CN108699508A - 利用基于含钴培养基的产类胡萝卜素细菌进行的类胡萝卜素的发酵制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用微生物培养高收率且稳定地制造类胡萝卜素的方法。其是一种产类胡萝卜素细菌的培养方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌。

Description

利用基于含钴培养基的产类胡萝卜素细菌进行的类胡萝卜素的 发酵制造方法

技术领域

本发明涉及利用产类胡萝卜素细菌进行的类胡萝卜素的微生物学制造方法。具体而言，本发明涉及利用产生虾青素、角黄素、玉米黄质、β-隐黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、金盏花红素(Adonirubin)、金盏花黄质(Adonixanthin)、海胆酮、Asteroidenone、以及3-羟基海胆酮等类胡萝卜素的微生物的发酵来制造该类胡萝卜素的方法。

背景技术

类胡萝卜素是作为饲料添加物、食品添加物、医药品等使用的有用的天然色素。类胡萝卜素包括虾青素、角黄素、玉米黄质、β-隐黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、金盏花红素、金盏花黄质、海胆酮、Asteroidenone及3-羟基海胆酮等。其中，虾青素作为养殖鱼中的鲑鱼、鳟鱼、真鲷等的体色改善剂、作为家禽类的蛋黄颜色改良剂这样的饲料添加物是有用的。另外，天然的虾青素作为安全的食品添加物、健康食品材料在工业上的价值很高。金盏花黄质及金盏花红素与虾青素同样地期待具有作为饲料添加物、食品添加物、医药品等的用途。

另外，β-胡萝卜素作为饲料添加物、食品添加物、医药品等使用，角黄素作为饲料添加物、食品添加物、化妆品等使用，玉米黄质作为食品添加物、饲料添加物等使用。此外，番茄红素、海胆酮、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、Asteroidenone等也期待作为饲料添加物、食品材料等使用。作为这些类胡萝卜素的制造方法，已知有化学合成法、从天然物提取的方法、基于微生物培养的生产方法等。

作为虾青素的化学合成法，已知基于β-胡萝卜素转化的方法(Pure Appl.Chem.,57,741,1985(非专利文献1))及由C15盐合成的方法(Helv.Chim.Acta,64,2436,1981(非专利文献2))。作为从天然物提取的方法，由于虾青素存在于鲑鱼、真鲷等鱼类及虾、蟹、磷虾等甲壳类中，因此可以从它们中提取收集。

作为基于微生物的类胡萝卜素的生产方法，已报道了利用绿藻类Haematococcuspluvialis的培养法(日本特开2007-97584号公报(专利文献1))、红酵母Phaffiarhodozyma的发酵法(日本特开平11-69969号公报(专利文献2))、利用属于副球菌属的细菌(以下，也称为“副球菌属细菌”)的发酵法、利用属于短波单胞菌属的细菌的发酵法(日本特开2006-340676号公报(专利文献3))、利用属于赤杆菌属的细菌的发酵法(日本特开2008-259449号公报(专利文献4))。作为生产类胡萝卜素的副球菌属细菌的例子，可以举出E-396株及A-581-1株(日本特开平7-79796号公报(专利文献5)及International Journal ofSystematic Bacteriology(1999),49,277-282(非专利文献3))。作为其它类胡萝卜素生产性的属于副球菌属的细菌，可以列举：Paracoccus marcusii MH1株(日本特表2001-512030号公报(专利文献6))、Paracoccus haeundaensis BC74171株(International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology(2004),54,1699-1702(非专利文献4))、副球菌属细菌N-81106株(日本特开2007-244205号公报(专利文献7))、Paracoccuszeaxanthinifaciens(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2003),53,231-238(非专利文献5))及Paracoccus sp.PC-1株(WO 2005/118812号小册子(专利文献8))等。

然而，上述的类胡萝卜素的制造方法中存在若干问题。例如，从安全性的观点考虑，用化学合成法制造的类胡萝卜素给消费者留下不好的印象。与化学合成法相比，从天然物提取出的类胡萝卜素的制造成本非常高。在利用微生物进行的制造中，利用绿藻类、酵母的培养进行的生产的生产率低，而且这些微生物具有牢固的细胞壁，难以从培养物中提取类胡萝卜素。

另一方面，利用属于副球菌属的细菌进行的类胡萝卜素的制造具有该菌体的增殖速度快、类胡萝卜素的生产率高、易于从培养物中提取类胡萝卜素等优点，已经报道了若干培养方法及制造方法。

作为例子，日本特开2007-143492号公报(专利文献9)公开了在培养中添加铁盐的方法，WO2010/044469号小册子(专利文献10)公开了在培养基中添加氨基酸的方法，日本特开2011-188795号公报(专利文献11)公开了在培养基中添加生物素的方法，另外，日本特开2012-139164号公报(专利文献12)公开了在培养基中添加3.6mM以上的钙化合物的方法。但是，在利用副球菌属细菌进行的类胡萝卜素的发酵中，培养基成分如何影响培养方法及制造方法的详细情况仍不明确。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-97584号公报

专利文献2：日本特开平11-69969号公报

专利文献3：日本特开2006-340676号公报

专利文献4：日本特开2008-259449号公报

专利文献5：日本特开平7-79796号公报

专利文献6：日本特表2001-512030号公报

专利文献7：日本特开2007-244205号公报

专利文献8：WO2005/118812号小册子

专利文献9：日本特开2007-143492号公报

专利文献10：WO2010/044469号小册子

专利文献11：日本特开2011-188795号公报

专利文献12：日本特开2012-139164号公报

非专利文献

非专利文献1：Pure Appl.Chem.,57,741,1985

非专利文献2：Helv.Chim.Acta,64,2436,1981

非专利文献3：International Journal of Systematic Bacteriology(1999),49,277-282

非专利文献4：International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2004),54,1699-1702

非专利文献5：International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2003),53,231-238

发明内容

发明要解决的课题

本发明人为了进行基于产类胡萝卜素细菌的类胡萝卜素的制造而实施培养时，类胡萝卜素的生产率随培养的批次而大幅变化，并且有时该细菌完全不生长，面临无法稳定制造的重大课题。

本发明是鉴于这样的实际情况而完成的，其目的在于提供一种利用微生物培养高收率且稳定地制造类胡萝卜素的方法。

解决课题的方法

作为生产率随培养的批次而变化的原因，可以考虑有不适当的通气/搅拌、温度的变化、pH的变化、溶解氧电极的性能异常、种菌活性的变化、培养基原料的批号间差异、水中微量成分的变化、培养基灭菌所导致的营养源损失及抑制物质的生成、磁/振动的影响、电刺激、杂菌污染、从装置混入抑制物质等，原因的调查极其困难。

本发明人等为了解决上述课题付出了巨大的劳力和时间，进行了深入研究，结果发现，培养基中的钴是产类胡萝卜素细菌的生长及类胡萝卜素的生产的重要因素，在培养基中的钴浓度过低时，微生物不生长，且在钴浓度过高时，微生物也不生长。进而，本发明人等查明：在以往的方法中，从培养基的原料、水或发酵设备金属部等以杂质的形式微量混入培养基的钴的量为适量时，产类胡萝卜素细菌的生长良好且类胡萝卜素的生产浓度高，培养成功；在混入的钴的量未达到适量时，培养不成功，无法进行稳定制造。

另外，本发明人等发现培养所需要的钴的量为微量且具有适于培养的浓度范围，确认了以往技术中均没有注意到的、培养基中的钴的浓度在产类胡萝卜素细菌生长及类胡萝卜素生产中是非常重要的因素。

即，本发明人等首次明确了钴是产类胡萝卜素细菌的生长及类胡萝卜素生产所必需的营养素，而且其浓度存在适当的范围，从而完成了本发明的基于产类胡萝卜素细菌的类胡萝卜素的微生物学制造方法，解决了制造上的课题，能够实现利用微生物进行稳定的类胡萝卜素制造。

本发明具有以下特征。

(1)一种高产类胡萝卜素细菌的培养方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌。

(2)一种高产类胡萝卜素细菌的制造方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌。

(3)一种类胡萝卜素的制造方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌，并从得到的培养物采集类胡萝卜素。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，培养基中的钴或钴盐的浓度为0.005μmol/L～8μmol/L。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，类胡萝卜素为选自虾青素、角黄素、玉米黄质、β-隐黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、金盏花红素、金盏花黄质、海胆酮、Asteroidenone、以及3-羟基海胆酮中的至少一种。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，产类胡萝卜素细菌是属于副球菌属、短波单胞菌属或赤杆菌属的细菌。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，产类胡萝卜素细菌是含有碱基序列与序列号1中记载的碱基序列具有95％以上的同源性的DNA的细菌，所述DNA是与16S核糖体RNA对应的DNA。

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，产类胡萝卜素细菌是E-396株(FERMBP-4283)、A-581-1株(FERM BP-4671)、或它们的突变株。

(9)一种高产类胡萝卜素细菌，其是通过(2)及(4)～(8)中任一项所述的方法制造的。

(10)一种高产类胡萝卜素细菌，其干燥菌体中至少含有36mg/g的类胡萝卜素。

(11)一种高产类胡萝卜素细菌，其含有钴。

发明的效果

根据本发明，可以提供一种不受培养基成分、水等原料的生产商、等级、批号、产地的影响、不受发酵设备的材质、制造场地等的影响，可稳定且得到高生产率的类胡萝卜素的生产细菌或类胡萝卜素的制造方法。

附图说明

图1是示出培养基中的钴存在浓度、菌体生长OD610及总类胡萝卜素生产浓度的关系的图。

图2是示出培养基中的钴存在浓度、菌体生长OD610及总类胡萝卜素生产浓度在低浓度范围(0.001-0.1μmol/L)的关系的图。

图3是示出培养基中的钴存在浓度、菌体生长OD610及总类胡萝卜素生产浓度在高浓度范围(1-100μmol/L)的关系的图。

图4是示出培养基中的钴存在浓度、菌体生长OD610及总类胡萝卜素生产浓度在低浓度范围(0-0.05μmol/L)的关系的图。

图5是示出添加氯化钴的培养基及未添加氯化钴的培养基中的总类胡萝卜素量的批次间差异的图。

具体实施方式

以下，进一步具体地对本发明进行说明。本发明的范围并不限定于这些说明，除以下的示例以外，也可以在不损害本发明的主旨的范围进行适当变更而实施。

需要说明的是，本说明书的表中记载的数值有时根据所实施的实验而改变有效数字、四舍五入的数字的位数(后1位、后2位)等来表示。由此，总计值所记载的数值有时与将各数值总计后的值不一致。

本发明涉及稳定地培养产类胡萝卜素细菌来制造类胡萝卜素的方法，本方法的特征在于，使培养基中在给定浓度范围内存在钴或钴盐。

通过本发明的方法，能够稳定地培养产类胡萝卜素细菌，可以稳定地制造高浓度的类胡萝卜素。

作为本发明中使用的细菌，只要是产生类胡萝卜素的细菌即可，没有任何限定，可以列举例如：属于副球菌属(Paracoccus属)、短波单胞菌属(Brevundimonas属)、赤杆菌属(Erythrobacter属)的细菌。

优选使用属于副球菌属的细菌、属于短波单胞菌属的细菌或属于赤杆菌属的细菌，更优选使用属于副球菌属的细菌。副球菌属、赤杆菌属及短波单胞菌属均分类于蛋白菌门(Proteobacteria门)、α蛋白菌纲(Alpha Proteobacteria纲)，在细菌分类学上具有共通性，因此，在本发明中，可以使用属于这些属的细菌。

在属于副球菌属的细菌中，优选使用Paracoccus carotinifaciens(产类胡萝卜素副球菌)、Paracoccus marcusii(马氏副球菌)、Paracoccus haeundaensis(海云台副球菌)及Paracoccus zeaxanthinifaciens(产玉米黄素副球菌)，特别优选使用Paracoccuscarotinifaciens。作为属于副球菌属的细菌的具体菌株的例子，可以列举：Paracoccuscarotinifaciens E-396株及副球菌属细菌A-581-1株(FERM BP-4671)，本发明也可优选使用它们的突变株。

作为属于赤杆菌属的产类胡萝卜素细菌，可以列举例如：Erythrobacter JPCC M种(日本特开2008-259452)、Erythrobacter JPCC O种(日本特开2008-259449)等。

作为属于短波单胞菌属的产类胡萝卜素细菌，可以列举例如：BrevundimonasSD212株(日本特开2009-27995)、Brevundimonas FERM P-20515,20516株(日本特开2006-340676)、Brevundimonas vesicularis(泡囊短波单胞菌属)(Gene,Vol.379,p.101-108,1Sep 2006)等。

另外，作为产类胡萝卜素细菌，优选使用与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列与序列号1中记载的E-396株的碱基序列具有高同源性的细菌。这里所谓的碱基序列的同源性优选为95％以上，更优选为96％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为98％以上，最优选为99％以上。

与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列是指将16S核糖体RNA的碱基序列中的U(尿嘧啶)取代为T(胸腺嘧啶)的而得到的碱基序列。

基于该16S核糖体RNA的碱基序列的同源性的微生物分类法近年成为主流。以往的微生物分类法基于以往的运动性、营养缺陷性、糖的同化性等菌学性质，因此，在发生了由自然突变所引起的形状的变化等的情况下，有时会将微生物错误分类。与此相对，由于16S核糖体RNA的碱基序列在遗传上是非常稳定的，因此，与以往的分类法相比，基于其同源性的分类法的分类可靠度显著提高。

Paracoccus carotinifaciens E-396株的16S核糖体RNA的碱基序列与其它的产类胡萝卜素细菌Paracoccus marcusii DSM 11574株、副球菌属细菌N-81106株、Paracoccushaeundaensis BC 74171株、副球菌属细菌A-581-1株、Paracoccus zeaxanthinifaciensATCC 21588株及Paracoccus sp.PC-1株的16S核糖体RNA的碱基序列的同源性分别为99.7％、99.7％、99.6％、99.4％、95.7％及95.4％，可知它们是分类学上极其接近的菌株。因此，可以认为这些菌株作为产生类胡萝卜素的细菌而形成了一个组。因此，这些菌株可以优选用于本发明，能够高效地产生类胡萝卜素。

在本发明中，可以使用改善了类胡萝卜素生产率的突变株。作为改善后的突变株的例子，可以列举：虾青素生产能力高的菌株(日本特开2001-95500)、选择性大量产生角黄素的菌株(日本特开2003-304875)、选择性大量产生玉米黄质和β-隐黄素的菌株(日本特开2005-87097)、选择性产生番茄红素的菌株(日本特开2005-87100)。

改善了类胡萝卜素生产率的突变株可以通过突变处理和筛选而获得。进行突变处理的方法只要是可诱发突变的方法即可，没有特别限定。例如，可以使用基于N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)及甲磺酸乙酯(EMS)等突变剂的化学方法、紫外线照射及X射线照射等物理方法、基于基因重组及转座子等的生物学方法等。突变处理的细菌没有特别限定，优选为产类胡萝卜素细菌。另外，突变株也可以是因自然发生的突变而产生的。

突变株的筛选方法没有特别限定，例如，除了根据琼脂培养基上的菌落的色调来选择目标突变株的方法以外，还可以示例出用试管、烧瓶、发酵槽等培养突变株，并通过利用吸光度、高效液相色谱、薄层色谱等的类胡萝卜素色素分析来选择目标突变株的方法等。

突变及筛选的工序可以为1次，另外，例如也可以如下所述将突变及筛选工序重复2次以上：通过突变处理和筛选得到突变株，然后进一步通过对其进行突变处理和筛选来获得改善了生产率的突变株。

作为本发明中使用的产类胡萝卜素细菌的例子而举出的E-396株在IPOD，NITE-国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)进行了以下所述的国际保藏。

国际保藏单位：IPOD，NITE-国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)

(原名：通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所))305-8566

茨城县驻波市东1丁目1番地1中央第6(茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)

显示标识：E-396

保藏编号：FERM BP-4283

原保藏日：平成5年(1993年)4月27日

另外，作为本发明中使用的产类胡萝卜素细菌的另一例子而举出的A-581-1株在上述单位进行了以下所述的国际保藏。

显示标识：A-581-1

保藏编号：FERM BP-4671

原保藏日：平成6年(1994年)5月20日

在本发明中，通过在含有给定浓度的钴或钴盐的培养基中培养上述产类胡萝卜素细菌，可以稳定地生产高浓度的类胡萝卜素。

产生的类胡萝卜素没有特别限定，例如为虾青素、角黄素、玉米黄质、β-隐黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、金盏花红素、金盏花黄质、海胆酮、Asteroidenone或3-羟基海胆酮，优选为虾青素、角黄素、玉米黄质或β-隐黄素，更优选为虾青素或玉米黄质。通过本发明制造的类胡萝卜素可以是一种，也可以是多种组合。

以下，对于在本发明中培养上述细菌的方法进行说明。

本发明涉及使用以给定浓度含有钴或钴盐的培养基来培养产类胡萝卜素细菌的方法。

在本发明中，在培养基中添加钴或钴盐并以给定的浓度含有的方法没有特别限制，例如，优选使用在培养基中添加选自氯化钴、硝酸钴、甲酸钴、乙酸钴、氧化钴、溴化钴、碳酸钴、硫酸钴、环烷酸钴、油酸钴、硬脂酸钴、硫氰酸钴、粉末钴、氰基钴胺等钴化合物中的1种或2种以上并使其为给定浓度范围内的方法。这些钴化合物可以是无水物，也可以是水合物。钴化合物优选在培养开始前的加料时添加至培养基，但也可以在培养开始后单次、逐步或连续添加。

作为其它添加方法，可与使用添加以杂质的形式微量含有钴的培养基原料并使其为给定的钴浓度范围内的方法。作为可能微量含有钴的培养基原料，可以示例出例如：玉米浆、Pharmamedia、大豆粕、大豆粉、花生饼粉、大豆蛋白胨、酒糟(distillers’solubles)、干燥酵母、酵母提取物、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、铁盐类、锰盐类、铜盐类、锌盐类、钼盐类、镍盐类、硒盐类、磷酸盐类、镁盐类、钙盐类、水等。可以使用在给定的钴浓度范围内添加这些培养基原料中1种或2种以上的方法。在该方法中，培养基原料中含有的钴的量随生产商、批号、产地等而变化，因此也可以适当管理原料中的钴含量。这些以杂质的形式微量含有钴的培养基原料优选在培养开始前的加料时添加至培养基，但也可以在培养开始后单次、逐步或连续添加。

另外，作为其它添加方法，也可以使用包含含钴材质的发酵设备，并一边使钴在给定的钴浓度范围内溶出，一边进行培养。该方法也包括在搅拌轴、搅拌轴的轴承、密封部等使用含有钴的超合金并使钴溶出的方法。在该方法中，溶出的钴的量随设备的状态等而变化，如果过少，则作为营养源是不足的，如果过多，则妨害生产，因此可以分析培养基中的钴浓度来适当进行管理。

可以优选进行将选自上述的添加钴化合物的方法、添加以杂质的形式微量含有钴的培养基原料的方法、以及从含有钴的材质的发酵设备中使其溶出而添加的方法中的2种以上进行组合的方法。

作为钴化合物添加的时间，有如下方法：以从种子培养基带入的钴在最终阶段的生产用培养基中达到给定浓度范围的方式添加至种子培养基的方法；或者在种子培养基和最终阶段的生产培养基两者中添加钴并在最终阶段的生产培养基中达到给定浓度范围内的方法；将该化合物添加于培养最终阶段所使用的培养基的方法。

在本发明中，发现培养基中含有的钴或钴盐的浓度无论过低或过高时，微生物的生长及类胡萝卜素的生产均不能充分进行。该见解可以认为是由于，浓度过低时作为营养源不足，而在过高时妨害微生物的生长及类胡萝卜素的生产。

培养基中的钴或钴盐的下限浓度优选为0.005μmol/L以上、0.006μmol/L以上，更优选为0.01μmol/L以上，进一步优选为0.02μmol/L以上。上限浓度优选为20μmol/L以下，更优选为10μmol/L以下、9μmol/L以下、8μmol/L以下、7μmol/L以下、6μmol/L以下、5μmol/L以下，进一步优选为4μmol/L以下、3μmol/L以下、2μmol/L，最优选为1μmol/L以下。在本发明中，可以适当选择上述上限浓度及下限浓度，从而设为培养所需要的钴等的浓度范围，例如设为0.005μmol/L～20μmol/L、0.006μmol/L～20μmol/L、0.01μmol/L～8μmol/L、0.02μmol/L～8μmol/L、0.02μmol/L～7μmol/L、0.02μmol/L～6μmol/L、0.02μmol/L～1μmol/L等范围。其中，上述范围为示例，并不限定于这些浓度范围。

本发明的培养所用的类胡萝卜素生产用培养基是含有给定浓度的钴或钴盐的培养基，除钴以外，只要是产类胡萝卜素细菌生长、生产类胡萝卜素的成分，可以添加任意成分。含有这样的添加物的培养基可以是任意培养基，可优选使用含有碳源、氮源、无机盐类及根据需要添加的维生素类等的培养基。

作为碳源，可以列举例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇及麦芽糖等糖类、乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸及丙酮酸等有机酸、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇及甘油等醇类、大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油及亚麻籽油等油脂类等，其中，优选使用葡萄糖或蔗糖。在这些碳源中，可以使用1种或2种以上。培养前的培养基(初始培养基)中添加的量根据碳源种类而不同，可以适当调整，通常为每1L培养基1～100g，优选为2～50g。另外，也优选碳源不仅添加于初始培养基，也在培养过程中逐步或连续地追加供给。

作为氮源，可以使用作为无机盐的硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐类、硝酸钾等硝酸盐类、氨及尿素等中的1种或2种以上。添加量根据氮源的种类而不同，可以适当调整，通常相对于培养基1L为0.1g～20g，优选为0.2～10g。

另外，作为有机氮源，例如可以使用玉米浆(包含过滤处理物)、Pharmamedia、大豆粕、大豆粉、花生饼粉、大豆蛋白胨、酒糟、干燥酵母、酵母提取物、酪蛋氨基酸、谷氨酸、天冬氨酸等中的1种或2种以上。添加浓度根据氮源的种类而不同，可以适当调整，通常为0～80g/L，优选为1～30g/L。

无机氮源及有机氮源通常添加于初始培养基，也优选逐步或连续地进行追加供给。

作为无机盐类，例如可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐类、硫酸镁、氯化镁等镁盐类、硫酸铁、氯化铁等铁盐类、氯化钙、碳酸钙等钙盐类、碳酸钠、氯化钠等钠盐类、硫酸锰等锰盐类、硫酸铜等铜盐类、硫酸锌等锌盐类、钼酸钠等钼盐类、硫酸镍等镍盐类、硒酸钠等硒盐类、钨酸钠等钨盐类、氯化铝等铝盐类、氯化铬等铬盐类、硼酸及碘化钾等中的1种或2种以上。添加量根据无机盐的种类而不同，可以适当调整，通常相对于培养基1L为0.0001～15g。对于磷酸盐类、镁盐类、钙盐类、钠盐类及铁盐类而言，优选为0.02～15g/L，在加入锰盐类、铜盐类、锌盐类、钼盐类、镍盐类、硒盐类、钨盐类、铝盐类、铬盐类、硼酸、碘化钾等的情况下，0.1～15mg/L为优选的浓度。无机盐类通常添加于初始培养基，也可以逐步或连续地进行追加供给。

作为维生素类，例如可以使用氰基钴胺、核黄素、泛酸、吡哆醇、硫胺素、抗坏血酸、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、生物素、肌醇、胆碱等。添加比例根据维生素类的种类而不同，可以适当调整，通常相对于培养基1L为0.001～1000mg，优选为0.01～100mg。维生素类通常添加于初始培养基，也可以逐步或连续地进行追加供给。

在本发明中，为了抑制培养液起泡，优选使用消泡剂。对于消泡剂的种类而言，只要具有抑制泡的产生或消除产生的泡的作用、且对产生细菌的抑制作用小即可，可以是任意消泡剂。可以示例出例如：醇类消泡剂、聚醚类消泡剂、酯类消泡剂、脂肪酸类消泡剂、有机硅类消泡剂、磺酸类消泡剂等。添加量根据消泡剂的种类而不同，可以适当调整，通常相对于培养基1L为0.01g～10g。

消泡剂通常添加于灭菌前的初始培养基。另外，也可以在培养过程中连续或间歇地追加添加。作为在培养过程中添加消泡剂的方法，可以示例出：用传感器探测泡而自动添加的方法、利用程序计时器每隔一定时间进行添加的方法、与进料用碳源、氮源或pH调整剂等混合添加以使其与生长速度联动的方法等。添加于初始培养基的消泡剂与培养过程中添加于培养液的消泡剂可以是相同种类，也可以根据作用使用不同种类。

在本发明中，培养基的初期pH调整为2～12，优选调整为6～9，更优选调整为6.5～8.0。在培养中也优选保持上述范围的pH。作为pH调整剂，可以示例出氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、氨水、氨气、硫酸水溶液或它们的混合物。

在本发明中，培养基在进行了灭菌处理后用于细菌的培养。本领域技术人员可以适当进行灭菌处理。例如，可以用高压灭菌器对适当容器中的培养基进行加热灭菌。或者利用灭菌过滤器进行过滤灭菌。

在本发明中，产类胡萝卜素细菌被接种至如上所述制备的培养基并在给定的条件下培养。接种可以通过以下方式进行：通过使用了试管、烧瓶或发酵槽等的种子培养使菌株适当增殖，将得到的培养液加入类胡萝卜素生产用培养基。种子培养所用的培养基只要是产类胡萝卜素细菌可良好增殖的培养基即可，没有特别限定，需要含有生长所必需的最低限度的钴或钴盐。

培养可以在适当的培养容器中进行。培养容器可根据培养容量而适当选择，可以列举例如：试管、烧瓶、发酵槽等。

培养温度为15～40℃，优选为20～35℃，更优选为25℃～32℃，通常为1～18天，优选为2～12天，更优选为3～8天，在好氧条件下进行培养。作为好氧条件，可以举出例如振荡培养或通气搅拌培养等，优选将溶解氧浓度控制为一定的范围。溶解氧浓度的控制例如可以通过改变搅拌转速、通气量、内压等来进行。溶解氧浓度优选控制为0.3～10ppm，更优选控制为0.5～7ppm，进一步优选控制为1～5ppm。

在本发明中，对产类胡萝卜素细菌进行了培养后的产类胡萝卜素细菌的菌体数可以通过OD来测定。另外，培养产类胡萝卜素细菌而得到的培养物中的类胡萝卜素、或从培养物中采集的类胡萝卜素的定量可以通过高效液相色谱来进行。在如上所述培养产类胡萝卜素细菌后，可以从得到的培养物中采集类胡萝卜素。

培养物可以列举例如：培养液、培养上清、菌体浓缩液、湿菌体、干燥菌体、菌体溶解物等。培养上清可以通过对培养液进行离心处理或过滤处理，从培养液中除去菌体来制备。菌体浓缩液可以通过对培养液进行离心分离或膜过滤浓缩而得到。湿菌体可以通过对培养液进行离心或过滤而得到。干燥菌体可以通过用通常的干燥方法将湿菌体或菌体浓缩液干燥而得到。这样得到的含有类胡萝卜素的干燥菌体可以直接用作饲料添加物。

在得到的干燥菌体中，至少含有36mg/g的类胡萝卜素，例如含有36mg/g、37mg/g、38mg/g、39mg/g或40mg/g的类胡萝卜素。根据使用的菌体，干燥菌体中含有的类胡萝卜素的量有变化，但例如含有36mg/g～50mg/g的类胡萝卜素，进一步优选含有36mg/g～45mg/g的类胡萝卜素。含有这些量的细菌也包含在本发明中。因此，本发明提供一种干燥菌体中至少含有36mg/g的类胡萝卜素的高产类胡萝卜素细菌(例如属于副球菌属、短波单胞菌属或赤杆菌属的细菌)。

在本发明中，从上述培养物中采集类胡萝卜素的方法没有特别限定，可以是能够稳定且高效地回收类胡萝卜素的任意方法。对于本领域技术人员，这些方法可以从公知的提取、纯化技术中适当选择进行。另外，在本发明中，也可以使用上述培养物作为含有类胡萝卜素的组合物。

在进行提取之前，可以对培养物进行以下的1种或2种以上的处理：使用了碱试剂、表面活性剂等的化学处理，使用了溶菌酶、脂肪分解酶及蛋白水解酶等的生化学处理，或者超声波或粉碎等物理处理。

例如，在从培养物中提取类胡萝卜素的情况下，提取及清洗所用的溶剂没有特别限定，可以列举：甲醇、乙醇、异丙醇等低级醇类、丙酮、四氢呋喃、甲乙酮、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。

在想要尽量防止提取操作中类胡萝卜素的氧化的情况下，可以在氮气等非活性气体氛围中进行处理。另外，也可以在提取溶剂中加入医药品、食品所用的抗氧化剂。或者可以将这些处理进行组合。另外，为了尽量防止光导致的类胡萝卜素的分解，可以在不照射光的条件下进行。

可以将这样得到的提取物直接作为类胡萝卜素使用，也可以进一步纯化后使用。

将残存在提取操作后的提取物中的细菌等分离的方法没有特别限定，可以使用膜过滤、离心分离、倾析等。

作为从提取液中得到类胡萝卜素沉淀物的方法，通常可以列举加热和/或减压浓缩、结晶析出。此外，也可以通过低温下的类胡萝卜素色素的析出、利用酸/碱试剂、各种盐类进行的析出而不使类胡萝卜素色素浓缩地进行分离。在工业上使用的情况下，优选结晶析出。

为了清洗，可以根据需要使用少量的低级醇类等溶剂将得到的类胡萝卜素沉淀物悬浮搅拌。清洗的方法没有特别限定，例如可以举出在悬浮搅拌后进行滤取的方法或使液体从沉淀物的上方通过的方法等作为实用的优选方法。

如上所述得到的培养物、提取物或纯化物可以作为类胡萝卜素而分别单独使用，也可以将它们以任意比例混合使用。

实施例

以下，举出实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明的范围并不限定于以下的实施例。

需要说明的是，实施例中的类胡萝卜素类的定量使用高效液相色谱(HPLC)如下所述进行。

柱将2根Inertsil SIL-100A、5μm(φ4.6mm×250mm)(GL Sciences公司制造)连接使用。在室温附近的一定温度下使作为流动相的正己烷∶四氢呋喃∶甲醇混合液(40∶20∶1)以每分钟1.0mL流过进行洗脱。在测定中，将用四氢呋喃溶解了样品的液体用流动相稀释100倍，将得到的溶液20μL作为注入量，在波长470nm下进行了柱洗脱液的检测。另外，作为用于定量的标准品，使用了Sigma公司制造的虾青素(Cat.No.A9335)。标准溶液的虾青素浓度的设定通过以下方式进行：测定标准溶液在477nm的吸光度(A)、以及在上述条件下进行HPLC分析时的虾青素峰的面积百分率％(B)，然后用下式进行。

虾青素的浓度(mg/L)＝A÷2150×B×100

〔实施例1〕

将以下组成的培养基(蔗糖30g/L、玉米浆30g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、pH7.2)8ml加入内径18mm的带有棉塞的试管，在121℃下进行15分钟的高压灭菌器灭菌，制备了种子用试管培养基。种子用试管培养基的原料使用已确认了菌体生长充分的批号的原料。

接着，准备5份生产用试管培养基，所述生产用试管培养基是将以下组成的培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆过滤处理物30g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、有机硅类消泡剂0.2g/L)7.2ml加入内径18mm的带有棉塞的试管而得到的。生产用试管培养基的原料使用了已确认菌体生长不充分的批号的原料。

在上述生产用试管的第1根(试管1)中添加最终培养基中的浓度(最终浓度)调整为表1中记载的浓度的微量金属类混合水溶液(氯化钴六水合物0.1mg/L＝0.42μmol/L)0.8ml，在第2根(试管2)中添加调整为表2的浓度的核酸类混合水溶液0.8ml，在第3根(试管3)中添加调整为表3的浓度的维生素类混合水溶液0.8ml，在第4根(试管4)中添加调整为3g/L的浓度的柠檬酸三钠二水合物的水溶液0.8ml，并且在第5根(试管5)中添加离子交换水0.8ml。培养基用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调整为pH7.2，在121℃下进行了20分钟的高压灭菌器灭菌。

表1

表2

表3

将Paracoccus carotinifaciens E-396株(FERM BP-4283)接种于种子用试管培养基，在28℃下以300spm进行了2天的振荡培养，然后将该培养液分别在5种生产用试管培养基中接种0.05ml，在28℃下以300spm进行了4天的振荡培养。

通过OD610(610nm的光学密度)测定了培养液的菌体生长，结果是，在5种生产用试管培养基中，只有添加了微量金属类的试管显示出良好的生长(表4)。

表4

〔实施例2〕

用与实施例1中记载的方法相同的方法制备了种子用试管培养基。接着，准备13份生产用试管培养基，所述生产用试管培养基是将以下组成的培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆过滤处理物30g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、有机硅类消泡剂0.2g/L)7.2ml加入内径18mm的带有棉塞的试管而得到的。生产用试管培养基的原料使用了已确认菌体生长不充分的批号的原料。

将表1中记载的12种微量金属类分别添加至12根上述生产用试管，使其分别为表1记载的最终浓度，并调整为0.8ml，在剩余1根中添加离子交换水0.8ml。培养基用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调整至pH7.2，在121℃下进行20分钟的高压灭菌器灭菌。

将Paracoccus carotinifaciens E-396株(FERM BP-4283)接种于种子用试管培养基，在28℃下以300spm进行了2天的振荡培养，然后将该培养液分别在13种生产用试管培养基中接种0.05ml，在28℃下以300spm进行了4天的振荡培养。

通过OD610测定了培养后的菌体生长，结果是只有添加了氯化钴六水合物的试管显示出良好的生长(表5)。

表5

〔实施例3〕

用与实施例1中记载的方法相同的方法制备了种子用试管培养基。接着，准备12份生产用试管培养基，所述生产用试管培养基是将以下组成的培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆过滤处理物30g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、有机硅类消泡剂0.2g/L)7.2ml加入内径18mm的带有棉塞的试管而得到的。生产用试管培养基的原料使用了已确认菌体生长不充分的批号的原料。

将氯化钴六水合物以0.8ml的水溶液的形式添加于12根上述生产用试管，使得最终浓度为0、0.0001、0.001、0.002、0.005、0.01、0.1、0.25、1、2、5及10mg/L(即，0、0.00042、0.0042、0.0084、0.021、0.042、0.42、1.1、4.2、8.4、21及42μmol/L)。培养基用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调整至pH7.2，在121℃下进行20分钟的高压灭菌器灭菌。

将Paracoccus carotinifaciens E-396株(FERM BP-4283)接种于种子用试管培养基，在28℃下以300spm进行了2天的振荡培养，然后将该培养液分别在钴浓度不同的12种生产用试管培养基中接种0.05ml，在28℃下以300spm进行了4天的振荡培养。

使用ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)测定了未添加另外准备的氯化钴六水合物的上述生产用试管培养基中种子接种后的钴浓度，结果为0.002μmol/L。将未添加氯化钴的培养基中存在的钴浓度与添加的氯化钴的浓度结合，计算出培养基中的钴存在浓度(表6)。

在4天的培养后，通过OD610测定了培养液的菌体生长，通过HPLC测定了类胡萝卜素的浓度，将结果示于表6。另外，将培养基中的钴存在浓度与菌体生长OD610及总类胡萝卜素生产浓度的关系示于图1。另外，将钴存在浓度在高浓度范围及低浓度范围的刻度放大作图，并将其示于图2～4。根据图2～4所示，作为用于产生类胡萝卜素的有效的浓度范围，为0.005μmol/L以上、且8μmol/L以下，作为更有效的浓度范围，为0.01μmol/L以上、且8μmol/L以下，作为进一步有效的浓度范围，为0.02μmol/L以上、且8μmol/L以下。

可知，在钴浓度过低时，细菌数及类胡萝卜素生产量以用量依赖性的方式增加，在钴浓度过高时，细菌数及类胡萝卜素生产量均以用量依赖性的方式降低，在类胡萝卜素的生产中存在钴的适当浓度范围。

〔实施例4〕

用与实施例1中记载的方法相同的方法制备了种子用试管培养基。接着，将生产商、批号不同的原料组合，将以下组成的培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆过滤处理物30g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、有机硅类消泡剂0.2g/L)制成表7所示的A、B、C、D、E这5种，将7.2ml加入内径18mm的带有棉塞的试管得到生产用试管培养基，准备该生产用试管培养基各2份总计10份。

接着，将氯化钴六水合物以0.8ml的水溶液的形式添加于A、B、C、D、E各1根，使得培养基的最终浓度为0.1mg/L(即，0.42μmol/L)，在其它各1根中添加离子交换水0.8ml作为阴性对照。培养基用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调整至pH7.2，在121℃下进行20分钟的高压灭菌器灭菌。

将Paracoccus carotinifaciens E-396株(FERM BP-4283)接种于种子用试管培养基，在28℃下以300spm进行了2天的振荡培养，然后将该培养液分别在钴浓度不同的5种(总计10份)生产用试管培养基中接种0.05ml，在28℃下以300spm进行了4天的振荡培养。

在4天的培养后，通过OD610测定了培养液的菌体生长，通过HPLC测定了类胡萝卜素的浓度，将未添加氯化钴时的结果(使用ICP-MS测定了未添加另外准备的氯化钴六水合物的生产用试管培养基中种子接种后的钴浓度)示于表8，将添加了氯化钴时的结果示于表9，将总类胡萝卜素的比较示于图5。在未添加氯化钴的情况下，随培养基原料的生产商、批号，生长及类胡萝卜素生产浓度的波动大。特别是在钴存在浓度低的培养基批号A及D中，类胡萝卜素生产浓度极低。另一方面，在添加了最终浓度0.1mg/L的氯化钴的情况下，无论培养基原料的生产商、批号如何，均可以确认稳定且高的细菌生长性及类胡萝卜素生产率，可知培养基中的钴浓度在适当范围内的重要性。

表7

表8

表9

〔实施例5〕

将Paracocus carotinifaciens E-396株用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍进行突变处理，用含有0.4mmol/L的clomazone的试管培养基培养了10天。将该培养液涂布于含有0.3mmol/L的fosmydomycin的琼脂培养基进行培养，选择红色色调深的菌落。对选择的株的培养液中的类胡萝卜素进行分析，选择了虾青素生产率提高了的突变株CF-358株。

将以下组成的培养基(葡萄糖20g/L、玉米浆过滤处理物5g/L、磷酸二氢钾0.54g/L、磷酸氢二钾2.78g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、醇类消泡剂0.2g/L、pH7.5)100ml加入500ml容量的带有棉塞的三角烧瓶，在121℃下进行20分钟的高压灭菌器灭菌，制备了种子用烧瓶培养基5份。种子用烧瓶培养基的原料使用了已确认生长充分的批号的原料。

接着，将以下组成的培养基(葡萄糖40g/L、玉米浆过滤处理物30g/L、硫酸铵0.5g/L、谷氨酸钠1水合物6g/L、磷酸二氢钾2.25g/L、磷酸氢二钠十二水合物5.7g/L、氯化钙二水合物0.1g/L、硫酸镁七水合物0.5g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、生物素0.1mg/L、醇类消泡剂0.5g/L)2.0L加入5L容量的发酵槽得到生产培养基，准备了5份该生产培养基。

将氯化钴六水合物添加于上述生产用发酵槽，使得最终浓度为0、0.01、0.1、1及5mg/L(即，0、0.042、0.42、4.2及21μmol/L)。培养基在121℃下进行30分钟的高压灭菌器灭菌，冷却后用20％氢氧化钠水溶液将pH调整至7.2。使用ICP-MS测定了未添加另外准备的氯化钴的发酵槽培养基中种子接种后的钴浓度，结果为0.003μmol/L。

将上述选择的突变株Paracoccus carotinifaciens CF-358株接种于种子用烧瓶培养基，在28℃下以100rpm进行2天的旋转振荡培养，然后将该培养液80ml接种至各发酵槽。在28℃、计示压力0.01Mpa下进行了5天通气量1.5vvm的通气搅拌培养。在培养中自动供给氨水，使得pH保持7.2。自动改变搅拌转速，使得培养液中的溶解氧浓度保持2～4ppm。自动添加醇类消泡剂来抑制起泡。

对于培养结束时的培养液，通过OD610测定了菌体生长，通过HPLC测定了类胡萝卜素的浓度(表10)。在以最终浓度计添加了0.042～21μmol/L的氯化钴的情况下，显示出很高的总类胡萝卜素生产浓度，但在未添加的情况下，生产浓度低。

表10

〔实施例6〕

将以下组成的培养基(蔗糖30g/L、玉米浆30g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1g/L、pH7.2)8ml加入内径18mm的带有棉塞的试管，在121℃下进行15分钟的高压灭菌器灭菌，制备了种子用试管培养基。种子用试管培养基的原料使用了已确认菌体生长充分的批号的原料。

接着，将以下组成的培养基(葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾0.54g/L、磷酸氢二钾2.78g/L、硫酸铵1.5g/L、氯化钙二水合物1g/L、氯化钠3g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物0.5g/L、硫酸锰五水合物5mg/L、硼酸5mg/L，硫酸锌七水合物5mg/L、钼酸钠二水合物2mg/L、硫酸铜五水合物2mg/L、碘化钾1mg/L、钨酸钠1mg/L、硫酸镍六水合物1mg/L、硒酸钠0.1mg/L、氯化铝(III)六水合物0.1mg/L、氯化铬(III)六水合物0.1mg/L、myo-肌醇50mg/L、抗坏血酸30mg/L、吡哆醇盐酸盐20mg/L、泛酸钙15mg/L、核黄素10mg/L、对氨基苯甲酸10mg/L、胆碱10mg/L、氰基钴胺5mg/L、硫胺素盐酸盐1mg/L、叶酸1mg/L、烟酸1mg/L、生物素0.1mg/L、聚醚类消泡剂0.2g/L)7.2ml加入内径18mm的带有棉塞的试管得到生产用试管培养基，准备了7份该生产用试管培养基。生产用试管培养基的原料使用了已确认菌体生长不充分的批号的原料。

将氯化钴六水合物以0.8ml的水溶液的形式添加于上述生产用试管，使得最终浓度调整为0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1及10mg/L(即，0、0.00042、0.0042、0.042、0.42、4.2及42μmol/L)。培养基用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调整至pH7.2，在121℃下进行20分钟的高压灭菌器灭菌。

将副球菌属细菌A-581-1株(FERM BP-4671)接种于种子用试管培养基，在29℃下以300spm进行了2天的振荡培养，然后将该培养液分别在钴浓度不同的7种生产用试管培养基中接种0.05ml，在29℃下以300spm进行了4天的振荡培养。

使用ICP-MS测定了未添加另外准备的氯化钴六水合物的生产用试管培养基中种子接种后的钴浓度，结果为0.002μmol/L。

在4天的培养后，通过OD610测定了培养液的菌体生长，通过HPLC测定了类胡萝卜素的浓度，将结果与培养基中钴的总浓度结合示于表11。即使对于与E-396株不同的从土壤中分离发现的副球菌属细菌A-581-1株而言，也与E-396株一样，在钴浓度过低或过高时，生长及类胡萝卜素的生产均明显降低。

表11

〔实施例7〕

用与实施例1中记载的方法相同的方法制备了种子用试管培养基。接着，将以下组成的培养基(葡萄糖30g/L、玉米浆过滤处理物30g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钠十二水合物3.8g/L、氯化钙二水合物5.0g/L、硫酸镁七水合物0.7g/L、硫酸铁七水合物1.0g/L、有机硅类消泡剂0.2g/L)7.2ml加入内径18mm的带有棉塞的试管得到生产用试管培养基，准备了9份该生产用试管培养基。生产用试管培养基的原料使用了已确认菌体生长不充分的批号的原料。

将氯化钴六水合物以0.8ml的水溶液的形式分别添加于9根上述生产用试管，使得最终浓度为0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、5及10mg/L(即，0、0.00042、0.0042、0.021、0.042、0.42、4.2、21及42μmol/L)。培养基用氢氧化钠水溶液或硫酸水溶液调整至pH7.2，在121℃下进行20分钟的高压灭菌器灭菌。

将Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588株接种于种子用试管培养基，在28℃下以300spm进行了2天的振荡培养，然后将该培养液分别在钴浓度不同的9种生产用试管培养基中接种0.05ml，在28℃下以300spm进行了4天的振荡培养。

使用ICP-MS测定了未添加另外准备的氯化钴六水合物的生产用试管培养基中种子接种后的钴浓度，结果为0.002μmol/L。

在4天的培养后，通过OD610测定了培养液的菌体生长，通过HPLC测定了类胡萝卜素的浓度，将结果示于表12。在钴浓度过低或过高时，生长及类胡萝卜素生产均明显降低，在利用Paracoccus zeaxanthinifaciens进行的玉米黄质及β-隐黄素的生产中，也可知钴的适当浓度范围与其它副球菌属细菌相同。

表12

无序列表文本

n表示a、c、g或t(存在位置：1350)。

序列表

<110> JXTG能源株式会社(JXTG Nippon Oil & Energy Corporation)

<120> 利用基于含钴培养基的产类胡萝卜素细菌进行的类胡萝卜素的发酵制造方法

<130> P1474

<150> JP2015-255920

<151> 2015-12-28

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> E-396

<220>

<221> misc_feature

<222> (1350)..(1350)

<223> n 为 a, c, g, 或 t

<400> 1

agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60

gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120

aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180

agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240

atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360

gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420

accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480

agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540

aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600

gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660

gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780

tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900

aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960

cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020

ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080

tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140

gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200

agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260

atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320

accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380

ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440

gatcacctcc tt 1452

Claims (11)

1.一种高产类胡萝卜素细菌的培养方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌。

2.一种高产类胡萝卜素细菌的制造方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌。

3.一种类胡萝卜素的制造方法，该方法包括：使用以0.005μmol/L～20μmol/L的浓度含有钴或钴盐的培养基培养产类胡萝卜素细菌，并从得到的培养物采集类胡萝卜素。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，培养基中的钴或钴盐的浓度为0.005μmol/L～8μmol/L。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，类胡萝卜素为选自虾青素、角黄素、玉米黄质、β-隐黄素、番茄红素、β-胡萝卜素、金盏花红素、金盏花黄质、海胆酮、Asteroidenone、以及3-羟基海胆酮中的至少一种。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，产类胡萝卜素细菌是属于副球菌属、短波单胞菌属或赤杆菌属的细菌。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，产类胡萝卜素细菌是含有碱基序列与序列号1中记载的碱基序列具有95％以上的同源性的DNA的细菌，所述DNA是与16S核糖体RNA对应的DNA。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，产类胡萝卜素细菌是E-396株(FERMBP-4283)、A-581-1株(FERM BP-4671)、或它们的突变株。

9.一种高产类胡萝卜素细菌，其是通过权利要求2及4～8中任一项所述的方法制造的。

10.一种高产类胡萝卜素细菌，其干燥菌体中至少含有36mg/g的类胡萝卜素。

11.一种高产类胡萝卜素细菌，其含有钴。