CN115176024A

CN115176024A - 红发夫酵母的虾青素高产菌株

Info

Publication number: CN115176024A
Application number: CN202080066969.2A
Authority: CN
Inventors: 帕斯·谢梅什; 特扎夫拉·科恩; 雅艾尔·利夫希茨; 马里纳·胡托里安; 亚尼夫·哈拉里
Original assignee: Nextferm Technologies Ltd
Current assignee: Nextferm Technologies Ltd
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-10-11
Also published as: KR20220063159A; AU2020320436A1; CA3148418A1; IL290098A; EP4004225A1; US20220290119A1; MX2022001091A; WO2021019409A1

Abstract

本发明涉及红发夫酵母的新型酵母菌株，该酵母菌株产生大量的类胡萝卜素，特别是大量的虾青素。这些新型菌株能够在浓度增加的碳源的存在下产生增加量的类胡萝卜素。

Description

红发夫酵母的虾青素高产菌株

技术领域

本发明涉及红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的新型酵母菌株，该酵母菌株产生大量的类胡萝卜素，特别是大量的虾青素。这些新型菌株在浓度增加的碳源的存在下能够产生增加量的类胡萝卜素。

背景技术

虾青素(3,3′-二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮)是一种发现于某些海洋植物、甲壳类动物、鱼类和酵母中的天然存在的脂溶性红色含氧类胡萝卜素色素。在商业水产养殖中，虾青素经常被添加到鲑鱼和甲壳类动物的饮食中，以为它们的肉赋予本地物种中发现的独特粉红色。赋予这种独特粉红色被认为对于鼓励消费者接受通过水产养殖生产的鲑鱼和甲壳类动物是非常重要的。

虾青素的平面结构如下所示：

虾青素的特征在于其结构中存在氧分子。虾青素分子具有位于β-紫罗兰酮环的3,3'位置处的两个不对称碳原子，其中分子任一端上有一个羟基基团(-OH)。虾青素由两端上的羟基和酮基部分组成。其亲脂性和亲水性允许其以细胞膜的磷脂双层排列[Yang 2013,JHum Nutr Food Sci1:1003,Ambati 2014,Mar Drugs.2014年1月；12(1)]。红色色素颜色是由化合物中心处的共轭双键导致。这种类型的共轭双键通过提供电子并与自由基反应以将其转化为更稳定的产物以及终止多种活生物体中的自由基链式反应，作为强抗氧化剂起作用。

虾青素已被广泛研究并已证明它具有许多临床健康益处，例如抗氧化、抗炎、抗糖尿病、运动营养(减轻对耐力、运动表现和热应激的影响)、预防CVD，以及促进大脑、眼睛和皮肤健康[Yang 2013,J Hum Nutr Food Sci 1:1003；Ambati 2014,Mar Drugs.2014年1月；12(1)]。虾青素的抗氧化活性已在多项研究中得到证实，并且据报道，它的自由基抗氧化活性比维生素E和β-胡萝卜素强几倍(Kurashge等人,1990,Shimidzu等人,1996)。虾青素的抗氧化特性被认为在其他几个特性中起着关键作用，所述特性例如防止UV光氧化、癌症、幽门螺杆菌感染、衰老和与年龄有关的疾病，以及促进免疫反应，以及肝脏、心脏、关节和前列腺健康(Guerin,Huntley和Olaizola,2003)。

虾青素来源对于水产养殖业来说需求大，尤其是虾青素是一种昂贵的饲料成分，并且可供人类食用。用于工业用途的虾青素的天然来源是微藻(雨生红球藻)、酵母红发夫酵母和海洋细菌产胡萝卜素副球菌。近年来，水产养殖业不断扩大并且大西洋鲑鱼的产量也已增加。由于养殖的鲑鱼、鳟鱼和甲壳类动物没有以诸如虾和磷虾等天然虾青素来源的稳定饮食喂养，它们的虾青素消耗必须源自所消耗的饲料。如果没有在它们的饮食中添加虾青素，农场养殖的鲑鱼就是白色的，而不是橙粉色。合成虾青素是世界范围内水产养殖业使用的主要类胡萝卜素。合成虾青素分别由异构体(3S,3S)、(3R,3S)和(3R,3R)的1:2:1混合物组成。然而，消费者对不使用合成色素的天然食品的不断增长的需求是改善从生物来源而非合成来源生产虾青素的主要尝试的潜在推动力。发夫酵母已被证明是虾青素的可靠来源，但现有的解决方案极其昂贵。

酵母红发夫酵母由Herman J.Phaff于1960年代后期从俄罗斯、智利、芬兰、日本和美国等较冷地区的白桦树粘液中首次分离出。这种酵母通过出芽进行无性繁殖，后来红发夫酵母的有性状态被定义并名为Xanthophyllomyces dendrorhous(XDEN)。酵母红发夫酵母是担子菌起源的。用于鉴定红发夫酵母为担子菌的标准包括其合成类胡萝卜素(其中虾青素是主要成分)的能力；其多层细胞壁结构和芽形成方式及其发酵多种糖的能力；任何其他产生类胡萝卜素的酵母都不具备的特性。

红发夫酵母的野生型菌株产生低水平的虾青素，通常为酵母干质量的百万分之100至300(ppm)，因此它们不是实用或经济的来源(Torrissen,Hardy和Shearer,1989)。红发夫酵母的突变菌株已被描述为能够在某些生长条件(例如生长培养基中的低葡萄糖水平)下产生高水平的虾青素；参见例如，US5356809,US5922560,Barredo 2012,An等人1989,Jeong-Hwan 2004,以及Baeza 2010。每克酵母干质量中具有超过5000μg虾青素的虾青素高产红发夫酵母菌株可以通过野生型菌株的诱变获得。然而，由于食品、营养和健康行业对虾青素的需求不断增加，因此需要在一系列生长条件下，特别是在变化量或较高量的碳源的存在下，以及当酵母在高生物质浓度下培养时，产生甚至更高水平的虾青素的另外的红发夫酵母菌株。本发明的新型红发夫酵母菌株满足了这些需求，并且产生了非常高水平的虾青素并且适合于工业规模发酵。

发明内容

本发明提供了虾青素高产菌株，其产生异常高水平的类胡萝卜素，例如虾青素。值得注意的是，这些菌株能够在1-10％碳源的存在下产生增加量的类胡萝卜素，这使得它们特别适合于其中通常会发生碳源浓度波动的工业规模发酵。这种菌株因此可以提供类胡萝卜素生产，特别是虾青素生产的增加的效率和增加的产率。因此，本发明的菌株可应用于类胡萝卜素，特别是虾青素的工业生产，既用于水产养殖业又用于人类消费。

因此，本发明提供了红发夫酵母的酵母菌株，其中酵母菌株的特征尤其在于与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它们能够产生更大量的类胡萝卜素。

具体实施方式

定义

术语“NCYC”代表“国家酵母培养物保藏中心”，其是根据布达佩斯条约接受用于专利目的的酵母菌株保藏的国际保藏机构。

术语“CBS”代表“Centraalbureau voor Schimmelcultures”，其是根据布达佩斯条约接受用于专利目的酵母菌株保藏的国际保藏机构。

如本文所用，类胡萝卜素(例如虾青素)的量表示为每干酵母质量的类胡萝卜素质量，例如：μg虾青素/g干酵母或干质量(d.m.)。

如本文所用，类胡萝卜素(例如虾青素)的产率“Y”可称为Y_P/S比，其中P是产量并且S是碳源，如下：

Y_P/S＝类胡萝卜素(例如虾青素)产量，单位为mg/g碳源

Y_P/S＝P_f/(S₀–S_f)

P_f＝类胡萝卜素产量(mg/L)

S₀＝生长开始时的碳源(g/L)

S_f＝生长结束时的碳源(g/L)

类胡萝卜素的总量在本文中简称为“TC”。

根据本发明的“碳源”可以是单糖、二糖、三糖或寡糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、木糖、玉米糖浆、甘油、琥珀酸盐、丙酮酸盐或其组合。优选地，碳源是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、木糖或其组合。

如本文所用，“酵母生长培养基”是酸性pH的选择性生长培养基，其允许酵母生长，同时阻止细菌和其他酸不耐受生物的生长。这种培养基的示例是酵母和霉菌“YM”培养基，它是本领域已知的标准酵母琼脂/肉汤。这种培养基通常包含碳源、氮源和盐，并且它可以包含蛋白胨(蛋白质部分水解形成的多肽和氨基酸的水溶性混合物)、微量元素和酵母提取物。示例性YM培养基组合物可以包含酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L、蛋白胨5g/L和碳源10至50g/L。

如本文所用，碳源的百分比是重量/体积。

如本文所用，术语“v/v”是指体积/体积，并且术语“w/w”是指重量/重量。

如本文所用，“突变”可包含蛋白质编码序列中核苷酸的缺失、核苷酸的替换或核苷酸的插入(其可导致框移)。

如本文所用，“点突变”是在核苷酸序列中，例如在蛋白质编码序列中、内含子序列中或上游/下游序列区域中，一个核苷酸被替换为另一个核苷酸。

红发夫酵母菌株

本发明提供了红发夫酵母的酵母菌株，其中该酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素。例如，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含约3％(w/v)至约10％(w/v),或约3％(w/v)至约8％(w/v),或约3％(w/v)至约5％(w/v),或约3.5％(w/v),或约4％(w/v),或约4.5％(w/v),或约5％(w/v),或约6％(w/v),或约7％(w/v),或约8％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，该酵母菌株能够产生更大量的类胡萝卜素。

优选地，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含约3％(w/v)至约8％(w/v),或约3％(w/v)至约5％(w/v),或约3.5％(w/v),约4％(w/v),约4.5％(w/v)或约5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，本发明的酵母菌株能够产生更大量的类胡萝卜素。

本发明的酵母菌株可包含基因组，该基因组包含以下定义的i)至vi)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种：

i)在基因XDEN_04715上游区域处，支架69中位置2028187处的点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:5中提及的点突变)；

ii)在基因XDEN_05955处支架79中的位置1540450处的点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:4中提及的点突变)；

iii)在基因XDEN_00738上游，在支架242中的位置318703和318738处的两点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:1中提及的点突变)；

iv)在基因XDEN_06229下游，在支架88中的位置855和1020处的两点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:2中提及的点突变)；

v)位于基因XDEN_00195处，在支架162中紧挨位置213879之后的两个碱基的缺失(例如，根据表20在SEQ ID NO:3中提及的突变)；以及

vi)在基因XDEN_01573处，在支架24中的位置84078和84206处的两点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:6中提及的点突变)。

在一些实施方案中，基因组包含如i)至vi)中定义的所有突变。

点突变可以存在于所述基因的至少一种、至少两种或所有等位基因中。优选地，点突变存在于所述基因的所有等位基因中。

在优选的实施方案中，本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含在名为crtE的基因XDEN_05955处，在支架79中的位置1540450处的点突变。优选地，支架79中的位置1540450处的点突变是G到A(鸟嘌呤到腺嘌呤)的变化，导致在由crtE编码的蛋白质中(被编码在互补反向链上的基因XDEN_05955处)的脯氨酸到丝氨酸的氨基酸交换(密码子CCG→TCG碱基取代)。

在一些实施方案中，支架79中名为crtE的基因XDEN_05955处的点突变导致crtE功能的改变。crtE(也称为香叶基香叶基焦磷酸酯合成酶)的功能可以例如通过量化红发夫酵母提取物中香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的量来测量。

在优选的实施方案中，本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含在名为erg20的基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变。优选地，在基因XDEN_04715(名为erg20)的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变是G到A(鸟嘌呤到腺嘌呤)的变化。

在一些实施方案中，在名为erg20的基因XDEN_04715处的支架69中的点突变导致erg20功能的改变。erg20(也称为法呢基焦磷酸酯合酶)的功能可以例如通过在细胞培养物中(例如在酵母或大肠杆菌中)过表达突变基因、从转化的细胞中分离蛋白质提取物以及用所述蛋白质提取物进行法呢基焦磷酸酯合酶活性体外测定来测量。野生型erg20的过表达可用作阳性对照，而非转化或非诱导培养物可用作阴性对照。

在优选的实施方案中，本发明的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在名为crtE的基因XDEN_05955处，在支架79中的位置1540450处的点突变，以及在名为erg20的基因XDEN_04715的上游区域中在支架69中的位置2028187处的点突变。

erg20和crtE是参与类胡萝卜素生物合成的基因。ERG20蛋白质(法呢基焦磷酸酯合酶)负责DMAPP和IPP的缩合以形成香叶基-二磷酸酯(香叶基-PP)。此外，ERG20还催化将第二IPP分子添加到香叶基-PP中，产生法尼基-二磷酸酯(FPP)。然后FPP通过GGDP合酶(crtE编码的蛋白质)转化为香叶基香叶基-二磷酸酯(GGPP)。然后，该GGPP中间体通过八氢番茄红素合酶(CrtB)缩合为八氢番茄红素。DMAPP、IPP、FPP、GGPP都是β-胡萝卜素的前体。然而，本发明首次确定erg20和crtE基因中的特定突变使得与在包含较低[例如，1％(w/v)]浓度的碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含更高[例如，至少3％(w/v)]浓度的碳源的酵母生长培养基中培养时，红发夫酵母这个酵母能够产生更大量的类胡萝卜素。

本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_00738上游，在支架242中的位置318703和318738处的两点突变。

本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_06229下游，在支架88中的位置855和1020处的两点突变。

本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_00195处，在支架162中紧挨位置213879之后的两个碱基的缺失。

本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_01573处，在支架24中的位置84078和84206处的两点突变。尽管位置84078中的突变被定义为内含子突变，但位置84206中的突变是一种外显子突变，其导致被编码在互补反向链上的基因XDEN_01573中的组氨酸到酪氨酸的氨基酸600取代(密码子CAT→TAT碱基取代)。

本发明还提供了红发夫酵母的酵母菌株，其中该酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素，其中本发明的酵母菌株包含基因组，该基因组包含：

i)在基因XDEN_04715(名为erg20)的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变，和/或

ii)在基因XDEN_05955(名为crtE)处在支架79中的位置1540450处的点突变。

在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变可以是例如根据表20在SEQ ID NO:4中提及的点突变。优选地，在支架79中的位置1540450处的点突变是G到A(鸟嘌呤到腺嘌呤)的变化，导致由crtE编码的蛋白质中(在被编码在互补反向链上的基因XDEN_05955处)的脯氨酸到丝氨酸的氨基酸交换(密码子CCG→TCG碱基取代)。

在基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变可以是例如根据表20在SEQ ID NO:5中提及的点突变。优选地，在基因XDEN_04715(名为erg20)的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变是G到A(鸟嘌呤到腺嘌呤)的变化。

本发明的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含：

ii)在基因XDEN_05955(名为crtE)处在支架79中的位置1540450处的点突变；

并且可以进一步包括以下定义的iii)至vi)中的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种：

v)位于基因XDEN_00195处，在支架162中紧挨位置213879之后的两个碱基的缺失(例如，根据表20在SEQ ID NO:3中提及的突变)；和/或

SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列提供于实施例12的表20和随附的序列表中。可以通过现有技术的分子DNA技术，例如聚合酶链式反应(PCR)，从本发明的任何红发夫酵母菌株扩增所述核苷酸序列。Gardner&Jaspersen,Methods Mol Biol.2014；1205中描述了用于操作酵母基因组的方法，包括通过PCR进行的缺失、插入、突变和标记。Toulmay&Schneiter,Yeast,2006Aug；23(11)中描述了将单个或多个定义的点突变引入到酵母的基因组中的另一示例性方法。

SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的核苷酸序列可以使用合适的引物通过PCR扩增来鉴定。例如，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物可用于鉴定SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的引物可用于鉴定SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物可用于鉴定SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物可用于鉴定SEQ ID NO:4，SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16的引物可用于鉴定SEQ ID NO:5，以及SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物可用于鉴定SEQ ID NO:6。引物序列提供于实施例12的表20和随附的序列表中。

在一些实施方案中，本发明的酵母菌株的基因组包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核苷酸序列的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种。

本发明的酵母菌株的特征可以在于它可从选自以下的红发夫酵母菌株获得：

AF-02(保藏NCYC 4294),

AF-03(保藏NCYC 4337),

AF-04(保藏NCYC 4336),

AF-05(保藏NCYC 4345),

AF-06(保藏NCYC 4344),

AF-07(保藏CBS 146150),

AF-08(保藏NCYC 4389),

AF-09(保藏NCYC 4388),

AF-10(保藏NCYC 4406),以及

AF-11(保藏NCYC 4405)。

在一些实施方案中，本发明的酵母菌株是选自以下的红发夫酵母菌株：

AF-02(保藏NCYC 4294),

AF-03(保藏NCYC 4337),

AF-04(保藏NCYC 4336),

AF-05(保藏NCYC 4345),

AF-06(保藏NCYC 4344),

AF-07(保藏CBS 146150),

AF-08(保藏NCYC 4389),

AF-09(保藏NCYC 4388),

AF-10(保藏NCYC 4406),以及

AF-11(保藏NCYC 4405)。

本发明的优选酵母菌株是可获自以下的酵母菌株：AF-03(保藏NCYC 4337),AF-04(保藏NCYC 4336),AF-05(保藏NCYC 4345),AF-06(保藏NCYC 4344),AF-07(保藏CBS146150),AF-08(保藏NCYC 4389),AF-09(保藏NCYC 4388),AF-10(保藏NCYC 4406),或AF-11(保藏NCYC4405)。本发明的特别优选的酵母菌株是以下酵母菌株：AF-03(保藏NCYC4337),AF-04(保藏NCYC 4336),AF-05(保藏NCYC 4345),AF-06(保藏NCYC 4344),AF-07(保藏CBS 146150),AF-08(保藏NCYC 4389),AF-09(保藏NCYC 4388),AF-10(保藏NCYC4406),或AF-11(保藏NCYC 4405)。

可获自AF-03(保藏NCYC 4337),AF-04(保藏NCYC 4336),AF-05(保藏NCYC 4345),AF-06(保藏NCYC 4344),AF-07(保藏CBS 146150),AF-08(保藏NCYC 4389),AF-09(保藏NCYC 4388),AF-10(保藏NCYC4406),或AF-11(保藏NCYC 4405)的根据本发明的酵母菌株可以例如通过诱变(如下文“获得酵母菌株的方法”中所述)或通过菌株内育种获得。育种可以是例如孢子与孢子或孢子与细胞或细胞与细胞的杂交。优选地，在菌株内育种(例如杂交)之后，针对与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含例如3％(w/v)或4％(w/v)或5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，能够产生更多量的类胡萝卜素的菌株进行一轮或多轮选择。

在一些实施方案中，本发明的酵母菌株是或可获自AF-02(保藏NCYC 4294),AF-03(保藏NCYC 4337),AF-04(保藏NCYC 4336),AF-05(保藏NCYC 4345),AF-06(保藏NCYC4344),AF-07(保藏CBS 146150)AF-08(保藏NCYC 4389),以及AF-09(保藏NCYC 4388),AF-10(保藏NCYC4406),以及AF-11(保藏NCYC 4405)中的任何项，并且其包含基因组，该基因组包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,以及SEQ IDNO:6的核苷酸序列中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种。

在一些实施方案中，本发明的酵母菌株是或可获自AF-02(保藏NCYC 4294),AF-03(保藏NCYC 4337),AF-04(保藏NCYC 4336),AF-05(保藏NCYC 4345),AF-06(保藏NCYC4344),AF-07(保藏CBS 146150)AF-08(保藏NCYC 4389),以及AF-09(保藏NCYC 4388),AF-10(保藏NCYC4406),以及AF-11(保藏NCYC 4405)中的任何项，并且它包含基因组，该基因组包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,以及SEQ IDNO:6的核苷酸序列中的全部。

本发明的任何酵母菌株的特征可以在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源，例如约3％(w/v)至约10％(w/v),或约3％(w/v)至约8％(w/v),或约3％(w/v)至约5％(w/v),或约3.5％(w/v),约4％(w/v),约4.5％(w/v)或约5％(w/v),或约6％(w/v),或约7％(w/v),或约8％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素。

例如，本发明的酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.1倍的类胡萝卜素量。

优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.2倍的类胡萝卜素量。更优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.3倍的类胡萝卜素量。甚至更优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.5倍的类胡萝卜素量。

在一些实施方案中，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.1倍的类胡萝卜素量。优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.2倍的类胡萝卜素量。更优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.3倍的类胡萝卜素量。甚至更优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.5倍的类胡萝卜素量。

在一些实施方案中，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.2倍的类胡萝卜素产率，该产率通过Y_P/S(以mg/g碳源计的类胡萝卜素产量)测量。

优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.3倍的类胡萝卜素产率，该产率通过Y_P/S(以mg/g葡萄糖计的类胡萝卜素产量)测量。

更优选地，酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生至少1.8倍的类胡萝卜素产率，该产率通过Y_P/S(以mg/g葡萄糖计的类胡萝卜素产量)测量。

如本领域技术人员将理解的，本文提及的比较，例如，在1％(w/v)碳源中培养对比在3％(w/v)碳源中的培养，是在同一时间段内仅在碳源量方面不同的生长条件下类胡萝卜素产量的比较。例如，每种情况下酵母菌株的典型培养期为至少3天,至少4天,至少5天,至少6天,至少8天,至少10天,至少12天或至少13天,例如6天,6.5天,7天,7.5天,8天,8.5天,9天,9.5天,10天,10.5天,11天,11.5天,12天,12.5天,13天,13.5天,14天,14.5天或15天。

在较高浓度的碳源中类胡萝卜素(例如虾青素)的增加产量是本发明的菌株的显著且令人惊讶的效果，因为红发夫酵母通常在葡萄糖浓度低于2％时产生最大量的类胡萝卜素，这是红发夫酵母大规模生产的典型条件，如US5922560中所述。例如，常见的观察结果是，当葡萄糖浓度大于15g/L，即1.5％(w/v)葡萄糖时，类胡萝卜素的合成特别低。因此，本发明的酵母菌株能够产生大量的类胡萝卜素，尽管有碳源浓度的波动，该波动通常发生在发酵过程中，特别是在大规模发酵过程中。同样值得注意的是，在较高碳源浓度下会发生这种效果，同时酵母菌株会产生非常大量的类胡萝卜素，如实施例中所证实。不希望受理论束缚，据信本发明的菌株实现这些效果，而不受在高浓度葡萄糖的存在下介导类胡萝卜素产量抑制的途径的影响。例如，本文所述的产生高量类胡萝卜素的“AF”菌株能够在基于蔗糖的培养基中生长，并且还能够在厌氧条件下进行乙醇发酵，这表明“AF”菌株中的Snf1-Mig1葡萄糖传感途径不是该效果的基础。此外，本文所述的“AF”菌株在多种不同的碳源中保留了它们的高类胡萝卜素(因此，虾青素)产量，这强调了这种效果不需要Snf1-Mig1葡萄糖传感途径。因此，在一些实施方案中，本发明的菌株不依赖于在高浓度碳源(例如葡萄糖)的存在下对类胡萝卜素产率的去抑制。

在一些实施方案中，酵母菌株的特征在于在包含至少3％(w/v)碳源,例如约3％(w/v)至约10％(w/v)碳源,或约3％(w/v)至约5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天，或例如7.5天时，它能够产生至少7500μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。优选地，酵母菌株的特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源,例如约3％(w/v)至约10％(w/v)碳源,或约3％(w/v)至约5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天，或例如7.5天时，它能够产生至少12000μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。更优选地，酵母菌株的特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源,例如约3％(w/v)至约10％(w/v)碳源,或约3％(w/v)至约5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天，或例如7.5天时，它能够产生至少18000μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。甚至更优选地，酵母菌株的特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源,例如约3％(w/v)至约10％(w/v)碳源,或约3％(w/v)至约5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天，或例如7.5天时，它能够产生至少35000μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。

本发明的酵母菌株的特征还可以在于，与培养6天相比，在培养7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天时，它能够积累增加类胡萝卜素总量，例如，与培养6天时相比，总类胡萝卜素量多于1.2倍，优选多于1.3倍，更优选多于1.4倍。

例如，本发明的酵母菌株的特征可以在于，在包含约3％(w/v)至约10％(w/v)碳源,或约3％(w/v)至约5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养第6天至第13天，它能够积累多于1.4倍的类胡萝卜素(例如虾青素)。

根据本发明的所有酵母菌株，产生的类胡萝卜素优选为产生的类胡萝卜素总量的至少50％(w/w)虾青素。

用于本发明的发夫菌株的大规模发酵的方法

本发明还提供了用于通过本发明的酵母菌株的大规模发酵来产生类胡萝卜素的方法。通常，该方法包括在合适体积的酵母生长培养基中培养该酵母菌株，然后在发酵罐中培养，以及在发酵结束时收获细胞团并提取类胡萝卜素(例如虾青素)。在大规模发酵过程中，在整个发酵过程中将碳源浓度优选保持较低，例如低于5g/L。

在典型的大规模发酵过程中，可以从培养皿中取出酵母菌株环并接种到包含补充有适量酵母提取物(例如15g/L)和碳源(例如10g/L)的培养基(例如，20ml)的烧瓶(例如，250ml)中。将烧瓶在合适的温度下搅动孵育一段时间(例如20℃ 24小时)以使酵母繁殖。随后，将该酵母悬浮液的一部分接种到包含酵母生长培养基(例如，500ml)的较大烧瓶(例如，5LErlenmeyer烧瓶)中。然后将该较大烧瓶在合适的温度下搅动孵育一段时间(例如20℃48至72小时)以使酵母繁殖。随后，将酵母悬浮液接种到包含酵母生长培养基的发酵罐(例如，7L或70L)中。合适的发酵开始条件是，例如：1v/v通气、300rpm搅动、％溶解氧(DO₂)40、20℃和pH 5至6。由于克勒勃屈利效应(Crabtree effect)，在现有技术的方法中，碳源(例如葡萄糖)溶液通常用于分批补料发酵，因为有必要在整个发酵过程中将碳源浓度保持低于5g/L[0.5％(w/v)]，优选低于2g/L[0.2％(w/v)]。可以例如使用氨来控制pH。溶解氧可以通过搅动和气流控制在40％到75％的饱和度之间。可根据需要添加消泡剂。实施例11提供了关于合适的发酵过程的进一步细节。在包含红发夫酵母细胞的发酵肉汤达到所需的细胞密度或类胡萝卜素/虾青素含量后，可以收获细胞团。

合适的小批量发酵和分批补料发酵方法的示例在US 5,922,560(其通过引用并入)中有描述。合适的发酵方法的其他示例在例如Yeast Strain Selection,编辑ChandraJ.Panchal,1990,第140页(其通过引用并入)，或在US4232045、US3617306A、EP 0 237427B2(其全部公开内容也通过引用并入)中有描述。

所有这些分批补料方法的缺点是碳源的量难以保持在恒定水平，并且它可能在补料步骤期间在发酵悬浮液中的短时间内显著增加，即高于约2％(w/v)，这引起强烈的克勒勃屈利效应，该效应导致产生大量不需要的发酵副产物，如乙醇和乙酸盐，从而造成生物量低，并大大减少类胡萝卜素和虾青素的合成。由于本发明的发夫菌株显著更耐受发酵培养基中较高量的碳源，因此这些菌株特别适合于大规模生产虾青素。此外，当使用本发明的发夫菌株时，所应用的碳源可以在类胡萝卜素，特别是虾青素的生产过程中更有效地使用。

本发明的菌株的用途

虾青素广泛用作营养补充剂、食品补充剂、饮料补充剂等膳食补充剂，以及用于食品着色剂等食品添加剂。虾青素还可用作产蛋鸡和猪饲料的饲料补充剂。由于其强大的抗氧化活性，虾青素对人体健康也有多重益处；例如在帕金森病、心血管疾病、炎症和皮肤健康方面；促进心脏病发作后的康复；并改善免疫系统的功能。因此，本发明还提供了本发明的菌株在生产包含虾青素的膳食或食品补充剂中的用途。

虾青素也用于美容行业。虾青素可以直接涂抹在皮肤上，它最大限度地减少UV伤害、空气污染影响和其他外部影响，并且它可以减缓衰老过程。因此，本发明还提供了本发明的菌株在生产包含虾青素的化妆品组合物中的用途。

虾青素还用于水产养殖，以为养殖鱼类，如鲑鱼、鳟鱼、螃蟹和虾提供野生鱼类偏红的肉色。它通常被纳入养殖鱼类(如鲑鱼和鳟鱼)的饮食(例如水产养殖饲料)中。因此，本发明还提供了本发明的菌株用于生产包含虾青素的色素的用途。该色素适用于给肉(优选鱼肉)上色。

在一个实施方案中，本发明提供了本发明的菌株在生产包含虾青素的产品中的用途。该产品可以是膳食补充剂、营养补充剂、食品补充剂、饮料补充剂、食品添加剂或饲料添加剂，如饲料着色剂；用于人类健康的药物组合物，例如用于治疗帕金森病、心血管疾病、促进心脏病发作后的康复或用于改善免疫系统功能的药物组合物；或化妆品组合物。

获得酵母菌株的方法

本发明还提供了一种获得类胡萝卜素高产红发夫酵母的酵母菌株的方法，该方法包括：

a)通过在诱变条件下孵育红发夫酵母的酵母菌株来诱导其突变，以及

b)选择其获得的类胡萝卜素高产酵母菌株，其中步骤b)中选择的所述类胡萝卜素高产酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源,例如约3％(w/v)至约10％(w/v),或约3％(w/v)至约8％(w/v),或约3％(w/v)至约5％(w/v),或约3.5％(w/v),或约4％(w/v),或约4.5％(w/v),或约5％(w/v),或约6％(w/v),或约7％(w/v),或约8％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素。

在一个实施方案中，在步骤b)中选择的所述类胡萝卜素高产酵母菌株是如本文如上定义的根据本发明的酵母菌株。

在一些实施方案中，选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在名为crtE的基因XDEN_05955的位置处在支架79中的位置1540450处的点突变。

在一些实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在名为erg20的基因XDEN_04715的上游区域中在支架69中的位置2028187处的点突变。

在一些实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_00738上游，在支架242中的位置318703和318738处的两点突变。

在一些实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_06229下游，在支架88中的位置855和1020处的两点突变。

在一些实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_00195处，在支架162中紧挨位置213879之后的两个碱基的缺失。

在一些实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在基因XDEN_01573处，在支架24中的位置84078和84206处的两点突变。尽管位置84078中的突变被定义为内含子突变，但位置84206中的突变是一种外显子突变，其导致被编码在互补反向链上的基因XDEN_01573中的组氨酸到酪氨酸的氨基酸600取代(密码子CAT→TAT碱基取代)。

在优选的实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含在名为crtE的基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变，以及在名为erg20的基因XDEN_04715的上游区域中在支架69中的位置2028187处的点突变。

在具体实施方案中，所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含以下定义的i)至vi)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种：

i)在基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:5中提及的点突变)；

ii)在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变(例如，根据表20在SEQ ID NO:4中提及的点突变)；

在一些实施方案中，选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含如i)至vi)中定义的突变中的全部。

b)选择其获得的类胡萝卜素高产酵母菌株，

其中步骤b)中选择的类胡萝卜素高产酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素；其中所选择的酵母菌株包含基因组，该基因组包含：

i)在基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变，和/或

ii)在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变；

优选地，步骤b)中选择的所述类胡萝卜素高产酵母菌株为根据权利要求1至8中任一项所述的酵母菌株。

在基因XDEN_05955处支架79中的位置1540450处的点突变可以是例如根据表20在SEQ ID NO:4中提及的点突变。优选地，在支架79中的位置1540450处的点突变是G到A(鸟嘌呤到腺嘌呤)的变化，导致在由crtE编码的蛋白质中(在被编码在互补反向链上的基因XDEN_05955处)的脯氨酸到丝氨酸的氨基酸交换(密码子CCG→TCG碱基取代)]。

在基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变可以是例如根据表20在SEQ ID NO:5中提及的点突变。

优选地，在基因XDEN_04715(名为erg20)的上游区域处，在支架69中的位置2028187处的点突变是G到A(鸟嘌呤到腺嘌呤)的变化。

所选择的酵母菌株可以包含基因组，该基因组包含：

世界各地的培养物保藏中心(例如ATCC、NCYC和CBS)保存着不同的红发夫酵母的野生型菌株的保藏品。诱变是导致酵母细胞遗传变化的过程，它通过增加DNA复制过程中的突变频率来增加酵母种群内的遗传变异。诱变可由物理剂，如紫外线(UV)辐射(非化学诱变)，或由化学分子，如甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和硫酸二乙酯(化学诱变)诱导。诱变通常是随机的。为获得虾青素高产菌株，可单独或联合使用非化学诱变和化学诱变。

根据典型的诱变方案(例如在EP0438182A1中)，将化学诱变剂添加到缓冲液中的细胞悬浮液中，并将小瓶在室温下在摇动或不摇动的情况下孵育一段时间，例如15分钟至2小时。暴露于诱变剂后，将细胞收集，稀释并接种到琼脂培养基板上。板的组成通常包含碳源(如葡萄糖、棉子糖或其他)、酵母提取物、蛋白胨和琼脂。通过玻璃珠或细胞散布器(Drigalskispatel)将细胞分布在板表面上。将接种板倒置并在例如20℃左右孵育长达10天。类似的培养程序可用于非化学诱变。

在每个诱变周期之后，筛选酵母突变体以获得所需的特性。例如，在每个诱变周期后，可以孵育酵母细胞，直到出现可通过视觉筛选轻松识别的改善的色素沉着。为了鉴定色素虾青素高产菌株，可以使用增强菌落之间颜色差异的选择性培养基和/或筛选剂。

对板进行目视筛选并挑选高色素沉着的菌落用于分离接种。将这些分离物进一步转移到具有生长培养基(通常包含碳源、蛋白胨和酵母提取物)的烧瓶(例如，250mlErlenmeyer烧瓶)中孵育一段时间(例如20℃左右孵育6-7天)，然后进行类胡萝卜素和虾青素总分析。US5922560中提供了诱变和筛选红发夫酵母的示例。

重要的是，该菌株尚未通过重组DNA技术进行修饰。因此，在一些实施方案中，本发明的菌株尚未通过重组DNA技术进行修饰。

具有类胡萝卜素和虾青素最高总水平的分离菌株用于重复诱变以获得这样的菌株，其显示非常高的虾青素浓度，并且与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时产生的类胡萝卜素的量相比，在包含至少3％(w/v)碳源,例如约3％(w/v)至约10％(w/v),或约3％(w/v)至约8％(w/v),或约3％(w/v)至约5％(w/v),或约3.5％(w/v),约4％(w/v),约4.5％(w/v)或约5％(w/v),或约6％(w/v),或约7％(w/v),或约8％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，其产生更大量的类胡萝卜素。在一些实施方案中，在3％(w/v)碳源中培养时产生的类胡萝卜素与在1％(w/v)碳源中培养时产生的类胡萝卜素的比率为至少1.1，优选地，其是至少1.2，并且更优选地，其是至少1.3。在一些实施方案中，在5％(w/v)碳源中培养时产生的类胡萝卜素与在1％(w/v)碳源中培养时产生的类胡萝卜素的比率为至少1.1，优选地，其是至少1.2，并且更优选地，其是至少1.3。

在一些实施方案中，通过该方法获得的酵母菌株的进一步特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天时，它能够产生至少7500μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。

优选地，通过该方法获得的酵母菌株的进一步特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天时，它能够产生至少12000μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。

更优选地，通过该方法获得的酵母菌株的进一步特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天时，它能够产生至少18000μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。

甚至更优选地，通过该方法获得的酵母菌株的进一步特征在于，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养至少7.5天时，它能够产生至少35000μg类胡萝卜素/g酵母干重量的量。

在一些实施方案中，通过该方法获得的酵母菌株的特征在于，与培养6天相比，在培养7天、8天、9天、10天、11天、12天或13天时，它能够积累增加类胡萝卜素总量，例如，与培养6天时相比，总类胡萝卜素量多于1.2倍，优选多于1.3倍，更优选多于1.4倍。

因此，本发明提供了通过本文提供的方法获得的类胡萝卜素高产酵母菌株。

类胡萝卜素提取与分析

本发明还提供由本发明的菌株产生的虾青素。在一些实施方案中，由本发明的菌株产生的虾青素以组合物的形式提供。

类胡萝卜素总分析广泛用于研究红发夫酵母高产菌株，并在诸如Sedmak等人,1990等文献中进行了描述。这种方案的示例如下。将细胞收集并(例如用去离子水)洗涤。任选地，可以通过酶促技术破坏细胞壁，例如，如先前在M.Michelon等人,2012中所述。简而言之，将沉淀的细胞与来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的裂解酶在0.2M醋酸钠缓冲液pH＝5.04中于55℃搅动孵育30分钟，然后离心，并将沉淀物用蒸馏水洗涤两次。将洗涤过的细胞干燥，重新悬浮在DMSO中(预热至55℃左右)。将管剧烈涡旋，随后加入磷酸盐缓冲液和有机溶剂。通过离心分离各相并除去有机相。可以将有机相的样品进一步用DMSO稀释并通过分光光度计在470-495nm处进行OD测量。类胡萝卜素总含量由470-495nm处的吸光度确定。

类胡萝卜素含量可以使用以下等式计算。

TC＝(A/E)x 10⁴x稀释系数

A是吸光度的值

E是消光系数

(消光系数E＝2150通过使用合成虾青素测定。)

对于虾青素提取和分析，将酵母细胞收集并用去离子水或乙酸钠缓冲液(0.2M，pH＝5.04)洗涤并通过离心沉淀。任选地，可以通过酶促技术破坏细胞壁，例如，如先前在M.Michelon等人,2012中所述。简而言之，将沉淀的细胞与来自哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的裂解酶在0.2M醋酸钠缓冲液pH＝5.04中于55℃搅动孵育30分钟。之后，离心细胞，并将沉淀物用蒸馏水洗涤两次。将洗涤过的细胞转移到容器中，沉淀并去除残留的水。将细胞沉淀物(例如用丙酮和玻璃珠)破坏，然后离心以沉淀细胞碎片和玻璃珠。

所得溶液中的虾青素水平可以通过正相HPLC与硅胶柱和己烷：丙酮(例如，86:14)流动相进行量化。为了计算虾青素浓度，可以使用合成虾青素的标准曲线。

实施例

实施例1：虾青素高产菌株的开发

使用诱变和选择重复循环的经典菌株改进方法从红发夫酵母的野生型菌株中获得虾青素高产红发夫酵母“AF”菌株AF-02(NCYC 4294),AF-03(NCYC 4337),AF-04(NCYC4336),AF-05(NCYC 4345),AF-06(NCYC 4344),AF-07(CBS 146150),AF-08(NCYC 4389),AF-09(NCYC4388),AF-10(NCYC 4406)和AF-11(NCYC 4405)。

实施例2：菌株描述：菌落形态

在标准YM琼脂板上培养6天和10天后观察新型菌株的菌落形态。结果总结在表1中。

表1：菌落形态

实施例3：在包含3％(w/v)碳源的培养基中生长的AF-红发夫酵母突变体的类胡萝卜素高产量

对于每个突变菌株，将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250mlErlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有3％(w/v)葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育48小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约2倍，将体积为800μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含20ml培养基(蛋白胨0.5％，酵母提取物0.3％，碳源3％，以及麦芽提取物0.3％)并在20℃下搅动孵育7.5天。测量了突变培养物的类胡萝卜素含量，结果总结在表2、3和4中。

表2：红发夫酵母菌株的类胡萝卜素含量

表3：红发夫酵母菌株的类胡萝卜素含量

表4：红发夫酵母菌株的类胡萝卜素含量

表2、3和4表明根据本发明的新型菌株产生高于7,500μgTC/g d.m.，甚至高于35,000μg TC/g d.m的极高类胡萝卜素水平。

实施例4：AF-红发夫酵母突变体中的虾青素产量

对于每个突变菌株，将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250mlErlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有3％(w/v)葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育48小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约2倍，将体积为800μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含20ml培养基(蛋白胨0.5％、1.5％葡萄糖、酵母提取物0.3％、棉子糖1.5％，以及麦芽提取物0.3％)并在20℃下搅动孵育7.5天。测量了突变培养物的类胡萝卜素含量，结果总结在表5中。

表5：红发夫酵母菌株的虾青素含量

菌株	虾青素(μg/g d.m.)
		AF-02	7858
AF-03	13510
		AF-04	15586
AF-05	14753
		AF-06	14065
AF-07	19817
		AF-08	28159
AF-09	35876
		AF-10	38646
AF-11	37845

表5表明根据本发明的菌株在YM培养基中培养7.5天后产生高于13500μg虾青素/gd.m.，甚至高于19000μg虾青素/g d.m.的高水平的虾青素。

实施例5：与在包含1％葡萄糖浓度的培养基中生长相比，在包含3％葡萄糖浓度的培养基中生长的新型AF红发夫酵母突变体产生了增加的类胡萝卜素产量

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)总含量。YM 3％(w/v)葡萄糖中的TC产量与YM 1％(w/v)葡萄糖中的TC产量的比率呈现在表6.1中。

表6.1：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的YM培养基中培养6天后TC水平的比率

表6.1表明与参考菌株NCYC 4245和ATCC 74220不同，根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]葡萄糖浓度的YM培养基中生长时产生更高水平的类胡萝卜素。与“AF”菌株不同，参考菌株NCYC 4245和ATCC 74220在基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69的位置2028187处包含G，并且它们在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处包含G。对于参考菌株ATCC 74220和NCYC 4245来说，在具有3％(w/v)葡萄糖的YM培养基中的类胡萝卜素产量与具有1％(w/v)葡萄糖的YM培养基中的类胡萝卜素产量相比的比率分别为0.63和0.80，即在较高的葡萄糖浓度下产生少得多的类胡萝卜素。相反，根据本发明的菌株的所述比率为至少1.1(参见例如AF-04)，并且对于一些菌株而言为至少1.3(参见例如AF-02、AF-03、AF-05和AF-07)而对于某些菌株而言为至少1.8(参见例如AF-06、AF-08、AF-09、AF-10和AF-11)。在上表6.1中，AF-09和AF-11分别显示出2.57和2.16的最高比率。除了高比率之外，AF-03至AF-11菌株在YM 3％(w/v)葡萄糖中培养后的类胡萝卜素总含量非常高。本发明的菌株的这些特征对于在通常在低至极低的葡萄糖浓度下培养(例如US5922560)的红发夫酵母中的类胡萝卜素产量来说是特殊的。

进行与上述相同的实验，不同之处在于测量虾青素含量。在YM 3％(w/v)葡萄糖中的虾青素产量与在YM 1％(w/v)葡萄糖中的虾青素产量之间的比率呈现在表6.2中。

表6.2：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的YM培养基中培养6天后虾青素水平的比率

表6.2表明，与参考菌株NCYC 4245不同，根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]葡萄糖浓度的YM培养基中时产生更高水平的虾青素。参考菌株NCYC4245在基因XDEN_04715的上游区域处，在支架69中的位置2028187处包含G，并且它们在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处包含G。根据本发明的菌株的比率为至少1.7(参见例如AF-05和AF-10)，对于某些菌株而言为至少2.1(参见例如AF-11)，对于某些菌株而言为至少2.4(参见例如AF-07和AF-09)。本发明菌株的这些特征对于在红发夫酵母中的虾青素产量来说是特殊的。

然后在YE培养基(包含4g/L酵母提取物和葡萄糖)而非YM培养基中进行类似的实验。

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动培养24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YE培养基(包含4g/L酵母提取物和葡萄糖的培养基)并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)或虾青素总含量。在YE 3％(w/v)葡萄糖中的TC产量与YE 1％(w/v)葡萄糖中的TC产量之间的比率呈现在表6.3中，并且在YE 3％(w/v)葡萄糖中的虾青素产量与在YE 1％(w/v)葡萄糖中的虾青素产量之间的比率呈现在表6.4中。

表6.3：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的YE培养基中培养6天后TC水平的比率

表6.4：红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的YE培养基中培养6天后虾青素水平的比率

表6.3和6.4表明使用YE培养基获得相同的效果。与参考菌株NCYC 4245不同，根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]葡萄糖浓度的YE培养基中时产生更高水平的TC和更高水平的虾青素。根据本发明的菌株的比率为至少1.6，并且对于某些菌株而言为至少2.2，从而表明本发明的菌株的特征对于红发夫酵母中的虾青素产量来说是特殊的。

实施例6：与在包含1％果糖浓度的培养基中生长相比，在包含3％果糖浓度的培养基中生长的新型AF红发夫酵母突变体产生了增加的类胡萝卜素产量

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)总含量。YM 3％(w/v)果糖中的TC产量与YM 1％(w/v)果糖中的TC产量的比率呈现在表7.1中。

表7.1：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的YM培养基中培养6天后TC水平的比率

表7.1表明根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]果糖浓度的YM培养基中生长时产生更高水平的类胡萝卜素。对于根据本发明的菌株来说，在具有3％(w/v)果糖的YM培养基中的类胡萝卜素产量与在具有1％(w/v)果糖的YM培养基中的类胡萝卜素产量相比的比率为至少1.1(参见例如AF-04)，并且对于某些菌株而言为至少1.3(参见例如AF-02、AF-03和AF-10)而对于某些菌株而言为至少1.8(参见例如AF-05、AF-06、AF-07、AF-08、AF-09和AF-11)。

进行与上述相同的实验，不同之处在于测量虾青素含量。在YM 3％(w/v)果糖中的虾青素产量与在YM 1％(w/v)果糖中的虾青素产量之间的比率呈现在表7.2中。

表7.2：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的YM培养基中培养6天后虾青素水平的比率

表7.2表明，根据本发明的“AF”菌株在具有较高[3％(w/v)对比1％(w/v)]果糖浓度的YM培养基中生长时产生较高水平的虾青素。对于根据本发明的这些菌株来说，在具有3％(w/v)果糖的YM培养基中的虾青素产量与在具有1％(w/v)果糖的YM培养基中的虾青素产量的比率为至少1.5。

然后在YE培养基(包含酵母提取物4g/L果糖)而非YM培养基中进行了类似的实验。

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动培养24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的20ml新鲜YE培养基(包含4g/L酵母提取物和果糖的培养基)并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)或虾青素总含量。在YE 3％(w/v)果糖中的TC产量与YE 1％(w/v)果糖中的TC产量之间的比率呈现在表7.3中，并且在YE 3％(w/v)果糖中的虾青素产量与在YE 1％(w/v)果糖中的虾青素产量之间的比率呈现在表7.4中。

表7.3：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的YE培养基中培养6天后TC水平的比率

表7.4：红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的YE培养基中培养6天后虾青素水平的比率

表7.3和7.4表明使用YE培养基获得相同的效果。与参考菌株NCYC 4245和野生型菌株不同，根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]果糖浓度的YE培养基中时产生更高水平的TC和更高水平的虾青素。对于根据本发明的这些菌株来说，在具有3％(w/v)果糖的YE培养基中的虾青素产量与在具有1％(w/v)果糖的YE培养基中的虾青素产量相比的比率为至少1.4。

实施例7：与在包含1％蔗糖浓度的培养基中生长相比，在包含3％蔗糖浓度的培养基中生长的新型AF红发夫酵母突变体产生了增加的类胡萝卜素产量

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)蔗糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)总含量。YM 3％(w/v)蔗糖中的TC产量与YM 1％(w/v)蔗糖中的TC产量的比率呈现在表8.1中。

表8.1：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)蔗糖的YM培养基中培养6天后TC水平的比率

表8.1表明，与参考菌株ATCC 74220不同，根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]蔗糖浓度的YM培养基中生长时产生更高水平的类胡萝卜素。对于参考菌株ATCC 74220，在具有3％(w/v)蔗糖的YM培养基中的类胡萝卜素产量与在具有1％(w/v)蔗糖的YM培养基中类胡萝卜素产量相比的比率为0.91，即在较高的蔗糖浓度下产生少得多的类胡萝卜素。相反，对于根据本发明的菌株来说该比率为至少1.2(参见例如AF-03和AF-04)，并且对于某些菌株而言为至少1.4(参见例如AF-02、AF-05、AF-07和AF-08)而对于某些菌株而言为至少2.0(参见例如AF-06、AF-09、AF-10和AF-11)。

进行与上述相同的实验，不同之处在于测量虾青素含量。在YM 3％(w/v)蔗糖中的虾青素产量与在YM 1％(w/v)蔗糖中的虾青素产量之间的比率呈现在表8.2中。

表8.2：将红发夫酵母突变体在补充有1％(w/v)或3％(w/v)蔗糖的YM培养基中培养6天后虾青素水平的比率

表8.2表明根据本发明的“AF”菌株在具有更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]蔗糖浓度的YM培养基中生长时产生更高水平的虾青素。对于根据本发明的这些菌株来说，该比率为至少2.0。

实施例8：与在包含1％葡萄糖浓度的培养基中生长相比，在包含3％葡萄糖浓度的培养基中培养新型红发夫酵母突变体产生了增加的虾青素产量

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。2天后，无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YM或YE培养基(仅包含酵母提取物5g/L和葡萄糖的培养基)并于20℃搅动孵育6天。之后，收集酵母细胞并测定虾青素水平。结果总结在表9中。结果显示为在包含3％(w/v)葡萄糖的YM或YE培养基中的虾青素产量(μg虾青素/g d.m.)与在包含1％(w/v)葡萄糖的YM或YE培养基中的虾青素产量(μg虾青素/g d.m.)相比的比率。

表9：在补充有1％(w/v)和3％(w/v)葡萄糖的YM和YE培养基中培养红发夫酵母突变体6天后虾青素水平的比率

表9表明，在两种不同类型的培养基中，在葡萄糖浓度更高[3％(w/v)对比1％(w/v)]的培养基中生长时，AF-05和AF-06产生更高水平的虾青素。

实施例9：与在包含1％葡萄糖或棉子糖浓度的培养基中生长相比，在包含5％葡萄糖或棉子糖浓度的培养基中生长的AF-红发夫酵母突变体中类胡萝卜素产量增加

9.1将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)葡萄糖的20ml YM培养基，并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为160μl的浓缩细胞悬浮液转移到50ml TUBESPIN生物反应器中，该生物反应器包含具有1％或5％(w/v)葡萄糖的8ml新鲜YM培养基并于20℃以100rpm搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素总含量(TC)。结果总结在表10中。

表10：在补充有1％(w/v)或5％(w/v)葡萄糖的YM培养基中培养6天红发夫酵母突变体后TC水平的比率

9.2在替代性实验中，将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250mlErlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％和5％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)总含量。结果总结在表11中。

表11：在包含1％和5％葡萄糖的YM培养基中将红发夫酵母突变体培养6天后TC水平的比率

表10和11显示，对比在1％(w/v)葡萄糖浓度的YM培养基中生长时，根据本发明的新型“AF”菌株在具有5％(w/v)葡萄糖浓度的YM培养基中生长时产生更高水平的类胡萝卜素。

9.3在附加的实验中，将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250mlErlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％或5％(w/v)棉子糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)总含量。结果总结在表11中。在YM 5％(w/v)棉子糖中的TC产量对比1％(w/v)棉子糖中的TC产量的比率呈现在表12中。

表12：在补充有1％(w/v)或5％(w/v)棉子糖的YM培养基中培养红发夫酵母突变体6天后TC水平的比率

表12显示对比在1％(w/v)棉子糖浓度的YM培养基中生长时，根据本发明的新型“AF”菌株在具有5％(w/v)棉子糖浓度的YM培养基中生长时产生更高水平的类胡萝卜素。

实施例10：AF-红发夫酵母突变体中类胡萝卜素总产量在6至13天期间的增加

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。6-13天之后，收集酵母细胞并测量类胡萝卜素(TC)总含量。结果作为第6天类胡萝卜素总产量的比率提供在表13中。

表13：在培养6至13天后AF-红发夫酵母突变体中的TC水平的比率

表13表明根据本发明的新型菌株在6至13天的培养期间继续产生和积累类胡萝卜素。

实施例11：实验室规模发酵(7升)

将来自冷冻培养物的环转移到YM培养皿上，并在20℃中孵育72小时。将来自培养皿的环接种到250ml烧瓶中，该烧瓶包含补充有15g/L酵母提取物和10g/L葡萄糖的20ml培养基。将烧瓶于20℃搅动培养24小时。然后，将2-7ml的酵母悬浮液接种到5L Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含补充有15g/L酵母提取物和10g/L葡萄糖的500ml培养基。将Erlenmeyer烧瓶放入20℃孵育箱中，进行搅动。48-72小时后，将酵母悬浮液接种到7L发酵罐中。

发酵开始条件如下：1vv通气，300rpm搅动，DO₂ 40，20℃和pH 5-6。葡萄糖溶液采用分批补料发酵，以保持葡萄糖浓度低于2g/L，并使用氨水控制pH。根据需要添加消泡剂。下面提供了培养基组成、矿物质混合物和维生素混合物。

表14:典型的培养基组成

表15:典型的矿物质混合物

表16:典型的维生素混合物

中试规模发酵(70升)

将来自实验室规模发酵罐的约3-4升生长培养基与60-80g生长培养物接种到中试规模发酵的70升发酵罐中。

发酵开始条件为1vv通气，300rpm搅动，DO2 40，20℃和pH 5-6。在整个发酵过程中将葡萄糖作为60重量％溶液以使葡萄糖浓度低于5克/升(g/L)，优选低于2g/L的速率为培养物补料。发酵开始时的葡萄糖浓度为1.15g/L。通过搅动和气流将溶解氧控制介于40％和75％之间的饱和度。

表17：典型的中试培养基组成

AF-06、AF-07、AF-09和AF-11的典型发酵结果呈现在表18中。

表18：7L发酵罐中TC和虾青素的产量

菌株	时间(小时)	TCμg/g d.m.	虾青素μg/g d.m.
				AF-06	170	19733	12372
AF-07	160	37463	20756
				AF-08	180	40924	23030
AF-09	180	37040	21913
				AF-11	165	43576	29012

AF-03的典型发酵结果呈现在表19中。

表19：70L发酵罐中的虾青素产量

菌株	时间(小时)	虾青素μg/g d.m.
			AF-03	170	16582

表18表明AF-06、AF-07、AF-09和AF-11菌株在7升发酵罐中培养期间产生高水平的总类胡萝卜素和虾青素，并且表19表明尽管在70升发酵罐中进行培养，AF-03菌株产生了非常高水平的虾青素。

实施例12：通过桑格测序分析进一步表征根据本发明的AF-02、AF-03、AF-04、AF- 05、AF-06、AF-07、AF-08、AF-09、AF-10和AF-11菌株

通过使用PCR，然后在3730xl毛细管电泳装置(Applied Biosystems,ThermoFisher Scientific)上使用Big-Dye终止子测序进行桑格测序获得DNA序列。PCR使用如下所公开的设计用于扩增特定基因组DNA片段的引物。在使用标准方案[DreamTaqGreen PCR Master Mix(2X)，马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific]从酵母中制备DNA后进行PCR，其中1.4ng DNA处于以下条件下：在95℃进行初始变性5分钟，然后是30个循环的95℃变性30秒、55℃或60℃退火45秒和72℃延伸1分钟。

表20展示了存在于AF-02、AF-03、AF-04、AF-05、AF-06、AF-07、AF-08、AF-09、AF-10和AF-11菌株中的支架、使用的独特引物组和六种扩增基因组DNA片段。所有所述菌株都包含如表20中所列的序列—另见随附的序列表。本发明的菌株的突变和点突变以带有下划线的粗体表示。

表20:AF-02、AF-03、AF-04、AF-05、AF-06、AF-07、AF-08、AF-09、AF-10和AF-11菌株的基因组的PCR扩增子的PCR结果

实施例13：分析生成的酵母菌株的基因组标记

根据制造商的说明，使用Nextera XT试剂盒(加利福尼亚州圣地亚哥的Illumina)制备基因组DNA用于测序。处理后，使用Agilent TapeStation 2000自动电泳设备(加利福尼亚州圣克拉拉的Agilent Technologies)对文库进行大小评估，并通过Qubit荧光计(马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific Inc.)进行浓度评估。将DNA文库以等摩尔比合并以及使用具有双端2x150碱基读数的Illumina NextSeq500测序仪进行测序。进行生物信息学分析，使用至少250x的覆盖率提供至少1000bp长的重叠群。根据覆盖率单独评估每个基因组的拷贝数变化，寻找来自全基因组中位数的大规模波动。

发现根据本发明的菌株在所有等位基因中的特征在于如下所述的点突变。相反，在位于ENA数据库的系统测序项目中使用的酵母菌株CBS6938[登录号LN483084-LN483350,(Sharma等人2015)]中，在所述基因中没有这种点突变。本文提及的所有突变或修饰均涉及与红发夫酵母野生型菌株的比较。

·支架79处的名为crtE的基因XDEN_05955—包含位置1540450处的点突变(G到A的变化)，从而导致氨基酸交换(脯氨酸交换为丝氨酸)。

·支架69处的名为erg20的基因XDEN_04715—包含在上游区域中的位置2028187处的点突变。

实施例14：虾青素占类胡萝卜素总含量的百分比

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300至400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YM培养基并于20℃搅动孵育。7天后，收集酵母细胞并测定类胡萝卜素(TC)总含量和虾青素量。根据以下公式计算虾青素占TC含量的百分比(w/w)：

％虾青素＝虾青素量/TC含量*100

结果总结在表21中。

表21：虾青素占TC含量的百分比(w/w).

如表21所示，虾青素占总类胡萝卜素的至少50％(w/w)。

实施例15：与在包含1％葡萄糖浓度的培养基中生长相比，新型AF红发夫酵母突变体在包含3％葡萄糖浓度的培养基中的生长导致增强的Y_P/S[虾青素产量(mg)/g葡萄糖]

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的20ml新鲜YE培养基(包含酵母提取物4g/L和葡萄糖)并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量每克葡萄糖的虾青素产量(mg)(Y_P/S)。在YE 3％(w/v)葡萄糖中的Y_P/S对比在YE 1％(w/v)葡萄糖中的Y_P/S的比率呈现在表22中。

表22：在补充有1％(w/v)或3％(w/v)葡萄糖的YE培养基中培养红发夫酵母突变体6天后的Y_P/S比率

如上所述，与包含1％葡萄糖浓度的培养基相比，本发明的改进菌株在包含3％葡萄糖浓度的培养基中生长时具有增加的Y_P/S[虾青素产量(mg)/g葡萄糖]，这与具有降低的Y_P/S的野生型和参考菌株不同。对于根据本发明的菌株来说，在具有3％(w/v)葡萄糖的YE培养基中的虾青素产量(Y_P/S)与在具有1％(w/v)葡萄糖的YE培养基中的虾青素产量(Y_P/S)相比增加的比率为至少1.2(参见例如AF-03)，对于某些菌株而言为至少1.3(参见例如AF-02、AF-04和AF-06)，并且对于某些菌株而言为至少1.8(参见例如AF-05、AF-07、AF-08、AF-09、AF-10和AF-11)。

实施例16：与在包含1％果糖浓度的培养基中生长相比，新型AF红发夫酵母突变体在包含3％果糖浓度的培养基中的生长导致增强的Y_P/S[每克果糖的虾青素产量(mg)]

将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液并浓缩大约3倍(从20ml到6ml)。将体积为300-400μl的浓缩细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的20ml新鲜YE培养基(包含酵母提取物4g/L和果糖)并于20℃搅动孵育。六天后，收集酵母细胞并测量每克果糖的虾青素产量(mg)(Y_P/S)。在YE 3％(w/v)果糖中的Y_P/S对比YE 1％(w/v)果糖中的Y_P/S的比率呈现在表23中。

表23：在补充有1％(w/v)或3％(w/v)果糖的YE培养基中培养红发夫酵母突变体6天后的Y_P/S比率

如上所述，与包含1％果糖浓度的培养基相比，本发明的改进菌株在包含3％果糖浓度的培养基中生长时具有至少1.2的增加的Y_P/S[每克果糖的虾青素产量(mg)]，与具有0.7或更低的降低的Y_P/S的野生型和参考菌株不同。

实施例17：在厌氧发酵条件下由新型AF红发夫酵母突变体产生的乙醇浓度的测量

对于每个突变菌株，将新鲜酵母的完整接种环从YM琼脂板转移到250mlErlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有1％(w/v)葡萄糖的20ml YM培养基并在摇床孵育箱中于20℃搅动孵育24小时。无菌收集细胞悬浮液，并将体积为18ml的细胞悬浮液转移到5000ml Erlenmeyer烧瓶中，该烧瓶包含具有3％(w/v)葡萄糖的220ml YM培养基并于20℃搅动孵育2天。在将细胞在YM培养基中孵育后，将它们进行发酵步骤。无菌收集10ml的细胞悬浮液并离心，在弃去上清液后，将细胞沉淀物重悬于具有2％(w/v)蔗糖的体积为10ml的YM培养基中。然后将体积为5ml的细胞悬浮液转移到250ml Erlenmeyer烧瓶中进行厌氧发酵，该烧瓶由带阀门的硅塞密封并包含具有2％(w/v)蔗糖的50ml YM培养基。2天后停止发酵，使用离心将酵母细胞从发酵培养基的液体部分解离。使用HPLC测定发酵培养基样品中的乙醇浓度(g/l)，并通过比较发酵结束时的生物质(g/ld.m.)与发酵开始时的细胞生物质(g/l d.m.)来确定细胞增殖。

表24:蔗糖发酵和细胞增殖2天(g/l)后的乙醇浓度(作为生长开始时的生物质g/l和用2％(w/v)蔗糖孵育2天后的生物质g/l的比率)

表24说明本发明的“AF”菌株可以在作为碳源的蔗糖上生长，并且它们具有在厌氧条件下将蔗糖发酵成乙醇从而产生高浓度乙醇的能力。

序列表

<110> 纳斯特姆科技有限公司

<120> 红发夫酵母的虾青素高产菌株

<130> NXF19150PCT

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 218

<212> DNA

<213> 红发夫酵母

<220>

<223> 支架242

<400> 1

agggaacgaa acagttgccg aacgaccatg aagaagtgta tataagaagc gccggaatca 60

ggtcgtccat gttcacttct ctctttctca tcccctctcc atcactgttc gatttcaatt 120

cacttcctca ataacttcca ttcatccaat gtcccattca caaggcgata tcgttgtcta 180

tccggatgaa gcacctcctc tctatgatga tcggccat 218

<210> 2

<211> 758

<212> DNA

<213> 红发夫酵母

<220>

<223> 支架88

<400> 2

tcatatacaa acatgctaac ggcgaagtta ggcctcgtat acggctcaat cgttgcagag 60

gcctttctga ggcatcaata ccctaatggg cagagcctca tccagcgctc acaagagtgc 120

tctaaaaagt atagggctct actagcccct aaaggtttat aagtagagct tccatagctc 180

tctaaggcgc aaagccaaaa agaagaatag tatcctcttc caaatcaaca agccaatggc 240

tatttctcaa aagtcctctg cgagggagag cgctcgacgt cacatgtcct ttccgacgct 300

ctgacgagta caatacctca atagccaata gagaccgctt aaacttacca aagagggctc 360

tagaggctac aagagttttt caagaatggg gtaacacccc tcaaagcggg gtccattacc 420

cctagcaagc taaacaaaag caaaggcgtt ctctgcagag taaagccgaa gctaaacaaa 480

gtttaaaagc tagagctttt ctcagtactc aaagagctca gaggctaagc ctcctatcta 540

tgccatccaa aagcagatag ataggagtgc ttagagtgaa agctcgtaga gtaccgcgca 600

catgcgcctt cctcccttac gaggaaagct ttcaaagttt aaaaatttct tcaaagcttt 660

ccgagaacaa tagctctcgg agctcagaga gcaaggataa gcgcttctac tccgtagaga 720

gtagaaagag ctctttcctt gcaaagactc ccgcaaag 758

<210> 3

<211> 601

<212> DNA

<213> 红发夫酵母

<220>

<223> 支架162

<400> 3

aaggtcatat gttacgatat gtggccgtaa ccacatgaca cgcgtcgcgt cgcgtgtccg 60

tctcgcgcgt cgcgtctctg ttggccggtg cgggcttgtg tgcgcatggg ttcgtcgttc 120

gagagagaga gagagagaga gtggtcctgc tcggcgtaca tcgatatcat gatggctcac 180

atatatatat atatcacact cggaaagaag attacaaggt tttggttctg tctctcttga 240

ttctttcctc ctcctccttc ttcttctcct tcttcttctc ttttgtcctc ttctttcctc 300

cactttagaa ccacaaactc ttgatgcctc ctcggatggc gttccacccg gtggtaccta 360

caaatgcggc gttgtcgatc tttgtctgca attcatagta gttctcgagt cgacgtttga 420

gaaagtcgcg cgttgacggc atcgacggtt cgttcaacgg aagcgagagc tggtgaagct 480

cagtggagag gtacaagagt gagagtggta atgactcgtg caagttctga acagcgttat 540

ggagagatcg cgagatcgcg agattgacag agatacaacg ttaatagagt cctgaagctg 600

a 601

<210> 4

<211> 234

<212> DNA

<213> 红发夫酵母

<220>

<223> 支架79

<400> 4

ctttatcaag atacgtatct ttcgagaacg gaatctgcga attaggagtt gacgtgcccc 60

cgttttcaga cgaggccgag gaggaggagg atgcagagga gacggatgat tgaagcgaag 120

cagatgaagg aggaattaca ggcatgggta tcgatgttgg gcgaagcttg aagatctctt 180

gataagccag aaagtagacg tagtttgcac tataatccat agtagttatc cggt 234

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 红发夫酵母

<220>

<223> 支架69

<400> 5

atatgttcaa aatgtcaggc gagttctcgg gagaaaaaaa aagcgtgggc tctgaaacag 60

tgtggaaatg tctacaaagt gagctggatt 90

<210> 6

<211> 345

<212> DNA

<213> 红发夫酵母

<220>

<223> 支架24

<400> 6

gaagaagaga gcaacattgg aagaaacaac gttgtcgtcg tcctgctcgt cctctgggat 60

ttcgttcaac ttctcctgaa gcattctagc gtaagtctca ctagaaattt cgaaatagcc 120

gccagtgcag agagggaaag caggtagaat cagcaaacta gcacggtcga ctaatataat 180

tgaaaaaaag aaagaaaaac acaaagctct cacctaagct cctccatctt cgcagctcga 240

tccttctctg ggtcgtaagc caaatgtctt ttcaaaacca tcgtctccca caagctcaag 300

tgtcgtttgt gaacggcgat tccatagtat tctccagcct tacca 345

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架242 - 引物1

<400> 7

cccacagaga gataaagaga gaga 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架242 - 引物2

<400> 8

tactagagga gaggaggtga ga 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架88 - 引物1

<400> 9

gttcatcctt ctacaccacc taat 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架88 - 引物2

<400> 10

ctcactcttt ctacaccact ctg 23

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架162 - 引物1

<400> 11

cacccaaagc gtttagaa 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架162 - 引物2

<400> 12

cattccctgt cctgaatc 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架79 - 引物1

<400> 13

aaagaccatt cgctcacttc c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架79 - 引物2

<400> 14

catcccatct ctgtgtgtgt tc 22

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架69 - 引物1

<400> 15

gcaaggtccg agagtatt 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架69 - 引物2

<400> 16

tacagtgagc aaccaaca 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架24 - 引物1

<400> 17

tgatggtcaa agggagaagg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 支架24 - 引物2

<400> 18

acagagagca agagcgatac 20

PCT/RO/134表

Claims

1.一种红发夫酵母的酵母菌株，其中所述酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素；其中所述酵母菌株包含基因组，所述基因组包含：

ii)在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变。

2.如权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株进一步包含基因组，所述基因组包含以下定义的iii)至vi)中的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种：

iii)在基因XDEN_00738上游，在支架242中的位置318703和318738处的两点突变；

iv)在基因XDEN_06229下游，在支架88中的位置855和1020处的两点突变；

v)位于基因XDEN_00195处，在支架162中紧挨位置213879之后的两个碱基的缺失；以及

vi)在基因XDEN_01573处，在支架24中的位置84078和84206处的两点突变。

3.如权利要求1或2所述的酵母菌株，其中在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变是G到A的变化，从而导致脯氨酸到丝氨酸的氨基酸交换。

4.如前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其中所述点突变存在于所述基因的至少一种、至少两种或所有等位基因中。

5.如前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其包含基因组，所述基因组包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核苷酸序列中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种。

6.如前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株的特征在于它能从选自以下的红发夫酵母菌株获得：

AF-02(保藏NCYC 4294)，

AF-03(保藏NCYC 4337)，

AF-04(保藏NCYC 4336)，

AF-05(保藏NCYC 4345)，

AF-06(保藏NCYC 4344)，

AF-07(保藏CBS 146150),

AF-08(保藏NCYC 4389),

AF-09(保藏NCYC 4388)，

AF-10(保藏NCYC 4406)，以及

AF-11(保藏NCYC 4405)。

7.如前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株选自以下：

AF-02(保藏NCYC 4294)，

AF-03(保藏NCYC 4337)，

AF-04(保藏NCYC 4336)，

AF-05(保藏NCYC 4345)，

AF-06(保藏NCYC 4344)，

AF-07(保藏CBS 146150),

AF-08(保藏NCYC 4389),

AF-09(保藏NCYC 4388)，

AF-10(保藏NCYC 4406)，以及

AF-11(保藏NCYC 4405)。

8.如前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含5％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素。

9.用于通过发酵根据前述权利要求中任一项所述的酵母菌株来生产类胡萝卜素的方法。

10.一种获得红发夫酵母的类胡萝卜素高产酵母菌株的方法，所述方法包含：

b)选择其获得的类胡萝卜素高产酵母菌株，

其中步骤b)中选择的所述类胡萝卜素高产酵母菌株的特征在于，与在包含1％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时相比，在包含至少3％(w/v)碳源的酵母生长培养基中培养时，它能够产生更大量的类胡萝卜素，其中选择的所述酵母菌株包含基因组，所述基因组包含：

ii)在基因XDEN_05955处在支架79中的位置1540450处的点突变；

优选地，步骤b)中选择的所述类胡萝卜素高产酵母菌株是根据权利要求1至8中任一项所述的酵母菌株。

11.如权利要求1至8中任一项所述的酵母菌株、如权利要求9所述的方法或如权利要求10所述的方法，其中所述碳源选自由葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、木糖或其组合组成的群组。

12.通过权利要求10或权利要求11的方法获得的类胡萝卜素高产酵母菌株。

13.如权利要求1至8或11中任一项所述的酵母菌株、如权利要求9所述的方法、如权利要求10或权利要求11所述的方法，或如权利要求12所述的类胡萝卜素高产酵母菌株，其中所述类胡萝卜素为至少50％(w/w)虾青素。

14.如权利要求1至8、11或13中任一项所述的酵母菌株或如权利要求12所述的类胡萝卜素高产酵母菌株在生产包含虾青素的产品中的用途，其中所述产品是膳食补充剂、营养补充剂、食品补充剂、饮料补充剂、食品添加剂或饲料添加剂，如饲料着色剂；用于人类健康的药物组合物，例如用于治疗帕金森病、心血管疾病、促进心脏病发作后的康复或用于改善免疫系统功能的药物组合物；或化妆品组合物。