CN106318878A

CN106318878A - 一种高产虾青素红酵母工程菌及其构建方法

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Publication number: CN106318878A
Application number: CN201510388597.6A
Authority: CN
Inventors: 王士安; 李福利
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2035-07-06
Also published as: CN106318878B

Abstract

本发明涉及一种高产虾青素的红酵母工程菌及其构建方法，属于生物技术领域。红酵母工程菌为红发夫酵母菌株SXD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10519，保藏日期为2015年2月4日。本发明通过代谢工程方法获得红发夫酵母工程菌株SXD，显著提高了红发夫酵母虾青素合成途径的代谢通量。所获得的红发夫酵母工程菌株SXD的最高虾青素含量为4.4mg/g细胞干重，经优化培养，该菌株的虾青素含量达到7.1mg/g细胞干重，最大生物量为83.8g/L，具有工业开发前景。并且，SXD菌株未经任何诱变处理，后续借助诱变育种手段继续提高虾青素产量的空间很大，有望继续降低酵母虾青素生产成本。

Description

一种高产虾青素红酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种高产虾青素的红酵母工程菌及其构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

虾青素(Astaxanthin)是一种萜类天然色素，属于类胡萝卜素范畴。虾青素分子由两个末端环状结构通过中间的多烯连接，分子式为C₄₀H₅₂O₄。由于末端两个β-紫罗兰酮结构第三位羟基碳原子的手性，虾青素存在三种立体异构体，即(3S,3S')、(3R,3R')、(3R,3S')。虾青素分子含有共轭双健、羟基、酮基，既具有亲脂性，也具有亲水性，这些分子特征赋予虾青素独特的生物学活性和功能。

虾青素具有强抗氧化作用。虾青素分子中的共轭双键能够作为电子供体与生物体内的自由基反应，将其转化为稳定产物，从而终止自由基的破坏性氧化反应。除共轭双键外，虾青素分子的羟基和酮基功能团赋予其亲水性，对抗氧化起到重要作用(Hussein G,Sankawa U,Goto H,MatsumotoK,Watanabe H.Astaxanthin,a carotenoid with potential in humanhealth and nutrition.J Nat Prod,2006,69:443-449)。与其它抗氧化剂不同，虾青素分子既有亲水性又有亲脂性，能够跨过细胞膜，清除细胞膜脂双层内部及外部的自由基、单态氧，终止脂过氧化反应，从而对蛋白质、脂类和DNA起到保护作用(Goto S,Kogure K,Abe K,Kimata Y,KitahamaK,Yamashita E,Terada H.Efficient radical trapping at the surfaceand inside the phospholipid membrane is responsible for highly potentantiperoxidative activity of the carotenoid astaxanthin.BiochimBiophys Acta,2001,1512:251-258；Rao AR,Sindhuja HN,Dharmesh SM,Sankar KU,Sarada R,Ravishankar GA.Effective inhibition of skincancer,tyrosinase,and antioxidative properties by astaxanthin andastaxanthin esters from the green alga Haematococcus pluvialis.JAgric Food Chem,2013,61:3842-3851)。虾青素的抗氧化活性是β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、角黄素等的10倍以上。

除强抗氧化作用外，虾青素还有多种其它保健功效和潜在的疾病治疗作用，主要包括以下几个方面：

(1)抗炎症。多项研究表明，虾青素能抑制眼睛炎症、缓解眼疲劳(ParkJS,Chyun JH,Kim YK,Line LL,Chew BP.Astaxanthin decreasedoxidative stress and inflammation and enhanced immune response inhumans.Nutr Metab(Lond),2010,7:18)。虾青素还能吸收紫外线，防止皮肤加厚和老化(Hama S,Takahashi K,Inai Y,Shiota K,SakamotoR,Yamada A,Tsuchiya H,Kanamura K,Yamashita E,Kogure K.Protectiveeffects of topical application of a poorly soluble antioxidantastaxanthin liposomal formulation on ultraviolet-induced skindamage.J Pharm Sci,2012,101:2909-2916)。除此之外，初步研究表明，虾青素对某些其它炎症有治疗效果，如类风湿性关节炎、口腔溃疡、腕管综合症等(Kidd P.Astaxanthin,cell membrane nutrient with diverseclinical benefits and anti-aging potential.Altern Med Rev,2011,16:355-364)。

(2)预防心脑血管疾病。动物实验研究表明，虾青素对动脉缺血、高血压、动脉粥样硬化等有预防和改善作用(Fassett RG,Coombes JS.Astaxanthin:a potential therapeutic agent in cardiovascular disease.Mar Drugs,2011,9:447-465；Monroy-Ruiz J,Sevilla MA,Carron R,Montero MJ.Astaxanthin-enriched-diet reduces blood pressure andimproves cardiovascular parameters in spontaneously hypertensiverats.Pharmacol Res,2011,63:44-50)。

(3)抗肿瘤活性。与角黄素和β-胡萝卜素相比，虾青素具有显著的抗癌活性(Chew BP,Park JS,Wong MW,Wong TS.A comparison of theanticancer activities of dietary beta-carotene,canthaxanthin andastaxanthin in mice in vivo.Anticancer Res,1999,19:1849-1853)。虾青素可以抑制皮肤癌、口腔癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等癌症细胞的生长(Tanaka T,Makita H,Ohnishi M,Mori H,Satoh K,Hara A.Chemoprevention of rat oral carcinogenesis by naturally occurringxanthophylls,astaxanthin and canthaxanthin.Cancer Res,1995,55:4059-4064；Palozza P,Torelli C,Boninsegna A,Simone R,CatalanoA,Mele MC,Picci N.Growth-inhibitory effects of theastaxanthin-rich alga Haematococcus pluvialis in human colon cancercells.Cancer Lett,2009,283:108-117；Ambati RR,Phang SM,Ravi S,Aswathanarayana RG.Astaxanthin:sources,extraction,stability,biological activities and its commercial applications--a review.MarDrugs,2014,12:128-152)。

虾青素的传统用途是着色剂，用作鱼类的饲料添加剂，提升鱼的色泽和抗病能力。随着虾青素生物学功能研究的发展，该产品的应用领域正在扩展。近期，可供人口服的虾青素胶囊(Nutrex)以及化妆品(ASTALIFT)陆续问世。虾青素的市场也正在扩大，据BCC research估计，到2015年虾青素的市场额度会达到2.5亿美元(Schmidt I,Schewe H,Gassel S,JinC,Buckingham J,Humbelin M,Sandmann G,Schrader J.Biotechnologicalproduction of astaxanthin with Phaffia rhodozyma/Xanthophyllomycesdendrorhous.Appl Microbiol Biotechnol,2011,89:555-571)。另有预测，到2020年虾青素的市场额度会达到15亿美元。

目前，虾青素的来源以化学合成为主，化学合成的虾青素主要用作饲料添加剂，不能供人使用。天然虾青素存在于虾蟹壳、藻类等海洋生物和红酵母等微生物。天然虾青素可供人使用，但产量非常有限，远远不能满足市场需求，而且价格昂贵。从虾蟹等甲壳类水产品废弃物提取虾青素，面临原料来源和收集方面的困难，产量有限。通过藻类和酵母菌培养获得虾青素，成为当前国内外的研发热点，具有很好的开发前景。

红发夫酵母(Phaffia rhodozyma/Xanthophy llomyces dendrorhous)能够合成多种类胡萝卜素，其中虾青素比例最高，可以达到85％。此外，红发夫酵母在生长速度、细胞培养密度、抗污染等方面具有突出优势。因此，红发夫酵母被认为是虾青素工业化生产的重要潜在细胞工厂。但是，野生型红发夫酵母的虾青素含量低于细胞干重的0.1％。传统的物理化学诱变和培养优化，在一定程度上提高了红发夫酵母的虾青素含量，有研究将突变菌的虾青素含量提高到细胞干重的0.47％(de la Fuente JL1,Rodríguez-Sáiz M,Schleissner C,Díez B,Peiro E,Barredo JL.High-titer production of astaxanthin by the semi-industrialfermentation of Xanthophyllomyces dendrorhous.J Biotechnol,2010,148:144-146)。除了传统诱变和培养优化，遗传改造是提高红发夫酵母虾青素含量的另一种方法。随着代谢工程和合成生物学的发展，理性设计和优化虾青素合成途径具备了可实现性，这些新方法的应用有望大大提高红发夫酵母的虾青素产量，推动该产品的产业化进程和市场供给。

发明内容

本发明提供一种高产虾青素的红酵母工程菌种以及构建方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种高产虾青素红酵母工程菌，红酵母工程菌为红发夫酵母菌株SXD，分类学命名为Xanthophy llomyces dendrorhous，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10519，保藏日期为2015年2月4日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一种高产虾青素红酵母工程菌的构建方法：以红发夫酵母CBS 6938菌株作为宿主，通过代谢工程方式，将提高红发夫酵母乙酰辅酶A合成、降低甾体类物质合成以及提高虾青素合成途径代谢通量的基因元件表达盒转化宿主，进而获得高产虾青素红酵母工程菌。

优选为：通过代谢工程方式，在宿主CBS 6938中过量表达红发夫酵母虾青素合成酶基因CrtS、细胞色素P450还原酶基因CrtR、GGPP合成酶基因CrtE和茄红素合成酶基因CrtYB；同时表达酿酒酵母HMG-CoA还原酶基因HMGR，并且敲除红发夫酵母C22-甾醇去饱和酶基因CYP61，表达细菌丙酮酸脱氢酶基因LpdA、AceE和AceF基因，进而获得高产虾青素红酵母工程菌。

所述高产虾青素红酵母工程菌基因的整合位点为红发夫酵母基因组rDNA、CYP61或/和DHS3位点。

所述高产虾青素红酵母工程菌的启动子和终止子分别为红发夫酵母基因ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD、GDH或ACT中任意的启动子和终止子。

所述高产虾青素红酵母工程菌的抗性筛选标记为遗传霉素(G418)、潮霉素(Hgr)、放线菌酮(CHX)、博莱霉素(BLM)中的一种或几种的组合。

其中，遗传霉素(G418)为100-500μg/ml、潮霉素(Hgr)为50-400μg/ml、放线菌酮(CHX)为2-10μg/ml、博莱霉素(BLM)为100-500μg/ml。

本发明所具有优点：本发明通过代谢工程方法获得红发夫酵母工程菌株SXD，显著提高了红发夫酵母虾青素合成途径的代谢通量。。所获得的红发夫酵母工程菌株SXD的最高虾青素含量为4.4mg/g细胞干重，经优化培养，该菌株的虾青素含量达到7.1mg/g细胞干重，最大生物量为83.8g/L，具有工业开发前景。并且，SXD菌株未经任何诱变处理，后续借助诱变育种手段继续提高虾青素产量的空间很大，有望继续降低酵母虾青素生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例提供的虾青素合成代谢改造图；其中，cytoPDH代表基因LpdA、AceE和AceF；HMGR代表HMG-CoA还原酶基因；CrtE代表GGPP合成酶基因；CrtYB代表茄红素合成酶基因；CrtS代表虾青素合成酶基因；CrtR代表细胞色素P450还原酶基因；CYP61代表C22-甾醇去饱和酶基因。

图2为本发明实施例提供的虾青素HPLC检测图；其中，横坐标为样品的保留时间(min)，纵坐标为测试样品的响应强度(mAu)，虾青素出峰时间为2.483min。

图3为本发明实施例提供的红发夫酵母菌株的虾青素含量图。

具体实施方式

实施例1、质粒构建

1.1基因元件的克隆

1)基因ADH2、ALD6、CrtE、CrtYB、CrtS和CrtR的获得：

采用玻璃珠破碎法提取红发夫酵母的基因组DNA，分别以红发夫酵母的基因组DNA作为模板，并分别以表1中记载的作为各基因的引物序列，采用KAPAHiFi高保真DNA聚合酶扩增基因，分别进行PCR扩增，扩增体系皆为25ul(2×KAPA Mix,12.5ul；10uM引物各0.5ul；模板1ul；加水补至25ul)，即得到各基因序列。

扩增条件为：95℃预变性3分钟；98℃变性20秒、60-72℃退火15秒、72℃延伸，延伸时间按照15秒每kb计算，循环数为29-35；72℃延伸6分钟。

2)基因ACS、PHK和PTA的合成：大肠杆菌乙酰辅酶A合成酶基因ACS、黑曲霉磷酸转酮酶基因PHK、枯草芽孢杆菌磷酸转乙酰酶基因PTA，由生工生物工程(上海)有限公司通过基因合成获得。

3)基因LpdA、AceE、AceF以及基因HMGR的获得：

分别以大肠杆菌基因组作为模板，表1中记载的作为各基因的引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶扩增基因，分别进行PCR扩增，扩增体系皆为25ul[与步骤1.1，1)中记载一致]，即分别获得LpdA、AceE、AceF各基因序列。其中，扩增条件以及扩增体系的用量与上述步骤1)中记载的一致。

以酿酒酵母基因作为模板，表1中记载的作为各基因的引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶扩增基因，分别进行PCR扩增，扩增体系为25ul[与步骤1.1，1)中记载一致]，即获得基因HMGR序列。其中，扩增条件以及扩增体系的用量与上述步骤1)中记载的一致。

表1、基因引物序列

引物名称	引物序列
		ADH2-F	ATTAACGGTACCGTAATACACAATGTCTATTCC
ADH2-R	AGACATGCTAGCTCCGCTTATTTAGAAGTGTC
		ALD6-F	CAAACACCCGGGATCAGAATACAATGACTAAGC
ALD6-R	GCAGGTGGATCCATTACAACTTAATTCTGAC
		CrtE-F	GGAACAGAATTCATGGATTACGCGAACATCCTC
CrtE-R	GAATATGGATCCTCACAGAGGGATATCGGCTAGC
		CrtYB-F	GTTACTGGTACCATGACGGCTCTCGCATATTACC
CrtYB-R	TCTTCCTCCGGATTACTGCCCTTCCCATCCGC
		CrtS-F	TACTTTACCGGTATGTTCATCTTGGTCTTGCTC
CrtS-R	TGAAGAGGATCCTCATTCGACCGGCTTGACCTG
		CrtR-F	TATCCACAATTGATGGCCACACTCTCCGATCTTG
CrtR-R	AAGTCGGCTAGCCTACGACCAGACGTCCATCAAC
		LpdA-F	CTCAATCGAGGCATTCAACCATGAGTACTGAAATCAAAACTC
LpdA-R	TGTGAGAGAGGCGGGGTAATTTACTTCTTCTTCGCTTTCG
		AceE-F	AGCTCTCGAGAACCCTTAATACATTCTGAAGCAACCAGAC
AceE-R	ATCATGGTCAGACCATGATTACGCCTTGATC
		AceF-F	AATCATGGTCTGACCATGATTACGCCACGA
AceF-R	GGTGTCTCCTACAGCACAGATACGTCATTCTAGTCACTCTTACC
		HMGR-F	CAGATCCACTAGTGGCCTATTACGTCATTCTAGTCACTCTTAC

HMGR-R

GATGAGCCAGTACTTGTCCGACGAATCTATTTATTACGTCTAATG

1.2启动子和终止子元件的克隆

1)ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD和GDH启动子的克隆：

采用玻璃珠破碎法提取红发夫酵母的基因组DNA，以红发夫酵母的基因组DNA作为模板，并分别以表2中记载作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶扩增启动子，分别进行PCR扩增，扩增体系皆为25ul(与步骤1.1，1)中记载一致)，即得到基因ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD和GDH的启动子序列。

2)ACT、GPD和GDH终止子的克隆：

与启动子的克隆类似，以红发夫酵母的基因组DNA为模板，并分别以表3中记载作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶扩增终止子，分别进行PCR扩增，扩增体系皆为25ul(与步骤1.1，1)中记载一致)，即得到基因ACT、GPD和GDH的终止子序列。其中，扩增条件以及扩增体系的用量与上述步骤1)中记载的一致。

表2、启动子引物序列

表3、终止子引物序列

引物名称

引物序列

Tact-F	tctattcatcTAAGTCAACAAAGTCTTTCTATC
		Tact-R	gctatgaccatgattacgccACGAATCTATTTATTACGTCTAATG
Tgpd-F	gaaccccacaTCCGGAACGGTTCTCTCCAA
		Tgpd-R	gctatgaccatgattacgccTTGATCAGATAAAGATAGAGATTTTTTTTTGGG
Tgdh-F	gcattcaaccATTACCCCGCCTCTCTCACATTC
		Tgdh-R	gctatgaccatgattacgccTTGCATGTGGGCAAGCTCGC

1.3抗性基因元件的克隆

1)Hgr、G418和BLM抗性基因的克隆

遗传霉素(G418)抗性基因的获得是以质粒pUG6(EUROSCARF赠送)作为基本骨架，其自身携带遗传霉素(G418)抗性基因。

潮霉素(Hgr)抗性筛选标记基因的获得是以质粒pAG32(EUROSCARF赠送)为模板，以表4中记载的作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，25ul反应体系，PCR扩增潮霉素(Hgr)抗性筛选标记基因。

博莱霉素(BLM)抗性筛选标记基因的获得是以质粒pSH65(EUROSCARF赠送)为模板，以表4中记载的作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，25ul反应体系，PCR扩增博莱霉素(BLM)抗性筛选标记基因。

表4.抗性基因引物序列

2)CHX抗性基因的合成

放线菌酮(CHX)抗性筛选标记基因由生工生物工程(上海)有限公司通过DNA合成获得(参考:Kim IG,Nam SK,Sohn JH et al.Cloning of theRibosomal Protein L41Gene of Phaffia rhodozyma and Its Use as a DrugResistance Marker for Transformation.Appl Environ Microbiol,1998,64:1947-1949.)。

1.4DNA同源重组片段的克隆

采用玻璃珠破碎法提取红发夫酵母的基因组DNA，以获得基因组DNA为模板，分别以表5中记载的作为引物序列，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，25ul反应体系，PCR扩增分别得到同源重组片段rDNA、CYP61和DHS3。

表5、同源重组片段引物序列

引物名称	引物序列
		DHS3-F	GAGCCGATTGAGGTTGTTTG
DHS3-R	CAATCCGTCGTCAAGATCGTC
		CYPUP-F	acgatttaggtgacactataCTTCTCAACACGTACCAGC
CYPUP-R	attaagggttgtcgacctgcGGAACACACTGAATGCGC
		CYPDN-F	gagctccagcCGGACAAGTACTGGCTCATC
CYPDN-R	tatcgaaattaatacgactcCGGCACGGTGTAGTCAGA
		rDNA1-F	taatttcgatCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATC
rDNA1-R	aatgcaggttaacctggcttcccgggTGCTTTCGATATCCTATGGC
		rDNA2-F	cagctgaagcttcgtacgctcccgggTAGGTGAACCTGCGGAAGGA
rDNA2-R	gttgtcgacctgcGTTCAGCGGGTAGTCCTACC

1.5质粒的组装构建

所有质粒的构建以质粒pUG6(EUROSCARF赠送)为基本骨架，表1-7中记载序列为引物，采用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，25ul反应体系，PCR扩增质粒基本骨架片段、目的基因、启动子、终止子、抗性基因、同源片段，应用Gibson Assembly方法和试剂盒(New England Biolabs)将pUG6质粒骨架与目的基因、启动子、终止子、抗性基因和同源片段组装成完整质粒(参见表6)。每个质粒包含一种抗性基因、一种同源片段、一至三个目的基因，每个目的基因带有一个启动子和一个终止子。

以构建pCrtS质粒为例：(引物可根据表1-7确认)

1)以质粒pUG6(EUROSCARF赠送)为基本骨架，分别以pUG6和红发夫酵母基因组DNA为模板，以表7所记载的pUG6-F/R、TEF1-F/R和GPD-F/R为引物，PCR扩增质粒骨架片段、TEF启动子片段和GPD终止子片段，将三个DNA片段应用Gibson Assembly方法组装在一起，获得质粒pUG6-P_TEF-T_GPD。DNA片段浓度控制在100-200ng每个反应，反应体系为20微升，装配条件为50℃，1小时。反应结束后，取2微升转化DH5α感受态细胞，阳性克隆由菌落PCR和DNA测序验证筛选获得。

2)分别以pUG6-P_TEF-T_GPD和红发夫酵母基因组DNA为模板，以表7所记载的pTG-F/R和CrtS2-F/R为引物，PCR扩增带有启动子和终止子的质粒骨架片段和CrtS基因，将两个DNA片段应用Gibson Assembly方法组装在一起，得到质粒pUG6-PT-CrtS。

3)分别以质粒pUG6和红发夫酵母基因组DNA为模板，以表7所记载的pCre2-F/R和CYPUP-NF/NR为引物，PCR扩增质粒骨架和CYP61上游同源臂，应用Gibson Assembly方法组装在一起，获得质粒pUG6-CYP61UP。

4)分别以质粒pUG6-CYP61UP、pSH47(EUROSCARF赠送)和红发夫酵母基因组DNA为模板，以表7所记载的pCYP-F/R、CREN-F/R和CYPDN-NF/NR为引物，PCR扩增质粒骨架、Cre酶基因和CYP61下游同源臂，应用GibsonAssembly方法组装在一起，获得质粒pUG6-CYP61UP-CYP61ND，记为pUG6-CYP61。

5)分别以质粒pUG6-CYP61和pUG6-PT-CrtS为模板，以表7所记载的pCYP2-F/R和CrtS-setF/setR为引物，PCR扩增pUG6-CYP61质粒骨架和带有启动子终止子的CrtS基因，应用Gibson Assembly方法组装在一起，获得质粒pUG6-CYP61-PT-CrtS，记为pCrtS。

表6所记载质粒的构建与pCrtS质粒的组装类似，即应用GibsonAssembly方法将目的基因、启动子、终止子、同源片段和抗性基因整合到一个质粒上。

表6、质粒描述

质粒名称	特征	整合位点
			pCrtS	CrtS,Hgr	CYP61
pStH	CrtS,tHMGR,Hgr	CYP61
			pSR	CrtS,CrtR,Hgr	CYP61
pCrtE	CrtE,G418	rDNA
			pEYB	CrtE,CrtYB,G418	rDNA
pKA	PHK,PTA,BLM	DHS
			pA3	ADH2,ALD6,ACS,BLM	DHS
pPDH	LpdA,AceE,AceF,BLM	DHS

表7.构建质粒pCrtS的引物序列

实施例2、红发夫酵母工程菌的构建

2.1表达盒的获得

以表6所记载的质粒pCrtS为模板，以表7记载的CYPUP-NF和CYPDN-NR为引物，应用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增CrtS-Hgr-CYP61表达盒。

以表6所记载的质粒pCrtE为模板，以表5记载的rDNA1-F和rDNA2-R为引物，应用KAPA HiFi高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增CrtE-G418-rDNA表达盒。

应用SmaI分别酶切表6所记载的质粒pStH和pSR，获得表达盒CrtS-tHMGR-Hgr-CYP61或CrtS-CrtR-Hgr-CYP61。

应用AflII分别酶切表6所记载的质粒pCrtE、pEYB、pKA、pA3和pPDH，获得表达盒CrtE-G418-rDNA、CrtE-CrtYB-G418-rDNA或PHK-PTA-BLM-DHS或ADH2-ALD6-ACS-BLM-DHS或LpdA-AceE-AceF-BLM-DHS。

2.2红发夫酵母转化

(1)培养。从YPD平板培养基上挑取菌株CBS 6938(可从荷兰CBS或德国DSMZ等保藏机构获得)单菌落，接种于含30ml YPD的250ml摇瓶(YPD成分为葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、)，22℃培养48h。将上述培养的菌液接种于含40ml YPD的250ml摇瓶中，至终浓度为OD600＝0.02，而后于22℃培养至OD600为1.2，约需14-20h。

(2)感受态制备。将培养液离心，用磷酸钾缓冲液(50mM,pH 7.0)重悬，加入DTT，终浓度为25mM，处理15min。然后，4℃离心，用冰冷的蔗糖缓冲液STM(270mM sucrose,10mM Tris-HCl,pH 7.5,and 1mM MgCl₂)洗涤两次，洗涤后细胞重悬于0.1ml STM缓冲液，备用。

(3)转化。取60μl上述获得感受态细胞，加入10μg基因表达盒DNA，分别为CrtE-G418-rDNA或CrtS-tHMGR-Hgr-CYP61或CrtS-CrtR-Hgr-CYP61或CrtE-G418-rDNA或CrtE-CrtYB-G418-rDNA或PHK-PTA-BLM-DHS或ADH2-ALD6-ACS-BLM-DHS或LpdA-AceE-AceF-BLM-DHS，电转化，条件为1000Ω,800V,25μF。转化液用600μl冰冷(约0℃)的YPD重悬，22℃孵育2.5h，取100μl涂布于筛选平板。筛选平板的抗性浓度分别为G418200μg/ml、Hgr 150μg/ml、BLM 200μg/ml、CHX 6μg/ml。

2.3工程菌株

从筛选平板上挑取单菌落，利用PCR验证转化结果，筛选阳性转化子。利用YM液体培养基(YM液体培养基成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L)，通过摇瓶培养进一步筛选转化子，获得工程菌株XD2-1、XD2-2、XD2-3、XD4和SXD。

菌株XD2-1由上述可知其是经转化由质粒pStH来源的表达盒CrtS-tHMGR-Hgr-CYP61而获得，即过量表达基因CrtS，表达外源基因tHMGR，并且敲除CYP61基因。菌株XD2-2由上述可知其是经转化由质粒pSR来源的表达盒CrtS-CrtR-Hgr-CYP61而获得，即过量表达基因CrtS和CrtR，并且敲除CYP61基因。

菌株XD2-3由上述可知其是经转化由质粒pEYB来源的表达盒CrtE-CrtYB-G418-rDNA而获得，即过量表达基因CrtE和CrtYB，基因组整合位点为rDNA。

菌株XD4由上述可知其是经转化由质粒pSR和pEYB来源的表达盒CrtS-CrtR-Hgr-CYP61和CrtE-CrtYB-G418-rDNA而获得，即过量表达基因CrtS、CrtR、CrtE、CrtYB，表达外源基因tHMGR，并且敲除CYP61基因。

菌株SXD在XD4基础上，经转化由质粒pPDH来源的表达盒LpdA-AceE-AceF-BLM-DHS而获得，在菌株XD4的基础上额外表达外源基因LpdA、AceE和AceF(图1)。

实施例3、工程菌株培养产虾青素

3.1菌种摇瓶培养

在YM固体平板上分别活化菌株CBS 6938、XD4和SXD，22℃培养4天。挑取单菌落分别接种于装有20ml CNM培养基的250ml摇瓶，22℃培养48h，作为种子培养液。而后将获得的各种子液按照8％的接种量，将种子培养液分别接种于含30ml CNM培养基的250ml摇瓶，22℃培养3天，然后18℃培养3天，待用。

其中，CNM培养基的组成为葡萄糖40g/L，蛋白胨3g/L，酵母提取物1.5g/L，玉米浆1g/L，(NH₄)₂SO₄0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L,KH₂PO₄1.5g/L,K₂HPO₄0.3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，生物素1mg/L，大豆油2ml/L。

3.2菌种发酵罐培养(以菌株SXD为例)

将上述获得的菌株SXD活化后种子液，在5L发酵罐中加入3L培养基CNMB，发酵控制溶氧在35％左右。发酵过程中补加浓度为40％的葡萄糖，使发酵罐中还原糖浓度在3％至4％，直到发酵结束。前3天控制温度为22℃，然后18℃培养3天。

其中，CNMB培养基是在CNM培养基基础上添加甘油0.1g/L、CuSO₄·5H₂O0.05g/L、NaCl 0.2g/L、泛酸钙5mg/L、硫胺素0.5mg/L。接种量为10％。

3.3虾青素的提取

取上述获得的5ml培养液，离心，用体积比为1:1的水和丙酮的混合液洗菌体培养液两次，放置或氮吹至溶剂挥发。加入1ml玻璃珠和2ml DMSO，60℃处理15min。漩涡振动细胞，充分破壁。然后，依次加入丙酮、石油醚和20％NaCl各2ml，振荡，离心使溶液分层，虾青素等类胡萝卜素位于石油醚层。吸取色素，真空冻干，待HPLC分析用。

3.4虾青素的测定

总类胡萝卜素的含量通过分光光度法在A₄₇₄纳米下测定，消光系数为1％＝2100。虾青素含量应用HPLC方法测定，使用Agilent XD-C18反相柱，洗脱缓冲液为乙腈：甲醇＝85:15。

在洗脱缓冲液为乙腈：甲醇＝85∶15条件下，HPLC检测的虾青素出峰时间为2.483min(图2)。在摇瓶培养条件下，菌株CBS6938、XD2-1、XD2-2、XD2-3、XD4和SXD的虾青素含量分别为0.15mg/g、1.1mg/g、0.95mg/g、0.83mg/g、2.9mg/g和4.4mg/g(细胞干重)(图3)。六株菌摇瓶批次培养的生物量相差不大，在17g/L至20g/L之间。在发酵罐培养条件下，菌株SXD的最大虾青素含量为7.1mg/g(细胞干重)，最大生物量为83.8g/L。

Claims

1.一种高产虾青素红酵母工程菌，其特征在于：红酵母工程菌为红发夫酵母菌株SXD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10519，保藏日期为2015年2月4日。

2.一种权利要求1所述的高产虾青素红酵母工程菌的构建方法，其特征在于：以红发夫酵母CBS 6938菌株作为宿主，通过代谢工程方式，将提高红发夫酵母乙酰辅酶A合成、降低甾体类物质合成以及提高虾青素合成途径代谢通量的基因元件表达盒转化宿主，进而获得高产虾青素红酵母工程菌。

3.按权利要求2所述的高产虾青素红酵母工程菌的构建方法，其特征在于：通过代谢工程方式，在宿主CBS 6938中过量表达红发夫酵母虾青素合成酶基因CrtS、细胞色素P450还原酶基因CrtR、GGPP合成酶基因CrtE和茄红素合成酶基因CrtYB；同时表达酿酒酵母HMG-CoA还原酶基因HMGR，并且敲除红发夫酵母C22-甾醇去饱和酶基因CYP61，表达细菌丙酮酸脱氢酶基因LpdA、AceE和AceF基因，进而获得高产虾青素红酵母工程菌。

4.按权利要求2或3所述的高产虾青素红酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述高产虾青素红酵母工程菌基因的整合位点为红发夫酵母基因组rDNA、CYP61或/和DHS3位点。

5.按权利要求2或3所述的高产虾青素红酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述高产虾青素红酵母工程菌的启动子和终止子分别为红发夫酵母基因ADH4、TPI、ACT、TEF1、GPD、GDH或ACT中任意的启动子和终止子。

6.按权利要求2或3所述的高产虾青素红酵母工程菌的构建方法，其特征在于：所述高产虾青素红酵母工程菌的抗性筛选标记为遗传霉素(G418)、潮霉素(Hgr)、放线菌酮(CHX)、博莱霉素(BLM)中的一种或几种的组合。