CN114836506A - 一种富含虾青素的酵母培养物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，具体包括以下步骤：(1)酿酒酵母发酵液的制备；(2)红法夫酵母发酵液的制备；(3)混合发酵液的制备；(4)固态发酵培养基的制备；(5)固态发酵；(6)干燥、粉碎。本发明采用酵母培养物的生产方式，将酿酒酵母和红法夫酵母组合生产成一种富含虾青素的新型酵母培养物，该产品既保留有酵母培养物的原有功效，同时又具有虾青素的强抗氧化功能，从而增强了酵母培养物的功效，降低了虾青素在动物养殖中的使用成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体的说是涉及一种富含虾青素的酵母培养物及其制备方法。
背景技术
虾青素是一种断链抗氧化剂，具有极强的抗氧化能力，可以清除二氧化氮、硫化物和二硫化物等，也可降低脂质过氧化作用，有效的抑制自由基引起的脂质过氧化作用。同时，虾青素还有抑制肿瘤发生、增强免疫力和清除体内自由基等多方面的生理作用。但是，虾青素的生产成本较高，目前仅能在高档水产动物中使用，限制了其在动物养殖中的应用。
酵母培养物是指在特定工艺条件控制下由酵母菌在特定的培养基上经过充分的厌氧发酵后形成的微生态制品，主要由酵母细胞代谢产物、经过发酵后变异的培养基和少量已无活性的酵母细胞所构成。酵母培养物属“后生元(Postbiotics)”，研究证实，经过筛选的后生元，增强免疫能力优于原活菌，即使经由高温作用或肠胃消化液处理，仍保持有高度的生理活性。
虽然酵母培养物在动物养殖中广泛应用，但是主要用于调节动物肠道和提高动物免疫力，而其抗氧化功能并不突出。
因此，如何制备一种富含虾青素的酵母培养物是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种富含虾青素的酵母培养物及其制备方法，采用酵母培养物的生产工艺，以酿酒酵母菌和富含虾青素的红法夫酵母菌为菌种，液态发酵时以糖蜜和葡萄糖为复合碳源、以酵母膏和硫酸铵为混合氮源组成培养联合，分别生产菌种发酵液，再将两种发酵液按一定比例混合接种到以玉米副产物为原料的固态培养基中进行固态发酵后干燥粉碎，所得到的产品具有调肠道、抗氧化和增免疫的功效，对动物的健康养殖和减抗提质具有重要作用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)酿酒酵母发酵液的制备
将酿酒酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到酿酒酵母发酵液；
(2)红法夫酵母发酵液的制备
将红法夫酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到红法夫酵母发酵液；
(3)混合发酵液的制备
将酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液混合均匀，得到混合发酵液，备用；
(4)固态发酵培养基的制备
将玉米胚芽粕和喷浆玉米皮混合均匀，得到固态发酵培养基；
(5)固态发酵
先将混合发酵液和固态发酵培养基混合均匀，再加水混合均匀，自然发酵，得到固态发酵物；
(6)干燥、粉碎
将固态发酵物进行干燥，粉碎，即得富含虾青素的酵母培养物。
进一步，上述步骤(1)中，酿酒酵母菌的活化培养方法具体为:将酿酒酵母菌的冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在28-30℃培养箱中培养24-36h；
酿酒酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的无菌培养皿平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28-30℃、160rpm的条件培养20-24h，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28-30℃、160rpm的条件培养20-24h，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％-10％的接种量接种至装液量为70％三级种子培养基的种子罐中，以28-30℃、800-1000rpm的条件培养20-24h，待活菌数达到10-12亿/mL且细胞湿重达到40-50g/L时，作为三级种子；
酿酒酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量为70％发酵培养基的发酵罐中，以28-30℃的条件培养20-24h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，待细胞湿重达到100-120g/L时，得到酿酒酵母发酵液；
其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
发酵培养基的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖80g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂5mL/L；
碳源的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖90g/L，酵母膏40g/L；所述碳源的流加方式为：溶氧高于50％时自动流加；氮源的配方为：硫酸铵10g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过将酿酒酵母菌进行活化培养、种子培养和液态发酵，能够培养足够数量的酿酒酵母菌，有利于固态发酵时产生更多的代谢产物。
进一步，上述步骤(1)中，酿酒酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CICC 1339。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选保藏编号为CICC 1339的酿酒酵母菌菌种高产谷胱甘肽，可与虾青素协同作用，提高酵母培养物产品的抗氧化功能。
进一步，上述步骤(2)中，红法夫酵母菌的活化培养方法具体为：将红法夫酵母菌的冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在20-22℃培养箱中培养72-96h；
红法夫酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20-22℃、200rpm的条件培养72-96h，当活菌数达到1亿/mL时，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20-22℃、200rpm的条件培养72-96h，当活菌数达到1亿/mL时，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％-10％的接种量接种至装液量70％三级种子培养基的种子罐中，以20-22℃的条件培养60-72h，当活菌数达到1.0-1.5亿/mL且细胞湿重生物量达到40-50g/L时，作为三级种子；
红法夫酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量50％发酵培养基的发酵罐中，以20-22℃的条件培养72-96h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，当细胞湿重生物量达到100-120g/L时，得到红法夫酵母发酵液；
其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；所述三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
发酵培养基的配方均为：糖蜜50g/L，葡萄糖60g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵7g/L，消泡剂5mL/L；
碳源的配方为：糖蜜80g/L，葡萄糖120g/L，酵母膏40g/L；所述碳源的流加方式为：溶氧高于30％自动流加；氮源的配方为：硫酸铵20g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过将红法夫酵母菌进行活化培养、种子培养和液态发酵，能够最大程度提高红法红夫酵母的活菌数、生物量及虾青素含量。
进一步，上述步骤(2)中，红法夫酵母菌为红法夫酵母(Phaffia rhodozymaLUCNOVA001)，保藏编号为CCTCC M 20211124。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选保藏编号为CCTCC M20211124的红法夫酵母菌菌种富含虾青素，可有效提升酵母培养物产品中的虾青素含量。
进一步，上述步骤(3)中，酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液的质量比为(1-3):(3-1)。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过调控酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液的质量比，可生产出不同虾青素含量的酵母培养物产品。
进一步，上述步骤(4)中，玉米胚芽粕和喷浆玉米皮的质量比(1-9):(9-1)。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过调控玉米胚芽粕和喷浆玉米皮的质量比，可降低固态发酵培养基原料的供应难度。
进一步，上述步骤(5)中，混合发酵液和固态发酵培养基的质量比为(1-3):(9-7)。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过调控混合发酵液和固态发酵培养基的质量比，可生产出不同虾青素含量的产品酵母培养物。
进一步，上述步骤(5)中，加水至物料的水分含量为38％-40％，温度为18-20℃；自然发酵的物料高度为0.3-0.5m，温度为18-30℃，时间为60-72h，待物料温度达到42℃以上且有酒香味时发酵完成。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选物料的水分含量、温度，以及发酵的物料高度、温度和时间，同时兼顾了酿酒酵母菌和红法夫酵母菌的生长条件，最大可能的提升了酵母培养物产品中的代谢产物含量。
进一步，上述步骤(6)中，干燥的进风温度不高于160℃，待物料水分含量达到10％-12％且物料温度不高于70℃时干燥完成。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选干燥的进风温度和物料温度，在干燥的基础上，充分保证了酵母代谢物中的活性物质不被高温破坏。
本发明还请求保护一种上述制备方法制得的富含虾青素的酵母培养物。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明采用酵母培养物的生产方式，将酿酒酵母和红法夫酵母组合生产成一种富含虾青素的新型酵母培养物，该产品既保留有酵母培养物的原有功效，同时又具有虾青素的强抗氧化功能，从而增强了酵母培养物的功效，降低了虾青素在动物养殖中的使用成本。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中：
酿酒酵母菌的中文名称为酿酒酵母，拉丁名称为Saccharomycescerevisiae，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏时间：1958年01月01日，保藏编号：CICC 1339，保藏地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮编：100015，电话：010-53218300/11，传真：010-53218307，网址：http://www.china-cicc.org。
红法夫酵母菌的中文名称为红法夫酵母，拉丁名称为Phaffia rhodozymaLUCNOVA001，记载在申请人为湖北绿科乐华生物科技有限公司、申请日为2021年10月09日、申请号为202111175715.7、公开日为2021年12月14日、公开号为CN113789322A、发明名称为一种高产虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法与应用的专利申请文件中，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏时间：2021年09月01日，保藏编号：CCTCC M 20211124，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072，电话：027-68752319，网址：http://cctcc.whu.edu.cn。
需要说明的是，以上酿酒酵母菌菌株和红法夫酵母菌菌株均为现有技术，自保藏之日起可通过正常渠道购买获得，无需提供保藏证明等文件。
实施例1
富含虾青素的酵母培养物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)酿酒酵母发酵液的制备
将酿酒酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到酿酒酵母发酵液；
酿酒酵母菌的活化培养方法具体为:将保藏编号为CICC 1339的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在28℃培养箱中培养30h；其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
酿酒酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的无菌培养皿平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28℃、160rpm的条件培养22h，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28℃、160rpm的条件培养22h，作为二级种子；③将二级种子收集，以8％的接种量接种至装液量为70％三级种子培养基的种子罐中，以28℃、800rpm的条件培养22h，待活菌数达到10亿/mL且细胞湿重达到45g/L时，作为三级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
酿酒酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量为70％发酵培养基的发酵罐中，以28℃的条件培养22h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，待细胞湿重达到100g/L时，得到酿酒酵母发酵液；其中，发酵培养基的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖80g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂5mL/L；碳源的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖90g/L，酵母膏40g/L；碳源的流加方式为：溶氧高于50％时自动流加；氮源的配方为：硫酸铵10g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L；
(2)红法夫酵母发酵液的制备
将红法夫酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到红法夫酵母发酵液；
红法夫酵母菌的活化培养方法具体为：将保藏编号为CCTCC M 20211124的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma LUCNOVA001)冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在20℃培养箱中培养84h；其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
红法夫酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20℃、200rpm的条件培养84h，当活菌数达到1亿/mL时，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20℃、200rpm的条件培养84h，当活菌数达到1亿/mL时，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％-10％的接种量接种至装液量70％三级种子培养基的种子罐中，以20℃的条件培养66h，当活菌数达到1.2亿/mL且细胞湿重达到45g/L时，作为三级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
红法夫酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量50％发酵培养基的发酵罐中，以20℃的条件培养84h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，当细胞湿重达到100g/L时，得到红法夫酵母发酵液；其中，发酵培养基的配方均为：糖蜜50g/L，葡萄糖60g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵7g/L，消泡剂5mL/L；碳源的配方为：糖蜜80g/L，葡萄糖120g/L，酵母膏40g/L；碳源的流加方式为：溶氧高于30％自动流加；氮源的配方为：硫酸铵20g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L；
(3)混合发酵液的制备
将酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液以1:1的质量比混合均匀，得到混合发酵液，储存于10℃储存罐中备用；
(4)固态发酵培养基的制备
将玉米胚芽粕和喷浆玉米皮以1:1的质量比混合均匀，得到固态发酵培养基；
(5)固态发酵
先将混合发酵液和固态发酵培养基以2:5的质量比混合均匀，再加热水混合均匀至物料的水分含量为38％，温度为18℃；将混合后的物料放入发酵箱，物料高度为0.4m，在24℃的环境温度下自然发酵66h；待物料温度达到42℃以上且有酒香味时发酵完成，得到固态发酵物；
(6)干燥、粉碎
将固态发酵物送入流化床气流干燥机低温干燥，设置进风温度不高于160℃，待物料水分含量达到10％且物料温度不高于70℃时干燥完成，干燥冷却后的物料用1.0mm筛进行粉碎，打包入库，即得富含虾青素的酵母培养物。
实施例2
富含虾青素的酵母培养物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)酿酒酵母发酵液的制备
将酿酒酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到酿酒酵母发酵液；
酿酒酵母菌的活化培养方法具体为:将保藏编号为CICC 1339的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在28℃培养箱中培养36h；其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
酿酒酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的无菌培养皿平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28℃、160rpm的条件培养24h，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以30℃、160rpm的条件培养24h，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％的接种量接种至装液量为70％三级种子培养基的种子罐中，以28℃、800rpm的条件培养24h，待活菌数达到10亿/mL且细胞湿重达到40g/L时，作为三级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
酿酒酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量为70％发酵培养基的发酵罐中，以28℃的条件培养24h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，待细胞湿重达到100g/L时，得到酿酒酵母发酵液；其中，发酵培养基的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖80g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂5mL/L；碳源的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖90g/L，酵母膏40g/L；碳源的流加方式为：溶氧高于50％时自动流加；氮源的配方为：硫酸铵10g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L；
(2)红法夫酵母发酵液的制备
将红法夫酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到红法夫酵母发酵液；
红法夫酵母菌的活化培养方法具体为：将保藏编号为CCTCC M 20211124的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma LUCNOVA001)冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在20℃培养箱中培养96h；其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
红法夫酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20℃、200rpm的条件培养96h，当活菌数达到1亿/mL时，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20℃、200rpm的条件培养96h，当活菌数达到1亿/mL时，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％的接种量接种至装液量70％三级种子培养基的种子罐中，以20℃的条件培养72h，当活菌数达到1.0亿/mL且细胞湿重达到到40g/L时，作为三级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
红法夫酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量50％发酵培养基的发酵罐中，以20℃的条件培养96h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，当细胞湿重达到100g/L时，得到红法夫酵母发酵液；其中，发酵培养基的配方均为：糖蜜50g/L，葡萄糖60g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵7g/L，消泡剂5mL/L；碳源的配方为：糖蜜80g/L，葡萄糖120g/L，酵母膏40g/L；碳源的流加方式为：溶氧高于30％自动流加；氮源的配方为：硫酸铵20g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L；
(3)混合发酵液的制备
将酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液以1:3的质量比混合均匀，得到混合发酵液，储存于10℃储存罐中备用；
(4)固态发酵培养基的制备
将玉米胚芽粕和喷浆玉米皮以1:9的质量比混合均匀，得到固态发酵培养基；
(5)固态发酵
先将混合发酵液和固态发酵培养基以1:9的质量比混合均匀，再加热水混合均匀至物料的水分含量为38％，温度为18℃；将混合后的物料放入发酵箱，物料高度为0.3m，在18℃的环境温度下自然发酵72h；待物料温度达到42℃以上且有酒香味时发酵完成，得到固态发酵物；
(6)干燥、粉碎
将固态发酵物送入流化床气流干燥机低温干燥，设置进风温度不高于160℃，待物料水分含量达到10％且物料温度不高于70℃时干燥完成，干燥冷却后的物料用0.8mm筛进行粉碎，打包入库，即得富含虾青素的酵母培养物。
实施例3
富含虾青素的酵母培养物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)酿酒酵母发酵液的制备
将酿酒酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到酿酒酵母发酵液；
酿酒酵母菌的活化培养方法具体为:将保藏编号为CICC 1339的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在30℃培养箱中培养24h；其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
酿酒酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的无菌培养皿平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以30℃、160rpm的条件培养20h，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以30℃、160rpm的条件培养20h，作为二级种子；③将二级种子收集，以10％的接种量接种至装液量为70％三级种子培养基的种子罐中，以30℃、1000rpm的条件培养20h，待活菌数达到12亿/mL且细胞湿重达到50g/L时，作为三级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
酿酒酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量为70％发酵培养基的发酵罐中，以30℃的条件培养20h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，待细胞湿重达到120g/L时，得到酿酒酵母发酵液；其中，发酵培养基的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖80g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂5mL/L；碳源的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖90g/L，酵母膏40g/L；碳源的流加方式为：溶氧高于50％时自动流加；氮源的配方为：硫酸铵10g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L；
(2)红法夫酵母发酵液的制备
将红法夫酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到红法夫酵母发酵液；
红法夫酵母菌的活化培养方法具体为：将保藏编号为CCTCC M 20211124的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma LUCNOVA001)冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在22℃培养箱中培养72h；其中，活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
红法夫酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以22℃、200rpm的条件培养72h，当活菌数达到1亿/mL时，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以22℃、200rpm的条件培养72h，当活菌数达到1亿/mL时，作为二级种子；③将二级种子收集，以10％的接种量接种至装液量70％三级种子培养基的种子罐中，以22℃的条件培养60h，当活菌数达到1.5亿/mL且细胞湿重达到50g/L时，作为三级种子；其中，一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
红法夫酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量50％发酵培养基的发酵罐中，以22℃的条件培养72h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，当细胞湿重达120g/L时，得到红法夫酵母发酵液；其中，发酵培养基的配方均为：糖蜜50g/L，葡萄糖60g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵7g/L，消泡剂5mL/L；碳源的配方为：糖蜜80g/L，葡萄糖120g/L，酵母膏40g/L；碳源的流加方式为：溶氧高于30％自动流加；氮源的配方为：硫酸铵20g/L；磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L；
(3)混合发酵液的制备
将酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液以3:1的质量比混合均匀，得到混合发酵液，储存于10℃储存罐中备用；
(4)固态发酵培养基的制备
将玉米胚芽粕和喷浆玉米皮以9:1的质量比混合均匀，得到固态发酵培养基；
(5)固态发酵
先将混合发酵液和固态发酵培养基以3:7的质量比混合均匀，再加热水混合均匀至物料的水分含量为40％，温度为20℃；将混合后的物料放入发酵箱，物料高度为0.5m，在30℃的环境温度下自然发酵60h；待物料温度达到42℃以上且有酒香味时发酵完成，得到固态发酵物；
(6)干燥、粉碎
将固态发酵物送入流化床气流干燥机低温干燥，设置进风温度不高于160℃，待物料水分含量达到12％且物料温度不高于70℃时干燥完成，干燥冷却后的物料用1.2mm筛进行粉碎，打包入库，即得富含虾青素的酵母培养物。
性能测试
选取360只健康且体重相近的1日龄樱桃谷鸭，随机分为2组(Ⅰ组和Ⅱ组)，每组6个重复，每个重复30只，试验期为42d。试验采用玉米-豆粕型基础日粮，参考美国NRC(1994)中樱桃谷鸭的营养需要量，分别设计1～21日龄和22～42日龄樱桃谷鸭的日粮配方。其中，Ⅰ组饲喂玉米-豆粕型基础日粮，Ⅱ组在玉米-豆粕型基础日粮中添加2％实施例1制得的富含虾青素的酵母培养物。
玉米-豆粕型基础日粮的原料组成及营养水平见表1。
表1玉米-豆粕型基础日粮的原料组成及营养水平
注：
1.每千克预混料中含有：VA 12000IU、VD3 2 500 IU、VE 20IU、VK 2.0mg、VB1 1.0mg、VB2 8.0 mg、VB12 0.01 mg、VB6 2.0 mg、泛酸10.0mg、烟酸75.0mg、胆碱500.0mg、生物素0.05mg、叶酸2.0mg、Cu 5.0mg、Zn 100.0mg、Fe 120.0mg、Mn 100.0mg、I 0.2mg、Se0.15mg；
2.营养水平为计算值。
饲养试验开始前，对鸭舍、水槽和料槽进行充分清洗并严格消毒。樱桃谷鸭为舍内平养，自由采食和饮水，少添勤喂，按鸭场常规程序进行免疫和管理。试验至第42d，每组每个重复随机取一只接近平均体重的樱桃谷鸭，称重后颈静脉采血，室温静置后3000r/min，离心20min获得血清样品，-20℃保存。采血后将樱桃谷鸭放血处死，立即解剖，取两侧胸腺、脾脏和法氏囊，剔除表面附着的脂肪组织，滤纸擦干血液，准确称重。在无菌操作条件下，快速收集盲肠内容物于灭菌的冻存管中，液氮速冻，-80℃保存。
分别进行以下测试：
1、肠道微生物分析：PCR扩增，Illumina Miseq测序和生物信息分析均由深圳华大基因科技服务有限公司完成。
日粮中添加富含虾青素的酵母培养物对樱桃谷鸭肠道差异菌属水平相对丰度的影响结果见表2。
表2樱桃谷鸭肠道差异菌属水平相对丰度
由表2可知，在属水平上，Ⅱ组樱桃谷鸭肠道细菌中拟杆菌属的相对丰度高于Ⅰ组，Erysipelatoclostridium的相对丰度低于对照组。拟杆菌属的脆弱拟杆菌能激活Toll样受体，通过分泌一种微生物多糖A可抵制Helicobacter hepaticus诱导的结肠炎，增强机体免疫力。Erysipelatoclostridium是一种条件性致病菌，日粮中添加2％富含虾青素的酵母培养物可降低Erysipelatoclostridium的相对丰度，减小樱桃谷鸭患病的可能性。
2、抗氧化指标：取樱桃谷鸭的血清样品检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)和总抗氧化能力(T-AOC)。GSH-Px检测试剂盒(A005)、MDA检测试剂盒(A003-1)、POD检测试剂盒(A084-2)和T-AOC检测试剂盒(A015-2)均购于南京建成生物工程研究所。
日粮中添加富含虾青素的酵母培养物对樱桃谷鸭抗氧化能力的影响结果见表3。
表3樱桃谷鸭抗氧化能力
| 项目 | Ⅰ组 | Ⅱ组 |
| GSH-Px(U/mL) | 178.13±15.36 | 186.40±17.47 |
| POD(U/mL) | 30.78±3.86 | 27.32±3.44 |
| MDA(nmol/mL) | 5.58±0.96 | 2.92±0.31 |
| T-AOC(mmol/l) | 0.44±0.03 | 0.61±0.05 |
由表3可知，Ⅱ组樱桃谷鸭血清MDA的含量显著低于Ⅰ组(P<0.05)。Ⅱ组樱桃谷鸭血清T-AOC的含量极显著高于Ⅰ组(P<0.01)。
3、免疫指标：①由免疫器官指数(g/kg)＝免疫器官重量(g)/活体重量(kg)计算得出；②酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)的含量，IgM检测试剂盒(H109)、IgA检测试剂盒(H108)和IgG检测试剂盒(H106)均购于南京建成生物工程研究所。
日粮中添加富含虾青素的酵母培养物对樱桃谷鸭免疫器官指数的影响结果见表4。
表4樱桃谷鸭免疫器官指数
| 项目 | Ⅰ组(g/kg) | Ⅱ组(g/kg) |
| 胸腺指数 | 3.01±0.13 | 5.57±0.64 |
| 脾脏指数 | 0.83±0.08 | 0.73±0.06 |
| 法氏囊指数 | 1.28±0.04 | 1.80±0.14 |
由表4可知，Ⅱ组樱桃谷鸭的胸腺指数极显著高于Ⅰ组(P<0.01)。
日粮中添加富含虾青素的酵母培养物对樱桃谷鸭血清免疫球蛋白含量的影响结果见表5。
表5樱桃谷鸭血清免疫球蛋白含量
| 项目 | Ⅰ组(mg/mL) | Ⅱ组(mg/mL) |
| IgM | 0.33±0.02 | 0.61±0.04 |
| IgA | 6.85±0.90 | 8.47±0.70 |
| IgG | 5.51±0.41 | 5.62±0.23 |
由表5可知，Ⅱ组樱桃谷鸭血清IgM的含量极显著高于Ⅰ组(P<0.01)，Ⅱ组樱桃谷鸭血清IgA的含量均极显著高于Ⅰ组(P<0.05)。
由以上试验可知，本发明富含虾青素的酵母培养物按一定比例添加到动物饲料中，对动物具有调肠道、抗氧化和增免疫的功效，对动物的健康养殖和减抗提质具有重要作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)酿酒酵母发酵液的制备
将酿酒酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到酿酒酵母发酵液；
(2)红法夫酵母发酵液的制备
将红法夫酵母菌经活化培养、种子培养和液态发酵，得到红法夫酵母发酵液；
(3)混合发酵液的制备
将酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液混合均匀，得到混合发酵液，备用；
(4)固态发酵培养基的制备
将玉米胚芽粕和喷浆玉米皮混合均匀，得到固态发酵培养基；
(5)固态发酵
先将混合发酵液和固态发酵培养基混合均匀，再加水混合均匀，自然发酵，得到固态发酵物；
(6)干燥、粉碎
将固态发酵物进行干燥，粉碎，即得所述富含虾青素的酵母培养物。
2.根据权利要求1所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酿酒酵母菌的活化培养方法具体为:将酿酒酵母菌的冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在28-30℃培养箱中培养24-36h；
所述酿酒酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的无菌培养皿平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28-30℃、160rpm的条件培养20-24h，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以28-30℃、160rpm的条件培养20-24h，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％-10％的接种量接种至装液量为70％三级种子培养基的种子罐中，以28-30℃、800-1000rpm的条件培养20-24h，待活菌数达到10-12亿/mL且细胞湿重达到40-50g/L时，作为三级种子；
所述酿酒酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量为70％发酵培养基的发酵罐中，以28-30℃的条件培养20-24h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，待细胞湿重达到100-120g/L时，得到酿酒酵母发酵液；
其中，所述活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
所述一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；所述三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
所述发酵培养基的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖80g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂5mL/L；
所述碳源的配方为：糖蜜60g/L，葡萄糖90g/L，酵母膏40g/L；所述碳源的流加方式为：溶氧高于50％时自动流加；所述氮源的配方为：硫酸铵10g/L；所述磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；所述氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L。
3.根据权利要求1或2所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酿酒酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CICC1339。
4.根据权利要求1所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述红法夫酵母菌的活化培养方法具体为：将红法夫酵母菌的冻干粉用2mL无菌水制成菌悬液，使用接种环接一环菌悬液划线至装有活化培养基的无菌培养皿平板上，在20-22℃培养箱中培养72-96h；
所述红法夫酵母菌的种子培养方法具体为：①用接种环从活化好的平板中挑取单菌落，接种至装有一级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20-22℃、200rpm的条件培养72-96h，当活菌数达到1亿/mL时，作为一级种子；②用移液枪从一级种子中以5％的接种量接种至装有二级种子培养基的无菌三角瓶中，在摇床中以20-22℃、200rpm的条件培养72-96h，当活菌数达到1亿/mL时，作为二级种子；③将二级种子收集，以5％-10％的接种量接种至装液量70％三级种子培养基的种子罐中，以20-22℃的条件培养60-72h，当活菌数达到1.0-1.5亿/mL且细胞湿重生物量达到40-50g/L时，作为三级种子；
所述红法夫酵母菌的液态发酵方法具体为：将三级种子通过接种管道由种子罐导入装液量50％发酵培养基的发酵罐中，以20-22℃的条件培养72-96h，并流加补充碳源、氮源和磷盐，当细胞湿重生物量达到100-120g/L时，得到红法夫酵母发酵液；
其中，所述活化培养基的配方为：YPD液态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，高压灭菌锅115℃灭菌30min；YPDA固态培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，调节pH为6.4，琼脂18g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；
所述一级种子培养基和二级种子培养基的配方均为：糖蜜20g/L，葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，高压灭菌锅115℃灭菌30min；所述三级种子培养基的配方为：糖蜜20g/L，葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵5g/L，消泡剂2mL/L；
所述发酵培养基的配方均为：糖蜜50g/L，葡萄糖60g/L，酵母膏25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸铵7g/L，消泡剂5mL/L；
所述碳源的配方为：糖蜜80g/L，葡萄糖120g/L，酵母膏40g/L；所述碳源的流加方式为：溶氧高于30％自动流加；所述氮源的配方为：硫酸铵20g/L；所述磷盐的配方为：磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁3g/L；所述氮源和磷盐的流加方式为：每小时流加10次，每次0.1L。
5.根据权利要求1或4所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述红法夫酵母菌为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma LUCNOVA001)，保藏编号为CCTCC M 20211124。
6.根据权利要求1所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酿酒酵母发酵液和红法夫酵母发酵液的质量比为(1-3):(3-1)。
7.根据权利要求1所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述玉米胚芽粕和喷浆玉米皮的质量比(1-9):(9-1)。
8.根据权利要求1所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述混合发酵液和固态发酵培养基的质量比为(1-3):(9-7)；所述加水至物料的水分含量为38％-40％，温度为18-20℃；所述自然发酵的物料高度为0.3-0.5m，温度为18-30℃，时间为60-72h，待物料温度达到42℃以上且有酒香味时发酵完成。
9.根据权利要求1所述的一种富含虾青素的酵母培养物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述干燥的进风温度不高于160℃，待物料水分含量达到10％-12％且物料温度不高于70℃时干燥完成。
10.一种如权利要求1-9任一项所述制备方法制得的富含虾青素的酵母培养物。
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