DE102006007292A1

DE102006007292A1 - Verfahren zum anaeroben Abbau von organo-funktionalisierten Silicium-Verbindungen, Silanen und Siloxanen durch Bakterien

Info

Publication number: DE102006007292A1
Application number: DE200610007292
Authority: DE
Inventors: Miryam Fischer; Johann Dr. Heider
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg; Wacker Chemie AG
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg; Wacker Chemie AG
Priority date: 2006-02-16
Filing date: 2006-02-16
Publication date: 2007-08-30
Also published as: WO2007093523A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Organo-Silicium-Verbindungen, Silanen und Siloxanen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismenstamm der Gattung Paracoccus in Anwesenheit der Organo-Silicium-Verbindungen, Silane oder Siloxane und eines Elektronenakzeptors unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Organo-Siliciumverbindungen, Silanen und Siloxanen durch Bakterienstämme der Gattung Paracoccus wie z. B. Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705), Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) und Paracoccus denitrificans (DSM 17839).

Silicium ist das zweithäufigste Element in der Erdkruste, jedoch liegt es wegen seiner hohen Affinität zum Sauerstoff in der Natur nur in entsprechenden Verbindungen, nämlich Silikaten oder Siliciumdioxid, in Form von Sand oder Mineralien vor.

Silicone sind synthetisch hergestellte polymere Verbindungen, in denen Silicium-Atome über Sauerstoff-Atome ketten- und/oder netzartig verknüpft und die restlichen Valenzen des Siliciums durch Kohlenwasserstoff-Reste abgesättigt sind. Das Gerüst kann durch die jeweils verwendeten organischen Gruppen verschiedenartig abgewandelt werden. So werden Silicone mit verschiedenen gewünschten Eigenschaften für entsprechende Anwendungen synthetisiert. Fast alle Siliconprodukte gehören zu einer von drei Rohstoffgruppen: Siliconöle, Siliconkautschuke oder Siliconharze. Silicone findet man heute in fast allen Bereichen des Alltags und der Technik, so dass diese Substanzklasse eine enorme Bedeutung erlangt hat.

Siliconöle sind Polymere mit verschiedenen Kettenlängen, die von 2 Silicium-Atomen bis weit über 1000 Si-Atome enthalten. Sie sind gewöhnlich klare, farblose, neutrale, geruchslose und hydrophobe Flüssigkeiten. Siliconöle finden beispielsweise Anwendung als Trennmittel (Entformung von Kunststoffteilen, z. B. in der Reifenindustrie), als Gleitmittel (Kunststofflager, Näh garn, Weinkorken, Folien), als Dämpfungsmedium, als Hydrauliköl, als flüssiges Dielektrikum (Kühlmittel, Transformatoren), als Hydrophobierungsmittel (Glas, Keramik, Textilien), als Antischaummittel, in kosmetischen Rezepturen (Hautschutzsalben, Sonnencremes, Haarpflegemittel) und als Pflegemittelzusatz (Auto- und Möbelpolituren, Schuh- und Bodenpflegemittel). Aufgrund der zahlreichen Anwendung von Siliconölen im Alltag ist es nicht überraschend, dass lineare Silicon-Polymere in alle Bereiche der Umwelt, also in die Atmosphäre, in den Boden und auch ins Wasser gelangen.

Lineare Silicon-Polymere werden in der Umwelt durch natürliche Prozesse abgebaut. Die am häufigsten vorkommenden Silicon-Polymere, die Polydimethylsiloxane (PDMS), werden bei der konventionellen Abwasserreinigung nicht entfernt, gelangen in den Boden und ins Grundwasser und werden dort durch chemische Hydrolyse depolymerisiert. Im Gegensatz zu einer enzymatischen Spaltung, die spezifisch für eine Bindung oder einen Depolymerisierungsprozess vom Kettenende her ist, erfolgt dieser hydrolytische Abbau im Boden zufällig. Die Depolymerisierung liefert schließlich die Monomere Dimethylsilandiol und eine geringe Menge an Trimethylsilanol (Gravier et al., J. of Polymers and Environment, Vol. 11, No. 4 (2003)). Die Monomere diffundieren in die Atmosphäre und werden dort durch UV-Strahlung photooxidiert. Weder die Ausgangsstoffe noch die Abbauprodukte sind für die Umwelt oder für lebende Organismen schädlich.

Obwohl auch Mikroorganismen an ihren natürlichen Standorten, vor allem im Boden und im Wasser, Zugang zu Siliconölen haben, ist bisher nicht viel über ihre Rolle beim Siliconabbau bekannt. Folgende Veröffentlichungen befassen sich mit dem Abbau von Siliconölen durch Mikroorganismen:
R. Wasserbauer und Z. Zadak, Folia Microbiol. 35, 384–393 (1990), berichten, dass ein Pseudomonas putida Stamm aerob mit Polydimethylsiloxan (PDMS) als einziger Kohlenstoffquelle wächst. Beim Wachstum von Pseudomonas putida auf PDMS wurden dabei jedoch keine Produkte identifiziert; zudem wurde die Reinheit des eingesetzten Siliconöls nicht überprüft. In dieser Veröffentlichung wird auch berichtet, dass hochmolekulare Siliconöle biologisch besser abbaubar seien als niedermolekulare Siliconöle, was schwer nachvollziehbar ist.

Als Hinweis auf eine mikrobielle Spaltung der Si-C-Bindung wurde 1996 publiziert, dass ¹⁴C-markiertes Dimethylsilandiol (DMSD) durch einige aerobe Mikroorganismen zu ¹⁴CO₂ umgesetzt wird (Sabourin et al., Applied and Environmental Microbiol., Vol. 62, No. 12, 4352–4360, (1996)). Die Umsetzung des DMSD wurde in dieser Publikation bei einer Arthrobacter sp. und dem Pilz Fusarium oxysporium Schlechtendahl cometabolisch mit anderen Substraten nachgewiesen. Beide Mikroorganismen wachsen allerdings nicht auf DMSD als einzigem Substrat, außerdem sind keine Intermediate des aeroben Abbaus bekannt und weiterhin ist unklar, ob Dimethylsilandiol zu anorganischem Silikat umgesetzt wurde.

Grümping et al., Applied and Environmental Microbiol., Vol. 65, No. 5, 2276–2278, (1999) berichtet, dass in Klärschlamm-Proben unter anaeroben Bedingungen das zyklische Oligosiloxan Octamethylcyclotetrasiloxan (D4) zu DMSD hydrolysiert wurde. Ein weiterer Abbau des Monomers wurde allerdings nicht beobachtet. Außerdem wurden die verantwortlichen Bakterien nicht identifiziert.

DE 10 2004 011 993 beschreibt ein Verfahren zum biologischen Abbau einer Masse enthaltend eine Silicium Kohlenstoff Einfachbindung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Mischung aus der Masse und einer Mikroorganismenpopulation unter anaeroben oder mikroaeroben Bedingungen unter Zusatz eines alternativen Elektronenakzeptors inkubiert wird. Bei den Verbindungen enthaltend eine Silicium Kohlenstoff Einfachbindung handelt es sich vorzugsweise um Polyorganosiloxane, organofunktionelle Siloxane, Organosilanole oder deren Bruchstücke. Der alternative Elektronenakzeptor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Fumarat, Succinat, oxidierte Eisenionen, Sulfat oder Nitrat.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches einen mikrobiellen Abbau von Organo-Silicium-Verbindungen, Silanen oder Siloxanen ermöglicht.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Mikroorganismenstamm der Gattung Paracoccus in Anwesenheit von Organo-Silicium-Verbindungen, Silanen oder Siloxanen und eines Elektronenakzeptors unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.

Überraschenderweise konnten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung zeigen, dass durch die Einwirkung eines Mikroorganismenstammes der Gattung Paracoccus, auf Organo-Silicium-Verbindungen, Silane oder Siloxane unter Zusatz von Verbindungen, die als anaerobe Elektronenakzeptoren dienen, ein Abbau der Organo-Silicium-Verbindungen erfolgt.

Vorzugsweise werden die Organo-Silicium-Verbindungen, Silane oder Siloxane in einem Mineralsalzmedium unter anaeroben Bedingungen abgebaut, wobei den Mikroorganismen ein geeigneter Elektronenakzeptor zur Verfügung gestellt wird.

Unter einem geeigneten Elektronenakzeptor sind vorzugsweise Nitrat, Sulfat oder Eisenionen zu verstehen. Der Elektronenak zeptor liegt vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 1000 mmol/l, bevorzugt in einer Menge von 1 bis 100 mmol/l und besonders bevorzugt in einer Menge von 1 bis 20 mmol/l vor.

Als Medium ist jedes Mineralsalzmedium geeignet, welches die chemischen Elemente, Vitamine und Wuchsstoffe, die für bakterielles Wachstum notwendig sind, enthält.

Ein Mineralsalzmedium enthält im allgemeinen Ammonium-, Calcium-, Kalium-, Natrium-, Magnesium-, Phosphat- und Sulfationen in Konzentrationen von jeweils 5–5000 mg/l. Spuren anderer Ionen, wie Cobalt-, Eisen-, Mangan-, Zink-, Kupfer-, Molybdän-, Nickel-, Bor-, Selen und Wofram sind in Konzentrationen von 0,0001–2000 mg/l enthalten. Vitamine, z. B. p-Aminobenzoesäure, Biotin, Nicotinsäure, Folsäure, Pantothensäure, Riboflavin, Thiamine, Vitamine der Gruppe B6, Vitamin B12, Liponsäure oder Vitamin K können in Konzentrationen von 0,0001–1000 mg/l zugesetzt werden.

Ein bevorzugtes Medium ist in Tab 1 in Beispiel 1 angegeben, eine Zusammenstellung der notwendigen Supplemente ist in Tab. 2 im Beispiel 1 angegeben.

Der Abbau erfolgt dabei vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 20–45°C, besonders bevorzugt bei 30°C.

Der pH-Wert des Mediums wird während des Abbaus vorzugsweise derart reguliert, dass er im Bereich von pH 7 bis pH 9 liegt.

Die Dauer des Abbaus einer vorgegebenen Konzentration an einer Organo-Siliciumverbindung, einem Silan oder einem Siloxan ist unter anderem von Verfahrensparametern, wie pH, Temperatur und verfügbarem Elektronenakzeptor abhängig.

In allen Fällen konnte aber eine Abnahme der Konzentration der Organo-Siliciumverbindungen, Silane oder Siloxane um mindestens den Faktor 0,5–1 nach 4–6 Wochen gemessen werden, d. h. 50–100 % der Organo-Siliciumverbindungen wurden abgebaut. Gleichzeitig konnte nach 4–6 Wochen ein Verbrauch des Elektronenakzeptors im Vergleich zu der vorgelegten Menge um den Faktor 3 gemessen werden, d. h. der Verbrauch des Elektronenakzeptors war nach 4–6 Wochen auf das 3fache der vorgelegten Konzentration angestiegen.

Durch ein weiteres Optimieren und Regulation von Wachstumsparametern, wie pH-Wert, Temperatur und anderen Parametern und Verfahren zur Biomasserückhaltung sind jedoch wahrscheinlich kürzere Abbauzeiten (mehrere Tage bis wenige Wochen) zu erreichen. In den Ansätzen stellen die Organo-Siliciumverbindungen die einzige Energie- und Kohlenstoffquelle dar. Die beschriebenen Paracoccus-Stämme können mit diesen Verbindungen nur wachsen, indem sie die Methylgruppen oxidieren und die dabei frei werdenden Elektronen auf einen geeigneten Elektronenakzeptor übertragen. Die Reduktion des Elektronenakzeptors ist proportional zur gleichzeitigen Oxidation der Organo-Siliciumverbindungen. Deshalb lässt sich der Abbau der Organo-Siliciumverbindungen anhand des verbrauchten Elektronenakzeptors quantifizieren. In dem beschriebenen Ansatz wurde das vorhandene Dimethylsilandiol (1–2 mmol/l) auf Kosten von 6 mmol/l Elektronenakzeptor (NO^– ₃) abgebaut.

Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Mikroorgansimenstamm ausgewählt aus der Gruppe Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705), Paracoccus denitrificans (DSM 17839) und Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) eingesetzt.

Die Verwendung eines Mikroorganismenstammes der Gattung Paracoccus, vorzugsweise eines Stammes ausgewählt aus der Gruppe Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705), Paracoccus denitrificans (DSM 17839) und Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) in dem beschriebenen Verfahren verringert die Konzentration der Organo-Siliciumverbindung, Silane oder Siloxane innerhalb von 4–6 Wochen um mindestens den Faktor 0,5–1 (d. h. es wurden mindestens 50–100 % der Organo-Siliciumverbindungen abgebaut) oder ermöglicht sogar den vollständigen Abbau der vorgelegten Organo-Siliciumverbindung, Silane oder Siloxane.

Die Erfindung betrifft somit auch die Bakterienstämme Paracoccus sp. IO-1 (hinterlegt am 11.11.2005 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 17705 gemäß Budapester Vertrag), Paracoccus denitrificans (hinterlegt am 22.12.2005 bei der DSMZ unter der Nummer DSM 17839 gemäß Budapester Vertrag) und Paracoccus sp. B8B2 (hinterlegt am 22.12.2005 bei der DSMZ unter der Nummer DSM 17838 gemäß Budapester Vertrag).

Die erfindungsgemäßen Bakterienstämme Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705), Paracoccus denitrificans (DSM 17839) und Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) ermöglichen insbesondere den anaeroben mikrobiellen Abbau von niedermolekularen Siliconölen und monomeren Modellsubstraten, die aus polymeren Siliconölen entstehen, wie beispielsweise Dimethylsilandiol oder Trimethylsilanol.

Die erfindungsgemäßen Bakterienstämme wachsen unter anaeroben Bedingungen mit Dimethylsilandiol oder Trimethylsilanol als einziger Kohlenstoffquelle und mit NO₃ ^– als Elektronenakzeptor. Während des Wachstums von Paracoccus sp. IO-1 auf Dimethylsilandiol wurde der Verbrauch von Dimethylsilandiol und von NO^– ₃ festgestellt. Weiterhin wurde die Zunahme der Bakterien- Zellzahl während der Kultivierung dokumentiert. Da den Bakterien die zugegebenen Silanole als einzige mögliche Kohlenstoff-Quelle für den Energie- und Baustoffwechsel dienen, müssen sie in der Lage sein, die C-Si-Bindungen der Silanole zu spalten und die Methylgruppen in ihrem Stoffwechsel zu verwerten. Demzufolge müssen in den Zellen dieser Bakterien auch Enzyme enthalten sein, die die Methylgruppen aus der Bindung an die Si-Atome freisetzen und dem Zell- und Energiestoffwechsel zuführen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von 4 Ausführungsbeispielen näher erläutert, wobei

Tabelle 1 die Zusammensetzung des Mineralsalzmediums für die Kultivierung der anaerob wachsenden Bakterien zeigt;
Tabelle 2 die Supplemente für das Mineralsalzmedium für anaerob wachsende Bakterien zeigt;
Tabelle 3 die Zusammensetzung der LB-Agar-Platten für die Vereinzelung von Mischkulturen zeigt;
Tabellen 4 und 5 die Zusammensetzung der Minimalmedium-Agar-Platten für die Vereinzelung von Mikroorganismen zeigt;
Tabelle 6 die Abbaufähigkeiten der Reinkultur von Paracoccus sp. Stamm IO-1 unter denitrifizierenden Bedingungen zeigt und
Tabelle 7 die Abbauergebnisse einer Anreicherungskultur mit Dimethylsilandiol oder Trimethylsilanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle und der Reinkultur von Paracoccus sp. IO-1 mit Dimethylsilandiol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zeigt.

1 zeigt die Wachstumskurve dieser Reinkultur, gemessen als Verbrauch an Nitrat während des Wachstums mit Dimethylsilandiol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1: Isolierung einer Reinkultur des Paracoccus sp. Stammes IO-1 aus einer anaeroben Mischkultur
Der Mikroorganismenstamm Paracoccus sp. IO-1 wurde aus einer anaerob wachsenden Mischkultur aus der kommunalen Kläranlage Forchheim (bei Freiburg) isoliert. Die Isolierung von Paracoccus sp. IO-1 erfolgte in mehreren, im Folgenden beschriebenen Schritten.
1. Anreicherung von Bakterien aus der kommunalen Kläranlage Forchheim mit Organo-Silicium-Verbindungen.
Die Probe wurde in Mineralsalzmedium (s. Tabellen 1 und 2) für anaerobe Mikroorganismen suspendiert. Tabelle 1: Mineralsalzmedium für anaerob wachsende Mikroorganismen (einfach konzentriert).

Mit deionisiertem H₂O auf 1 Liter auffüllen.

Tabelle 2: Supplemente für anaerob wachsende Mikroorganismen (einfach konzentriert)
Der pH-Wert des Mediums wurde mit 2 M HCl auf 7,2 eingestellt. Das Mineralsalzmedium wurde dafür zuvor anaerobisiert und autoklaviert und dann mit folgenden Substanzen supplementiert: Spurenelemente, Vitamine, Selenit-Wolframat-Lösung und Verbindungen (z. B. Nitrat), die als anaerobe Elektronenakzeptoren dienen. Weiterhin enthielt das Mineralsalzmedium NaHCO₃, aus dem durch Zusatz von Salzsäure ein HCO₃ ^–/CO₂-Puffer (pH = 7,2) hergestellt wurde. Als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle wurden Organo-Silicium-Verbindungen, insbesondere die Modell-Verbindungen Dimethylsilandiol, Trimethylsilanol oder Decamethylcyclopentasiloxan zugesetzt. Die Konzentration betrug jeweils 1 mmol/l. Das komplettierte Mineralsalzmedium wurde mit einer Probe aus der Kläranlage bzw. der entstandenen Mischkultur beimpft. Die Inkubation erfolgte in verschlossenen Flaschen in einem Schüttler bei 30°C. Das Wachstum der Mikroorganismen wurde mikroskopisch und über den Verbrauch an Nitrat kontrolliert und die Ansätze mehrfach überimpft. Abiotischer Abbau wurde durch eine nicht beimpfte Kontrolle (Sterilkontrolle) ausgeschlossen. Nach drei Subkulturen konnte man davon ausgehen, dass ausschließlich die zugesetzten Organo-Silicium-Modell-Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle von den Mikroorganismen genutzt wurden.
2. Vereinzelung der Mikroorganismen der Anreicherungskultur auf Minimalmedium- und Vollmedium-Platten.
Die Organo-Silicium-abbauenden Bakterien aus der Anreicherungskultur wurden über Verdünnungsreihen vereinzelt. Zusätzlich wurden die Mikroorganismen der Anreicherungskultur zur Vereinzelung auf Minimalmedium-Agar-Platten (s. Tabellen 4 und 5) und auf Vollmedium-Agar-Platten (LB-Agar-Platten, s. Tabelle 3) ausplattiert. Als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle ent hielten die Minimalmedium-Agar-Platten wasserlösliche Organo-Silicium-Modellsubstrate, insbesondere Dimethylsilandiol oder Trimethylsilanol. Tabelle 3: Vollmedium-Agar-Platten LB-Agar-Platten

Mit deionisertem H₂O auf 1 Liter auffüllen.

Minimalmedium-Agar-Platten
Zur Verfestigung des phosphatgepufferten Minimalmediums (Tabelle 4) wurde 2,8 %iger Bacto-Agar (2fach konzentriert) separat in 250 ml deionisiertem Wasser suspendiert und autoklaviert. Das 2fach konzentrierte und komplettierte (Tabelle 5) phosphatgepufferte Medium wurde dann mit dem 2fach konzentrierten Bacto-Agar versetzt und die Platten gegossen. Tabelle 4: 25fach phosphatgepuffertes Medium

Mit deionisiertem H₂O auf 1 Liter auffüllen.

Um 2fach konzentriertes phosphatgepuffertes Medium zu erhalten, wurden 20 ml des 25fachen phosphatgepufferten Mediums mit Aqua dest. auf 250 ml aufgefüllt und autoklaviert. Dann wurden folgende Komponenten (s. Tabelle 5) zugegeben:
Tabelle 5: Supplemente (2fach konzentriert) für das phosphatgepufferte Medium (2fach)
3. Inokulation und Kultivierung von Zellen aus Einzelkolonien in flüssigen Minimalmedien mit Organo-Silicium-Modellsubstraten
Einzelkolonien der auf den Minimalmedium-Agar-Platten (s. Tabellen 4 und 5) gewachsenen Mikroorganismen wurden gepickt und wieder in Flüssigkultur mit Mineralsalzmedium für anaerob wachsende Mikroorganismen (s. Tabellen 1 und 2) überführt. Als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle enthielten die Ansätze wasserlösliche und wasserunlösliche Organo-Silicium-Modellsubstrate in einer Konzentration von 1 mmol/l.
Schritte 2 und 3 wurden so oft wiederholt, bis die Kultur bei mikroskopischer Betrachtung einheitlich erschien.
4. PCR-Amplifikation und Sequenz-Analyse der 16S rRNA des vorherrschenden Bakterien-Stammes.
Die 16S rRNA-Gene der in Schritt 2 und 3 vereinzelten Bakterien-Stämme wurden durch PCR amplifiziert und anschließend se quenziert. Das Sequenzprotokoll gibt die Partialsequenz der 16S rDNR von Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705) (SEQ ID NO 1) und die vollständigen Sequenzen der 16S rDNA von Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) (SEQ ID NO 2) und Paracoccus denitrificans (DSM 17839) (SEQ ID NO 3) wieder. Damit wurde der isolierte Mikroorganismenstamm taxonomisch als Paracoccus-Art identifiziert.
5. Charakterisierung der Abbaufähigkeiten des erhaltenen Isolats (Paracoccus sp. Stamm IO-1 (DSM 17705)), z. B. die Verwertung von Siloxanen.
Bei dem angereicherten Stamm, der mit Organo-Silicium-Verbindungen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen kann, handelt es sich um Paracoccus sp. IO-1.
Die vorliegende Reinkultur wurde hinsichtlich ihrer Abbaufähigkeiten untersucht (s. Tabelle 6)
Es zeigte sich, dass Paracoccus sp. Stamm IO-1 nicht nur Silikonöle, sondern auch verzweigte Kohlenwasserstoffe, wie Isooktan oder Heptamethylnonan unter anaeroben Bedingungen mit Nitrat als Elektronenakzeptor abbaut. Da solche verzweigten Kohlenwasserstoffe oft als Kontamination in Silikonölen vorkommen, wurde das Wachstum von Stamm IO-1 auch auf den definierten Silikon-Modellverbindungen Decamethylcyclopentasiloxan und Dimethylsilandiol getestet, die frei von kontaminierenden Kohlenwasserstoffen waren. Die Kultivierung von Stamm IO-1 war auch mit diesen Modellsubstraten als einzigen C-Quellen möglich. Das Wachstum der Zellen konnte aufgrund des Nitratverbrauchs einfach verfolgt werden. Weiterhin baut Paracoccus sp. Stamm IO-1 unter denitrifizierenden Bedingungen auch n-Hexadecan, viele Carbonsäuren, tert-Butanol, Methylamin, Polyethylenglycol, DMSO, einige Zucker und Zuckeralkohole ab (s. Tabelle 6).
Tabelle 6: Verwertung von verschiedenen Verbindungen durch Paracoccus sp. Stamm IO-1 unter anaeroben Bedingungen als Energie- und Kohlenstoffquellen. Bei dem verwendeten Siliconöl M50 handelt es sich um ein Polydimethylsiloxan der Fa. Bayer AG, welches im Chemikalienhandel (Fa. Roth) erhältlich ist. Bei dem verwendeten Silicon D1 handelt es sich um Dimethylsilandiol, welches nach Literaturangaben (Hyde, J. F., J. Am. Chem. Soc.(75), 2166–2167 (1953) hergestellt wurde.
Als Kriterien für das Wachstum der Kulturen wurden in den einzelnen Ansätzen die Zunahme der Trübung (OD-Wert) und die Reduktion von Nitrat verfolgt:

++: Wachstum und Nitratreduktion innerhalb einer Woche;
+: Wachstum und Nitratreduktion innerhalb mehrerer Wochen bis Monate;
(+): messbare Nitratreduktion, aber keine Zunahme der OD;
–: weder OD-Zunahme noch Nitratreduktion

6. Mikrobiologische Charakterisierung von Paracoccus sp. Stammes IO-1
Paracoccus sp. Stamm IO-1 ist ein unbewegliches, kokkoides, gram-negatives Bodenbakterium, das zur alpha-Gruppe der Proteobakterien gehört und eng verwandt ist mit P. denitrificans (DSM 17839).
7. Wachstum von Paracoccus sp. IO-1 mit Organo-Silicium-Verbindungen.
Paracoccus sp. IO-1 und weitere Stämme der Gattung Paracoccus, wie z. B. Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) und Paracoccus denitrificans (DSM 17839), wachsen je nach Substrat mit sehr verschiedenen Raten. Mit einigen polaren Substraten (z. B. Citrat oder Isobutyrat) wachsen die Zellen relativ schnell (Verdopplungszeiten von 3 h), während mit einigen anderen Substraten nur sehr langsames Wachstum möglich ist. Dies gilt insbesondere für Kulturen mit Silikonöl oder den getesteten Silicon-Modellsubstraten, die mit Verdopplungszeiten von ca. 20 Tagen wuchsen und deshalb über 2–3 Monate beobachtet wurden. Das Wachstum der Kulturen wurde durch Messung des verbrauchten Nitrats und mikroskopische Auswertung der Zellzahl-Zunahme verfolgt (1). Paracoccus sp. IO-1 und die anderen Stämme der Gattung Paracoccus benötigen für die Umsetzung von 1 mmol/liter Dimethylsilandiol ca. 6 mmol/Liter Nitrat.
Beispiel 2: Isolierung einer Reinkultur des Paracoccus sp. Stammes B8B2 (DSM 17838) aus einer anaeroben Mischkultur
Analog Beispiel 1 wurde der Stamm Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) isoliert. Seine mikrobiologischen Eigenschaften und Wachstumseigenschaften entsprechen überwiegend Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705). Unterschiede gibt es hauptsächlich in den Abbaufähikeiten der hier genannten Stämme und in der genetischen Ausstattung der Organismen (z. B. 16S rDNA).
Beispiel 3: Isolierung einer Reinkultur des Stammes Paracoccus denitrificans (DSM 17839) aus einer anaeroben Mischkultur
Analog Beispiel 1 wurde der Stamm Paracoccus denitrificans (DSM 17839) isoliert. Seine mikrobiologischen Eigenschaften und Wachstumseigenschaften entsprechen überwiegend Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705). Unterschiede gibt es hauptsächlich in den Abbaufähikeiten der hier genannten Stämme und in der genetischen Ausstattung der Organismen (z. B. 16S rDNA).
Beispiel 4: Abbauuntersuchungen von Dimethylsilandiol und Trimethylsilanol durch Bakterienstämme der Gattung Paracoccus.
Die Abbauuntersuchungen mit Organo-Silicium-Verbindungen wurden unter Schütteln in anaeroben 100 ml-Flaschen in Mineralsalzmedium (s. Tabellen 1 und 2) bei 30°C und ca. pH 7,2 durchgeführt. Das Arbeitsvolumen betrug 40 ml, und die Endkonzentration der Organo-Silicium-Verbindungen in dem Mineralsalzmedium betrug ca. 1 mmol/Liter. Zu Beginn der Inkubation der Ansätze wurde eine Probe entnommen (Nullwert), um die tatsächliche Konzentration der Organo-Silicium-Verbindungen in den Ansätzen zu bestimmen. Nach 6 Wochen Inkubation wurde eine weitere Probe entnommen. Die Ergebnisse des Abbaus der Organo-Silicium-Verbindungen sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7: Ergebnisse des Abbaus von Organo-Silicium-Verbindungen.

Substratabnahme (mmol/Liter) und Nitratverbrauch (mmol/Liter) beim anaeroben Wachstum von Paracoccus sp. IO-1 mit Dimethylsilandiol als einziger Kohlenstoffquelle.
DMSD: Dimethylsilandiol

Ansätze: Es wurden 3 Kulturen und 2 Kontrollen von Paracoccus sp. IO-1 angesetzt. Die Kulturen unterschieden sich lediglich in der Anfangskonzentration an Nitrat. In Klammern ist die Konzentration an Nitrat (mmol/Liter) angegeben, die zu Beginn der Inkubation in den jeweiligen Ansätzen vorlag. Kontrolle 1 wurde nicht beimpft, enthielt jedoch als Kohlenstoffquelle DMSD. Kontrolle 2 wurde beimpft, enthielt jedoch kein DMSD als Kohlenstoffquelle.

Zugabe von DMSD (mmol/liter) zu Beginn der Inkubation:
Die Organo-Silicium-Verbindung (DMSD) wurde in einer Konzentration von 1 mmol/liter zu dem Mineralsalzmedium zugesetzt.
Tatsächliche Konzentration von DMSD (mmol/liter) zu Beginn der Inkubation:
Zu Beginn der Inkubation der Ansätze wurde eine Probe entnommen (Nullwert), um die tatsächliche Konzentration der Organo-Silicium-Verbindungen in den Ansätzen zu bestimmen.
Restkonzentration an DMSD (mmol/liter) nach 6 Wochen Inkubation:
Die verbliebene Menge an DMSD wurde nach sechs Wochen Inkubation mittels NMR-Bestimmung errmittelt.
Kultur 1 hatte nach sechs Wochen Inkubation 4 mmol/Liter Nitrat vebraucht und es wurde eine Restkonzentration an DMSD von 0,4 mmol/Liter festgestellt. Kultur 2 hatte nach sechs Wochen Wachstum ebenso 4 mmol/Liter Nitrat verbraucht und es konnte eine Restkonzentration an DMSD von 0,55 mmol/Liter nachgewiesen werden. Die Kulturen 1 und 2 hatten demnach nach 6 Wochen einen Teil des DMSD abgebaut.
Kultur 3 verbrauchte die anfänglichen 5 mmol/Liter Nitrat nicht. Die Kultur bildete zu Beginn des Wachstums sehr viel Nitrit, wodurch das Wachstum gehemmt wurde. Aus diesem Grund konnte das vorgelegte DMSD nicht abgebaut werden und die Restkonzentration an DMSD betrug nach sechs Wochen Wachstum noch 0,68 mmol/Liter.
Nitratverbrauch (mmol/Liter) nach 6 Wochen Inkubation:
Hatten die Kulturen das zu Anfang vorhandene Nitrat verbraucht, wurden sie mit Portionen von je 1 mmol/Liter Nitrat nachgefüttert.
Beim anaeroben Wachstum von weiteren Bakterienstämmen der Gattung Paracoccus, wie z. B. Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) und Paracoccus denitrificans (DSM 17839), mit Dimethylsilandiol als einziger Kohlenstoffquelle konnte ebenso eine deutliche Abnahme des Substrates und ein Verbrauch an Nitrat nach 6 Wochen Inkubation festgestellt werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Organo-Silicium-Verbindungen, Silanen oder Siloxanen dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismenstamm der Gattung Paracoccus in Anwesenheit der Organo-Silicium-Verbindungen, Silane oder Siloxane und eines Elektronenakzeptors unter anaeroben Bedingungen kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Mineralsalzmedium kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor ausgewählt ist aus der Gruppe Nitrat, Sulfat, Eisenionen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektronenakzeptor in einer Menge von 0,5 bis 1000 mmol/l vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3, oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Temperaturbereich von 20–45°C, besonders bevorzugt bei 30°C durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem Medium durchgeführt wird, welches während des Abbaus einen pH Wert im Bereich von pH 7 bis pH 9 besitzt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorgansimenstamm ausgewählt aus der Gruppe Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705), Paracoccus de nitrificans (DSM 17839) und Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838) eingesetzt wird.
Verwendung von Stämmen der Gattung Paracoccus zum Abbau von Organo-Silicium-Verbindungen, Silanen oder Siloxanen.
Bakterienstamm der Gattung Paracoccus ausgewählt aus der Gruppe Paracoccus sp. IO-1 (DSM 17705) Paracoccus denitrificans (DSM 17839) und Paracoccus sp. B8B2 (DSM 17838).