CN109588538A - 一种不含抗生素的微生物发酵饲料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种不含抗生素的微生物发酵饲料及其制备方法，属于生物饲料技术领域，其制备方法包含：将供发酵用的菌种分别扩增培养后混合得到复方乳酸菌发酵剂；将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，发酵；复方乳酸菌发酵剂的菌种包含植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌；复合酶包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶。本发明制备方法发酵效率高，能提高发酵饲料的香味，提高饲养动物的摄食率与促生长，同时能改进发酵饲料转化效率且使大大降低饲料喂养成本，制得的不含抗生素的微生物发酵饲料不含抗生素，具有提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

Description

一种不含抗生素的微生物发酵饲料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物饲料技术领域，具体涉及一种不含抗生素的微生物发酵饲料及其制备方法。

背景技术

随着社会和经济的发展，人们对食品安全、公共卫生和环境保护等问题越来越重视，畜牧业生产过程中饲料长期添加抗生素等药物，可引起耐药菌株的产生和畜禽产品如肉、蛋、奶中的药物残留以及环境污染等，对人类健康和公共卫生安全造成严重危害，且抗生素的使用使抗性基因在肠道菌群中持续存在，使一些致病菌有机可乘。动物肠道内的微生物，其对于动物有非常有益的作用，如可以促进营养物质的吸收，增强抵抗力，促进肠绒毛上皮细胞的生成，是一个抵抗病原体的天然防御系统，抗生素的使用严重破坏了微生物菌群的生态平衡。为了改变这种现状，人们开始寻求和研究安全、有效并能替代抗生素的饲料添加剂。利用益生菌发酵技术可以促进粗饲料的快速转化，提高消化利用率，发酵产生的菌体蛋白、酶、氨基酸和一些小肽等可进一步加强动物机体的免疫功能。基于这些优点，益生菌发酵饲料成为替代饲用抗生素的一种可行的替代品。不含抗生素发酵饲料是指在人为可控制的条件下，以蛋白和能量饲料主要原料，通过一种或多种益生菌的发酵作用，使饲料中富含更多的活性益生菌菌体、有益代谢产物、有机酸和可溶性多肽等小分子物质，同时可消除饲料中的抗营养因子，起到促生长、维持动物健康的一种无毒害作用的生物饲料。不含抗生素发酵饲料按照水分含量的多少可分为液体发酵饲料和固体发酵饲料。液体发酵饲料在国外使用较多，其可以提高饲料利用率和预防腹泻等优点，而国内普通使用以益生菌发酵剂或菌种为主的固体发酵饲料技术，其优点操作简单对环境要求低，并且成本低、产物的产率高等优点。

CN 104304686 B公开一种DDGS发酵饲料的添加剂、发酵饲料及其制备方法，该添加剂，其包括复合菌种、中温淀粉酶和强碱；复合菌种包括乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母。利用微生物对DDGS进行发酵处理，通过微生物的代谢作用可以降解DDGS中的粗纤维和非淀粉多糖等，提高蛋白质含量，且将蛋白质大分子降解为小肽等易于吸收的小分子物质；同时发酵过程会大量繁殖的有益微生物，以及产生的大量的乳酸等有机酸和较低的pH值环境能起到对DDGS中的霉菌的抑制作用，发酵产生的乳酸等有机酸使饲料具有酸香甜味进一步提高DDGS在饲料中的添加量。

发明内容

随着饲料行业的蓬勃发展，饲料逐步向低药低残留发展，畜禽、水产品也渐渐迈向绿色产业革命，因此，生物饲料也必然成为大势所趋。本发明的目的在于提供一种制备条件和菌种间发挥增益作用，以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂菌种，将饲料原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌、复合酶制剂为一体生物发酵饲料。该产品不但可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸，而且能使其它粗饲料原料营养成份迅速转化，达到增强消化吸收利用效果。同时能改进发酵饲料转化效率且使饲料得以长期保存，大大降低饲料喂养成本的不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，制得的不含抗生素的微生物发酵饲料不含抗生素，具有提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

本发明公开一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，包含：

将供发酵用的菌种分别扩增培养后混合得到复方乳酸菌发酵剂；

将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，发酵，即得不含抗生素的微生物发酵饲料；

其中，复方乳酸菌发酵剂的菌种包含植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌；复合酶包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶；发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比为8-12:1。本发明复方乳酸菌发酵剂的发酵区为密封的包装袋，属于相对密闭区域，而密封在包装袋中的空气使得酿酒酵母菌和凝结芽孢杆菌首先消耗掉其中的氧气，开始大量繁殖，破坏植物饲料细胞的细胞壁，促使细胞的营养物质释放出来，继而产生大量的可被植物乳酸菌和戊糖片球菌利用的营养物质，如果糖、葡萄糖、氨基酸、维生素和丙酮酸盐等，可供植物乳酸菌和戊糖片球菌生长利用，对植物乳酸菌和戊糖片球菌的生长和代谢活性有一定的促进作用，而植物乳酸菌和戊糖片球菌发酵产生的乳酸为酵母菌提供一个适宜的pH生长环境，从而促进酵母菌生长，此外，到发酵后期的高酸、无氧环境下，复方乳酸菌发酵剂发酵能够代谢出吡喃甘露糖、乙醇、乙酸、异戊酸等，一方面能够导致乳酸菌DNA损伤，出现碱基错配或脱碱基现象，诱导多种基因的转录水平升高，代谢出短链脂肪酸，促进肠道蠕动，从而改变渗透压，有效清洁胃肠，清除体内垃圾，防止便秘，同时抑制腐生菌在肠道的生长，进而抑制了腐败菌所产生的毒素，减少其对机体组织的损坏，提高动物的免疫力，明显提高肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用的健康营养生物饲料；另一方面能抑制有害微生物的生长繁殖，赋予发酵饲料特有的风味，提高动物的摄食率，而产生的吡喃甘露糖可吸收中链脂肪酸，从而解除中链脂肪酸对乳酸菌的毒害作用，改进发酵饲料转化效率且使饲料得以长期保存。本发明通过在发酵原料中添加能够大量分泌各种消化酶的有益菌种，发酵得到健康营养生物饲料含有微生物生长代谢产生的有机酸，可调节肠道的pH值，为乳酸菌提供厌氧环境，不含抗生素，无任何药物和有害物质，可有效的改善动物肠道微生态平衡，细化营养因子，从而提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

作为优选，微生物发酵饲料在室温下具有至少12个月的稳定性。

作为优选，复方乳酸菌发酵剂的菌种组方为：植物乳酸菌35-42重量份、酿酒酵母菌18-23重量份、凝结芽孢杆菌17-24重量份、戊糖片球菌16-25重量份，复方乳酸菌发酵剂为液体乳酸菌发酵剂或固体乳酸菌发酵剂；复合酶组方为：淀粉酶4-6份、纤维素酶3-5份、蛋白酶4-6份、葡萄糖氧化酶2-4份。

作为优选，发酵原料包含如下成分及重量份：米糠蛋白粉300-500份、干豆腐渣200-400份、废糖蜜100-200份、豆粕50-100份、复合酶10-20份和复方乳酸菌发酵剂3-8份。

作为优选，发酵原料经超高压预处理，具体为：将过40-60目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入废糖蜜中，混合均匀，调节初始含水量，然后加入不透气的包装袋，密封，在压力为550-650MPa下超高压处理20-30min，即可。该预处理一方面可使氢键、疏水键、盐键等非共价键会发生变化，发酵原料中的蛋白质结构展开，处于分子内部的芳香族氨基酸、色氨酸和酪氨酸逐渐暴露出来，进而改变发酵原料在水中的溶解性，暴露出来的芳香族氨基酸、色氨酸和酪氨酸进一步可与废糖蜜中的基团结合，且废糖蜜在超高压处理过程中能抑制了发酵原料中淀粉无定型区分子的运动，抑制淀粉的凝胶化，所以在配合超高压下，使得米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕被均匀分散于废糖蜜中，包覆其中，提高发酵原料的氧传质和热传质，使得复方乳酸菌发酵剂能够快速、充分发酵，大大缩短了发酵周期；另一方面可使废糖蜜发生羰氨反应生成醇酸类化合物，赋予发酵原料特殊的香味，且该香味物质不会被复方乳酸菌发酵剂利用，能够与发酵过程中产生的风味物质发挥协同增益的作用，提高发酵饲料的香味，进而提高饲养动物的摄食率。

更为优选，发酵原料的初始含水量为43-46％。合适的初始含水量可以通过增加发酵底物营养物质的溶解和微生物代谢产物的扩散来促进微生物的生长，可以增加水解酶的产生和促进水解酶的扩散。

作为优选，包装袋上设有单向排气阀，气体仅可通过所述单向排气阀从袋内排出袋外。单向通气阀内为的细菌滤膜，发酵过程中袋内的微生物代谢产生二氧化碳，使得袋内的气压大于外界常压，当袋内气压达到某一临界值时，气体通过这个单向通气阀排到外界，但是外界的气体始终没有机会进入发酵袋内，从而排除了外界的杂菌干扰。

作为优选，发酵温度为25-32℃，发酵时间短为72-84h，发酵pH值为5.5-6.4。

本发明还公开一种上述制备方法制得的不含抗生素的微生物发酵饲料。本发明发酵饲料含有微生物生长代谢产生的有机酸，可调节肠道的pH值，为乳酸菌提供厌氧环境，不含抗生素，无任何药物和有害物质，可有效的改善动物肠道微生态平衡，细化营养因子，从而提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本发明发酵饲料的制备方法能够促进植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌，制备条件和菌种间发挥增益作用，提高发酵效率，提高发酵饲料的香味，促进消化与吸收，进而提高饲养动物的摄食率，同时能改进发酵饲料转化效率且使饲料得以长期保存，大大降低饲料喂养成本；

2)本发明发酵饲料含有微生物生长代谢产生的有机酸，可调节肠道的pH值，为乳酸菌提供厌氧环境，不含抗生素，无任何药物和有害物质，可有效的改善动物肠道微生态平衡，细化营养因子，从而提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

本发明采用了上述技术方案提供一种不含抗生素的微生物发酵饲料及其制备方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

具体实施方式

下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。

实施例1：

一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，包含：

1)将植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌，分别用三角瓶和发酵罐扩增培养，然后按照复方乳酸菌发酵剂的菌种组方：植物乳酸菌35重量份、酿酒酵母菌18重量份、凝结芽孢杆菌17重量份、戊糖片球菌16重量份，取各菌种，混合得复方乳酸菌发酵剂；

2)按如下成分及重量份：米糠蛋白粉300份、干豆腐渣200份、废糖蜜100份、豆粕50份、复合酶10份和复方乳酸菌发酵剂3份取各发酵原料，将过40目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入废糖蜜中，混合均匀，调节初始含水量为43％，然后加入不透气的包装袋，密封，在压力为550MPa下超高压处理20min，即可；其中复合酶组方为：淀粉酶4份、纤维素酶3份、蛋白酶4份、葡萄糖氧化酶2份；该预处理一方面可使氢键、疏水键、盐键等非共价键会发生变化，发酵原料中的蛋白质结构展开，处于分子内部的芳香族氨基酸、色氨酸和酪氨酸逐渐暴露出来，进而改变发酵原料在水中的溶解性，暴露出来的芳香族氨基酸、色氨酸和酪氨酸进一步可与废糖蜜中的基团结合，且废糖蜜在超高压处理过程中能抑制了发酵原料中淀粉无定型区分子的运动，抑制淀粉的凝胶化，所以在配合超高压下，使得米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕被均匀分散于废糖蜜中，包覆其中，提高发酵原料的氧传质和热传质，使得复方乳酸菌发酵剂能够快速、充分发酵，大大缩短了发酵周期；另一方面可使废糖蜜发生羰氨反应生成醇酸类化合物，赋予发酵原料特殊的香味，且该香味物质不会被复方乳酸菌发酵剂利用，能够与发酵过程中产生的风味物质发挥协同增益的作用，提高发酵饲料的香味，进而提高饲养动物的摄食率；此外合适的初始含水量可以通过增加发酵底物营养物质的溶解和微生物代谢产物的扩散来促进微生物的生长，可以增加水解酶的产生和促进水解酶的扩散；

3)将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，使得发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比为8:1，在发酵温度为25℃、pH值为5.5的条件下发酵72h，即得不含抗生素的微生物发酵饲料；该制备方法中复方乳酸菌发酵剂的发酵区为密封的包装袋，属于相对密闭区域，而密封在包装袋中的空气使得酿酒酵母菌和凝结芽孢杆菌首先消耗掉其中的氧气，开始大量繁殖，破坏植物饲料细胞的细胞壁，促使细胞的营养物质释放出来，继而产生大量的可被植物乳酸菌和戊糖片球菌利用的营养物质，如果糖、葡萄糖、氨基酸、维生素和丙酮酸盐等，可供植物乳酸菌和戊糖片球菌生长利用，对植物乳酸菌和戊糖片球菌的生长和代谢活性有一定的促进作用，而植物乳酸菌和戊糖片球菌发酵产生的乳酸为酵母菌提供一个适宜的pH生长环境，从而促进酵母菌生长，此外，到发酵后期的高酸、无氧环境下，复方乳酸菌发酵剂发酵能够代谢出吡喃甘露糖、乙醇、乙酸、异戊酸等，一方面能够导致乳酸菌DNA损伤，出现碱基错配或脱碱基现象，诱导多种基因的转录水平升高，代谢出短链脂肪酸，促进肠道蠕动，从而改变渗透压，有效清洁胃肠，清除体内垃圾，防止便秘，同时抑制腐生菌在肠道的生长，进而抑制了腐败菌所产生的毒素，减少其对机体组织的损坏，提高动物的免疫力，明显提高肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用的健康营养生物饲料；另一方面能抑制有害微生物的生长繁殖，赋予发酵饲料特有的风味，提高动物的摄食率，而产生的吡喃甘露糖可吸收中链脂肪酸，从而解除中链脂肪酸对乳酸菌的毒害作用，改进发酵饲料转化效率且使饲料得以长期保存。本发明通过在发酵原料中添加能够大量分泌各种消化酶的有益菌种，发酵得到健康营养生物饲料含有微生物生长代谢产生的有机酸，可调节肠道的pH值，为乳酸菌提供厌氧环境，不含抗生素，无任何药物和有害物质，可有效的改善动物肠道微生态平衡，细化营养因子，从而提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

上述制备方法制得的微生物发酵饲料在室温下具有至少12个月的稳定性。

上述包装袋上设有单向排气阀，气体仅可通过所述单向排气阀从袋内排出袋外。单向通气阀内为的细菌滤膜，发酵过程中袋内的微生物代谢产生二氧化碳，使得袋内的气压大于外界常压，当袋内气压达到某一临界值时，气体通过这个单向通气阀排到外界，但是外界的气体始终没有机会进入发酵袋内，从而排除了外界的杂菌干扰。

一种上述制备方法制得的不含抗生素的微生物发酵饲料。本发明发酵饲料含有微生物生长代谢产生的有机酸，可调节肠道的pH值，为乳酸菌提供厌氧环境，不含抗生素，无任何药物和有害物质，可有效的改善动物肠道微生态平衡，细化营养因子，从而提高动物的免疫力、肉料比，改善肉、蛋、奶等畜禽产品品质作用。

实施例2：

一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，包含：

1)将植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌，分别用三角瓶和发酵罐扩增培养，然后按照复方乳酸菌发酵剂的菌种组方：植物乳酸菌40重量份、酿酒酵母菌20重量份、凝结芽孢杆菌20重量份、戊糖片球菌20重量份，取各菌种，混合得复方乳酸菌发酵剂；

2)按如下成分及重量份：米糠蛋白粉400份、干豆腐渣300份、废糖蜜150份、豆粕80份、复合酶15份和复方乳酸菌发酵剂5份取各发酵原料，将过50目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入废糖蜜中，混合均匀，调节初始含水量为45％，然后加入不透气的包装袋，密封，在压力为600MPa下超高压处理25min，即可；其中，复合酶组方为：淀粉酶5份、纤维素酶4份、蛋白酶5份、葡萄糖氧化酶3份；

3)将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，使得发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比为10:1，在发酵温度为30℃、pH值为6.0的条件下发酵75h，即得不含抗生素的微生物发酵饲料；制得的微生物发酵饲料在室温下具有至少12个月的稳定性。上述包装袋上设有单向排气阀，气体仅可通过所述单向排气阀从袋内排出袋外。

实施例3：

一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，包含：

1)将植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌，分别用三角瓶和发酵罐扩增培养，然后按照复方乳酸菌发酵剂的菌种组方：植物乳酸菌42重量份、酿酒酵母菌23重量份、凝结芽孢杆菌24重量份、戊糖片球菌25重量份，取各菌种，混合得复方乳酸菌发酵剂；

2)按如下成分及重量份：米糠蛋白粉500份、干豆腐渣400份、废糖蜜200份、豆粕100份、复合酶15份和复方乳酸菌发酵剂8份取各发酵原料，将过60目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入废糖蜜中，混合均匀，调节初始含水量为46％，然后加入不透气的包装袋，密封，在压力为650MPa下超高压处理30min，即可；其中复合酶组方为：淀粉酶6份、纤维素酶5份、蛋白酶6份、葡萄糖氧化酶4份；

3)将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，使得发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比为12:1，在发酵温度为32℃、pH值为6.4的条件下发酵84h，即得不含抗生素的微生物发酵饲料；制得的微生物发酵饲料在室温下具有至少12个月的稳定性。上述包装袋上设有单向排气阀，气体仅可通过所述单向排气阀从袋内排出袋外。

实施例4：

为了进一步提高所饲养动物对微生物发酵饲料的摄食率，一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，包含：

1)将植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌，分别用三角瓶和发酵罐扩增培养，然后按照复方乳酸菌发酵剂的菌种组方：植物乳酸菌42重量份、酿酒酵母菌23重量份、凝结芽孢杆菌24重量份、戊糖片球菌25重量份，取各菌种，混合得复方乳酸菌发酵剂；

2)按如下成分及重量份：米糠蛋白粉500份、干豆腐渣400份、废糖蜜200份、豆粕100份和复方乳酸菌发酵剂8份取各发酵原料，将过80目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入经絮凝处理的废糖蜜，混合均匀，调节初始含水量为46％，然后加入不透气的包装袋，密封，在压力为650MPa下超高压处理30min，即可；糖蜜中含有胶体物质、灰分等，需对糖蜜进行预处理，才能有效进行加工利用，上述废糖蜜的絮凝处理采用聚丙烯酰胺，并添加葡萄糖酸和甘油酸作为辅助澄清剂，聚丙烯酰胺絮凝机理在于架桥作用，使胶粒形成粗大絮凝团沉淀析出，葡萄糖酸和甘油酸的存在即使在聚丙烯酰胺不足时仍达到最佳澄清效果，共同作用于糖蜜，絮凝大量微细悬浮物及胶体，较大幅度提高原料糖蜜的纯度，同时能保证将糖蜜中碳水化合物的蔗糖较为充分地转化成还原糖，促进后续超高压预处理羰氨反应的进行，更进一步提高饲养动物的摄食率，同时还原糖能更好地被复方乳酸菌发酵剂利用，提高发酵效率；

3)将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，使得发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比为12:1，在发酵温度为32℃、pH值为6.4的条件下发酵75h，即得不含抗生素的微生物发酵饲料；制得的微生物发酵饲料在室温下具有至少12个月的稳定性。上述包装袋上设有单向排气阀，气体仅可通过所述单向排气阀从袋内排出袋外。

对比例1：

本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，完全排出空气。

对比例2：

本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例将发酵原料和复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，不排空气。

对比例3：

本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例将过70目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入废糖蜜中，混合均匀，调节初始含水量为45％，即可。

试验例1：

不含抗生素的微生物发酵饲料的预测保存期

将实施例2和对比例1、对比例2及普通市售发酵饲料获得的饲料样品保存在较高的温度和湿度条件下，将饲料发霉时间乘以6来预测出饲料在常规储存条件下的保存期。在1L的PVC塑料杯子中部放置一个盛有45mL水的50mL小塑料杯子，将100g饲料样品均匀放置在大杯子底部，饲料高度为小杯子高度的一半，然后将大杯子盖上盖，置于37℃保温箱中。每天观察1次样品，当发现气味变化或霉菌(丝)长出时即判定为发霉。结果如表1所示。

表1极端环境下饲料发霉时间及预测保存期

注：表中“-”为没有发霉，“+”为开始发霉，“++”为中度发霉，“+++”为大部分发霉，“++++”为全部发霉。

由表1可知，本申请实施例2不含抗生素的微生物发酵饲料的预测保质期远远长于普通市售发酵饲料，同时本申请实施例2不含抗生素的微生物发酵饲料的预测保质期远远长于对比例1和对比例2不含抗生素的微生物发酵饲料，这说明本申请技术方案中发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比和复方乳酸菌发酵剂的相互作用，能延长微生物发酵饲料的保质期，使饲料得以长期保存。

试验例2：

发酵饲料中成分测定

发酵饲料中总氮含量的测定：在杨亚丽的方法基础上改进，称取发酵饲料1.0g左右(精准至0.0001g)于消化管中，加入0.3g硫酸铜，0.9g硫酸钾，12ml浓硫酸，经240℃碳化，400℃消化，至消化液澄清(或淡蓝色或浅绿色)为消化终点，冷却后得到待测样品，采用全自动凯氏定氮仪测总氮含量。

游离氨基酸总量的测定：

1)氨基酸标准曲线的制作：准确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL的0.2mg/mL的谷氨酸标准溶液，分别置于25mL的具塞比色管中，然后加入2％茚三酮溶液和磷酸盐缓冲溶液(pH 6.7)各1mL，混合均匀，水浴加热15min取出，迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀，静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比测定各溶液吸光值(A)。以氨基酸毫克数为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

2)发酵饲料中游离氨基酸总量的测定：准确称取样品1.0g，加水稀释100倍，混匀备用。吸取样品溶液1.0mL，按照标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光值(A)，用测得A值在标准曲线上即可查得对应的氨基酸毫克数。

3)结果计算：

式中：C为从标准曲线上查得的氨基酸毫克数；m为测定的样品溶液相当于样品的质量(g)。

粗蛋白的测定：依据GB 5009.5-2016，采用凯氏定氮法。

表2发酵饲料中成分测定结果

项目	氨基酸总量(g/100g)	粗蛋白(％)
			实施例1	65.35	50.05
实施例2	67.87	52.34
			实施例3	66.17	51.87

由表2可知，本发明实施例发酵饲料符合饲料的重要营养和质量指标要求，其氨基酸总量、粗蛋白均较高，这说明本发明实施例获得的发酵饲料的品质优异。

试验例3：

不含抗生素的微生物发酵饲料对乳猪生长性能的影响

试验方法：选择80头21天断奶乳猪，平均分成5组，试验组设为4组，喂养的饲料分别为本申请实施例1、实施例2、实施例3、实施例4；对比组设为3组，喂养的饲料分别为本申请对比例1、对比例2和对比例3微生物发酵饲料，对照组喂养市售饲料(其中市售饲料为：市售断奶乳猪的保育料，在市场上随机采购，规格25kg/件)，连续饲养14天，其余饲养条件完全一致。

测定指标：

1)日增重＝(末重-初重)/14；

2)日采食量＝每日平均采食量之和/14；

3)肉料比＝日增重/日采食量；

4)腹泻率：腹泻频率＝腹泻头数/(供试猪总头数×试验天数)；实验结果见表3。

表3不同饲料对断奶乳猪生长性能的影响

从表3可以看出，采用本申请实施例1、实施例2、实施例3获得的不含抗生素的微生物发酵饲料的断奶乳猪饲料的实验组，其断奶乳猪的日增重、日采食量、料肉比显著高于采用市售饲料的对照组，且腹泻率极显著的低于对照组。因此，本申请技术方案中的获得的不含抗生素的微生物发酵饲料具有很大诱食性，能提高断奶乳猪采食量，增加日增重和降低腹泻率的作用，而实验组3组中，可以看出，第2组的各项指标均最好，为本申请的优选的技术方案。采用本申请实施例2获得的不含抗生素的微生物发酵饲料的断奶乳猪饲料的实验组，其断奶乳猪的日增重、日采食量、料肉比显著高于采用本申请对比例1、对比例2和对比例3微生物发酵饲料的对比组，且腹泻率极显著的低于对比组。因此，本申请技术方案中发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比和复方乳酸菌发酵剂的相互作用，能够赋予发酵饲料特有的风味，提高动物的摄食率，改进发酵饲料转化效率，明显提高肉料比；本申请技术方案中发酵原料经超高压预处理能够在相同的发酵条件下发酵更加完全，大大缩短了发酵周期，且能赋予发酵原料特殊的香味，与发酵过程中产生的风味物质发挥协同增益的作用，提高发酵饲料的香味，进而提高饲养动物的摄食率。采用本申请实施例4获得的不含抗生素的微生物发酵饲料的断奶乳猪饲料的实验组，其断奶乳猪的日增重、日采食量、料肉比显著高于采用本申请实施例1微生物发酵饲料，且腹泻率极显著的低于对比组。因此，糖蜜的预处理过程能更进一步提高饲养动物的摄食率。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：包含：

将供发酵用的菌种分别扩增培养后混合得到复方乳酸菌发酵剂；

将发酵原料和所述复方乳酸菌发酵剂、复合酶装入不透气的包装袋，排出空气，发酵，即得不含抗生素的微生物发酵饲料；

所述复方乳酸菌发酵剂的菌种包含植物乳酸菌、酿酒酵母菌、凝结芽孢杆菌、戊糖片球菌；

所述复合酶包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶；

所述发酵原料与密封在包装袋中的空气的体积比为8-12:1。

2.根据权利要求1所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述微生物发酵饲料在室温下具有至少12个月的稳定性。

3.根据权利要求1所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述复方乳酸菌发酵剂的菌种组方为：植物乳酸菌35-42重量份、酿酒酵母菌18-23重量份、凝结芽孢杆菌17-24重量份、戊糖片球菌16-25重量份；所述复合酶组方为：淀粉酶4-6份、纤维素酶3-5份、蛋白酶4-6份、葡萄糖氧化酶2-4份。

4.根据权利要求1所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述发酵原料包含如下成分及重量份：米糠蛋白粉300-500份、干豆腐渣200-400份、废糖蜜100-200份、豆粕50-100份、复合酶10-20份和复方乳酸菌发酵剂3-8份。

5.根据权利要求1或3所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述发酵原料经超高压预处理。

6.根据权利要求5所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述预处理为：将过40-60目筛米糠蛋白粉、干豆腐渣、豆粕加入废糖蜜中，混合均匀，调节初始含水量，然后加入不透气的包装袋，密封，在压力为550-650MPa下超高压处理20-30min，即可。

7.根据权利要求6所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述发酵原料的初始含水量为43-46％。

8.根据权利要求1所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述包装袋上设有单向排气阀，气体仅可通过所述单向排气阀从袋内排出袋外。

9.根据权利要求1所述的一种不含抗生素的微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于：所述发酵温度为25-32℃，发酵时间短为72-84h，发酵pH值为5.5-6.4。

10.一种权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的不含抗生素的微生物发酵饲料。