CN113789322A - 一种高产虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产虾青素的红法夫酵母菌株，为红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)LUCNOVA001菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20211124，保藏日期为2021年09月01日，分类学命名为PhaffiarhodozymaLUCNOVA001；该菌株以红法夫酵母为出发生产菌，经ARTP诱变和β‑紫罗酮筛选获得，选育方法：(1)菌种活化；(2)对数生长期菌液的制备；(3)菌悬液的制备；(4)ARTP诱变；(5)β‑紫罗酮筛选；(6)菌株复筛；(7)连续传代。本发明菌株的虾青素产量和含量以及对应的生物量都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。

Description

一种高产虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法与应用

技术领域

本发明涉及菌株选育技术领域，更具体的说是涉及一种高产虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法与应用。

背景技术

虾青素，又名虾黄素、虾黄质、龙虾壳色素等，天然呈紫红色，广泛存在于生物界中，特别是存在于甲壳类动物及鲑鱼、虹鳟鱼等中，是它们的主要色素(1.Johnson E A，AnG H.Anstaxanthin from microbial sources.Critical Reviews in Biotechnology，1991.11：297-326；2.Torrissen O J，Christiansen R.Requirenents for carotenoidsin fish diets.J Appl Ichthyol.，1995.11：225-230；3.Pharmaceuticals M.Aquaxan TMHD algal meal use in aquaculture diets：Enhancingnutritional performance andpigmentation.Inc.Technical Report TR，1999.2102.001)。

虾青素的化学名称为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，分子式是C₄₀H₅₂O₄。虾青素最初被用作水产业的饲料添加剂，后来人们发现它具有极强的抗氧化活性、增强机体免疫力活性及抗肿瘤活性，在食品、医药和化妆品等领域中有着广阔的应用前景(4.Jyonouchi H，Zhang L，Gross M，Tomita Y.Immunomodulating actions ofcarotenoids：enhancement of in vivo and in vitro antibodyproduction to T-dependent antigens.Nutrition Cancer，1994，21(1)：47-58；5.Lorenz R T，Cysewski GR.Commercial potential for Heamatococcus microalgae as a natural sourceofastaxanthin.Trends in biotechnology，2000，18：160-167)。

虾青素作为饲料添加剂，除了可以提供动物鲜艳的色泽和促进生长繁殖外，还可极大地促进水产动物的生长繁殖，提高动物产品的市场价值(6.Johnson E A，An GH.Anstaxanthin from microbial sources.Critical Reviews inBiotechnology，1991.11：297-326；7.Torrissen O J，Christiansen R.Requirenents for carotenoidsinfish diets.J Appl Ichthyol.，1995.11：225-230；8、Hansen K B，Tauson A H，InborrJ.Effect ofsupplementation with the antioxidant astaxanthin on reproduction，pre-weaning growthperformance of kits and daily milk intake in mink.J ReprodFertile Suppl.，2001.57：331-334)。比如，在家禽饲料中添加虾青素，可促进家禽的生长，同时使蛋黄色素含量增加(9.ElwingerK，Lignell A，Wilhelmson M.Astaxanthin richalgae(Heamacoccus Pluvialis)as a carotenoidsource in feed for laying hens.Inprocceding of the VII European symposium on the quality of eggsand eggsproducts，Poznan，Poland，52-59)。

虾青素还可以作为着色剂添加于果酱、果冻、饮料、水产品和肉制品等食物，对于食品尤其含脂类较多的食品，既有着色效果又起到保鲜作用。在化妆品中添加虾青素，可以起到抗衰老、防紫外线的效果(10.Hansen K B，Tauson A H，InborrJ.Effect ofsupplementation with the antioxidant astaxanthin on reproduction，pre-weaninggrowthperformance of kits and daily milk intake in mink.J Reprod FertileSuppl.，2001.57：331-334；11.Anderson M.Method of inhibiting 5α-reductase withastaxanthin，US Patent，2001.Patent No.：US 6277417；12.Kurihara H，Koda H，AsamiS，Kiso Y，Tanaka T.Contribution of theantioxidative property of astaxanthin toits protective effect on the promotion of cancer metastasisin mice treatedwith restraint stress.Life Sdci.，2002.70(21)：2509-2520；13.Jewell C，O’BrienN.Effects of dietary supplementation with carotenoids on xenobioticmetabolizing enzymes in theliver，lung，kidney and small intestine of therat.Br.J.Nutr.，1999.81：235-342；14.Jyonouchi H，Sun S，Lijima K，Gross MD.Antitumor activity of astaxanthin and its model of action.Nutr.Cancer，2000.36：59-65)。

制药及食品工业利用虾青素的抗氧化及免疫促进作用，做成可预防氧化组织损伤的药物及保健食品。目前添加有虾青素的各种饲料、食品、化妆品和保健药品等早已面市，并且随着人们对虾青素功能及其产品的进一步了解，虾青素的市场需求已经越来越大了。

到目前为止，虾青素的来源主要有：化学合成、从甲壳类动物的废弃物中提取、雨生红球藻和红法夫酵母。其中，化学合成的虾青素价格相对便宜，在饲料添加剂方面仍有一定的竞争力，但是其结构多为顺式，动物利用率低，且随着人们对环保的认识，正面临被淘汰的威胁；对于虾蟹加工业发达的国家来说，甲壳类动物的废弃物是虾青素的一个很好的来源，但是其虾青素含量很低，提取过程有机溶剂污染、产品纯度低等问题限制了它的进一步发展；雨生红球藻中虾青素的含量一般占细胞干重的0.2％-2％，最高可达4％，是虾青素极好的来源，因而被广泛的研究和应用，但是由于雨生红球藻的生长条件极其苛刻，对水质、环境以及光照的要求很高，以及周期长、占地面积大等因素，因此其大规模生产比较困难；红法夫酵母是微生物中虾青素含量第二高的菌种，由于其培养方法简单、周期短、虾青素活性高等优点，在近二十年来人们逐渐把目光从雨生红球藻转移到红法夫酵母上。

红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)，有时也简称红酵母，是真菌界、真菌门、半知菌亚门、担子菌纲、隐球酵母科、法夫酵母属的唯一一种。1995年被正式命名为Xanthophyllomyces dendrorhous。由于野生型红法夫酵母虾青素的产量很低，无法与化学合成竞争，因此改良菌种以提高虾青素产量成为首要工作，这已经成为近20年来的研究热点了。

目前，获得高产菌株的方法有物理、化学诱变和原生质体融合等传统方法以及许多转基因技术，但常用且有效的方法还是人工诱变法。倪辉等采用硫酸二乙酯诱变红法夫酵母，得到一株高产的菌株，在200L发酵罐中流加培养114h，获得红法夫酵母生物量为59.97g/L，细胞虾青素含量为1250mg/kg(15.倪辉.法夫酵母虾青素发酵条件的优化及提取与分析研究.博士学位论文，浙江大学，2005)。汪文俊等先后采用紫外诱变、甲基磺酸乙酯、60Co等方法诱变得到一株高产红法夫酵母，采用5L发酵罐培养，得到生物量为15.56g/L，虾青素含量为866mg/kg(16.汪文俊.红法夫酵母发酵生产虾青素及其代谢调控研究.博士学位论文，华中科技大学，2006)。

尽管在前人的研究基础上，红法夫酵母的虾青素含量已有所提高，但要满足工业化生产的需求，还需要进一步提高红法夫酵母的生物量和虾青素含量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高产虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法与应用，以解决现有技术中的不足。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高产虾青素的红法夫酵母菌株，该菌株为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)LUCNOVA001菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，电话：027-68754052，保藏编号为CCTCC NO：M20211124，保藏日期为2021年09月01日，分类学命名为Phaffia rhodozyma LUCNOVA001。

本发明红法夫酵母菌株的形态特征为：菌落前期呈黄色，后期呈鲜红色，菌苔表面粗糙，菌体在显微镜下呈椭圆形。

本发明红法夫酵母菌株的生物学特性为：最适生长温度范围在20℃到25℃之间，超过30℃时会死亡，属于低温酵母；最适生长pH范围在6.0到6.5之间。

进一步，本发明红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)LUCNOVA001菌株的18s序列为：

ATCTGTCTCAGATTAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACAAATTCATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTTGCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCCTAAAAGCCCCGACTTCTGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCGTGAAAGCGCTCCCTTGGTGATTCATAATAACTTTTCGAATCGTATGGCCTTGCGCCGACGATGCTTCATTCAAATATCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATATAGGGCTCTATGGGTCTTATAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCAGGCCTGGTCGGCCGGTCCGCCTCACGGTGTGTACTGGTCGGCCGGGCCTTACCTCTTGGTGAGCCGTTCGGTCGTTTACGCGGCCGGGCGGGGAACCAGGATTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCCCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGATCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTCAGTTGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTACTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAGGTTAGGGGATCGAAAACGATCAGATACCGTTGTAGTCTTAACAGTAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATGTTCTCTTTTGACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAATATAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTTATTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGCCGGCTCTTGCTGGTCGCCGGCTTCTTAGAGGGACTATCAGCATCTAGCTGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAGCGAGTTTCTTTCCTTGGCCGAAAGGTCTGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTCTTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGATCTCCGGATTGGCTTTGGGGAGCCGGCAACGGCACCCTATCGTCGAGAAGCTGCTCAAACTTGGTCACTAGAGGAAGTAAAAGTCGAGCAGTTCA。

本发明红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)LUCNOVA001菌株的ITS序列为：

GCGGGGAGTCTACCTGATTTGAGGCCCGATCAGAAGTGTGCGCATGCAGTCCGCAAAGACCACACACACAGTATCGTTAGAAGCAGTTCGCATGCGTCGTTTAGTTGTACTAGCTAGTCTGCGTGTCCCCGAGGAAACCCACACACTCACACAGACAGCGACACTCGACGACAATTTCTTATCATGTCAAGGCACCGCCCGCGCTTCGCCAGCACAGACGCACACACCCACTGATCGTTTTAAGACGAGCCGACCCCCGAACCAAATCAGGGCCAGCAGAACCGTCCAAGTCCAAGCCAGGCGCCTCTCAACAAAGAAAGGACACCCGGTTGAGAGTGTTTCATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTATTGTGTTTTATAGTGTTTCGAACATACAATCGACTGGTGTTTGTTTAAATGATAAAAGAGCTTGCGTCTCCCGAGAGAGACACAGGTGTGGGTTAAAGGAATAGGAAAGAGTAGGGCCCCGTCGAAAGACAGAACCCCGAATAAATTTCACTAATGATCCTTCCGCAGGTCACCCTTTACCGGAAGCT。

一种上述高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，该菌株以红法夫酵母为出发生产菌，经ARTP(常温常压等离子体)诱变和β-紫罗酮筛选获得；具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

将红法夫酵母冻干粉用无菌水溶解，全部接种至YPDA试管斜面或者培养皿平板上培养，然后从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶培养，保存至4℃冰箱中，得到活化菌种；

(2)对数生长期菌液的制备

将活化菌种从步骤(1)摇瓶接种到另一摇瓶中，测定其生长曲线，找到对数生长期，然后再次从步骤(1)中接种摇瓶培养至对数生长期，得到对数生长期菌液；

(3)菌悬液的制备

从对数生长期菌液中取出部分菌液，离心除去上清液，并用去离子水洗涤两次，再次离心除去上清液后加入生理盐水稀释，得到菌悬液；

(4)ARTP诱变

在ARTP诱变专用金属片上滴加10μL的菌悬液，并使其浸润金属片的整个平面，然后将ARTP诱变专用金属片放入ARTP诱变育种仪对应的孔中，调整ARTP诱变育种仪参数，打开诱变开关开始诱变，诱变结束后将菌体用生理盐水洗下，得到ARTP诱变菌悬液；

(5)β-紫罗酮筛选

将ARTP诱变菌悬液梯度稀释，然后涂布至加有β-紫罗酮的固体培养基上培养，挑选红色色泽深的色素产量高的菌株，得到初筛菌株；

(6)菌株复筛

将初筛菌株挑到摇瓶培养，测其生物量及虾青素含量，挑选出产量较高的突变菌株；

(7)连续传代

将突变菌株连续传代五代，重复测其生物量及虾青素含量，挑选出高产虾青素的红法夫酵母菌株，即得。

进一步，上述步骤(1)中，YPDA试管斜面或者培养皿平板上培养的温度为20-25℃，时间为3-5天；摇瓶培养的培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)培养基或YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)琼脂培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂0或20g/L，pH为6.4；摇瓶培养的温度为20-22℃，转速为150-200rpm，时间为36-60h。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过YPDA试管斜面或者培养皿平板上培养以及摇瓶培养，用于获取单菌落，并转入液态培养用于下一步操作。

进一步，上述步骤(2)中，对数生长期的时间为12-40h；摇瓶培养的具体操作同步骤(1)。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，对数生长期的红法夫酵母菌株在诱变条件下有更大的突变率，有利于提高获取目标突变菌株的概率。

进一步，上述步骤(3)中，菌液为2mL；离心的转速为4000-6000rpm，时间为5-10min；生理盐水的加入量为2mL。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过离心并加入生理盐水，能够去除培养基因素，从而保证红法夫酵母在可暂时存活的液体分散环境中进行诱变。

进一步，上述步骤(4)中，ARTP诱变育种仪的功率为120W，进气量为10.00L/min，诱变时间为30-50s。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选功率、进气量和诱变时间，能够将对菌株的致死率控制在90％左右，最大限度德提高诱变效果。

进一步，上述步骤(5)中，β-紫罗酮的浓度为3×10^-4-6×10^-4mol/L；固体培养基同步骤(1)摇瓶培养的培养基。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过加入β-紫罗酮，能够根据产虾青素的能力对诱变后的菌株进行筛选。

进一步，上述步骤(6)中，摇瓶培养的具体操作同步骤(1)；虾青素的提取方法为二甲亚砜丙酮提取法，测量方法为高效液相色谱(HPLC)法。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明选用二甲亚砜丙酮提取法，可在保证较高提取率的前提下使用有机溶剂简单直接地对虾青素进行提取，并使用高效液相色谱仪对提取液中虾青素的浓度进行多样品连续快速的检测。

本发明还请求保护一种上述高产虾青素的红法夫酵母菌株或上述选育方法制得的高产虾青素的红法夫酵母菌株在生产虾青素中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明先测得红法夫酵母的生长曲线，从而制得对数生长期菌液，然后通过ARTP诱变及β-紫罗酮筛选等方法进行虾青素生产菌株的选育，获得一株高产虾青素的红法夫酵母X17，即虾青素生产菌株。

2、本发明采用常温常压等离子体(ARTP)微生物突变育种技术，原理是通过ARTP中的活性离子作用于红法夫酵母，使其细胞膜或者细胞壁的结构改变，通透性改变，并使其基因损伤，从而使红法夫酵母基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致基因突变。

3、相较其他诱变方法而言，本发明方法更方便，快捷，且诱变效果显著，可通过本发明方法进行大量诱变实验，从而增加筛选到高产虾青素菌株的概率。

4、本发明菌株在YPD培养基中于摇瓶培养5天，虾青素产量和含量最高达到35.37mg/L和5248mg/kg(细胞干重)；将本发明菌株连续传代5次后虾青素的产量稳定；本发明菌株的虾青素产量和含量以及对应的生物量都满足了工业化生产的要求，具有很大的应用前景。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

将红法夫酵母冻干粉用无菌水溶解，全部接种至YPDA试管斜面或者培养皿平板上，在22℃温度下培养4天，然后从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶中，在21℃温度下以180rpm的转速培养48h，保存至4℃冰箱中，得到活化菌种；

其中，摇瓶培养的培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)琼脂培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L，pH为6.4；

(2)对数生长期菌液的制备

将活化菌种从步骤(1)摇瓶接种到另一摇瓶中，测定其生长曲线，找到对数生长期为12-40h，然后再次从步骤(1)中接种摇瓶并按步骤(1)摇瓶培养的具体操作培养至对数生长期，得到对数生长期菌液；

(3)菌悬液的制备

从对数生长期菌液中取出2mL菌液，以5000rpm的转速离心8min除去上清液，并用去离子水洗涤两次，再次以5000rpm的转速离心8min除去上清液后加入2mL生理盐水稀释，得到菌悬液；

(4)ARTP诱变

在ARTP诱变专用金属片上滴加10μL的菌悬液，并使其浸润金属片的整个平面，然后将ARTP诱变专用金属片放入ARTP诱变育种仪对应的孔中，调整ARTP诱变育种仪的功率为120W，进气量为10.00L/min，时间为40s，打开诱变开关开始诱变，诱变结束后将菌体用生理盐水洗下，得到ARTP诱变菌悬液；

(5)β-紫罗酮筛选

将ARTP诱变菌悬液梯度稀释，然后涂布至加有5×10^-4mol/L的β-紫罗酮的固体培养基上培养，挑选红色色泽深的色素产量高的菌株，得到初筛菌株；

其中，固体培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)琼脂培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L，pH为6.4；

(6)菌株复筛

将初筛菌株挑到摇瓶中并按步骤(1)摇瓶培养的具体操作培养，测其生物量，并以二甲亚砜丙酮提取法提取虾青素，以高效液相色谱法测量虾青素的含量，挑选出产量较高的突变菌株；

(7)连续传代

将突变菌株连续传代五代，按步骤(6)操作重复测其生物量及虾青素含量，挑选出高产虾青素的红法夫酵母菌株，即得。

实施例2

高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

将红法夫酵母冻干粉用无菌水溶解，全部接种至YPDA试管斜面或者培养皿平板上，在20℃温度下培养5天，然后从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶中，在20℃温度下以200rpm的转速培养60h，保存至4℃冰箱中，得到活化菌种；

其中，摇瓶培养的培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)琼脂培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L，pH为6.4；

(2)对数生长期菌液的制备

将活化菌种从步骤(1)摇瓶接种到另一摇瓶中，测定其生长曲线，找到对数生长期为12-40h，然后再次从步骤(1)中接种摇瓶并按步骤(1)摇瓶培养的具体操作培养至对数生长期，得到对数生长期菌液；

(3)菌悬液的制备

从对数生长期菌液中取出2mL菌液，以4000rpm的转速离心10min除去上清液，并用去离子水洗涤两次，再次以4000rpm的转速离心10min除去上清液后加入2mL生理盐水稀释，得到菌悬液；

(4)ARTP诱变

在ARTP诱变专用金属片上滴加10μL的菌悬液，并使其浸润金属片的整个平面，然后将ARTP诱变专用金属片放入ARTP诱变育种仪对应的孔中，调整ARTP诱变育种仪的功率为120W，进气量为10.00L/min，时间为30s，打开诱变开关开始诱变，诱变结束后将菌体用生理盐水洗下，得到ARTP诱变菌悬液；

(5)β-紫罗酮筛选

将ARTP诱变菌悬液梯度稀释，然后涂布至加有3×10^-4mol/L的β-紫罗酮的固体培养基上培养，挑选红色色泽深的色素产量高的菌株，得到初筛菌株；

其中，固体培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)琼脂培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L，pH为6.4；

(6)菌株复筛

将初筛菌株挑到摇瓶中并按步骤(1)摇瓶培养的具体操作培养，测其生物量，并以二甲亚砜丙酮提取法提取虾青素，以高效液相色谱法测量虾青素的含量，挑选出产量较高的突变菌株；

(7)连续传代

将突变菌株连续传代五代，按步骤(6)操作重复测其生物量及虾青素含量，挑选出高产虾青素的红法夫酵母菌株，即得。

实施例3

高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

将红法夫酵母冻干粉用无菌水溶解，全部接种至YPDA试管斜面或者培养皿平板上，在25℃温度下培养3天，然后从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶中，在22℃温度下以150rpm的转速培养36h，保存至4℃冰箱中，得到活化菌种；

其中，摇瓶培养的培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，pH为6.4；

(2)对数生长期菌液的制备

将活化菌种从步骤(1)摇瓶接种到另一摇瓶中，测定其生长曲线，找到对数生长期为12-40h，然后再次从步骤(1)中接种摇瓶并按步骤(1)摇瓶培养的具体操作培养至对数生长期，得到对数生长期菌液；

(3)菌悬液的制备

从对数生长期菌液中取出2mL菌液，以6000rpm的转速离心5min除去上清液，并用去离子水洗涤两次，再次以6000rpm的转速离心5min除去上清液后加入2mL生理盐水稀释，得到菌悬液；

(4)ARTP诱变

在ARTP诱变专用金属片上滴加10μL的菌悬液，并使其浸润金属片的整个平面，然后将ARTP诱变专用金属片放入ARTP诱变育种仪对应的孔中，调整ARTP诱变育种仪的功率为120W，进气量为10.00L/min，时间为50s，打开诱变开关开始诱变，诱变结束后将菌体用生理盐水洗下，得到ARTP诱变菌悬液；

(5)β-紫罗酮筛选

将ARTP诱变菌悬液梯度稀释，然后涂布至加有6×10^-4mol/L的β-紫罗酮的固体培养基上培养，挑选红色色泽深的色素产量高的菌株，得到初筛菌株；

其中，固体培养基为YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖)培养基，具体为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂20g/L，pH为6.4；

(6)菌株复筛

将初筛菌株挑到摇瓶中并按步骤(1)摇瓶培养的具体操作培养，测其生物量，并以二甲亚砜丙酮提取法提取虾青素，以高效液相色谱法测量虾青素的含量，挑选出产量较高的突变菌株；

(7)连续传代

将突变菌株连续传代五代，按步骤(6)操作重复测其生物量及虾青素含量，挑选出高产虾青素的红法夫酵母菌株，即得。

性能测试

连续传代试验步骤：

I将实施例1筛选出的高产虾青素的红法夫酵母菌株接种至准备好的YPD琼脂培养基摇瓶中，培养基配方及条件与实施例1步骤(1)中一致，在22℃温度下以150rpm的转速培养5天；

II将步骤I的菌液继续接种到新的YPD琼脂培养基摇瓶中，在22℃温度下以150rpm的转速培养5天；

III上述传代操作重复5次，取最后一次传代中摇瓶的菌液，使用二甲亚砜及丙酮提取虾青素，HPLC检测虾青素含量，与传代前的虾青素含量对比是否有较大的偏差。

连续传代试验结果：

在5个平行实验中，检测出连续传代后的虾青素产量分别为34.87mg/L、33.62mg/L、32.54mg/L、33.78mg/L和35.37mg/L，细胞干重下虾青素含量为4876mg/kg、4793mg/kg、4735mg/kg、4901mg/kg和5248mg/kg。

该试验说明，本发明选育方法获得的红法夫酵母菌株具有稳定高产虾青素的特性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 湖北绿科乐华生物科技有限公司

<120> 一种高产虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1739

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atctgtctca gattagccat gcatgtctaa gtataaacaa attcatactg tgaaactgcg 60

aatggctcat taaatcagtt atagtttatt tgatggtacc ttgctacatg gataactgtg 120

gtaattctag agctaataca tgcctaaaag ccccgacttc tggaaggggt gtatttatta 180

gataaaaaac caacgcgtga aagcgctccc ttggtgattc ataataactt ttcgaatcgt 240

atggccttgc gccgacgatg cttcattcaa atatctgccc tatcaacttt cgatggtagg 300

atagaggcct accatggttt caacgggtaa cggggaataa gggttcgatt ccggagaggg 360

agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc 420

gacacgggga ggtagtgaca ataaataaca atatagggct ctatgggtct tataattgga 480

atgagtacaa tttaaatccc ttaacgagga accattggag ggcaagtctg gtgccagcag 540

ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag 600

ttgaacttca ggcctggtcg gccggtccgc ctcacggtgt gtactggtcg gccgggcctt 660

acctcttggt gagccgttcg gtcgtttacg cggccgggcg gggaaccagg atttttactt 720

tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcct atgcccgaat acattagcat ggaataatag 780

aataggacgt gcggttctat tttgttggtt tctaggatcg ccgtaatgat taatagggat 840

agttgggggc attagtattc agttgctaga ggtgaaattc ttggatttac tgaagactaa 900

ctactgcgaa agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgaagg ttaggggatc 960

gaaaacgatc agataccgtt gtagtcttaa cagtaaacta tgccgactag ggatcgggcg 1020

atgttctctt ttgactcgct cggcacctta cgagaaatca aagtctttgg gttctggggg 1080

gagtatggtc gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggagtgga 1140

gcctgcggct taatttgact caacacgggg aaactcacca ggtccagaca atataaggat 1200

tgacagattg atagctcttt cttgatttat tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttg 1260

gtggagtgat ttgtctggtt aattccgata acgaacgaga ccttaacctg ctaaatagcc 1320

cggccggctc ttgctggtcg ccggcttctt agagggacta tcagcatcta gctgatggaa 1380

gtttgaggca ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca 1440

ctgacagagc cagcgagttt ctttccttgg ccgaaaggtc tgggtaatct tgtgaaactc 1500

tgtcgtgctg gggatagagc attgcaattc ttgctcttca acgaggaatt cctagtaagc 1560

gcaagtcatc agcttgcgtt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac 1620

taccgattga atggcttagt gagatctccg gattggcttt ggggagccgg caacggcacc 1680

ctatcgtcga gaagctgctc aaacttggtc actagaggaa gtaaaagtcg agcagttca 1739

Claims (10)

1.一种高产虾青素的红法夫酵母菌株，其特征在于，所述菌株为红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)LUCNOVA001菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211124，保藏日期为2021年09月01日，分类学命名为Phaffia rhodozyma LUCNOVA001。

2.一种如权利要求1所述高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，所述菌株以红法夫酵母为出发生产菌，经ARTP诱变和β-紫罗酮筛选获得。

3.根据权利要求2所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

将红法夫酵母冻干粉用无菌水溶解，全部接种至YPDA试管斜面或者培养皿平板上培养，然后从活化的斜面上挑一环菌体接种到摇瓶培养，保存至4℃冰箱中，得到活化菌种；

(2)对数生长期菌液的制备

将活化菌种从步骤(1)摇瓶接种到另一摇瓶中，测定其生长曲线，找到对数生长期，然后再次从步骤(1)中接种摇瓶培养至对数生长期，得到对数生长期菌液；

(3)菌悬液的制备

从对数生长期菌液中取出部分菌液，离心除去上清液，并用去离子水洗涤两次，再次离心除去上清液后加入生理盐水稀释，得到菌悬液；

(4)ARTP诱变

在ARTP诱变专用金属片上滴加10μL的菌悬液，并使其浸润金属片的整个平面，然后将ARTP诱变专用金属片放入ARTP诱变育种仪对应的孔中，调整ARTP诱变育种仪参数，打开诱变开关开始诱变，诱变结束后将菌体用生理盐水洗下，得到ARTP诱变菌悬液；

(5)β-紫罗酮筛选

将ARTP诱变菌悬液梯度稀释，然后涂布至加有β-紫罗酮的固体培养基上培养，挑选红色色泽深的色素产量高的菌株，得到初筛菌株；

(6)菌株复筛

将初筛菌株挑到摇瓶培养，测其生物量及虾青素含量，挑选出产量较高的突变菌株；

(7)连续传代

将突变菌株连续传代五代，重复测其生物量及虾青素含量，挑选出高产虾青素的红法夫酵母菌株，即得。

4.根据权利要求3所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，步骤(1)中，所述YPDA试管斜面或者培养皿平板上培养的温度为20-25℃，时间为3-5天；

所述摇瓶培养的培养基为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，琼脂0或20g/L，pH为6.4；

所述摇瓶培养的温度为20-22℃，转速为150-200rpm，时间为36-60h。

5.根据权利要求3或4所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，步骤(2)中，所述对数生长期的时间为12-40h；

所述摇瓶培养的具体操作同步骤(1)。

6.根据权利要求3所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌液为2mL；

所述离心的转速为4000-6000rpm，时间为5-10min；

所述生理盐水的加入量为2mL。

7.根据权利要求3所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，步骤(4)中，所述ARTP诱变育种仪的功率为120W，进气量为10.00L/min，诱变时间为30-50s。

8.根据权利要求3或4所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，步骤(5)中，所述β-紫罗酮的浓度为3×10^-4-6×10^-4mol/L；

所述固体培养基同步骤(1)摇瓶培养的培养基。

9.根据权利要求3或4所述的一种高产虾青素的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，步骤(6)中，所述摇瓶培养的具体操作同步骤(1)；

所述虾青素的提取方法为二甲亚砜丙酮提取法，测量方法为高效液相色谱法。

10.一种如权利要求1所述的高产虾青素的红法夫酵母菌株或如权利要求2-9任一项所述选育方法制得的高产虾青素的红法夫酵母菌株在生产虾青素中的应用。