CN104178430A - 一种虾青素高产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虾青素高产菌株及其应用，其分类命名为法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)VR-032，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCM2014190，本发明以亚硝基胍诱变，通过摇瓶发酵筛选获虾青素产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株VR-032，该菌株可较大幅度提高发酵产物中虾青素组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用蔗糖为发酵碳源，在5L发酵罐中，以廉价蔗糖为碳源，发酵产虾青素产量达到68.7mg/L，相比原始出发菌株提高了20.8%，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种虾青素高产菌株及其应用。
背景技术
虾青素（3，3' –二羟基-4，4' 二酮基-β，β'胡萝卜素）是一种酮式类胡萝卜素，天然呈红色。虾青素最初被用做水产业的饲料添加剤，后来药理学和生理学研究表明虾青素有极强的抗氧化、淬灭自由基的功能，井能促进抗体的产生，增强宿主的免疫功能，在食品、医药和化妆品等领域有广阔的应用前景，具有很高的经济价值。红法夫酵母（Phaffia rhodozyma)是唯一天然可产虾青素的酵母,其反式虾青素已于2000年获得FDA批准，用于食品添加剤。它是真菌界、真菌门、半知菌亚门、隐球酵母科、红法夫酵母属的唯一种。作为虾青素的生产菌，红法夫酵母具有许多优势：可利用多种糖进行快速异养代谢，培养时间短，不需光照及可以实现高密度培养等。
但野生型红法夫酵母（DCW)的虾青素含量低（300450 μ g/g干细胞），发酵成本高，无法与化学合成竞争，无法满足工业化生产，因此需要对虾青素产菌株进行选育和改良，以提高产品质量，降低成本。由于红法夫酵母的遗传背景并不清楚，虾青素的合成路径也很复杂。因此，目前多采用传统的诱变和原生质体融合等方法对其进行改造。
目前，国外已有利用红法夫酵母进行虾青素生产的企业，如美国的红星公司、Igene生物有限公司、Tate&Lyle发酵产品有限公司和Igene生物技术有限公司合资工厂等。但国内还没有虾青素的生产企业，因此研究一种适于工业生产的虾青素生产途径具有很好的研究意义和很大的发展空间。
发明内容
为了解决目前法夫酵母的虾青素产量低，无法满足工业化生产的问题，本发明提供一株虾青素高产菌株及其应用。
本发明采用的技术方案如下：
一种虾青素高产菌株，其分类命名为法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous） VR-032，已于2014年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO： M 2014190，地址：中国 武汉 武汉大学。
本发明所述的虾青素高产菌株法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）VR-032的诱变筛选方法是：将虾青素出发菌株法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous） vr01，经亚硝基胍诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得虾青素产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出虾青素产量高的目标菌株法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous） VR-032，形态学及生理生化学特征如下：
菌落颜色：米白色。
需氧方式：好氧生长。
菌落大小：4~7 mm。
最适生长温度：22℃。
适宜生长pH：7.0~7.2。
菌体形态：圆形菌落，无光泽。
革兰氏染色：阳性。
本发明所提供的虾青素高产菌株的诱变方法，具体步骤如下：
(a)为了获得虾青素高产菌株，经过对比多种诱变方法，选用亚硝基胍(NTG)诱变方法，从在液体培养基中的出发菌株法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous vr01培养物中获得待诱变的细胞混悬液，在20℃和100rpm下，将108细胞／mL在250ug／mL NTG溶液的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0中温浴60～120min。
（b）然后将诱变细胞在液体中间培养基中，23℃和100rpm下培养10小时。
(c)、诱变菌株的筛选：
筛选：将步骤(b)诱变得到的培养液接入种子培养基，在培养温度23℃，200rpm摇床转速下扩大培养48h后，按10%(v/v)的接种量接入发酵培养基。23℃，200rpm摇床转速下培养48h后下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中虾青素含量。取发酵虾青素含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a) ~(c)，直至筛选出虾青素产量高的目标菌株法夫酵母VR-032。
步骤(b)中所用的液体中间培养基为：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、无机盐 0.1%~0.4%其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖和蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合，所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
步骤(c) 中所用的种子培养基为：碳源3.0%~5.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.4%，其余为水，pH 6.0~6.2；其中所述碳源为葡萄糖和蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
步骤(c) 中所用的发酵培养基为：碳源1.0%~3.0%、氮源2.0%~6.0%、无机盐0.1%~0.4%、微量元素0.0001%~0.0004%，其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合；所述的微量元素为维生素B1。
上述筛选出的法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）VR-032在发酵生产虾青素中的应用，具体步骤如下：
1)、固体培养：将法夫酵母VR-032接种于固体培养基上，培养温度为21~23℃，培养时间为48h；
2)、种子培养：将步骤2)固体培养的法夫酵母VR-032接种到种子培养基中，培养温度为21~23℃，200rpm转速下培养48h；
3)、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)，培养温度为21~23℃，200rpm转速下发酵48~52h。
步骤1）所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖和蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。
步骤2）所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3.0%~5.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.4%，其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖和蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、玉米浆中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
步骤3）所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源1.0%~3.0%、氮源2.0%~6.0%、无机盐0.1%~0.4%、微量元素0.0001%~0.0004%，其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合； 所述的微量元素为维生素B1。
有益效果
本发明采用亚硝基胍诱变，最终筛选获得一株虾青素高产菌株法夫酵母VR-032，可较大幅度提高发酵产物中虾青素组分且遗传稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以廉价蔗糖为碳源，发酵产虾青素产量达到68.7mg/L ，相比原始出发菌株提高了20.8%，同时也超过国内外目前有报道的发酵产量最高的菌株（产量在60mg/L左右）。本技术发明完全符合工业化虾青素生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1：实施例2发酵液中虾青素色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 本实施例说明将法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous) vr01进行诱变的方法。
以实验室保存的法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)vr01为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：
(a)为了获得虾青素高产菌株，经过对比多种诱变方法，选用亚硝基胍(NTG)诱变菌株的方法。从在液体培养基中的法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)vr01培养物中获得待诱变的细胞混悬液。在20℃和100rpm下，将108细胞／mL的细胞混悬液在250ug／Ml NTG溶液的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0中温浴60～120min。（b）然后将诱变细胞在液体中间培养基中，23℃和100rpm下培养10小时。
(c)、诱变菌株的筛选：
筛选：将步骤(b)诱变得到的培养液接入种子培养基，在培养温度23℃，200rpm摇床转速下扩大培养48h后，按10%(v/v)的接种量接入发酵培养基。23℃，200rpm摇床转速下培养48h后下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中虾青素含量。取发酵虾青素含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a) ~(c)，直至筛选出虾青素产量高的目标菌株法夫酵母VR-032。
步骤(b)中所用的液体中间培养基为：蔗糖 3.0%，麦芽浸粉 1.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，pH 5.8~6.0，其余为水。
步骤(c) 中所用的种子培养基为：蔗糖4.0%，花生饼粉 2.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，pH 6.0~6.2，其余为水。
步骤(c) 中所用的发酵培养基为：蔗糖 2.0%，花生饼粉 4.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，维生素B1 0.0002%，pH 5.8~6.0，其余为水。
实施例2 本实施例说明高产菌株法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）VR-032发酵生产虾青素的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
固体培养基为：蔗糖 3.0%，麦芽浸粉 1.0%，琼脂粉 1.5%，pH 5.8~6.0，其余为水。
种子培养基为：蔗糖4.0%，花生饼粉 2.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，pH 5.8~6.0，其余为水。
发酵培养基为：蔗糖 2.0%，花生饼粉 4.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，维生素B1 0.0002%，pH 5.8~6.0，其余为水。
将法夫酵母VR-032接种于固体培养基上，培养温度为21℃，培养时间为48h；将固体培养的法夫酵母VR-032培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为21℃，200rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为5.8，接种量为10%(v/v)， 500mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为21℃，200rpm摇床转速下培养发酵50h。发酵产虾青素产量为70.0mg/L，相对于原始出发菌株提高了22.9%（原始出发菌株的产量以最高值产量56.9 mg/L计算）。
实施例3 本实施例说明突变株的形态学及生理生化学特征和传代稳定性
法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous） VR-032，形态学及生理生化学特征如下：菌落颜色：米白色；需氧方式：好氧生长；菌落大小：4~7 mm；最适宜生长温度：22℃；适宜生长pH：7.0~7.2；菌体形态：圆形菌落，无光泽；革兰氏染色：阳性。
在以蔗糖为碳源的发酵培养基中（发酵培养条件同实施例2），检测突变株法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous) VR-032的产量，观察期传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示：
表1 高产突变菌株法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous) VR-032稳定性试验
| 传代次数 | 虾青素产量 (mg/L)vr01 | 虾青素产量 (mg/L)VR-032 |
| F1 | 56.4 | 69.8 |
| F2 | 55.8 | 70.0 |
| F3 | 56.9 | 69.5 |
| F4 | 56.7 | 69.3 |
| F5 | 55.9 | 69.5 |
从实验结果可以看出，经过5次传代，突变菌株法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous) VR-032的虾青素产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例4本实施例说明高产菌株法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）VR-032发酵生产虾青素的工艺。
本实施例所用的培养基配方：
固体培养基为：蔗糖 3.0%，麦芽浸粉 1.0%，琼脂粉 1.5%，pH 5.8~6.0，其余为水。
种子培养基为：蔗糖4.0%，花生饼粉 2.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，pH 5.8~6.0，其余为水。
发酵培养基为：蔗糖 2.0%，花生饼粉 4.0%，磷酸二氢钾 0.2%，硫酸镁 0.05%，维生素B1 0.0002%，pH 5.8~6.0，其余为水。
将法夫酵母VR-032接种于固体培养基上，培养温度为21℃，培养时间为48h；将固体培养的法夫酵母VR-032培养物接种至种子培养基中，500mL培养瓶中装液量为150mL，培养温度为21℃，200rpm转速下培养48h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为5.8，接种量为10%(v/v)， 5L培养瓶中装液量为3L，培养温度为21℃，200rpm摇床转速下培养发酵50h。发酵液中虾青素产量为68.7mg/L，相对于原始出发菌株提高了20.8%。
实施例5：本实例说明发酵液中虾青素产量的检测方法。
仪器设备：高效液相色谱仪、色谱工作站、离心机、超声清洗器、漩涡混合器、微量进样器、微孔滤膜、色谱柱为Agilent不锈钢柱（内装填料PLRS-S，10nm，长250nm，内径4.6mm）等。
试剂：色谱甲醇、乙腈；
检测条件：流动相为乙腈：水 （95:5）；流速为1.5mL·min-1；检测波长为471nm，进样量20μL。
操作步骤
(1) 标样的制备
准确称取虾青素标准品0.05g(精确至0.0002g)溶于50mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。再用移液管取1mL至10mL容量瓶，色谱甲醇溶解，并定容至刻度，备用。
(2) 样品制备
取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液经一定稀释后用微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。
在上述条件下，待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样虾青素峰面积相对变化小于1.5%后，再将制备好的样品进样检测。图1为标样及发酵液中虾青素色谱图。
(3) 计算方法
虾青素产量（g/L）=(样品峰面积 / 标准品峰面积) ×标准品浓度×稀释倍数。
Claims (6)
1.一种虾青素高产菌株，其分类命名为法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous） VR-032，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO： M 2014190。
2.权利要求1所述的虾青素高产菌株在发酵生产虾青素中的应用。
3.根据权利要求2所述虾青素高产菌株在发酵生产虾青素中的应用，其特征在于包含如下步骤：
1)、固体培养：将法夫酵母VR-032接种于固体培养基上，培养温度为21~23℃，培养时间为48h；
2)、种子培养：将步骤2)固体培养的法夫酵母VR-032接种到种子培养基中，培养温度为21~23℃，200rpm转速下培养48h；
3)、发酵培养：将步骤2)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为5~15%(v/v)，培养温度为21~23℃，200rpm转速下发酵48~52h。
4.根据权利要求3所述虾青素高产菌株在发酵生产虾青素中的应用，其特征在于：步骤1）所述固体培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~4.0%、氮源0.5%~1.5%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖和蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为麦芽浸粉和酵母膏中的一种或两种的混合。
5.根据权利要求3所述虾青素高产菌株在发酵生产虾青素中的应用，其特征在于：步骤2）所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3.0%~5.0%、氮源1.0%~3.0%、无机盐0.1%~0.4%，其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖和蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、玉米浆中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合。
6.根据权利要求3所述虾青素高产菌株在发酵生产虾青素中的应用，其特征在于：步骤3）所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源1.0%~3.0%、氮源2.0%~6.0%、无机盐0.1%~0.4%、微量元素0.0001%~0.0004%，其余为水，pH 5.8~6.0；其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐中的一种或几种的混合； 所述的微量元素为维生素B1。
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