CN106947707A - 一种菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种菌株及其应用。本发明所述菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13943。本发明所述菌株可提高虾青素的产量和生产效率，且具有优良的遗传稳定性。本发明还公开了一种虾青素的生产方法。本发明利用所述菌株生产虾青素的方法相对于现有技术更为环保、成本低廉、操作简单，为虾青素的生产提供了一种可行的方法。

Description

一种菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种虾青素发酵菌株及其应用，以及一种生产虾青素的方法。

背景技术

虾青素(Astaxanthin,3,3'-二羟基-β,β,-胡萝卜素-4,4'-二酮，C₄₀H₅₂O₄，相对分子质量为596.86)是生物界广泛存在的一种类胡萝卜素类物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、提高免疫力等多种生物学功能，在食品、化妆品、水产养殖、医药、饲料等行业中有着广泛的应用前景。虾青素的市场份额占到了类胡萝卜素的29％，市场价值约225百万美元。广泛的市场需求和高昂的市场价值使虾青素的研究和生产具有光明的前景。

目前虾青素的制备主要依赖化学合成和天然产物提取，化学合成虾青素的主要生产商是瑞士的罗氏公司和德国的巴斯夫公司，由于合成困难、工艺复杂，导致价格居高不下，而且化学合成的虾青素和天然虾青素的构型不同，其抗氧化能力仅为天然虾青素的1/3。基于市场需求，人们把目光转移到天然产物的提取上，水产品加工的下脚料、藻类、酵母等都是行之有效的来源。水产品加工的下脚料虾青素含量低，提取工艺复杂，生产成本较高。雨生红球藻作为自然界中虾青素含量最高的生物，最多能够积累细胞干重的4％，已经用于工业化生产。2016年中国海洋大学Ni Wang等人对雨生红球藻菌株进行紫外照射、甲基磺酸乙酯、二苯胺三阶段的诱变育种，其产量较高。然而雨生红球藻培养周期长、生产工艺复杂，且生产技术被日本富士化学和美国Cyanotech公司长期垄断。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足提供一种虾青素发酵菌株，以提高虾青素的产量和生产效率，满足虾青素的大规模工业化生产。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为CGMCC No.13943。

进一步的，本发明还提供了所述菌株在生产虾青素中的应用。

本发明还提供一种虾青素的发酵生产方法，包括如下步骤：

步骤1：将保藏编号为CGMCC No.13943的菌株接种于种子培养基中扩繁；

步骤2：将步骤1扩繁的菌株接种于发酵培养基中发酵，丙酮提取即得虾青素。

作为优选，所述种子培养基包括：酵母氮源6.7g/L，氨基酸缺省混合粉末2g/L，葡萄糖20g/L，pH值为6.0-6.5。

作为优选，所述发酵培养基包括：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，pH值为5.0-5.5。。

作为优选，所述扩繁步骤具体为：

步骤A：将所述菌株接种于一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养20-24小时；

步骤B：以一级种子培养基中菌体浓度OD₆₀₀＝0.1接种于二级种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养14-16小时。

作为优选，所述虾青素的发酵生产方法中步骤2接种浓度为菌体浓度OD₆₀₀＝0.05。

作为优选，所述发酵的条件为：30℃、250rpm发酵82小时。

由以上技术方案可知，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.13943的菌株可提高虾青素的产量和生产效率。同出发菌株相比，虾青素产量提高了160％，中间代谢产物量也相应提高。本发明提供的菌株具有优良的遗传稳定性，在连续传代培养中，连续5代的菌株其虾青素产量变化均在1mg/L以内，可应用于虾青素的工业化生产。本发明利用所述菌株生产虾青素的方法相对于现有技术更为环保、成本低廉、操作简单，为虾青素的生产提供了一种可行的方法。

生物保藏说明

菌株SyBE_Sc2110M3：分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2017年3月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13943。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示ARTP操作原理图；

图2示不同诱变时间对酿酒酵母的致死率影响图；

图3示不同菌株虾青素产量及中间代谢产物量图(其中图中Canthaxanthin为角黄素，zeaxanthin为玉米黄素，lycopene为番茄红素，astaxanthin为虾青素，β-carotene为β-胡萝卜素；control为对照株(SyBE_Sc118059)；SyBE_Sc2110M1-SyBE_Sc2110M8为诱变株)；

图4示SyBE_Sc2110M3遗传稳定性验证图。

具体实施方式

本发明公开了一种菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种菌株，其中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，所述氨基酸缺省混合粉末配方如下表1所示：

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：SyBE_Sc2110M3菌株的获得

常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasmas，简称ARTP)由等离子体发生器、氦气储存罐、控制系统和原盘状的金属铁片组成。等离子体发生器通过射频辉光放电产生富含各种高能活性粒子的等离子体

(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)。活性粒子对菌株的遗传物质造成损伤，从而诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程会产生种类丰富的错配位点，因此更易获得多样性状的诱变菌株，并最终稳定遗传进而形成诱变株。

ARTP诱变实验操作参数如下：输出功率120W、处理距离2mm、气体流速10L/min。为了确定合适的诱变时间，ARTP等离子体处理样品的时间分别为0、10、15、30、40、50、60、80、100、120、150s。

具体操作步骤如下：

(1)菌悬液制备：取1ml培养至对数期的SyBE_Sc118059菌液于1.5ml离心管，12000rpm离心1min，先用1ml生理盐水洗涤两次，再用适量蒸馏水稀释制成OD₆₀₀＝1的菌悬液。

(2)样品载片制备及处理：于超净台将金属载片在酒精灯火焰上灼烧30s，冷却后放到已灭菌的玻璃平板中，取10μl菌液均匀涂于金属载片；将装有样品载片的平板移至ARTP诱变系统操作仓，用无菌镊子将载片放到对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处，并关闭仓门，设置好参数，点击开始处理样品；样品处理完毕，用无菌镊子将金属载片立即放入装有1ml生理盐水的1.5ml EP管中；将EP管在涡旋振荡器上振荡1min，使附着在金属片上的菌液完全溶于生理盐水中，形成新的菌悬液；将新的菌悬液稀释10倍(10³)、100倍(10⁴)，取100μl涂布于Sc-Ura-Leu-His平板上，每个做两个平行对照，30℃培养3天，培养计数并观察菌落形态和颜色。

(3)试验结果：培养3天后对平板上的菌落进行计数，菌落数如表2所示。

表2不同诱变时间的菌落数量

高致死率会产生更多有效的突变，因此计算致死率并选择合适的处理时间是十分必要的。致死率的计算公式为：

式中：LR为致死率；T₀为处理时间0s的平均菌落数量；T_n为处理时间为ns的平均菌落数量(n＝10、15、30、40、50、60、80、100、120、150)。致死率如图2所示。

从图2中可以看出ARTP对产虾青素的酿酒酵母损伤程度很大，处理30s，致死率高达84.4％，致死率80％-90％更容易得到有效突变。因此选择从处理时间30、40、50、60s的平板中，挑选到8株诱变株(编号为：SyBE_Sc2110M1-SyBE_Sc2110M8)菌落颜色加深且菌落长势较好的诱变株。

实施例2：菌株的发酵

发酵比较对照株(SyBE_Sc118059)、诱变株(SyBE_Sc2110M1-SyBE_Sc2110M8)的虾青素产量。

其中种子培养基为SC drop-out培养基，由酵母氮源6.7g/L，氨基酸缺省(drop-out)混合粉末2g/L，葡萄糖20g/L组成，pH值为6.0-6.5；发酵培养基由40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉组成，pH值为5.0-5.5。

将上述菌株接种于3mL一级种子培养基中，在30℃、250rpm条件培养20-24小时，以一级种子培养基的菌体浓度OD₆₀₀＝0.1分别接种于5mL二级种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养14-16小时，以二级种子培养基菌体浓度OD₆₀₀＝0.05接种于50mL发酵培养基中，30℃，250rpm发酵培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD₆₀₀)及虾青素产量。

实施例3：虾青素的产量测定

虾青素测定方法：在发酵过程中的菌体密度达到OD₆₀₀＝23时取两等份的发酵液，4000rpm离心1min收集菌体，并水洗两次。将其中一份菌体置于80℃烘干至恒重，称重计算细胞干重；另一份菌体用以产物提取，具体方法为：用3M预冷HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸3min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞在12000rpm、4℃条件下离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋10min；最后离心收集丙酮相，用2μm有机滤膜过滤后上紫外液相检测，虾青素检测波长为470nm。

虾青素的测定选用的色谱柱为BDS HYPERSIL C18(150mm×4.6mm,5μm,Thermo)，测定波长为470nm，流速为1ml/min，柱温设置为25℃。流动相为溶剂A:乙腈-水(9:1)；溶剂B:甲醇-异丙醇(3:2)，测定条件为：0-15min，0-90％B；15-30min，90％B；30-35min，90-0％B。

虾青素产量及中间代谢物量结果如图3所示，其中SyBE_Sc2110M3虾青素产量提高了160％，中间代谢产物量也相应提高。

实施例4：SyBE_Sc2110M3遗传稳定性测定

诱变株SyBE_Sc2110M3在固体培养基上连续传代培养5次，每一代菌株进行摇瓶发酵，按照实施例3所述方法检测虾青素的产量并验证其遗传稳定性，结果如图4。

由图4可知，第二～第五代菌株的虾青素产量变化均在1mg/L以内，表明诱变株SyBE_Sc2110M3生产虾青素性能非常稳定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.13943。

2.权利要求1所述的菌株在生产虾青素中的应用。

3.一种虾青素的发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将保藏编号为CGMCC No.13943的菌株接种于种子培养基中扩繁；

步骤2：将步骤1扩繁的菌株接种于发酵培养基中发酵，丙酮提取即得虾青素。

4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述种子培养基包括：酵母氮源6.7g/L，氨基酸缺省混合粉末2g/L，葡萄糖20g/L，pH值为6.0-6.5。

5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，pH值为5.0-5.5。

6.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述扩繁具体如下：

步骤A：将所述菌株接种于一级种子培养基中，在30℃、250rpm培养20-24小时；

步骤B：以一级种子培养基中菌体浓度OD₆₀₀＝0.1接种于二级种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养14-16小时。

7.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2接种浓度为菌体浓度OD₆₀₀＝0.05。

8.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述发酵的条件为：30℃、250rpm发酵82小时。