JP4486883B2 - カロテノイドを作製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、カロテノイドを産生することが可能でありかつキサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）（ファフィア（Phaffia））属に属する微生物を利用して、ファルネシルピロリン酸（以下、FPPという）由来のステロイド生合成阻害剤の存在下でカロテノイドを産生する生物学的方法に関する。

600種を上回る様々なカロテノイドが、細菌、酵母、真菌、および植物中で見いだされるカロテノイド産生性（carotenogenic）の生物から開示されてきた。現在は、それらの内の2つであるβ-カロチンおよびアスタキサンチンのみが、微生物において商業的に作製され、食品および飼料産業において用いられている。これらのカロテノイドは強い抗酸化性の特性を有するので、天然色素として、およびヒトの健康に対する機能的な物質として産業上重要である。さらに、アスタキサンチンは、魚を独特なオレンジ-赤色に着色し、これが消費者へのアピールに貢献するので、商業的な見地から、特にサケの養殖など魚の養殖産業において、着色剤としてのアスタキサンチンに対する需要が増加している。

他のカロテノイド、例えばリコピン、ジアキサンチン、カンタキサンチン、およびβ-クリプトキサンチンもまた、天然色素および抗酸化剤として産業上重要である。リコピンは、インビトロで行われる実験において、一重項酸素を効率的にクエンチすることが示されている。リコピンは、脂質の過酸化を阻害するが、このカルチノイドの血清レベルは、膵臓および頚部における癌の危険性に反比例する。トマト、ピンクグレープフルーツ、赤ブドウの皮、スイカ、および赤グアバのような果物および野菜の赤色は、リコピンが原因である。他の食物供給源には、パパイヤおよびアプリコットが含まれる。ジアキサンチンは黄色のカロテノイドであり、β-カロチンの酸化ヒドロキシ誘導体である。ジアキサンチンは、ホウレンソウおよびトウモロコシ、ならびに多くの他の植物の種子に豊富である。これは、強い抗酸物であり、網膜中でも見られる。ジアキサンチンは、フィルターとなって目を有害な青色光から防御し、年齢に関連する黄班変性に対して目を保護するように作用すると広く信じられている。カンタキサンチンは赤色のカロテノイドであり、多くの植物および動物において見られる。これは、卵の黄身、ブロイラー、養殖マスの着色に用いられ、更にオレンジ-赤色が要求される食品および化粧品において用いられる。カンタキサンチンはまた、一重項酸素のクエンチャ（quencher）およびフリーラジカルの不活性化剤としても機能する。β-クリプトキサンチンは、オレンジ、マンゴー、パパイヤ、カボチャおよびその他多くの果物に見られる、黄色のカロテノイドである。β-クリプトキサンチンも、癌の予防のために有用な強い抗酸化剤として認識されている。

顕著な量のカロテノイドを産生できる微生物の中で、ファフィア・ロドジーマ（Phaffia rhodozyma）は、最もよく知られたカロテノイド産生株の一つである。この酵母株はアスタキサンチンを産生し、食品産業および飼料産業においてアスタキサンチンを提供するために現在用いられている数少ない微生物の一つである。最近の分類学的な研究において、ファフィア・ロドジーマの性サイクルが明らかにされ、終末形態の（telemorphic）状態がキサントフィロマイセス・デンデロース（Xanthophyllomyces dendrorhous）[Golubev、Yeast 11:101-110(1995)]と命名された。本明細書においては、広く認識された名前であるファフィア・ロドジーマを用いる。

例えば、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、または、カンジダ・ユーチリス（Candida utilis）のような適切な宿主株を用いていくつかのカロテノイドの顕著な量を産生する能力を得るために遺伝子操作された組み換え微生物の構築[Misawaら、J.Bacteriol. 172:6704(1990); Yamamotoら、Biosci.Biotech.Biochem.58:1112(1994);Miuraら、Biotechnol.Bioeng.58:306(1998)]、例えば、ファフィア・ロドジーマからのアスタキサンチン高産生体を得るための株の改良[Johnsonら、Critical Reviews in Biotechnology 11:297-326(1991)]、および例えば、ファフィア・ロドジーマによるアスタキサンチン産生のための醗酵過程を最適化するための方法の改良[米国特許第5,972,642号]を含む、微生物によるカロテノイド産生レベルを増加するためのいくつかの研究が行われた。米国特許第5,356,809号において、アンチマイシンまたはその他の主要呼吸鎖阻害剤をファフィア・ロドジーマ細胞に投与すると、アスタキサンチン産生が促進されることが開示された。しかし、これは、より効率的または便利な方法ではない。カロテノイド産生の収量を増加させるための単純かつ効率的な方法が未だ必要であることは、明らかである。

本発明の一つの態様は、有酸素条件下の水性栄養培地において、FPP由来のステロール生合成阻害剤の存在下で、カロテノイドを産生できる微生物を培養する段階を含む、カロテノイドを作製するための生物学的方法である。

例えばキサントフィロマイセス（ファフィア）属に属するものなどの高カロテノイド産生性の微生物を用いることがより好ましい。したがって、本発明の微生物の好ましい例は、キサントフィロマイセス（ファフィア）属に属する微生物である。本発明のキサントフィロマイセス（ファフィア）の好ましい株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 University Blvd.、Manassas、VA 20110-2209、U.S.A.から、キサントフィロマイセス（ファフィア）ATCC96594（ブダペスト条約に基づいて1988年4月8日に、アクセッション番号ATCC74438として再寄託された）として、入手することが可能である。

したがって本発明の一つの態様は、特に、有酸素条件下の水性栄養培地において、カロテノイドを産生するための基質および、FPP由来のステロール生合成阻害剤の存在下で、キサントフィロマイセス（ファフィア）属に属し、カロテノイドを産生できる微生物を培養する段階、ならびに、微生物の細胞から、または、培養された培養液から、得られたカロテノイドを単離する段階を含む、カロテノイドを作製するための生物学的方法に関する。

特に、スクアレン合成酵素により触媒されるステロール経路の最初の反応を阻害することは、本発明の生物学的方法にとって、より好ましいであろう。

スクアレン合成酵素（スクアレンシンセターゼ（synthetase）としての技術分野も指す）阻害剤は、細胞内ステロールレベルを下げることが報告されている。スクアレン合成酵素は、ステロール生合成に最初に関連する段階を触媒する酵素である。FPPの二つの分子は、スクアレンを形成するために濃縮される。

したがって、本発明の更なる態様は、スクアレン合成酵素の存在下で、カロテノイドを産生できる微生物を培養する段階を含む、カロテノイドを作製するための生物学的方法である。

いくつかの種類のスクアレン合成酵素阻害剤が報告されてきた[Billerら、Current Pharmaceutical Design 2:1-40(1996)]。大きく分けて三つの群のスクアレン合成酵素阻害剤である、アンモニウムイオンに基づくスクアレン合成酵素阻害剤、リンを含むFPP模倣体、およびカルボン酸に基づく阻害剤が報告されている。いかなる種類のスクアレン合成酵素阻害剤も、本発明にとって好ましい。そのようなスクアレン合成酵素阻害剤の好ましい例の一つは、アンモニウムイオンに基づくスクアレン合成酵素阻害剤である。

さらに、アンモニウムイオンに基づくスクアレン合成酵素阻害剤の好ましい例の一つは、フェノキシプロピルアミン型のスクアレン合成酵素阻害剤である[Brownら、Journal of Medicinal Chemistry 38:4157-4160(1995)]。例えば、[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミン、N-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)プロピルアミン、N-メチル-N-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)プロピルアミン、N-シクロペンチル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)プロピルアミン、N-シクロブチル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)プロピルアミン、N-イソプロピル-3-(2-アリル-4-ブチラミドフェノキシ)プロピルアミン、N-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-クロロフェノキシ)プロピルアミン、N-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-プロピルフェノキシ)プロピルアミン、およびN-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)-1-メチルプロピルアミン、または、生物学的に許容可能なそれらの塩を含む、多くのフェノキシプロピルアミン型のスクアレン合成酵素阻害剤が知られている（Brownら、前記）。

本実施例で用いられる好ましいスクアレン合成酵素阻害剤は、[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミン、N-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)プロピルアミン、およびN-メチル-N-イソプロピル-3-(4-アセトアミド-2-アリルフェノキシ)プロピルアミンである。

細胞成長のための炭水化物源としての、かつまたカロテノイド産生用の基質としての、糖蜜、ショ糖、またはグルコース、および、コーンスチープリカー（corn steep liquor）、酵母抽出液、硫酸二アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、または、尿素などの窒素源、リン酸アンモニウムおよびリン酸などのリン源、ならびに、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、および、ビオチンもしくはデスチオビオチンなどの添加された微量栄養素または無機塩のような、細胞にとって適切な主要栄養素および微量栄養素を含む培地中において、カロテノイド産生性微生物を培養することによって、カロテノイドは通常、産生される。

好ましい培養条件は、pH4〜8の範囲、15℃〜26℃の温度範囲で24時間〜500時間である。更に好ましい培養条件は、pH5〜7の範囲、18℃〜22℃の温度範囲で48時間〜350時間である。

培養において、通気および撹拌は通常、カロテノイドの産生に好ましい結果を与える。

本発明においては、FPP由来のステロール生合成阻害剤が培地に添加される。阻害剤の濃度は、カロテノイドの産生のために用いられる阻害剤および微生物の種類に基づいて、例えば、カロテノイド産生条件において細胞成長を50%未満低下させる濃度の範囲内で変化することが適切である。阻害剤のさらに好ましい濃度は、細胞成長を30%未満低下させる濃度範囲でありうる。

本発明において、FPP由来のステロール生合成阻害剤は、培養中のいかなる時点において培地に添加してもよい。

本発明の方法を用いてカロテノイド産生性微生物を培養することによって作製されるカロテノイドは、当技術分野で公知の方法[例えば、Carotenoids Vol IA: Isolation and Analysis、Brittonら、Birkhauser Verlag、Basel(1995)]により、培地中へ分泌される場合には培地から、または微生物の細胞から、単離されうり、かつ必要ならば、一つの特定のカロテノイドが望ましい場合には、存在しうる他のカロテノイドから分離される。

本発明に従って作製されるカロテノイドは、食品または飼料の調製用の方法において用いられ得る。当業者はそのような方法に精通している。そのような化合物の食品または飼料はさらに、そのような目的で通常用いられかつ当技術分野で公知の添加物または成分を含むことができる。

以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

本実施例で用いられるスクアレン合成酵素阻害剤は、一連のフェノキシプロピルアミン型阻害剤の一つである、[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミンである。この化合物は、Brownら（前記）により記載された方法にしたがって合成された。即ち、3-アリル-ビフェニル-4-オルが、ブタン-2-オン中での臭化アリルおよび炭酸カリウムとの反応、ならびに熱転位により、ビフェニル-4-オル（product code H7751、Sigma、USA）から調製された。3-アリル-ビフェニル-4-オルは、ブタン-2-オン中、1,3-ジブロモプロパンおよび炭酸カリウムと反応し、続いて2-プロパノール中、イソプロピルアミンと反応して、[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミンを生じた。

実施例1：ファフィア・ロドジーマの細胞成長に対するスクアレン合成酵素阻害剤の添加の影響
ファフィア・ロドジーマATCC96594を、YPD培地（DIFCO、Detroit、U.S.A.、試験管中10 mL）に接種し、20℃において2日間、振とう培養した。0.5mLの培養物を、30g/Lのグルコース、ならびに、各々0μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mLおよび20.0μg/mLの[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミンを含む新鮮なYPD培地（試験管中10mL）に接種し、20℃において5日間、振とう培養した。

培養物のアリコートを、培養の間に時々採取し、細胞成長の解析のために、660nmでの吸光度をUV-1200光度計（Shimadzu Corp.、Kyoto、Japan）を用いて測定した。結果を表1に示す。

スクアレン合成酵素阻害剤の濃度が2.0μg/mL以下のときには、細胞成長には影響しなかった。5.0μg/mLの阻害剤によって、細胞成長は2日目において約23％阻害されたことが、観察された。

実施例2：ファフィア・ロドジーマにより産生されたアスタキサンチンに対するスクアレン合成酵素阻害剤の添加の影響
ファフィア・ロドジーマATCC96594を実施例1のようにYPD培地に接種し、20℃において2日間、振とう培養した。2.5mLの培養物を、22g/Lのグルコース、ならびに、各々0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mLおよび5.0μg/mLの[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミンを含む新鮮なYPD培地（フラスコ中50mL）に接種し、20℃において7日間、振とう培養した。培養2日目に、50g/Lのグルコースを培養物に添加した。培養の途中における阻害剤の添加も同様に試験された。培養物のアリコートを、培養の4日目および7日目に採取し、660nmにおける吸光度（実施例1に記載されたのと同じ方法を用いることにより）、および培養物中のアスタキサンチン含量を測定した。

アスタキサンチン含量の解析のために、採取されたブロスを溶媒混合物（エチルアルコール、ヘキサン、および酢酸エチル）と混合し、かつ、ガラスビーズを用いた激しい振とうにより、ファフィア・ロドジーマの細胞からカロテノイドを抽出した。抽出後、破砕された細胞およびガラスビーズを遠心分離によって取り除き、得られた上清を、HPLCにより、アスタキサンチンの量について解析した。用いたHPLCの条件は以下の通りである。
HPLCカラム：Chrompack Lichrosorb si-60（4.6 mm、250 mm）
温度：室温
溶出剤：溶出のために、アセトン/ヘキサン（18/82）を1 ml/Lの水に加えた
注入容量：10μl
流速：2.0 ml/分
検出：450nmにおけるUV

アスタキサンチンの参照試料は、Hoffman La-Roche（Basel、Switzerland）から得た。結果を表2に示す。

^＊阻害剤の非存在下、7日目のアスタキサンチン含量を100として計算された相対値
^＊＊培養は阻害剤の非存在下で開始し、5.0μg/mLの阻害剤を、培養2日目に加えた

アスタキサンチン産生は、試験された全条件において増大した。培養2日目に阻害剤が添加された場合に最良の結果が得られたが、培養開始時からの阻害剤の添加もまた、アスタキサンチン産生に対して効果的であった。

Claims (5)

1. 有酸素条件下の水性栄養培地において、ファルネシルピロリン酸由来のステロール生合成阻害剤の存在下で、カロテノイドを産生できる微生物を培養する段階を含み、ファルネシルピロリン酸由来のステロール生合成阻害剤が、アンモニウムイオンに基づくスクアレン合成酵素阻害剤からなる群より選択されるカロテノイドを作製するための生物学的方法であって、
   培養する段階が、スクアレン合成酵素阻害剤の非存在下で培養を開始し、その後、スクアレン合成酵素阻害剤を添加するものであり、
   微生物が、キサントフィロマイセス・デンドロロス（Xanthophyllomyces dendrorhous）（ファフィア・ロドジーマ（Phaffia rhodozyma））ATCC96594であり、
   スクアレン合成酵素阻害剤が[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミンであり、
   スクアレン合成酵素阻害剤が５．０μｇ／ｍＬの濃度を有し、
   カロテノイドがアスタキサンチンであり、
   培養が、pH4〜8の範囲で、15℃〜26℃の温度範囲で24時間〜500時間実施される、方法。
2. 有酸素条件下の水性栄養培地において、カロテノイドを産生するための基質であるファルネシルピロリン酸由来のステロール生合成阻害剤の存在下で、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）（ファフィア（Phaffia））属に属し、カロテノイドを産生できる微生物を培養する段階、および微生物の細胞からまたは培養されたブロスから得られたカロテノイドを単離する段階を含み、ファルネシルピロリン酸由来のステロール生合成阻害剤が、アンモニウムイオンに基づくスクアレン合成酵素阻害剤からなる群より選択されるカロテノイドを作製するための生物学的方法であって、
   培養する段階が、スクアレン合成酵素阻害剤の非存在下で培養を開始し、その後、スクアレン合成酵素阻害剤を添加するものであり、
   微生物が、キサントフィロマイセス・デンドロロス（Xanthophyllomyces dendrorhous）（ファフィア・ロドジーマ（Phaffia rhodozyma））ATCC96594であり、
   スクアレン合成酵素阻害剤が[3-(3-アリル-ビフェニル-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミンであり、
   スクアレン合成酵素阻害剤が５．０μｇ／ｍＬの濃度を有し、
   カロテノイドがアスタキサンチンであり、
   培養が、pH4〜8の範囲で、15℃〜26℃の温度範囲で24時間〜500時間実施される、方法。
3. 阻害剤の濃度が、カロテノイド産生条件下で、細胞成長を50%未満低下させる濃度の範囲内である、請求項1または2記載の方法。
4. 阻害剤の濃度が、カロテノイド産生条件下で、細胞成長の30%未満低下させる濃度の範囲内である、請求項３記載の方法。
5. 培養が、pH5〜7の範囲で、18℃〜22℃の温度範囲で48時間〜350時間実施される、請求項１記載の方法。