骤为：
将卤虫无节幼体置于盐度50~100 g·L−1的卤水中，调整密度至100~250 ind·mL-1，在25~30℃条件下投加红色嗜盐古菌盐红菌（Halorubrum sp.）菌株HRM-150的菌体进行强化12~24h，投加量为0.2~0.5 g·DW·L-1，在整个强化过程维持充气，使卤水的溶解氧不低于5.0 mg·L-1；强化结束后用所述卤水冲洗卤虫无节幼体，得到红色嗜盐古菌菌体强化的卤虫；
所述卤虫无节幼体的培养方法，步骤为：
将卤虫卵在28℃，盐度30 g·L−1和连续充气条件下孵化24 h后，除去空壳和未孵化卤虫卵，收集卤虫无节幼体；
所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的培养方法，步骤为：
将所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的菌种接种到发酵培养基中进行连续发酵培养，收集菌体；所述发酵培养基含质量分数为1％的氮源和质量分数为1％的碳源，盐度为150～250 g·L-1；所述发酵培养的条件为：起始转速200 rpm，至对数生长期转速升高至400 rpm，发酵至50~54h时补加碳源，80~84h结束发酵。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤水的盐度为60~80 g·L−1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤虫无节幼体的密度为120~180ind·mL-1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150的投加量为0.2~0.4 g·DW·L-1。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤水的溶解氧为5.4~7.0 mg·L-1。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150联合硅藻或所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150和硅藻联合强化的卤虫在水产养殖中的应用；所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150联合硅藻或所述红色嗜盐古菌盐红菌菌株HRM-150和硅藻联合强化的卤虫在水产养殖中能有效降低氨氮胁迫下肝胰腺的脂质过氧化水平；
所述水产动物为对虾。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述硅藻包括三角褐指藻。
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