KR20220063159A - 파피아 로도지마의 아스타잔틴 과생산 균주 - Google Patents

파피아 로도지마의 아스타잔틴 과생산 균주 Download PDF

Info

Publication number
KR20220063159A
KR20220063159A KR1020227005448A KR20227005448A KR20220063159A KR 20220063159 A KR20220063159 A KR 20220063159A KR 1020227005448 A KR1020227005448 A KR 1020227005448A KR 20227005448 A KR20227005448 A KR 20227005448A KR 20220063159 A KR20220063159 A KR 20220063159A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
yeast
accession
ncyc
yeast strain
astaxanthin
Prior art date
Application number
KR1020227005448A
Other languages
English (en)
Inventor
파즈 쉐메쉬
차프라 코헨
야엘 리프쉬츠
마리나 쿠토리안
야니브 하라리
Original Assignee
넥스트펌 테크놀로지스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP19218701.1A external-priority patent/EP3839056A1/en
Application filed by 넥스트펌 테크놀로지스 리미티드 filed Critical 넥스트펌 테크놀로지스 리미티드
Publication of KR20220063159A publication Critical patent/KR20220063159A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0101—(2E,6E)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.10), i.e. geranyltranstransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01029—Geranylgeranyl diphosphate synthase (2.5.1.29)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

본 발명은 높은 양의 카로테노이드, 특히 높은 양의 아스타잔틴을 생산하는 파피아 로도지마의 신규 효모 균주에 관한 것이다. 이들 신규 균주는 증가된 농도의 탄소원의 존재 하에서 증가된 양의 카로테노이드를 생산할 수 있다.

Description

파피아 로도지마의 아스타잔틴 과생산 균주
본 발명은 높은 양의 카로테노이드, 특히 높은 양의 아스타잔틴을 생산하는 파피아 로도지마 (Phaffia rhodozyma)의 신규 효모 균주에 관한 것이다. 이들 신규 균주는 증가된 농도의 탄소원 존재 하에서 증가된 양의 카로테노이드를 생산할 수 있다.
아스타잔틴 (3,3'-디히드록시-β,β'-카로텐-4,4'-디온)은 일정 해양 식물, 갑각류, 어류, 및 효모에서 발견되는 천연적으로 발생되는 지용성의 붉은색 옥시카로테노이드 색소이다. 상업적 양식에서, 아스타잔틴은 종종 자생종에서 확인되는 독특한 분홍색을 그들 살에 부여하기 위해서 연어과 및 갑각류의 상용 사료에 첨가된다. 이러한 독특한 분홍색의 부여는 양식을 통해서 생산된 연어과 및 갑각류의 소비자 수용을 장려하는데 중요한 것으로 여겨진다.
아스타잔틴의 평면 구조는 하기에 도시된다:
Figure pct00001
.
아스타잔틴은 이의 구조 내에 산소 분자의 존재를 특징으로 한다. 아스타잔틴 분자는 분자의 양쪽 말단 상에 히드록실 기 (-OH)를 갖는 β-이오논 고리의 3, 3' 위치에 위치된 2개의 비대칭 탄소를 갖는다. 아스타잔틴은 양쪽 말단에서 히드록실 및 케토 모이어티로 구성된다. 이의 친지성 및 친수성 성질은 이것이 세포막의 인지질 이중층으로 정렬되게 허용한다 (Yang 2013, J Hum Nutr Food Sci 1:1003, Ambati 2014, Mar Drugs. 2014 Jan; 12(1)). 붉은색 색소 색상은 화합물의 중심에 있는 공액 이중 결합에 기인한다. 이러한 유형의 공액 이중 결합은 광범위한 생 유기체에서 전자를 제공하고 자유 라디칼과 반응하여 그들을 보다 안정한 산물로 전환시키고 자유 라디칼 연쇄 반응을 종결시킴으로써 강력한 항산화제로서 작용한다.
아스타잔틴은 광범위하게 연구되어 왔고 수많은 임상적 건강 이득 예컨대 항산화, 항염증, 항당뇨, 스포츠 영양　(지구력, 스포츠 수행능 및 열 스트레스에 대한 완화 효과), CVD의 예방, 및 건강한 뇌, 눈 및 피부의 촉진을 갖는다는 것이 입증되었다 (Yang 2013, J Hum Nutr Food Sci 1:1003; Ambati 2014, Mar Drugs. 2014 Jan; 12(1)). 아스타잔틴의 항산화 활성은 몇몇 연구들에서 입증되었고 비타민 E 및 β-카로텐에 비해서 최대 몇 배의 더 강력한 자유 라디칼 항산화 활성을 갖는다고 보고되었다 (Kurashge et.al., 1990, Shimidzu et.al., 1996). 아스타잔틴의 항산화 성질은 UV-광 광산화, 암, 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori) 감염, 노화 및 나이-관련 질환에 대한 보호, 및 면역 반응, 및 간, 심장, 관절 및 전립선 건강의 촉진에서 핵심 역할을 갖는 것으로 여겨진다 (Guerin, Huntley and Olaizola, 2003).
아스타잔틴의 공급원은 특히 아스타잔틴이 값비싼 사료 성분이기 때문에, 양식 산업, 및 인간 소비에서 큰 수요가 있다. 산업적 용도를 위한 아스타잔틴의 천연 공급원은 미세조류 (해마토코커스 플루비알리스)(Haematococcus pluvialis), 효모 파피아 로도지마 (Phaffia rhodozyma) 및 해양 박테리아 (파라코커스 카로티니파시엔스)(Paracoccus carotinifaciens)이다. 양식 산업은 계속 확장되고 있고 대서양 연어의 생산이 또한 최근 수년간 증가되어 왔다. 양식된 연어, 송어, 및 갑각류는 천연 아스타잔틴 공급원 예컨대 새우 및 크릴 새우의 안정한 사료를 공급받지 못하므로, 그들 아스타잔틴 소비는 소비된 사료로부터 유래되어야만 한다. 그들 사료에 아스타잔틴의 첨가없이, 농장에서 자란 연어는 오렌지-분홍색 대신에 흰색이다. 합성 아스타잔틴은 양식 산업에서 전세계적으로 사용되는 주요한 카로테노이드이다. 합성 아스타잔틴은 각각 이성질체 (3S, 3S), (3R, 3S), 및 (3R, 3R)의 1:2:1 혼합물로 이루어진다. 그러나, 합성 염료의 사용없는 천연 식품에 대해 증가하는 소비자 수요가 합성물 대신에 생물학적 공급원으로부터 아스타잔틴 생산을 개선시키기 위한 주요한 노력에 대한 기초 동인이다. 파피아 효모는 아스타잔틴의 신뢰할만한 공급원으로 증명되었지만, 현재의 해법은 매우 값비싸다.
효모 파피아 로도지마는 1960년대 후반 Herman J. Phaff가 러시아, 칠레, 핀란드, 일본, 및 미국 같은 추운 지역에서 자작 나무의 점액으로부터 최초로 단리하였다. 이러한 효모는 출아에 의해 영양적으로 번식되고 이후에 파피아 로도지마의 유성 상태가 분명해졌고 잔토필로마이세스 덴드로로우스 (Xanthophyllomyces dendrorhous) (XDEN)로 명명되었다. 효모 파피아 로도지마는 바시디오마이세테스 (basidiomycetes) 기원이다. 바시디오마이세테스로서 파피아 로도지마를 동정하는데 사용된 기준은 아스타잔틴이 주요 성분인 카로테노이드를 합성하는 이의 능력; 이의 다층 세포벽 구조 및 아체 형성 방식 및 몇몇 당류를 발효하는 이의 능력; 임의의 다른 카로테노이드-생산 효모와 공유하지 않는 성질을 포함한다.
파피아 로도지마의 야생형 균주는 저수준의 아스타잔틴, 전형적으로 효모 건조 질랑의 100 내지 300 백만분율 (ppm)을 생산하므로 그들은 실용적이거나 또는 경제적인 공급원은 아니다 (Torrissen, Hardy and Shearer, 1989). 파피아 로도지마의 돌연변이체 균주는 일정 성장 조건 예컨대 성장 배지 중 낮은 포도당 수준 하에서 높은 수준의 아스타잔틴을 생산할 수 있다고 기술되었다; 예를 들어, US5356809, US5922560, Barredo 2012, An et al 1989, Jeong-Hwan 2004, 및 Baeza 2010을 참조한다. 효모 건조 질량 g 당 5000 ㎍ 이상의 아스타잔틴을 아스타잔틴 과생산 파피아 로도지마 균주가 야생형 균주의 돌연변이유발을 통해 수득할 수 있다. 그러나, 식품, 영양, 및 건강 산업에서 아스타잔틴에 대해 증가되는 요구로 인해서, 광범위한 성장 조건 하에서, 특히 변화량 또는 더 높은 양의 탄소원의 존재 하에서, 그리고 또한 효모가 높은 생물량 농도에서 배양될 때 훨씬 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산하는 파피아 로도지마의 추가 균주에 대한 요구가 존재한다. 본 발명의 신규한 파피아 로도지마 균주는 이들 요구를 충족하고, 매우 높은 수준의 아스타잔틴을 생산하며, 산업적 규모의 발효배양을 처리할 수 있다.
본 발명은 예외적으로 높은 수준의 카로테노이드, 예컨대 아스타잔틴을 생산하는 아스타잔틴 과생산 균주를 제공한다. 현저하게, 이들 균주는 1-10% 탄소원의 존재 하에서 증가된 양의 카로테노이드를 생산할 수 있어서, 특히 전형적으로 탄소원 농도의 변동이 일어나게 되는 산업적 규모의 발효배양을 처리하게 만든다. 그러므로, 이러한 균주는 카로테노이드 생산, 특히 아스타잔틴 생산의 증가된 효율 및 증가된 수율을 제공할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 균주는 양식 산업 및 인간 소비를 위한, 카로테노이드, 특히 아스타잔틴의 산업적 생산을 위한 적용성을 갖는다.
따라서, 본 발명은 파피아 로도지마의 효모 균주를 제공하고, 효모 균주는 특히 그들이 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로 테노이드를 생산할 수 있다는 것을 특징으로 한다.
정의
용어 "NCYC"는 특허 목적을 위해 효모 균주 기탁을 수용하는 부다페스트 조약 하의 국제 기탁 기관인, "국립 효모 생물자원 센터 (National Collection of Yeast Cultures)"를 의미한다.
용어 "CBS"는 특허 목적을 위해 효모 균주 기탁을 수용하는 부다페스트 조약 하의 국제 기탁 기관인 곰팡이 생물자원 센터 "(Centraalbureau voor Schimmelcultures)"를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 카로테노이드 (예를 들어, 아스타잔틴)의 양은 건조 효모 질량 당 카로테노이드의 질량, 예를 들어, 건조 효모 g 또는 건조 질량 g (d.m.) 당 아스타잔틴 ㎍ 으로서 표시된다.
본 명세서에서 사용되는, 카로테노이드 (예를 들어, 아스타잔틴)의 수율, "Y"는 다음과 같이, YP/S 비율로서 표시될 수 있고, 여기서 P는 생산량 및 S는 탄소원이다:
YP/S = 탄소원 g 당 카로테노이드 (예를 들어, 아스타잔틴) 생산량 (mg)
YP/S = Pf / (S0 - Sf)
Pf = 카로테노이드 생산량 (mg/L)
S0 = 성장 시작 시의 탄소원 (g/L)
Sf = 성장 종료 시의 탄소원 (g/L)
카로테노이드의 총량은 본 명세서에서 "TC"로 축약된다.
본 발명에 따른 "탄소원"은 단당류, 이당류, 삼당류, 또는 올리고당, 예를 들어, 포도당, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 라피노스, 자일로스, 옥수수 시럽, 글리세롤, 숙시네이트, 피루베이트 또는 이의 조합일 수 있다. 바람직하게, 탄소원은 포도당, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 라피노스, 자일로스, 또는 이의 조합이다.
본 명세서에서 사용되는, "효모 성장 배지"는 박테리아 및 다른 산-불내성 유기체의 성장을 방해하면서, 효모의 성장을 허용하는 산성 pH의 선택적 성장 배지이다. 이러한 배지의 예는 당분야에 공지된 바와 같은 표준 효모 한천/액체배지인, 효모 및 곰팡이 "YM" 배지이다. 이러한 배지는 전형적으로 탄소원, 질소원 및 염을 함유하고 이것은 펩톤 (단백질의 부분 가수분해를 통해서 형성된 아미노산 및 폴리펩티드의 수용성 혼합물), 미량 원소 및 효모 추출물을 함유할 수 있다. 예시적인 YM 배지 조성물은 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L, 및 탄소원 10 내지 50 g/L를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 탄소원의 백분율은 중량/부피이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "v/v"는 부피/부피를 의미하고 용어 "w/w"는 중량/중량을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, "돌연변이"는 단백질-코딩 서열에 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 치환, 또는 뉴클레오티드의 삽입 (프레임-시프트를 일으킬 수 있음)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "점 돌연변이"는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 단백질-코딩 서열, 인트론 서열 또는 상류/하류 서열 영역에서 다른 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드의 치환이다.
파피아 로도지마 균주
본 발명은 파피아 로도지마의 효모 균주를 제공하고, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 또는 약 3.5% (w/v), 또는 약 4% (w/v), 또는 약 4.5% (w/v), 또는 약 5% (w/v), 또는 약 6% (w/v), 또는 약 7% (w/v), 또는 약 8% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 약 3% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 또는 약 3.5% (w/v), 약 4% (w/v), 약 4.5% (w/v) 또는 약 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있다.
본 발명의 효모 균주는 하기에 정의된 i) 내지 vi) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다:
i) 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:5에 표시되는 점 돌연변이);
ii) 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:4에 표시되는 점 돌연변이);
iii) 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에, 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:1에 표시되는 점 돌연변이);
iv) 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:2에 표시되는 점 돌연변이);
v) 유전자 XDEN_00195에 위치된, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:3에 표시되는 돌연변이); 및
vi) 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:6에 표시되는 점 돌연변이).
일부 구현예에서, 게놈은 i) 내지 vi)에 정의된 바와 같은 돌연변이의 전부를 포함한다.
점 돌연변이(들)는 상기 유전자의 대립유전자 중 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모두에 존재할 수 있다. 바람직하게, 점 돌연변이(들)는 상기 유전자(들)의 모든 대립유전자에 존재한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 효모 균주는 crtE 로 명명된 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다. 바람직하게, 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이는 crtE 에 의해 코딩되는 단백질에서 프롤린에서 세린으로의 아미노산 교환을 일으키는, G에서 A (구아닌에서 아데닌)로의 변화이다 (상보성 반대 가닥에서 코딩되는 유전자 XDEN_05955에서 (코돈 CCG → TCG 염기 치환)).
일부 구현예에서, crtE 로 명명된 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 점 돌연변이는 crtE 기능의 변경을 야기한다. crtE (제라닐제라닐 파이로포스페이트 신써타제로도 공지됨)의 기능은 예를 들어 파피아 로도지마의 추출물 중에서 제라닐제라닐 파이로포스페이트 (GGPP) 양의 정량을 통해서 측정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 효모 균주는 erg20 로 명명된 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다. 바람직하게, 유전자 XDEN_04715 (명칭: erg20)의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이는 G에서 A (구아닌에서 아데닌)로의 변화이다.
일부 구현예에서, erg20 으로 명명된 유전자 XDEN_04715에서 스캐폴드 69의 점 돌연변이는 erg20 기능의 변경을 야기한다. erg20 (파르네실 파이로포스페이트 신타제로도 공지됨)의 기능은 예를 들어 세포 배양 (예를 들어, 효모 또는 이. 콜라이)에서 돌연변이된 유전자를 과발현시키는 단계, 형질전환된 세포로부터 단백질 추출물을 단리시키는 단계, 및 상기 단백질 추출물을 사용하여 시험관내에서 파르네실 파이로포스페이트 신타제 활성 어세이를 수행하는 단계를 통해서 측정될 수 있다. 야생형 erg20 의 과발현은 양성 대조군으로서 사용될 수 있고, 비-형질전환 또는 비-유도된 배양물은 음성 대조군으로서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 효모 균주는 crtE 로 명명된 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이, 및 또한 erg20 으로 명명된 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
erg20 및 crtE 는 카로테노이드 생합성에 관여하는 유전자이다. ERG20 단백질 (파르네실 파이로포스페이트 신타제)은 제라닐-디포스페이트 (제라닐-PP)를 형성시키도록 DMAPP 및 IPP의 축합을 담당한다. 더 나아가서, ERG20은 또한 제라닐-PP에 제2 IPP 분자의 첨가를 촉매하여, 파르네실-디포스페이트 (FPP)를 생산한다. 다음으로 FPP는 GGDP 신타제 (crtE 코딩된 단백질)에 의해서 제라닐제라닐-디포스페이트 (GGPP)로 전환된다. 이러한 GGPP 중간체는 이후에 피토엔 신타제 (CrtB)에 의해서 피토엔으로 축합된다. DMAPP, IPP, FPP, GGPP는 모두 베타-카로텐의 전구체이다. 그러나, 본 발명은 erg20 및 crtE 유전자 내 특이적 돌연변이가 파피아 로도지마 효모를 낮은 (예를 들어, 1% (w/v)) 농도의 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 높은 (예를 들어, 적어도 3% (w/v)) 농도의 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있게 한다는 것을 최초로 결정하였다 .
본 발명의 효모 균주는 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에 2-점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다.
본 발명의 효모 균주는 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다.
본 발명의 효모 균주는 유전자 XDEN_00195에서, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실을 포함하는 게놈을 포함할 수 있다.
본 발명의 효모 균주는 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있다. 위치 84078의 돌연변이는 인트론 돌연변이로 정의되는 반면, 위치 84206의 돌연변이는 엑손 돌연변이로서, 상보성 반대 가닥에서 코딩되는 유전자 XDEN_01573에서 히스티딘의 티로신 아미노산 600으로의 치환 (코돈 CAT → TAT 염기 치환)을 초래한다.
본 발명은 또한 파피아 로도지마의 효모 균주를 제공하고, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하고, 본 발명의 효모 균주는
i) 유전자 XDEN_04715 (명칭: erg20)의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이, 및/또는
ii) 유전자 XDEN_05955 (명칭: crtE)에서, 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이는 예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:4에 표시된 점 돌연변이일 수 있다. 바람직하게, 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이는 G에서 A (구아닌에서 아데닌)로의 변화로서, crtE 에 의해 코딩되는 단백질에 프롤린에서 세린으로 아미노산 교환을 일으킨다 (상보성 반대 가닥에서 코딩되는 유전자 XDEN_05955에 (코돈 CCG → TCG 염기 치환)).
유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이는 예를 들어 표 20에 따른 SEQ ID NO:5에 표시된 점 돌연변이일 수 있다. 바람직하게, 유전자 XDEN_04715 (명칭: erg20)의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이는 G에서 A (구아닌에서 아데닌)로의 변화이다.
본 발명의 효모 균주는
i) 유전자 XDEN_04715 (명칭: erg20)의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이, 및/또는
ii) 유전자 XDEN_05955 (명칭: crtE)에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있고;
하기에 정의된 iii) 내지 vi) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개를 더 포함할 수 있다:
iii) 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:1에 표시된 점 돌연변이);
iv) 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:2에 표시된 점 돌연변이);
v) 유전자 XDEN_00195에 위치된, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:3에 표시된 돌연변이); 및/또는
vi) 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:6에 표시된 점 돌연변이).
SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 뉴클레오티드 서열은 실시예 12의 표 20 및 첨부된 서열 목록에서 제공된다. 상기 뉴클레오티드 서열은 최신 분자 DNA 기술, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해서 본 발명의 임의의 파피아 로도지마 균주로부터 증폭될 수 있다. 결실, 삽입, 돌연변이를 포함한, 효모 게놈의 조작, 및 PCR에 의한 태그화 방법은 [Gardner & Jaspersen, Methods Mol Biol. 2014;1205]에 기술되어 있다. 효모의 게놈으로 단일 또는 다수의 정의된 점 돌연변이의 도입을 위한 다른 예의 방법은 [Toulmay & Schneiter, Yeast, 2006 Aug;23(11)]에 기술되어 있다.
SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 뉴클레오티드 서열은 적합한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해서 확인될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8의 프라이머는 SEQ ID NO:1을 확인하는데 사용될 수 있고, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10의 프라이머는 SEQ ID NO:2를 확인하는데 사용될 수 있고, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12의 프라이머는 SEQ ID NO:3을 확인하는데 사용될 수 있고, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14의 프라이머는 SEQ ID NO:4를 확인하는데 사용될 수 있고, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16의 프라이머는 SEQ ID NO:5를 확인하는데 사용될 수 있고, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18의 프라이머는 SEQ ID NO:6을 확인하는데 사용될 수 있다. 프라이머 서열은 실시예 12의 표 20 및 첨부된 서열 목록에서 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 균주의 게놈은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개를 포함한다.
본 발명의 효모 균주는 하기로부터 선택되는 파피아 로도지마 균주로부터 수득가능한 것을 특징으로 할 수 있다:
AF-02 (기탁 번호 NCYC 4294),
AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337),
AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336),
AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345),
AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344),
AF-07 (기탁 번호 CBS 146150),
AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389),
AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388),
AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 및
AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405).
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 균주는 하기로부터 선택되는 파피아 로도지마 균주이다:
AF-02 (기탁 번호 NCYC 4294),
AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337),
AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336),
AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345),
AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344),
AF-07 (기탁 번호 CBS 146150),
AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389),
AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388),
AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 및
AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405).
본 발명의 바람직한 효모 균주는 AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337), AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336), AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345), AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344), AF-07 (기탁 번호 CBS 146150), AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389), AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388), AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 또는 AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405)로부터 수득가능한 효모 균주이다. 본 발명의 특히 바람직한 효모 균주는 AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337), AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336), AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345), AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344), AF-07 (기탁 번호 CBS 146150), AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389), AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388), AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 또는 AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405)인 효모 균주이다.
AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337), AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336), AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345), AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344), AF-07 (기탁 번호 CBS 146150), AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389), AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388), AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 또는 AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405)로부터 수득가능한 본 발명에 따른 효모 균주는 예를 들어, (하기 "효모 균주의 수득 방법"에 기술된 바와 같은) 돌연변이유발법에 의해서 또는 균주내 번식에 의해서 수득될 수 있다. 번식은 예를 들어, 포자에서 포자로 또는 포자에서 세포로 또는 세포에서 세포 혼성화에 의할 수 있다. 바람직하게, 균주내 번식 (예를 들어, 혼성화) 이후에, 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 예를 들어, 3% (w/v) 또는 4% (w/v) 또는 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산하는 균주 능력에 대한 1라운드 이상의 선택이 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 균주는 AF-02 (기탁 번호 NCYC 4294), AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337), AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336), AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345), AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344), AF-07 (기탁 번호 CBS 146150) AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389), 및 AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388), AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 및 AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405) 중 어느 하나이거나 또는 그로부터 수득가능하고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개를 포함하는 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 균주는 AF-02 (기탁 번호 NCYC 4294), AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337), AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336), AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345), AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344), AF-07 (기탁 번호 CBS 146150) AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389), 및 AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388), AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 및 AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405) 중 어느 하나이거나, 또는 그로부터 수득가능하고 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6의 모든 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈을 포함한다.
본 발명의 임의의 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 또는 약 3.5% (w/v), 약 4% (w/v), 약 4.5% (w/v) 또는 약 5% (w/v), 또는 약 6% (w/v), 또는 약 7% (w/v), 또는 약 8% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.1배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.2배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.3배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 더 바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.5배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.1배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.2배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.3배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 더 바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 적어도 1.5배 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때, YP/S (탄소원 g 당 카로테노이드 생산량 mg)로 측정하여 적어도 1.2배 더 많은 카로테노이드의 수율을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때, YP/S (포도당 g 당 카로테노이드 생산량 mg)로 측정하여, 적어도 1.3배 더 많은 카로테노이드의 수율을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
보다 바람직하게, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때, YP/S (포도당 g 당 카로테노이드 생산량 mg)로 측정하여, 적어도 1.8배 더 많은 카로테노이드의 수율을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 본 명세서에서 언급되는 비교, 예를 들어, 1% (w/v) 탄소원에서의 배양 대 3% (w/v) 탄소원에서의 배양은 동일한 시간 기간 동안 오로지 탄소원의 양만이 상이한 성장 조건 하에서 카로테노이드 생산량의 비교이다. 각 경우에서 효모 균주에 대한 전형적인 배양 기간은 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 8일, 적어도 10일, 적어도 12일 또는 적어도 13일, 예를 들어 6일, 6.5일, 7일, 7.5일, 8일, 8.5일, 9일, 9.5일, 10일, 10.5일, 11일, 11.5일, 12일, 12.5일, 13일, 13.5일, 14일, 14.5일 또는 15일이다.
파피아 로도지마는 전형적으로, US5922560에 기술된 바와 같이, 파피아 로도지마의 높은 생산 규모에 전형적인 조건인, 2% 미만의 포도당 농도에서 최대량의 카로테노이드를 생산하기 때문에, 높은 농도의 탄소원 중에서 카로테노이드 (예를 들어, 아스타잔틴)의 증가된 생산량은 본 발명의 균주의 주목할만하고 놀라운 효과이다. 예를 들어, 카로테노이드의 합성은 15 g/L 초과의 포도당 농도, 즉, 1.5% (w/v) 포도당에서 특히 낮다는 것이 일반적인 관찰이다. 그러므로, 본 발명의 효모 균주는 발효배양 공정, 특히 대규모 발효배양 공정에서 전형적으로 존재하는 탄소원 농도의 변동에도 불구하고 높은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있다. 높은 탄소원 농도에서 이러한 효과가 일어나는 한편 동시에 효모 균주는 실시예에서 입증되는 바와 같이, 매우 높은 양의 카로테노이드를 생산한다는 것이 또한 주목할만하다. 이론에 국한하고 싶지 않지만, 본 발명의 균주는 고농도의 포도당 존재 하에서 카로테노이드 생산의 억제를 매개하는 경로와 독립적으로 이들 효과를 획득한다고 여겨진다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 고-카로테노이드 생산 "AF" 균주는 수크로스-기반 배지에서 성장할 수 있고 또한 혐기성 조건 하에서 에탄올 발효를 수행할 수 있어서, "AF" 균주에서 Snf1-Mig1 포도당 감지 경로가 이러한 효과의 근간이 되는 것이 아님을 의미한다. 더 나아가서, 본 명세서에 기술된 "AF" 균주는 다수의 상이한 탄소원 중에서 그들의 높은 카로테노이드 (및 그러므로, 아스타잔틴) 생산량을 유지하여, Snf1-Mig1 포도당 감지 경로가 이러한 효과에 요구되지 않는다는 것을 강조한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 균주는 고농도의 탄소원 (예를 들어, 포도당)의 존재 하에서 카로테노이드 생산의 탈-억제에 의존하지 않는다.
일부 구현예에서, 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v) 탄소원, 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서, 적어도 7.5일, 또는 예를 들어, 7.5일 동안 배양했을 때, 효모 건조 중량 g 당 적어도 7500 ㎍의 카로테노이드 양을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 예를 들어 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v) 탄소원, 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서, 적어도 7.5일, 또는 예를 들어, 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 12000 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게, 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 예를 들어 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v) 탄소원, 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서, 적어도 7.5일, 또는 예를 들어, 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 18000 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다. 보다 더 바람직하게, 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 예를 들어 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v) 탄소원, 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서, 적어도 7.5일, 또는 예를 들어, 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 35000 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 효모 균주는 또한 6일 동안 배양시켰을 때에 비해서 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일 또는 13일 배양에서 증가된 총량의 카로테노이드, 예를 들어, 6일 동안 배양시켰을 때에 비해서 1.2배 초과, 바람직하게 1.3배 초과, 보다 바람직하게 1.4배 초과로 더 많은 총 카로테노이드 양을 축적시킬 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 효모 균주는 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v) 탄소원, 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 6일 내지 13일의 배양 동안 1.4배 초과로 더 많은 카로테노이드 (예를 들어, 아스타잔틴)를 축적할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 모든 효모 균주에 따라서, 생산된 카로테노이드는 바람직하게 생산된 카로테노이드의 총량의 적어도 50% (w/w) 아스타잔틴이다.
본 발명의 파피아 균주의 대규모 발효배양 공정
본 발명은 또한 본 발명의 효모 균주의 대규모 발효배양에 의해 카로테노이드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 발효기에서 배양시키는 단계 이전에, 적합한 부피의 효모 성장 배지에서 효모 균주를 배양시키는 단계, 및 발효배양 종료 시에 세포량을 회수하는 단계 및 카로테노이드 (예를 들어, 아스타잔틴)를 추출하는 단계를 포함한다. 대규모 발효배양 공정에서, 탄소원 농도는 바람직하게 발효배양 전반에서 낮게, 예를 들어, 5 g/L 이하로 유지시킨다.
전형적인 대규모 발효배양 공정에서, 효모 균주의 루프를 페트리 디쉬로부터 채취하여 적합한 양의 효모 추출물 (에를 들어, 15 g/L) 및 탄소원 (예를 들어, 10 g/L)이 보충된 배지 (예를 들어, 20 mL)를 함유하는 플라스크 (예를 들어, 250 mL)에 접종할 수 있다. 플라스크는 효모를 증식시키기 위한 시간 기간 동안 적합한 온도에서, 예를 들어, 24시간 동안 20℃에서 교반하면서 인큐베이션된다. 이후에, 이 효모 현탁액의 일부분을 효모 성장 배지 (예를 들어, 500 mL)를 함유하는 더 큰 플라스크 (예를 들어, 5 L 엘렌메이어 플라스크)에 접종한다. 다음으로 더 큰 플라스크는 효모를 증식시키기 위한 시간 기간 동안 적합한 온도에서, 예를 들어, 48시간 내지 72시간 동안 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시킨다. 이후에, 효모 현탁액을 효모 성장 배지를 함유하는 발효기 (예를 들어, 7 L 또는 70 L)에 파종한다. 적합한 발효배양 시작 조건은 예를 들어: 1 v/v 통기, 300 rpm 교반, % 용존 산소 (DO2) 40, 20℃, 및 pH 5 내지 6이다. 종래 기술의 공정에서, 크랩트리 효과로 인해서, 탄소원 (예를 들어, 포도당) 용액은 전형적으로 유가식 발효배양으로 적용되는데 발효배양 전반에서, 탄소원 농도를 5 g/L (0.5% (w/v)) 이하, 바람직하게 2 g/L (0.2% (w/v)) 이하로 유지시키는 것이 필수적이기 때문이다. pH는 예를 들어, 암모니아를 사용하여 제어될 수 있다. 용존 산소는 40% 내지 75% 포화도의 기류 및 교반을 통해서 제어될 수 있다. 소포제가 필요에 따라서 첨가될 수 있다. 실시예 11은 적합한 발효배양 공정에 대한 추가 상세사항을 제공한다. 파피아 로도지마 세포를 함유하는 발효배양 액체배지가 바람직한 세포 밀도 또는 카로테노이드/아스타잔틴 함량에 도달된 후에, 세포량을 회수할 수 있다.
적합한 소규모-회분식 발효배양 및 유가식 발효배양 공정의 예는 참조로 편입되는, US 5,922,560에 기술되어 있다. 적합한 발효배양 공정의 다른 예는 예를 들어, 참조로 편입되는, [Yeast Strain Selection edited by Chandra J. Panchal, 1990, page 140], 또는 역시 그 전체 개시가 참조로 편입되는, US4232045, US3617306A, EP 0 237 427 B2에 기술되어 있다.
모든 이들 유가식 공정은 탄소원의 양을 일정 수준으로 유지시키는 것이 어렵고 공급 단계 동안 짧은 기간에 발효배양 현탁액 중에서 상당히, 즉 약 2% (w/v)를 초과하여 증가될 수 있어서, 에탄올 및 아세테이트같은 원치않는 발효 부산물의 대량 생산의 원인이 되는 강력한 크랩트리 효과를 초래하여, 그 결과 낮은 생물량, 및 상당히 감소된 카로테노이드 및 아스타잔틴 합성이 야기된다는 단점을 보유한다. 본 발명의 파피아 균주가 발효배양 배지 중에서 더 높은 양의 탄소원에 대해서 유의하게 더 내성이므로, 이들 균주는 아스타잔틴의 대규모 생산에 특히 적합하다. 또한, 적용되는 탄소원은 본 발명의 파피아 균주를 사용할 때, 카로테노이드, 특히 아스타잔틴의 생산 동안 보다 효율적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 균주의 용도
아스타잔틴은 식이 보충제, 예컨대 영양 보충제, 식품 보충제, 음료 보충제, 및 식품 첨가제 예컨대 식품 착색제로서 광범위하게 사용된다. 아스타잔틴은 또한 돼지 사료 및 달걀-생산 닭을 위한 사료 보충제로서도 사용될 수 있다. 이의 강력한 항산화 활성 덕분에, 아스타잔틴은 또한 인간 건강; 예를 들어, 파킨슨병, 심혈관 질환, 염증, 및 피부 건강; 심장 마비 후 재활 촉진; 및 면역계 기능 개선에서 다수의 이득을 갖는다. 따라서, 본 발명은 또한 아스타잔틴을 포함하는 식이 또는 식품 보충제를 제조하기 위한 본 발명의 균주의 용도를 제공한다.
아스타잔틴은 또한 미용 산업에서도 사용된다. 아스타잔틴은 피부 상에 직접적으로 위치될 수 있고 UV 손상, 공기 오염의 효과 및 다른 외부 영향을 최소화하고, 노화 과정을 둔화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 아스타잔틴을 포함하는 미용 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 균주의 용도를 제공한다.
아스타잔틴은 또한 양식 어류, 예컨대 연어, 송어, 게, 및 새우, 붉은살 자연산 어류를 제공하도록 양식업에서도 사용된다. 일반적으로 연어과 및 송어같은 양식 어류의 식사 (예를 들어, 양식 사료)에 포함된다. 따라서, 본 발명은 또한 아스타잔틴을 포함하는 염료를 제조하기 위한 본 발명의 균주의 용도를 제공한다. 염료는 유색 살, 바람직하게 생선살에 적합한다.
일 구현예에서, 본 발명은 아스타잔틴을 포함하는 제품을 제조하기 위한 본 발명의 균주의 용도를 제공한다. 제품은 식이 보충제, 영양 보충제, 식품 보충제, 음료 보충제, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 예컨대 사료 착색제; 인간 건강, 예를 들어 파킨슨병, 심혈관 질환의 치료, 심장 마비 후 재활 촉진, 또는 면역계 기능 개선을 위한 약학 조성물; 또는 미용 조성물일 수 있다.
효모 균주의 수득 방법
본 발명은 또한
a) 돌연변이 유발 조건 하에서 인큐베이션시켜서 파피아 로도지마의 효소 균주의 돌연변이를 유도시키는 단계, 및
b) 이로부터 수득된 카로테노이드 과생산 효모 균주를 선택하는 단계를 포함하는 파피아 로도지마의 카로테노이드 과생산 효모 균주를 수득하는 방법을 제공하고, 단계 b)에서 선택된 상기 카로테노이드 과생산 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 성장시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 또는 약 3.5% (w/v), 또는 약 4% (w/v), 또는 약 4.5% (w/v), 또는 약 5% (w/v), 또는 약 6% (w/v), 또는 약 7% (w/v), 또는 약 8% (w/v)의 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 단계 b)에서 선택된 상기 카로테노이드 과생산 효모 균주는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 발명에 따른 효모 균주이다.
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 crtE 로 명명된 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 erg20 으로 명명된 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에 2-점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 유전자 XDEN_00195에서, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실을 포함하는 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다. 위치 84078의 돌연변이는 인트론 돌연변이로 정의되는 반면, 위치 84206의 돌연변이는 엑손 돌연변이로서, 상보성 반대 가닥에서 코딩되는 유전자 XDEN_01573에서 히스티딘에서 티로신 아미노산 600으로의 치환 (코돈 CAT → TAT 염기 치환)을 초래한다.
바람직한 구현예에서, 선택된 효모 균주는 crtE 로 명명된 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이, 및 또한 erg20 로 명명된 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다.
특별한 구현예에서, 선택된 효모 균주는 하기에서 정의된 i) 내지 vi) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개를 포함하는 게놈을 포함한다:
i) 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:5에 표시된 점 돌연변이);
ii) 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:4에 표시된 점 돌연변이);
iii) 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:1에 표시된 점 돌연변이);
iv) 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:2에 표시된 점 돌연변이);
v) 유전자 XDEN_00195에 위치된, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:3에 표시된 돌연변이); 및
vi) 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:6에 표시된 점 돌연변이).
일부 구현예에서, 선택된 효모 균주는 i) 내지 vi)에 정의된 바와 같은 돌연변이의 전부를 포함하는 게놈을 포함한다.
본 발명은 또한
a) 돌연변이 유발 조건 하에서 인큐베이션시켜서 파피아 로도지마의 효모 균주의 돌연변이를 유도시키는 단계, 및
b) 이로부터 수득된 카로테노이드 과생산 효모 균주를 선택하는 단계를 포함하는, 파피아 로도지마의 카로테노이드 과생산 효모 균주를 수득하는 방법을 제공하고, 단계 b)에서 선택된 카로테노이드 과생산 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하고; 선택된 효모 균주는
i) 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이, 및/또는
ii) 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하고,
바람직하게, 단계 b)에서 선택된 카로테노이드 과생산 효모 균주는 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 효모 균주이다.
유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이는 예를 들어 표 20에 따른 SEQ ID NO:4에 표시된 점 돌연변이일 수 있다. 바람직하게, 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이는 G에서 A (구아닌에서 아데닌)로의 변화로서, crtE 에 의해 코딩되는 단백질에서 프롤린에서 세린으로의 아미노산 교환을 일으킨다 (상보성 반대 가닥 상에서 코딩되는 유전자 XDEN_05955에서 (코돈 CCG → TCG 염기 치환)).
유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에서 점 돌연변이는 예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:5에 표시된 점 돌연변이일 수 있다. 바람직하게, 유전자 XDEN_04715 (명칭: erg20)의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에서 점 돌연변이는 G에서 A (구아닌에서 아데닌)로의 변화이다.
선택된 효모 균주는
i) 유전자 XDEN_04715 (명칭: erg20)의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이, 및/또는
ii) 유전자 XDEN_05955 (명칭: crtE)에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함할 수 있고;
하기에 정의된 iii) 내지 vi) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개를 더 포함할 수 있다:
iii) 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:1에 표시된 점 돌연변이);
iv) 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:2에 표시된 점 돌연변이);
v) 유전자 XDEN_00195에 위치된, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:3에 표시된 돌여변이); 및/또는
vi) 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이 (예를 들어, 표 20에 따른 SEQ ID NO:6에 점 돌연변이).
전세계 모든 생물자원 센터 (예를 들어 ATCC, NCYC 및 CBS)는 상이한 야생형 파피아 로도지마 균주의 기탁물을 보유한다. 돌연변이유발법은 효모 세포에 유전자 변화를 일으키는 과정이고, DNA 복제 동안 돌연변이 빈도를 증가시켜서 효모 개체군 내에서 유전자 변이를 증가시키도록 적용된다. 돌연변이유발법은 자외선 (UV) 조사 (비-화학적 돌연변이유발)같은 물리적 작용제에 의해서 또는 화학 분자 예컨대 에틸메탄 술포네이트 (EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 및 디에틸 술페이트 (화학적 돌연변이유발)에 의해서 유도될 수 있다. 돌연변이유발은 전형적으로 무작위적이다. 과생산 아스타잔틴 균주를 수득하기 위해서, 비-화학적 돌연변이유발법 및 화학적 돌연변이유발법은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
전형적인 돌연변이유발 프로토콜 (예를 들어, EP0438182A1)에 따라서, 화학적 돌연변이원이 완충액 중 세포 현탁액에 첨가되고, 바이알은 15분 내지 2시간같은 지속적인 시간 동안 진탕 존재 하에서 또는 진탕없이 실온에서 인큐베이션된다. 돌연변이원에 노출 이후, 세포를 수집하고, 희석시키고 한천 배지 플레이트 상에 파종한다. 플레이트의 조성은 일반적으로 탄소원 (예컨대 포도당, 라피노스 등), 효모 추출물, 펩톤 및 한천을 함유한다. 세포는 유리 비드 또는 세포 스프레더 (Drigalskispatel)를 통해서 플레이트 표면 상에 분포시킨다. 파종된 플레이트를 반전시키고 예를 들어 대략 20℃에서 최대 10일 동안 인큐베이션시킨다. 유사한 배양 절차가 비-화학적 돌연변이유발에 사용될 수 있다.
각각의 돌연변이유발 주기 이후에, 효모 돌연변이체는 바람직한 성질에 대해서 스크리닝된다. 예를 들어, 돌연변이유발의 각 주기 이후에, 효모 세포는 육안 스크리닝을 통해서 쉽게 인지할 수 있는 개선된 색소형성의 출현까지 인큐베이션될 수 있다. 아스타잔틴 색소를 과생산하는 균주를 동정하기 위해서, 콜로니간 색소 편차를 강화시키는 선택적 배지 및/또는 스크리닝제를 사용할 수 있다.
플레이트를 육안으로 스크리닝하고 높은 색소형성 콜로니를 선택해 단리 파종한다. 이들 단리주를 인큐베이션 기간 (예를 들어, 대략 20℃에서 6-7일) 동안 성장 배지 (통상 탄소원, 펩톤, 및 효모 추출물을 함유)가 존재하는 플라스크 (예를 들어, 250 mL 엘렌메이어 플라스크)로 더 옮기고 나서, 총 카로테노이드 및 아스타잔틴 분석을 후속한다. 파피아 로도지마의 돌연변이유발 및 스크리닝의 예는 US5922560에 제공된다.
중요한 것은, 균주가 재조합 DNA 기술을 통해서 변형되지 않았다는 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 균주는 재조합 DNA 기술에 의해 변형되지 않았다.
최고의 전체 카로테노이드 및 아스타잔틴 수준의 단리된 균주는 매우 높은 아스타잔틴 농도를 보이고, 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 생산되는 카로테노이드의 양과 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원, 예컨대 약 3% (w/v) 내지 약 10% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 또는 약 3% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 또는 약 3.5% (w/v), 약 4% (w/v), 약 4.5% (w/v) 또는 약 5% (w/v), 또는 약 6% (w/v), 또는 약 7% (w/v), 또는 약 8% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산하는 균주를 수득하기 위해서 반복적인 돌연변이유발법에 사용된다. 일부 구현예에서, 1% (w/v) 탄소원에서 배양시켰을 때와 비교하여 3% (w/v) 탄소원에서 배양시켰을 때 생산된 카로테노이드의 비율은 적어도 1.1, 바람직하게 적어도 1.2, 보다 바람직하게 적어도 1.3이다. 일부 구현예에서, 1% (w/v) 탄소원에서 배양시켰을 때와 비교하여 5% (w/v) 탄소원에서 배양시켰을 때 생산된 카로테노이드의 비율은 적어도 1.1, 바람직하게 적어도 1.2, 보다 바람직하게 적어도 1.3이다.
일부 구현예에서, 방법에 의해 수득된 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 적어도 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 7500 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산할 수 있는 것을 더욱 특징으로 한다.
바람직하게, 방법으로 수득되는 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 적어도 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 12000 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산할 수 있는 것을 더욱 특징으로 한다.
보다 바람직하게, 방법으로 수득되는 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 적어도 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 18000 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산시킬 수 있는 것을 더욱 특징으로 한다.
보다 더 바람직하게, 방법으로 수득되는 효모 균주는 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 적어도 7.5일 동안 배양시켰을 때 효모 건조 중량 g 당 적어도 35000 ㎍의 카로테노이드의 양을 생산할 수 있는 것을 더욱 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 방법으로 수득되는 효모 균주는 6일 동안 배양시켰을 때에 비해서 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일 또는 13일 배양시에 증가된 카로테노이드의 총량, 예를 들어, 6일 동안 배양시켰을 때에 비해서 1.2배 초과, 바람직하게 1.3배 초과, 보다 바람직하게 1.4배 초과로 더 많은 증가된 카로테노이드의 총량을 축적할 수 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 방법으로 수득된 카로테노이드 과생산 효모 균주를 제공한다.
카로테노이드 추출 및 분석
본 발명은 또한 본 발명의 균주에 의해 생산되는 아스타잔틴을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 균주에 의해 생산되는 아스타잔틴은 조성물의 형태로 제공된다.
전체 카로테노이드 분석은 파피아 로도지마 과생산 균주의 조사에서 광범위하게 사용되고 문헌, 예를 들어, [Sedmak et.al, 1990]에 기술되어 있다. 이러한 프로토콜의 예는 다음과 같다. 세포를 수집하고, 예를 들어 탈이온수로 세척한다. 임의로, 세포벽은 예를 들어 [M. Michelon et al., 2012]에 기술된 바와 같은 효소 기술을 통해 파괴시킬 수 있다. 간략하게, 펠렛화된 세포는 0.2 M 소듐 아세테이트 완충액 pH=5.04 중 트리코더마 하르지아넘 (Trichoderma harzianum) 유래 용해 효소와 30분 동안 55℃에서 교반하면서 인큐베이션시키고 나서, 원심분리시키고 펠렛을 2회 증류수로 세척한다. 세척된 세포를 건조시키고, DMSO (대략 55℃로 예열) 중에 재현탁시킨다. 튜브를 힘차게 와류시키고 이후에 포스페이트 완충액 및 유기 용매를 첨가한다. 원심분리를 통해서 층을 분리시키고 유기층을 제거한다. 유기층의 샘플을 DMSO로 더욱 희석시킬 수 있고 470-495 nm에서 분광광도계를 통해 OD를 측정한다. 총 카로테노이드 함량은 470-495 nm에서의 흡광도로부터 결정된다.
카로테노이드 함량은 하기 방정식을 사용해 계산될 수 있다.
TC = (A/E) x 104 x 희석 배율
A는 흡광도 값이다.
E는 소광 계수이다.
(소광 계수 E=2150는 합성 아스타잔틴을 사용해 결정되었음).
아스타잔틴 추출 및 분석을 위해서, 효소 세포를 수집하고 탈이온수 또는 소듐 아세테이트 완충액 (0.2 M, pH=5.04)으로 세척하고 원심분리하여 펠렛화시킨다. 임의로, 세포벽은 예를 들어 [Michelon et al., 2012]에 이전에 기술된 바와 같은 효소 기술을 통해 파괴시킬 수 있다. 간략하게, 펠렛화된 세포는 0.2 M 소듐 아세테이트 완충액 pH=5.04 중 트리코더마 하르지아넘 유래 용해 효소와 30분 동안 55℃에서 교반하면서 인큐베이션시킨다. 이후에, 세포를 원심분리하고 펠렛은 증류수로 세척한다. 세척된 세포를 용기로 옮기고, 펠렛화시키고, 잔류수를 제거한다. 세포 펠렛은 예를 들어, 아세톤 및 유리 비드를 사용해 부수고 나서, 원심분리하여 세포 찌꺼기 및 유리 비드를 펠렛화시킨다.
수득된 용액 중 아스타잔틴 수준은 실리카 컬럼 및 헥산:아세톤 (예를 들어, 86:14) 이동상을 사용하는 순상 HPLC를 통해서 정량할 수 있다. 아스타잔틴 농도를 계산하기 위해서, 합성 아스타잔틴의 표준 그래프를 사용할 수 있다.
실시예
실시예 1: 아스타잔틴 과생산 균주의 개발
아스타잔틴을 과생산하는 파피아 로도지마 "AF" 균주 AF-02 (NCYC 4294), AF-03 (NCYC 4337), AF-04 (NCYC 4336), AF-05 (NCYC 4345), AF-06 (NCYC 4344), AF-07 (CBS 146150), AF-08 (NCYC 4389), AF-09 (NCYC 4388), AF-10 (NCYC 4406) 및 AF-11 (NCYC 4405)은 돌연변이유발 및 선택의 반복 주기의 고전적인 균주 개선 방법론을 사용하여 야생형 파피아 로도지마 균주로부터 수득되었다.
실시예 2: 균주 설명: 콜로니 형태
신규 균주의 콜로니 형태는 표준 YM-한천 플레이트 상에서 6일 및 10일 배양 이후에 관찰되었다. 결과는 표 1에 요약되어 있다.
표 1: 콜로니 형태
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 3: 3% (w/v) 탄소원을 함유하는 배지에서 성장하는 AF-파피아 로도지마 돌연변이체에서 높은 카로테노이드 생산
각각의 돌연변이체 균주에 대해서, 신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 2배 농축하였으며 농축된 세포 현탁액의 800 ㎕ 부피를 20 mL의 배지 (펩톤 0.5%, 효모 추출물 0.3%, 탄소원 3%, 및 맥아 추출물 0.3%)를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 7.5일 동안 교반하면서 인큐베이션시켰다. 돌연변이체 배양물의 카로테노이드 함량을 측정하였고 결과를 표 2, 3, 및 4에 요약하였다.
표 2: 파피아 로도지마 균주의 카로테노이드 함량
Figure pct00004
표 3: 파피아 로도지마 균주의 카로테노이드 함량
Figure pct00005
표 4: 파피아 로도지마 균주의 카로테노이드 함량
Figure pct00006
표 2, 3 및 4는 본 발명에 따른 신규 균주가 매우 높은 카로테노이드 수준, 7,500 ㎍ TC/g d.m. 이상, 및 심지어 35,000 ㎍ TC/g d.m. 이상을 생산한다는 것을 입증한다.
실시예 4: AF-파피아 로도지마 돌연변이체에서 아스타잔틴 생산
각각의 돌연변이체 균주에 대해서, 신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 48시간동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 2배 농축시켰으며 농축된 세포의 800 ㎕ 부피를 20 mL의 배지 (펩톤 0.5%, 1.5% 포도당, 효모 추출물 0.3%, 라피노스 1.5%, 및 맥아 추출물 0.3%)를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겨서 20℃에서 7.5일 동안 교반하면서 인큐베이션시켰다. 돌연변이체 배양물의 아스타잔틴 농도를 측정하였다. 결과는 표 5에 요약되었다.
표 5: 파피아 로도지마 균주의 아스타잔틴 함량
Figure pct00007
표 5는 본 발명에 따른 균주가 YM 배지에서 7.5일의 배양 이후에 높은 수준의 아스타잔틴, 13500 ㎍ 아스타잔틴/g d.m. 이상, 심지어 19000 ㎍ 아스타잔틴/g d.m. 이상을 생산한다는 것을 입증한다.
실시예 5: 3% 포도당 농도를 함유하는 배지에서 신규 AF 파피아 로도지마 돌연변이체의 성장은 1% 포도당 농도를 함유하는 배지에서의 성장과 비교하여 증가된 카로테노이드 생산을 야기시켰다
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축하였다. 농축된 세포의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL의 신선한 YM 배지와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 이후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 (TC) 함량을 측정하였다. YM 3% (w/v) 포도당 대 YM 1% (w/v) 포도당에서의 TC 생산 간 비교는 표 6.1에 표시되어 있다.
표 6.1: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 이후 TC 수준의 비율
Figure pct00008
표 6.1은 기준 균주, NCYC 4245 및 ATCC 74220과 달리, 본 발명에 따른 "AF" 균주가 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 포도당 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 카로테노이드를 생산한다는 것을 입증한다. "AF" 균주와 달리, 기준 균주인 NCYC 4245 및 ATCC 74220은 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 G를 함유하고, 그들은 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 G를 함유한다. 1% (w/v) 포도당이 존재하는 YM 배지와 비교하여 3% (w/v) 포도당이 존재하는 YM 배지에서 카로테노이드 생산의 비율은 기준 균주 ATCC 74220 및 NCYC 4245 각각에 대해서 0.63 및 0.80이고, 다시 말해서, 훨씬 적은 카로테노이드가 더 높은 포도당 농도에서 생산된다. 대조적으로, 본 발명에 따른 균주에 대한 비율은 적어도 1.1 (예를 들어, AF-04 참조)이고, 일부 균주 경우 (예를 들어, AF-02, AF-03, AF-05 및 AF-07 참조)에 적어도 1.3이고, 일부 균주 (예를 들어, AF-06, AF-08, AF-09, AF-10 및 AF-11 참조)는 적어도 1.8이다. 상기 표 6.1에서, AF-09 및 AF-11은 각각 2.57 및 2.16의 최고 비율을 보였다. 높은 비율이외에도, 전체 카로테노이드 함량은 AF-03 내지 AF-11 균주 경우에 YM 3% (w/v) 포도당에서 배양 이후에 매우 높다. 본 발명의 균주의 이들 특징은 전형적으로 매우 낮은 포도당 농도에서 배양시키는, 파피아 로도지마에서의 카로테노이드 생산에서는 예외적인 것이다 (예를 들어 US5922560).
아스타잔틴 함량을 측정한 것을 제외하고, 상기 기술된 것과 동일한 실험을 수행하였다. YM 3% (w/v) 대 YM 1% (w/v) 포도당에서의 아스타잔틴 생산 간 비율은 표 6.2에 표시되어 있다.
표 6.2: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 아스타잔틴 수준의 비율
Figure pct00009
표 6.2는 본 발명에 따른 "AF" 균주가 기준 균주인 NCYC 4245와 달리, 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 포도당 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다는 것을 입증한다. 기준 균주 NCYC 4245는 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 G를 함유하고, 그들은 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 G를 함유한다. 본 발명에 따른 균주에 대한 비율은 적어도 1.7 (예를 들어, AF-05 및 AF-10 참조)이고, 일부 균주 경우 (예를 들어, AF-11 참조) 적어도 2.1이고 일부 균주 (예를 들어, AF-07 및 AF-09 참조)는 적어도 2.4이다. 본 발명의 균주의 이들 특징은 파피아 로도지마에서의 아스타잔틴 생산에 있어서 예외적이다.
다음으로 YM 배지 대신에 YE 배지 (효모 추출물 4 g/L 및 포도당 함유)에서 유사한 실험을 수행하였다.
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축하였다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YE 배지 (효모 추출물 4 g/L 및 포도당 함유 배지)와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고, 전체 카로테노이드 (TC) 또는 아스타잔틴 함량을 측정하였다. YE 3% (w/v) 대 YE 1% (w/v) 포도당 중에서 TC 생산 간 비율은 표 6.3에 표시되어 있고 YE 3% (w/v) 대 YE 1% (w/v) 포도당에서의 아스타잔틴 생산 간 비율은 표 6.4에 표시되어 있다.
표 6.3: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당 보충 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00010
표 6.4: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당 보충 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 아스타잔틴 수준의 비율
Figure pct00011
Figure pct00012
표 6.3 및 6.4는 YE 배지를 사용하여 동일한 효과가 수득된 것을 입증한다. 본 발명에 따른 "AF" 균주는 기준 균주, NCYC 4245와 달리, 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 포도당 농도의 YE 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 TC 및 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다. 본 발명에 따른 균주에 대한 비율은 적어도 1.6이고 일부 균주 경우에 적어도 2.2로서, 본 발명의 균주의 특징이 파피아 로도지마 아스타잔틴 생산에 있어서 예외적이라는 것을 입증한다.
실시예 6: 3% 프룩토스 농도를 함유하는 배지에서 신규 AF 파피아 로도지마 돌연변이체의 성장은 1% 프룩토스 농도를 함유하는 배지에서 성장과 비교하여 증가된 카로테노이드 생산을 야기시켰다
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액은 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 (TC) 함량을 측정하였다. YM 3% (w/v) 대 YM 1% (w/v) 프룩토스 중에서 TC 생산 간 비율은 표 7.1에 표시되어 있다.
표 7.1: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00013
표 7.1은 본 발명에 따른 "AF" 균주가 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 프룩토스 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 카로테노이드를 생산한다는 것을 입증한다. 본 발명에 따른 균주에 대한, 1% (w/v) 프룩토스의 YM 배지와 비교하여 3% (w/v) 프룩토스의 YM 배지에서 카로테노이드 생산의 비율은 적어도 1.1 (예를 들어, AF-04 참조)이고, 일부 균주 (예를 들어, AF-02, AF-03 및 AF-10 참조)는 적어도 1.3이고, 일부 균주 경우 (예를 들어, AF-05, AF-06, AF-07, AF-08, AF-09 및 AF-11) 적어도 1.8이다.
아스타잔틴 함량을 측정한 것을 제외하고, 상기 기술된 바와 동일한 실험을 수행하였다. YM 3% (w/v) 대 YM 1% (w/v) 프룩토스 중에서 아스타잔틴 생산 간 비율은 표 7.2에 표시되어 있다.
표 7.2: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 아스타잔틴 수준의 비율
Figure pct00014
Figure pct00015
표 7.2는 본 발명에 따른 "AF" 균주가 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 프룩토스 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다는 것을 입증한다. 본 발명에 따른 이들 균주에 대해, 1% (w/v) 프룩토스의 YM 배지와 비교하여 3% (w/v) 프룩토스의 YM 배지에서의 아스타잔틴 생산의 비율은 적어도 1.5이다.
다음으로 YM 배지 대신에 YE 배지 (효모 추출물 4 g/L 프룩토스 함유)에서 유사한 실험을 수행하였다.
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YE 배지 (효모 추출물 4 g/L 및 프룩토스 함유 배지)와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 (TC) 또는 아스타잔틴 함량을 측정하였다. YE 3% (w/v) 대 YE 1% (w/v) 프룩토스 중에서 TC 생산 간 비율은 표 7.3에 표시되어 있고 YE 3% (w/v) 대 YE 1% (w/v) 프룩토스 중에서 아스타잔틴 생산 간 비율은 표 7.4에 표시되어 있다.
표 7.3: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스 보충 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00016
표 7.4: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스 보충 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 아스타잔틴 수준의 비율
Figure pct00017
Figure pct00018
표 7.3 및 7.4는 동일한 효과가 YE 배지를 사용해여 수득된다는 것을 입증한다. 본 발명에 따른 "AF" 균주는 기준 균주, NCYC 4245 및 야생형 균주와 달리, 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 프룩토스 농도의 YE 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 TC 및 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다. 본 발명에 따른 이들 균주에 대해, 1% (w/v) 프룩토스의 YE 배지와 비교하여 3% (w/v) 프룩토스의 YE 배지에서 아스타잔틴 생산의 비율은 적어도 1.4이다.
실시예 7: 3% 수크로스 농도를 함유하는 배지에서 신규 AF 파피아 로도지마 돌연변이체의 성장은 1% 수크로스 농도를 함유하는 배지에서 성장과 비교하여 증가된 카로테노이드 생산을 야기하였다
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 수크로스를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 (TC) 함량을 측정하였다. YM 3% (w/v) 대 YM 1% (w/v) 수크로스 중에서 TC 생산 간 비율은 표 8.1에 표시되어 있다.
표 8.1: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 수크로스 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00019
표 8.1은 본 발명에 따른 "AF" 균주가 기준 균주, ATCC 74220와 달리, 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 수크로스 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 카로테노이드를 생산한다는 것을 입증한다. 1% (w/v) 수크로스의 YM 배지와 비교하여 3% (w/v) 수크로스의 YM 배지에서 카로테노이드 생산의 비율은 기준 균주 ATCC 74220 경우에 0.91이고, 다시 말해서, 훨씬 적은 카로테노이드가 더 높은 수크로스 농도에서 생산된다. 대조적으로, 본 발명에 따른 균주에 대한 비율은 적어도 1.2 (예를 들어, AF-03 및 AF-04 참조)이고, 일부 균주 경우 (예를 들어, AF-02, AF-05, AF-07 및 AF-08 참조) 적어도 1.4이고, 일부 균주 (예를 들어, AF-06, AF-09, AF-10 및 AF-11 참조)는 적어도 2.0이다.
아스타잔틴 함량을 측정한 것을 제외하고, 상기 기술된 것과 동일한 실험을 수행하였다. YM 3% (w/v) 대 YM 1% (w/v) 수크로스 중에서 아스타잔틴 생산 간 비율은 표 8.2에 표시되어 있다.
표 8.2: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 수크로스 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 아스타잔틴 수준의 비율
Figure pct00020
표 8.2는 본 발명에 따른 "AF" 균주가 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 수크로스 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다는 것을 입증한다. 본 발명에 따른 이들 균주에 대한 비율은 적어도 2.0이다.
실시예 8: 3% 포도당 농도를 함유하는 배지에서 신규 파피아 로도지마 돌연변이체의 배양은 1% 포도당 농도를 함유하는 배지에서의 성장과 비교하여 증가된 아스타잔틴 생산을 야기시켰다
신선한 효모의 전체 접종 루프는 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 2일 이후에, 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 또는 YE 배지 (오직 효모 추출물 5 g/L 및 포도당만을 함유하는 배지)와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 6일 동안 인큐베이션시켰다. 이후에, 효모 세포를 수집하였고 아스타잔틴 수준을 결정하였다. 결과는 표 9에 요약되어 있다. 결과는 1% (w/v) 포도당의 YM 또는 YE 배지 중에서 아스타잔틴 생산 (㎍ 아스타잔틴/g d.m.)과 비교하여 3% (w/v) 포도당의 YM 또는 YE 배지 중 아스타잔틴 생산 (㎍ 아스타잔틴/g d.m.) 간 비율로서 표시된다.
표 9: 1% (w/v) 및 3% (w/v) 포도당 보충 YM 및 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 아스타잔틴 수준의 비율
Figure pct00021
표 9는 2종의 상이한 종류의 배지에서, AF-05 및 AF-06이 더 높은 (3% (w/v) 대 1% (w/v)) 포도당 농도의 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다는 것을 입증한다.
실시예 9: 카로테노이드 생산은 1% 포도당 또는 라피노스 농도를 함유하는 배지에서의 성장과 비교하여 5% 포도당 또는 라피노스 농도를 함유하는 배지에서 성장시킨 AF-파피아 로도지마 돌연변이체에서 증가되었다
9.1. 신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 160 ㎕ 부피를 8 mL 신선한 YM 배지와 1% 또는 5% (w/v) 포도당을 함유하는 50 mL의 튜브스핀 생물반응기로 옮겼고 20℃에서 100 rpm으로 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 함량 (TC)을 측정하였다. 결과는 표 10에 요약되어 있다.
표 10: 1% (w/v) 또는 5% (w/v) 포도당 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00022
9.2. 대안적인 실험에서, 신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 1% 및 5% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 (TC) 함량을 측정하였다. 결과는 표 11에 요약되어 있다.
표 11: 1% 및 5% 포도당 함유 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00023
표 10 및 11은 본 발명에 따른 신규 "AF" 균주가 1% (w/v) 대비 5% (w/v) 포도당 농도의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 카로테노이드를 생산한다는 것을 보여준다.
9.3. 추가 실험에서, 신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 1% 또는 5% (w/v) 라피노스를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 함량 (TC)을 측정하였다. YM 5% (w/v) 대 1% (w/v) 라피노스 중에서 TC 생산 간 비율은 표 12에 표시되어 있다.
표 12: 1% (w/v) 또는 5% (w/v) 라피노스 보충 YM 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 TC 수준의 비율
Figure pct00024
표 12는 본 발명에 따른 신규 "AF" 균주가 1% (w/v) 라피노스 농도 대비 5% (w/v)의 YM 배지에서 성장하면서 더 높은 수준의 카로테노이드를 생산한다는 보여준다.
실시예 10: 6일 내지 13일의 기간 동안 AF-파피아 로도지마 돌연변이체에서 전체 카로테노이드 생산의 증가
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일-13일 이후에, 효모 세포를 수집하였고 전체 카로테노이드 (TC) 함량을 측정하였다. 결과는 6일에 전체 카로테노이드 생산에 대한 비율로서 표 13에 제공된다.
표 13: 6일 내지 13일 배양 후 AF - 파피아 로도지마 돌연변이체에서 TC 수준의 비율
Figure pct00025
표 13은 본 발명에 따른 신규 균주가 6일 내지 13일의 배양 기간 동안 카로테노이드를 계속 생산하고 축적한다는 것을 입증한다.
실시예 11: 실험실-규모 발효배양 (7리터)
냉동 배양물의 루프를 YM의 페트리 디쉬 상에 옮겼고 20℃에서 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 페트리 디쉬로부터의 루프를 15 g/L 효모 추출물 및 10 g/L 포도당이 보충된 20 mL 배지를 함유하는 250 mL 플라스크에 접종하였다. 플라스크는 20℃에서 24시간 동안 교반하면서 인큐베이션시켰다. 다음으로, 2-7 mL의 효모 현탁액을 15 g/L 효모 추출물 및 10 g/L 포도당이 보충된 500 mL의 배지를 함유하는 5 L 엘렌메이어 플라스크에 접종하였다. 엘렌메이어 플라스크를 교반되는 20℃ 인큐베이터에 위치시켰다. 48-72시간 이후에, 효모 현탁액을 7 L 발효기에 파종하였다.
발효배양 시작 조건은 다음과 같았다: 1 vv 통기, 300 rpm 교반, DO2 40, 20℃ 및 pH 5-6. 포도당 용액은 포도당 농도를 2 g/L 이하로 유지시키기 위해서 유가식 발효배양으로 적용하였고, pH는 암모니아를 사용하여 제어하였다. 소포제가 필요하면 첨가되었다. 배지 조성, 미네랄 믹스 및 비타민 믹스는 하기에 제공된다.
표 14: 전형적인 배지 조성
Figure pct00026
표 15: 전형적인 미네랄 믹스
Figure pct00027
표 16: 전형적인 비타민 믹스
Figure pct00028
파일럿-규모 발효배양 (70리터)
60-80 g 성장 배양물이 존재하는 실험실 규모 발효기로부터의 약 3-4리터 성장 배지를 파일럿-규모 발효배양의 70리터 발효기에 접종하였다.
발효배양 시작 조건은 1 vv 통기, 300 rpm 교반, DO2 40, 20℃ 및 pH 5-6이었다. 배양물은 발효배양 전반에서 포도당 농도가 리터 당 5 그램 (g/L) 미만, 바람직하게 2 g/L 미만이 되는 비율로 60 중량% 용액으로서 포도당이 공급되었다. 발효배양 시작 시 포도당 농도는 1.15 g/L였다. 용존 산소는 40% 내지 75% 포화도의 기류 및 교반을 통해 제어되었다.
표 17: 전형적인 파일럿 배지 조성
Figure pct00029
AF-06, AF-07, AF-09, 및 AF-11의 전형적인 발효배양의 결과는 표 18에 표시되어 있다.
표 18: 7 L 발효기 중 TC 및 아스타잔틴 생산량
Figure pct00030
AF-03의 전형적인 발효배양의 결과는 표 19에 표시되어 있다.
표 19: 70 L 발효기 중 아스타잔틴 생산량
Figure pct00031
표 18은 AF-06, AF-07, AF-09 및 AF-11 균주가 7-리터 발효기에서 배양 동안 높은 수준의 전체 카로테노이드 및 아스타잔틴을 생산하였다는 것을 보여주고 표 19는 AF-03 균주가 70 리터 발효기에서 배양에도 불구하고 매우 높은 수준의 아스타잔틴을 생산한다는 것을 입증한다.
실시예 12: 본 발명에 따른 AF-02, AF-03, AF-04, AF-05, AF-06, AF-07, AF-08, AF-09, AF-10 및 AF-11 균주는 생어 (Sanger) 시퀀싱 분석으로 더욱 특징규명되었다
DNA 서열은 PCR을 사용하고 나서 3730xl 모세관 전기영동 장치 (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific) 상에서 Big-Dye 종결자 시퀀싱을 사용하는 생어 시퀀싱을 후속하여 얻었다. PCR은 하기 개시된 바와 같은 특이적 게놈 DNA 단편의 증폭을 위해 디자인된 프라이머를 사용하였다. PCR은 하기 조건 하에서 1.4 ng DNA를 사용하여, 표준 프로토콜 (DreamTaq Green PCR Master Mix (2X), ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용해 효모로부터 DNA를 준비한 후에 수행하였다: 95℃에서 5분 동안 초기 변성에 이어서, 30초 동안 95℃ 변성, 45초 동안 55℃ 또는 60℃ 어닐링, 및 1분 동안 72℃ 연장의 30 사이클.
표 20은 스캐폴드, 사용된 고유 프라이머 세트, 및 AF-02, AF-03, AF-04, AF-05, AF-06, AF-07, AF-08, AF-09, AF-10 및 AF-11 균주에 존재하는 6개의 증폭된 게놈 DNA 단편을 표시한다. 모든 상기 균주는 표 20에 기재된 바와 같은 서열을 함유하고 - 첨부된 서열 목록을 또한 참조한다. 본 발명의 균주의 돌연변이 및 점 돌연변이는 밑줄과 굵은체로 표시된다.
표 20: AF -02, AF -03, AF -04, AF -05, AF -06, AF-07, AF-08, AF-09, AF-10 및 AF-11 균주의 게놈에 대한 PCR 앰플리콘으로부터의 PCR 결과
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
실시예 13: 생성된 효모 균주의 게놈 마커를 분석하였다
게놈 DNA는 제조사의 설명서에 따라서 Nextera XT 키트 (Illumina, San Diego, CA)를 사용해 시퀀싱을 위해 제조하였다. 처리 후에, 라이브러리는 Agilent TapeStation 2000 자동화 전기영동 장치 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 크기, 및 Qubit 형광계 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)에 의해 농도에 대해 평가되었다. DNA 라이브러리는 등몰 비율로 풀링되었고, 쌍형성-말단 2x150 염기 판독으로, Illumina NextSeq500 서열분석기를 사용하여 시퀀싱되었다. 적어도 250x의 커버리지를 사용하여 적어도 1000 bp 길이 contig를 제공하는 생물정보학 분석을 수행하였다. 카피수 변동을 커버리지를 기반으로 각 게놈에 대해 개별적으로 평가하여, 게놈-와이드 중앙값으로부터 대규모 변동을 찾았다.
본 발명에 따른 균주는 모든 대립유전자에서, 하기 기술된 바와 같이, 점 돌연변이를 특징으로 하는 것으로 확인되었다. 대조적으로, ENA 데이터베이스에 위치된 체계적 시퀀싱 프로젝트에서 사용된 효모 균주 CBS6938 [등록 ID LN483084-LN483350, (Sharma et al 2015)]에서는, 상기 유전자에 이러한 점 돌연변이가 존재하지 않는다. 본 명세서에서 표시되는 모든 돌연변이 또는 변형은 파피아 로도지마 야생형 균주와의 비교에 관한 것이다.
. 스캐폴드 79에 위치된 crtE 로 명명된 유전자 XDEN_05955는 - 아미노산 교환 (프롤린의 세린으로의 교환)을 초래하는, 위치 1540450에 점 돌연변이 (G에서 A로의 변화)를 포함한다.
. 스캐폴드 69에 위치된 erg20 으로 명명된 유전자 XDEN_04715는 - 상류 영역에서 위치 2028187에 점 돌연변이를 포함한다.
실시예 14: 전체 카로테노이드 함량 중 아스타잔틴의 백분율
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300 내지 400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YM 배지와 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고, 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 7일 이후에, 효모 세포를 수집하였고, 전체 카로테노이드 (TC) 함량 및 아스타잔틴 양을 측정하였다. TC 함량 (w/w) 중 아스타잔틴의 백분율은 하기 식에 따라서 계산하였다:
% 아스타잔틴 = 아스타잔틴 양/TC 함량 *100
결과는 표 21에 요약되어 있다.
표 21: TC 함량 (w/w) 중 아스타잔틴의 백분율.
Figure pct00035
표 21에서 입증된 바와 같이, 아스타잔틴은 전체 카로테노이드 중 적어도 50% (w/w)이다.
실시예 15: 3% 포도당 농도를 함유하는 배지에서 신규 AF 파피아 로도지마 돌연변이체의 성장은 1% 포도당 농도를 함유하는 배지에서의 성장과 비교하여 증강된 Y P/S (포도당 g 당 아스타잔틴 생산량 (mg))를 야기시켰다
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YE 배지 (효모 추출물 4 g/L 및 포도당 함유)와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 포도당 그램 당 아스타잔틴 생산량 (mg)의 수율 (YP/S)을 측정하였다. YE 3% (w/v) 대 YE 1% (w/v) 포도당 중에서 YP /S 간 비율은 표 22에 표시되어 있다.
표 22: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 포도당 보충 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 Y P /S 의 비율
Figure pct00036
상기 예시된 바와 같이, 본 발명의 개선된 균주는 1% 포도당 농도를 포함하는 배지와 비교하여 3% 포도당 농도를 포함하는 배지에서 성장되었을 때, 감소된 Y P/S 를 갖는, 야생형 및 기준 균주와 달리, 증가된 Y P/S (포도당 g 당 아스타잔틴 생산량 (mg))를 갖는다. 본 발명에 따른 균주에 대해서, 1% (w/v) 포도당의 YE 배지와 비교하여 3% (w/v) 포도당의 YE 배지에서 아스타잔틴 생산 (Y P/S )의 증가된 비율은 적어도 1.2 (예를 들어, AF-03 참조)이고, 일부 균주 경우 (예를 들어, AF-02, AF-04 및 AF-06 참조)에 적어도 1.3이고, 일부 균주 (예를 들어, AF-05, AF-07, AF-08, AF-09, AF-10 및 AF-11 참조)는 적어도 1.8이다.
실시예 16: 3% 프룩토스 농도를 함유하는 배지에서 신규 AF 파피아 로도지마 돌연변이체의 성장은 1% 프룩토스 농도를 함유하는 배지에서의 성장과 비교하여 증강된 Y P/S (프룩토스 g 당 아스타잔틴 생산량 (mg))를 야기시켰다
신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 대략 3배 (20 mL에서 6 mL로) 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 300-400 ㎕ 부피를 20 mL 신선한 YE 배지 (효모 추출물 4 g/L 및 프룩토스 함유)와 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 6일 후에, 효모 세포를 수집하였고 프룩토스 그램 당 아스타잔틴 생산량 (mg) (YP/S)을 측정하였다. YE 3% (w/v) 대 YE 1% (w/v) 프룩토스 중에서 YP /S 간 비율은 표 23에 표시되어 있다.
표 23: 1% (w/v) 또는 3% (w/v) 프룩토스 보충 YE 배지 중 파피아 로도지마 돌연변이체의 6일 배양 후 Y P /S 의 비율
Figure pct00037
상기 예시된 바와 같이, 본 발명의 개선된 균주는, 1% 프룩토스 농도를 포함하는 배지와 비교하여 3% 프룩토스 농도를 포함하는 배지에서 성장시켰을 때, 0.7 이하의 감소된 Y P/S 를 갖는, 야생형 및 기준 균주와 달리, 적어도 1.2의 증가된 Y P/S (프룩토스 g 당 아스타잔틴 생산량 (mg))를 갖는다.
실시예 17: 혐기성 발효배양 조건 하에서 신규 AF 파피아 로도지마 돌연변이체에 의해 생산된 에탄올 농도의 측정
각각의 돌연변이체 균주에 대해서, 신선한 효모의 전체 접종 루프를 YM 한천 플레이트로부터 20 mL YM 배지와 1% (w/v) 포도당을 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 진탕 인큐베이터에 20℃에서 교반하면서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액을 무균적으로 수집하였고 18 mL 부피의 세포 현탁액을 220 mL의 YM 배지와 3% (w/v) 포도당을 함유하는 5000 mL 엘렌메이어 플라스크로 옮겼고 20℃에서 2일 동안 교반하면서 인큐베이션시켰다. 세포를 YM 배지에서 인큐베이션시킨 이후에, 그들을 발효배양 단계에 제공하였다. 세포 현탁액 중 10 mL을 무균적으로 수집하였고 원심분리하였으며 상청액을 버린 후에, 세포 펠렛을 2% (w/v) 수크로스가 존재하는 10 mL 부피의 YM 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 중 5 mL 부피를 이어서 밸브를 갖는 실리콘 스토퍼로 밀봉되고 50 mL의 YM 배지와 2% (w/v) 수크로스를 함유하는 250 mL 엘렌메이어 플라스크로 혐기성 발효배양을 위해서 옮겼다. 2일 후에 발효배양을 중지하였고, 효모 세포는 원심분리를 사용하여 발효배양 배지의 액체 부분과 분리시켰다. 발효배양된 배지 샘플 중 에탄올 농도 (g/l)는 HPLC를 사용하여 결정하였고, 세포 증식은 발효배양 종료시 생물량 (g/l d.m.)을 발효배양 시작 시 세포 생물량 (g/l d.m.)과 비교하여 결정하였다.
표 24: 수크로스 발효배양 및 세포 증식의 2일 후 에탄올 농도 (g/l) (성장 시작 시 및 2% (w/v) 수크로스와 2일 인큐베이션 후 생물량 g/l의 비율)
Figure pct00038
표 24는 본 발명의 "AF" 균주가 탄소원으로서 수크로스 상에서 성장될 수 있고 그들이 고농도의 에탄올을 산출하는, 혐기성 조건 하에서 수크로스를 에탄올로 발효시키는 능력을 갖는다는 것을 예시한다.
SEQUENCE LISTING <110> NEXTFERM Technologies Ltd <120> ASTAXANTHIN OVER-PRODUCING STRAINS OF PHAFFIA RHODOZYMA <130> NXF19150PCT <160> 18 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 218 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> Scaffold 242 <400> 1 agggaacgaa acagttgccg aacgaccatg aagaagtgta tataagaagc gccggaatca 60 ggtcgtccat gttcacttct ctctttctca tcccctctcc atcactgttc gatttcaatt 120 cacttcctca ataacttcca ttcatccaat gtcccattca caaggcgata tcgttgtcta 180 tccggatgaa gcacctcctc tctatgatga tcggccat 218 <210> 2 <211> 758 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> Scaffold 88 <400> 2 tcatatacaa acatgctaac ggcgaagtta ggcctcgtat acggctcaat cgttgcagag 60 gcctttctga ggcatcaata ccctaatggg cagagcctca tccagcgctc acaagagtgc 120 tctaaaaagt atagggctct actagcccct aaaggtttat aagtagagct tccatagctc 180 tctaaggcgc aaagccaaaa agaagaatag tatcctcttc caaatcaaca agccaatggc 240 tatttctcaa aagtcctctg cgagggagag cgctcgacgt cacatgtcct ttccgacgct 300 ctgacgagta caatacctca atagccaata gagaccgctt aaacttacca aagagggctc 360 tagaggctac aagagttttt caagaatggg gtaacacccc tcaaagcggg gtccattacc 420 cctagcaagc taaacaaaag caaaggcgtt ctctgcagag taaagccgaa gctaaacaaa 480 gtttaaaagc tagagctttt ctcagtactc aaagagctca gaggctaagc ctcctatcta 540 tgccatccaa aagcagatag ataggagtgc ttagagtgaa agctcgtaga gtaccgcgca 600 catgcgcctt cctcccttac gaggaaagct ttcaaagttt aaaaatttct tcaaagcttt 660 ccgagaacaa tagctctcgg agctcagaga gcaaggataa gcgcttctac tccgtagaga 720 gtagaaagag ctctttcctt gcaaagactc ccgcaaag 758 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> Scaffold 162 <400> 3 aaggtcatat gttacgatat gtggccgtaa ccacatgaca cgcgtcgcgt cgcgtgtccg 60 tctcgcgcgt cgcgtctctg ttggccggtg cgggcttgtg tgcgcatggg ttcgtcgttc 120 gagagagaga gagagagaga gtggtcctgc tcggcgtaca tcgatatcat gatggctcac 180 atatatatat atatcacact cggaaagaag attacaaggt tttggttctg tctctcttga 240 ttctttcctc ctcctccttc ttcttctcct tcttcttctc ttttgtcctc ttctttcctc 300 cactttagaa ccacaaactc ttgatgcctc ctcggatggc gttccacccg gtggtaccta 360 caaatgcggc gttgtcgatc tttgtctgca attcatagta gttctcgagt cgacgtttga 420 gaaagtcgcg cgttgacggc atcgacggtt cgttcaacgg aagcgagagc tggtgaagct 480 cagtggagag gtacaagagt gagagtggta atgactcgtg caagttctga acagcgttat 540 ggagagatcg cgagatcgcg agattgacag agatacaacg ttaatagagt cctgaagctg 600 a 601 <210> 4 <211> 234 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> Scaffold 79 <400> 4 ctttatcaag atacgtatct ttcgagaacg gaatctgcga attaggagtt gacgtgcccc 60 cgttttcaga cgaggccgag gaggaggagg atgcagagga gacggatgat tgaagcgaag 120 cagatgaagg aggaattaca ggcatgggta tcgatgttgg gcgaagcttg aagatctctt 180 gataagccag aaagtagacg tagtttgcac tataatccat agtagttatc cggt 234 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> Scaffold 69 <400> 5 atatgttcaa aatgtcaggc gagttctcgg gagaaaaaaa aagcgtgggc tctgaaacag 60 tgtggaaatg tctacaaagt gagctggatt 90 <210> 6 <211> 345 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <223> Scaffold 24 <400> 6 gaagaagaga gcaacattgg aagaaacaac gttgtcgtcg tcctgctcgt cctctgggat 60 ttcgttcaac ttctcctgaa gcattctagc gtaagtctca ctagaaattt cgaaatagcc 120 gccagtgcag agagggaaag caggtagaat cagcaaacta gcacggtcga ctaatataat 180 tgaaaaaaag aaagaaaaac acaaagctct cacctaagct cctccatctt cgcagctcga 240 tccttctctg ggtcgtaagc caaatgtctt ttcaaaacca tcgtctccca caagctcaag 300 tgtcgtttgt gaacggcgat tccatagtat tctccagcct tacca 345 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 242 - primer 1 <400> 7 cccacagaga gataaagaga gaga 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 242 - primer 2 <400> 8 tactagagga gaggaggtga ga 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 88 - primer 1 <400> 9 gttcatcctt ctacaccacc taat 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 88 - primer 2 <400> 10 ctcactcttt ctacaccact ctg 23 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 162 - primer 1 <400> 11 cacccaaagc gtttagaa 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 162 - primer 2 <400> 12 cattccctgt cctgaatc 18 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 79 - primer 1 <400> 13 aaagaccatt cgctcacttc c 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 79 - primer 2 <400> 14 catcccatct ctgtgtgtgt tc 22 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 69 - primer 1 <400> 15 gcaaggtccg agagtatt 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 69 - primer 2 <400> 16 tacagtgagc aaccaaca 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 24 - primer 1 <400> 17 tgatggtcaa agggagaagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scaffold 24 - primer 2 <400> 18 acagagagca agagcgatac 20

Claims (14)

  1. 파피아 로도지마 (Phaffia rhodozyma)의 효모 균주로서, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하고,
    i) 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이, 및/또는
    ii) 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 것인, 효모 균주.
  2. 제1항에 있어서, 효모 균주는 하기에 정의된 iii) 내지 vi) 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개를 포함하는 게놈을 더 포함하는 것인 효모 균주:
    iii) 유전자 XDEN_00738의 상류에서, 스캐폴드 242의 위치 318703 및 318738에 2-점 돌연변이;
    iv) 유전자 XDEN_06229의 하류에서, 스캐폴드 88의 위치 855 및 1020에 2-점 돌연변이;
    v) 유전자 XDEN_00195에 위치하는, 스캐폴드 162의 위치 213879 바로 뒤에 2개 염기의 결실; 및
    vi) 유전자 XDEN_01573에서, 스캐폴드 24의 위치 84078 및 84206에 2-점 돌연변이.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이는 프롤린에서 세린으로 아미노산 교환을 야기하는, G에서 A로의 변화인 효모 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 점 돌연변이(들)는 상기 유전자(들)의 대립유전자 중 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모두에 존재하는 것인 효모 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개를 포함하는 게놈을 포함하는 것인 효모 균주.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 효모 균주는 하기로부터 선택되는 파피아 로도지마 균주에서 수득가능한 것을 특징으로 하는 것인 효모 균주:
    AF-02 (기탁 번호 NCYC 4294),
    AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337),
    AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336),
    AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345),
    AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344),
    AF-07 (기탁 번호 CBS 146150),
    AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389),
    AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388),
    AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 및
    AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 효모 균주는 하기로부터 선택되는 것인 효모 균주:
    AF-02 (기탁 번호 NCYC 4294),
    AF-03 (기탁 번호 NCYC 4337),
    AF-04 (기탁 번호 NCYC 4336),
    AF-05 (기탁 번호 NCYC 4345),
    AF-06 (기탁 번호 NCYC 4344),
    AF-07 (기탁 번호 CBS 146150),
    AF-08 (기탁 번호 NCYC 4389),
    AF-09 (기탁 번호 NCYC 4388),
    AF-10 (기탁 번호 NCYC 4406), 및
    AF-11 (기탁 번호 NCYC 4405).
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 5% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 것인 효모 균주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 효모 균주의 발효배양에 의한 카로테노이드의 제조 방법.
  10. 파피아 로도지마의 카로테노이드 과생산 효모 균주의 수득 방법으로서,
    a) 돌연변이유발 조건 하에서 인큐베이션시켜서 파피아 로도지마의 효모 균주의 돌연변이를 유도시키는 단계, 및
    b) 이로부터 수득된 카로테노이드 과생산 효모 균주를 선택하는 단계를 포함하고,
    단계 b)에서 선택된 카로테노이드 과생산 효모 균주는 1% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때와 비교하여 적어도 3% (w/v) 탄소원을 포함하는 효모 성장 배지에서 배양시켰을 때 더 많은 양의 카로테노이드를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하고; 선택된 효모 균주는
    i) 유전자 XDEN_04715의 상류 영역에서, 스캐폴드 69의 위치 2028187에 점 돌연변이, 및/또는
    ii) 유전자 XDEN_05955에서 스캐폴드 79의 위치 1540450에 점 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하고,
    바람직하게, 단계 b)에서 선택된 상기 카로테노이드 과생산 효모 균주는 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 효모 균주인, 수득 방법.
  11. 탄소원은 포도당, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 라피노스, 자일로스, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 효모 균주, 제9항의 제조 방법, 또는 제10항의 수득 방법.
  12. 제10항 또는 제11항의 방법으로 수득된 카로테노이드 과생산 효모 균주.
  13. 카로테노이드는 적어도 50% (w/w) 아스타잔틴인, 제1항 내지 제8항 또는 제11항 중 어느 하나의 항의 효모 균주, 제9항의 제조 방법, 제10항 또는 제11항의 방법, 또는 제12항의 카로테노이드 과생산 효모 균주.
  14. 아스타잔틴을 포함하는 제품을 생산하기 위한 제1항 내지 제8항, 제11항 또는 제13항 중 어느 하나의 항의 효모 균주, 또는 제12항의 카로테노이드 과생산 효모 균주의 용도로서, 제품은 식이 보충제, 영양 보충제, 식품 보충제, 음료 보충제, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 예컨대 사료 착색제; 인간의 건강, 예를 들어 파킨슨병, 심혈관 질환의 치료, 심장 마비 후 재활의 촉진, 또는 면역계 기능의 개선을 위한 약학 조성물; 또는 미용 조성물인, 용도.
KR1020227005448A 2019-07-26 2020-07-24 파피아 로도지마의 아스타잔틴 과생산 균주 KR20220063159A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19188637.3 2019-07-26
EP19188637 2019-07-26
EP19218701.1A EP3839056A1 (en) 2019-12-20 2019-12-20 Astaxanthin over-producing strains of phaffia rhodozyma
EP19218701.1 2019-12-20
PCT/IB2020/057033 WO2021019409A1 (en) 2019-07-26 2020-07-24 Astaxanthin over-producing strains of phaffia rhodozyma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220063159A true KR20220063159A (ko) 2022-05-17

Family

ID=71787008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227005448A KR20220063159A (ko) 2019-07-26 2020-07-24 파피아 로도지마의 아스타잔틴 과생산 균주

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220290119A1 (ko)
EP (1) EP4004225A1 (ko)
KR (1) KR20220063159A (ko)
CN (1) CN115176024A (ko)
AU (1) AU2020320436A1 (ko)
CA (1) CA3148418A1 (ko)
IL (1) IL290098A (ko)
MX (1) MX2022001091A (ko)
WO (1) WO2021019409A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113512504B (zh) * 2021-08-18 2024-02-02 南京工业大学 一株产虾青素菌株及其应用
CN116590160B (zh) * 2023-07-11 2023-09-05 山东合成远景生物科技有限公司 一种红法夫酵母菌诱变菌株hcyj-07及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3617306A (en) 1970-01-20 1971-11-02 Standard Brands Inc Propagation of yeast
US4232045A (en) 1977-10-06 1980-11-04 Standard Brands Incorporated Preparation of free-flowing particulate yeast
CA1299435C (en) 1986-03-07 1992-04-28 Jean Goux Free flowing frozen particulate yeasts and use of these novel yeasts in frozen doughs
US5356809A (en) 1988-08-08 1994-10-18 Igene Biotechnology, Inc. Processes for in vivo production of astaxanthin and phaffia rhodozyma yeast of enhanced astaxanthin content
CA2027835A1 (en) 1990-01-19 1991-07-20 William D. Prevatt Strains of phaffia rhodozyma containing high levels of astaxanthin
US5466599A (en) 1993-04-19 1995-11-14 Universal Foods Corporation Astaxanthin over-producing strains of phaffia rhodozyma

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021019409A1 (en) 2021-02-04
CA3148418A1 (en) 2021-02-04
AU2020320436A1 (en) 2022-03-03
EP4004225A1 (en) 2022-06-01
MX2022001091A (es) 2022-04-20
US20220290119A1 (en) 2022-09-15
IL290098A (en) 2022-03-01
CN115176024A (zh) 2022-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rodríguez-Sáiz et al. Xanthophyllomyces dendrorhous for the industrial production of astaxanthin
US10240215B2 (en) Method for producing astaxanthin by fermentation
EP3478850A1 (en) Improved heterotrophic production methods for microbial biomass and bioproducts
WO2001096591A9 (fr) Procede pour produire des pigments carotenoides
KR20220063159A (ko) 파피아 로도지마의 아스타잔틴 과생산 균주
EP1676925B1 (en) Process for producing zeaxanthin and beta-cryptoxanthin
EP1479777A1 (en) Method of producing astaxanthin by fermenting selected strains of xanthophyllomyces dendrorhous
TW200934872A (en) A strain of genetically reengineered escherichia coli for biosynthesis of high yield carotenoids after mutation screening
CN105087627B (zh) 一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用
EP3839056A1 (en) Astaxanthin over-producing strains of phaffia rhodozyma
JP2004129504A (ja) アスタキサンチン含有脂質の製造方法
Lukács et al. Phaffia rhodozyma and Xanthophyllomyces dendrorhous: astaxanthin-producing yeasts of biotechnological importance: A minireview
JP4486883B2 (ja) カロテノイドを作製する方法
KR100249731B1 (ko) 아스타산틴 생산 효모 돌연변이주 및 이의 제조방법
CN108699508A (zh) 利用基于含钴培养基的产类胡萝卜素细菌进行的类胡萝卜素的发酵制造方法
JP6132905B2 (ja) ゼアキサンチンの製造方法及び細菌の培養方法
Acheampong Some aspects of the taxonomy, genetics, carotenogenesis and chemical composition of a red yeast Rhodotorula rubra TP1
JP2007181451A (ja) 新規微生物およびそれを用いたカロテノイド類の製造方法