JPH08500001A

JPH08500001A - アグロバクテリウム種の純粋培養菌による第二鉄キレートの分解

Info

Publication number: JPH08500001A
Application number: JP50802691A
Authority: JP
Inventors: ジェイローフ，ジョン; エムブリートフェラー，ジェイムズ; バーニースティール，ディー; エイクーガン，ルイス
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1990-04-11
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1996-01-09
Also published as: US5252483A; CA2079899A1; DE69127208D1; EP0610176A1; DE69127208T2; EP0610176B1; EP0610176A4; US5364786A; WO1991015591A1

Abstract

(57)【要約】新規な微生物を分離し、アグロバクテリウム種、グラム陰性好気菌と同定した。このアグロバクテリウム種微生物は、廃棄水溶液にみられる、エチレンジアミンテトラ酢酸およびその関連化合物等のアミノポリカルボン酸の第二鉄キレートを効果的に分解することがわかった。アグロバクテリウム種の生物学的な純粋培養およびその使用方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】アグロバクテリウム種の純粋培養菌による第二鉄キレートの分解発明の背景１．発明の分野本発明は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートの生物分解に関する。より詳しくは、本発明は、これらの化合物をとくに水溶液から分解するための微生物アグロバクテリウム種の使用、ならびにアグロバクテリウム種の純粋培養菌に関する。２．現状技術これまで、エチレンジアミン四酢酸第二鉄（ＥＤＴＡ−第二鉄）の様なアミノポリカルボン酸の金属キレートおよび他の類似のキレートは容易に生物分解されないことが分かっている。例えば、ゲリケら、生態毒物学および環境安全、３：１５９−１７３（１９７５）参照。その様な金属キレートを容易に分解できないために、多くの環境問題が生じる。特に、活性化スラッジによる二次処理において、これらの金属キレートの生物分解は非常に遅いので、これらのキレートが二次処理施設を通過し、ほとんど分解されずに環境中に放出されることが報告されている。トムら、Proc.Roy.Soc. of London. 、１８９：３４７−３５７（１９７５）参照。このために、環境において可能なキレートの生物蓄積ならびに汚染された河川または堆積物中に高濃度を放出することにより可能な重金属の移動も問題になっている。さらに、ＥＤＴＡは、核廃棄物処理場から放射性核種を移動させることにもなる。他方、何年間にもわたってＥＤＴＡが環境中に蓄積することはなさそうである。例えば、土壌中の比較的低濃度（土壌１グラムあたり２−１０００マイクログラム）のＥＤＴＡ汚染は生物学的に除去されることが立証されている。Tiedje、Appl．Microbiol.、３０：３２７−３２９（１９７５）およびTiedje、J．Envir on Qual.、６：２１−２６（１９７７）参照。これらの研究において、低濃度のＥＤＴＡおよびその金属キレートは各種の土壌において１５−４５週間で消失することが示されている。しかし、ＥＤＴＡまたはその金属キレートを代謝できる単一の細菌種は分離されなかった。水溶液中のやや高い濃度（＜２mM）において、ベリーら、Appl .Microbiol.、２９：７８７−７９４（１９７５）は、細菌の順化した混合個体群によるＦｅ⁺³ ＥＤＴＡキレートの好気性細菌分解を研究している。これらの濃度において、基質の９０％以上が５日で消失している。やはり、第二鉄ＥＤＴＡ基質だけを炭素源として成長する単一の細菌種は分離されなかった。ＳＵ５２５６２７の要約は、先ず水酸化ナトリウム処理を行い、次いで好気性細菌を使用して生物学的精製を行うことにより、重金属錯体を沈殿させて水から除去する方法を記載している。水酸化ナトリウム処理から得られる濾液はpH８−９で微生物で精製する。特開昭５８−４３７８２号は、プソイドモナスおよびアルカリゲネス種の株が好気性条件下でＥＤＴＡを分解できることを記載している。試験した最高濃度は５mMで、８０％分解に５日間を要している。生物学的分解の他に、ＥＤＴＡの第二鉄キレートは、紫外線照射により分解できる。特に、模擬環境条件下で、ロックハートら、Env．Sci．and Technol.、９：１０３５−１０３８（１９７５）ならびにロックハートら、Environ.Lett.、９：１９−３１（１９７５）は、ＵＶ照射機構による分解を立証している。明るい日光における分解速度は、親化合物の除去に初期濃度１．６mM、pH４．９で１ −２日間、初期濃度９．８mM、pH６．９で１１日間以上かかることが分かった。これらの研究で、ＥＤＴＡ−第二鉄の変換は立証されたが、広範囲な鉱化作用は立証されなかった。上記の理由から、アミノポリカルボン酸の金属キレートを、特にその様なキレートで汚染された工業廃液から分解するための効率的な方法が常に必要とされている。さらに、その様なキレートを除去するためのその様な分解方法は、環境に害を与えることなく、迅速に行われる必要がある。発明の概要本発明は、微生物アグロバクテリウム種（アメリカンタイプコレクション、ロックビル、ＭＤ、にＡＴＣＣNo．５５００２として供託）がアミノポリカルボン酸の第二鉄キレートを迅速に、且つ効率的に分解し、したがってこの微生物を使用して水溶液を処理し、その様な第二鉄キレートを除去できるという発見によるものである。そこで、その構成の一つの特徴において、本発明は微生物アグロバクテリウム種ＡＴＣＣ番号５５００２の生物学的純粋培養菌を目的としている。その構成の別の特徴において、本発明は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートの一つ以上を含む水溶液からその第二鉄キレートを分解できる、アグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌を目的としている。その方法の特徴の一つにおいて、本発明は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートの分解方法であって、該キレートをアグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌と組み合わせることからなる方法を目的としている。本発明のこの特徴は、さらにエチレンジアミン四酢酸、プロピレンジアミン四酢酸またはそれらの混合物の第二鉄キレートを分解するための方法であって、該キレートの一つ以上をアグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌と組み合わせることからなる方法に関する。その方法の別の特徴において、本発明は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートを含む水溶液から鉄を回収する方法であって、ａ）アミノポリカルボン酸の一つ以上の第二鉄キレートを含む水溶液にアグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌を加えること、ｂ）その水溶液を、溶液から鉄が沈殿するのに十分な温度で、十分な時間、pH約８以下に維持すること、およびｃ）該鉄を回収することからなる方法を目的としている。図面の簡単な説明図１（ａ）および１（ｂ）は、振とうフラスコ中における、ナトリウムＥＤＴＡ−第二鉄によるアグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ No.５５００２）の成長特性を示す。基礎培地（下記）、３５mMのナトリウムＥＤＴＡ−第二鉄および１００ mMのリン酸塩を含む溶液を、ＨＣｌおよびＮａＯＨを加えることによりそれぞれ PH６．２および７．４に調節した。培養は振とう培養機中で２９℃で行った。図１（ａ）で、６００nmにおける光学密度を０．１ＮのＨＣｌで希釈したアリコートに対してプロットし、そのプロットした値を希釈ファクターで補正した。図１（ｂ）では、ＥＤＴＡ−第二鉄濃度をミリモル単位でプロットし、測定したpHをデータ点上に示す。図２（ａ）および（ｂ）は、pHを７．４に調節し、温度を２９−３１℃に維持し、１リットル規模で行ったアグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ No.５５００２）の培養菌から得た結果を示す。初期肉汁は、基本培地に３５mMのナトリウムＥＤＴＡ−第二鉄および１００mMのリン酸塩を含む様に調製した。特に、図２（ａ）は、培養中の異なった時間における化学的酸素要求量（ＣＯＤ）を示す。ＣＯＤ測定は、肉汁全体のアリコート全体（細胞を伴うＣＯＤ）で、および１３０００ｇで遠心分離して細胞物質および化学沈殿物を除去した後（ＣＯＤ上澄み）に行った。図２（ｂ）は、異なった培養点における、可溶性鉄（すなわち溶液中の）、アンモニアおよびＥＤＴＡ−第二鉄の濃度を示す。図３（ａ）および３（ｂ）は、ＥＤＴＡ−第二鉄によるアグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ５５００２）の大規模（７．２リットル）培養から得られた結果（炭素および窒素の物質収支を含む）を示す。ＣＯＤ値は、細胞を遠心分離した後のアリコートについて得た。ＥＤＴＡ−第二鉄からＣＯ₂およびアンモニアへの炭素および窒素の変換は、接種時に測定したＥＤＴＡ−第二鉄の初期濃度から可能な最大値の百分率としてプロットする。失われたＣＯＤの百分率は、初期肉汁中のＣＯＤから溶液中に残留するＣＯＤを引くことにより計算する。ＣＯＤもアンモニア値も蒸発に関しては補正していない。図４はアグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ５５００２）の成長に対する、初期pH およびＥＤＴＡ−第二鉄濃度の影響を示す。試験管は基本培地、リン酸塩緩衝液（１００mM）およびナトリウムＥＤＴＡ−第二鉄を図に示す濃度で含んでいた。試験管に、新たに収穫し、洗浄した細胞の濃縮物から１．０の計算初期光学密度（ＯＤ）で接種し、３０℃±１℃で４８時間培養した。誤差棒は三重実験（pH７．４）および二重実験（pH６．２）に対する標準偏差を示す。反復実験において比較試験は行わなかった。図５は、トリプチケース大豆肉汁寒天平板上で成長させた、白金／パラジウム陰影をつけた、アグロバクテリウム種の電子顕微鏡写真である。図６は、ＥＤＴＡ−第二鉄寒天平板上で成長させた、白金／パラジウム陰影をつけた、アグロバクテリウム種の電子顕微鏡写真である。小さな黒い断片は、細菌の表面上の局所的な高密度区域を示す。好ましい実施態様の詳細な説明エチレンジアミン四酢酸の第二鉄キレート（ＥＤＴＡ−第二鉄）を含む産業廃棄物を受け入れる処理施設からアグロバクテリウム種、ＡＴＣＣ No.５５００２の生物学的純粋培養菌を分離したが、これはアミノポリカルボン酸の第二鉄キレートを以前に報告されている値よりも著しく高い速度および基質濃度で分解できる。この微生物は、直径約１ミクロンで長さ約２−３ミクロンの、好気性のグラム陰性桿状菌である。この用途向けのアグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌菌は、アグロバクテリウム種の明白な特徴を有する、一種類の細胞、単一祖先または同一の祖先のすべての子孫ならびにその突然変異体および変種を含む培養菌である。分離されたアグロバクテリウム種の微生物は、ＥＤＴＡ−第二鉄を唯一の炭素源として、２４mM／日という急速な消費率で代謝することが分かった。好ましくは、水溶液中で、ＥＤＴＡ−第二鉄濃度は約１mM以下から約１５０mM以上まで、より好ましくは約３mMから約８０mMまでの範囲にすることができる。この様に、本発明の微生物は、ＥＤＴＡ−第二鉄を急速に、高基質濃度で分解することができる。代謝が進行するにつれて、二酸化炭素およびアンモニアが生成し、pHが上昇し、鉄が沈殿する。沈殿した鉄は、濾過、遠心分離、等の通常の方法により回収することができる。分離されたアグロバクテリウム種の微生物は、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、等の他のアミノポリカルボン酸の第二鉄キレートも代謝する。この出願の目的には、用語「アミノポリカルボン酸の第二鉄キレート」は、２個以上のアミノ基および３個以上のカルボン酸基を有し、Ｆｅ⁺とキレートを形成できるアミノポリカルボン酸を意味する。本発明の微生物により（第二鉄キレートとして）分解できるアミノポリカルボン酸には、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、等がある。新しく発見された微生物、アグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートを除去するための方法に使用できる。好ましくは、この方法は水溶液中で行うが、その際、水溶液を約８．０以下のpHに維持する。あるいは、この方法は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートで汚染されている埋立て地、または他の類似の場所中で行うこともできる。前と同様に、培地のpHは約８．０以下に調節するのが好ましい。水溶液中で行う場合、本方法は、とりわけ工業廃液、洗浄溶液などの広範囲な水溶液で効果的である。さらに、ここで使用する水溶液は有効量の殺菌剤を含むべきではない。好ましい実施形態では、第二鉄キレートの分解速度を高めるために、水溶液は、アグロバクテリウム種の抑制剤を抑制有効量未満で、すなわちアミノポリカルボン酸第二鉄代謝の５０％低下を引き起こす量未満で抑制剤を含むべきである。本発明の方法の好ましい実施形態では、水溶液に鉱物およびビオチン原料を加える。特に、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸カルシウムの塩をそれぞれ５mM、０．１mMおよび０．０７mMの濃度で使用することができる。これらの実施形態では、微生物成長のための培地を改良するために、第二鉄キレートを分解する水溶液に一定の微量鉱物塩を加える。これらの塩は、Ｈ₃ＢＯ₃、ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＣｕＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂ ₄ ・Ｈ₂Ｏ、ＣｏＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含むことができる。これらの微量の塩は、約２５マイクロモル未満の量で存在するのが好ましい。特に、これらの塩は、それぞれ０．０２５mM、０．００３mM、０．００２mM、０．０００３５mM 、０．０００２mMおよび０．００００４mMの濃度で使用することができる。ビオチンも、一般的に約１〜約１０マイクロモルの量で溶液に加えることができる。塩、微量鉱物塩、およびビオチンの上記の特定濃度を含む水溶液をここでは「基本培地」と呼ぶことがある。水溶液中に存在できる他の原料には、相容性のある緩衝液、すなわちリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、等の、微生物にとって毒性でない緩衝液がある。水溶液のpHを望ましい範囲に維持するために、十分な量の緩衝液を加える。本発明の方法に好ましい緩衝液は、リン酸塩緩衝液、例えば総リン酸塩濃度が２５〜２００mMであるナトリウム塩およびカリウム塩の５０／５０モル混合物である。しかし、pHを約８．０未満の水準に維持するために酸を定期的に加える場合、どの様な相容性のある緩衝液でも使用できる。好ましくは、水溶液のpHは約６〜８に維持し、水溶液に加える緩衝液は一般的に約２５mM〜約２００mMの量で存在するのが好ましい。水溶液を約８．０以下のpHに維持するには、溶液に酸を加えることができる。酸は、アグロバクテリウム種の微生物による第二鉄キレートの分解に影響しない、どの様な酸でも使用できる。その様な酸には、ＨＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄、等が含まれる。好ましくはＨＣｌを使用する。酸は、pHを約８．０以下に維持するために定期的に加える。金属キレートおよびアグロバクテリウム種の両方を含む水溶液の温度は、微生物に無害な温度を使用するのであれば、重要ではない。したがって、微生物が第二鉄キレートを分解できるのに十分な、どの様な温度でも使用できる。好ましい実施形態では、使用する温度は約２１℃〜約３７℃であり、より好ましくは約２９℃〜約３１℃である。下記の実施例は、アグロバクテリウム種の分離、確認および試験を説明し、本発明をさらに説明するが、請求項の範囲を制限するものではない。実施例下記の手順を使用して本発明の微生物を評価した。細菌の分離ＥＤＴＡ−第二鉄を含む廃棄物を数年間受け入れてきた、通気二次廃棄物処理施設からスラッジの試料を得た。試料はプラスチックびんに集め、氷上で輸送し、使用前は４℃に保持した。濃縮培地（ＥＤＴＡＥＭ、表１参照）に１００マイクロリットルの試料を接種し、３０℃で２週間培養した。この初期濃厚培地から得た成長物を寒天平板培地（寒天固化ＥＤＴＡＥＭ）に塗り付け、３０℃で成長が観察されるまで培養した。これらの平板からの細菌コロニーの継代を繰り返し、強制寒天培地（ＥＤＴＡＭ１およびＭ２、表１参照）上における成長について試験し、ＥＤＴＡ−第二鉄を唯一の炭素源として利用するコロニーを選別した。次いで、これらの培地上で分離されたコロニーを、唯一の炭素源としてＥＤＴＡ−第二鉄を含む好気性液体培地（ＥＤＴＡＧ１、表１参照）に継代した。すべての実験において、ＥＤＴＡ−第二鉄を含む培地はアグロバクテリウム種を接種する前に滅菌した。幾つかの場合には、すべての成分を加え、pHを調節した後、０．２ミクロンフィルターを通して濾過することにより、この滅菌を行った。他の場合には、肉汁全体を濾過せず、原料溶液を個別に濾過滅菌し、次いで一緒に加え、その時に無菌性を維持するためにエタノール洗浄したpH電極を使用してpHを調節した。さらに他の場合には、ビオチン以外の原料溶液をその場で加熱滅菌した。次いで、１mMで鉄を追加するためにＦｅＣｌ₃ （０．１Ｍ）の原料溶液を調製した。ビオチンおよびＦｅＣｌ₃原料を濾過滅菌し、個別に加えた。不注意でアグロバクテリウム種以外の微生物により汚染された培地は、ＥＤＴＡ−第二鉄の分解を十分に支持せず、したがって、その様な他の微生物を含む培地は好ましくない。細胞の収穫および保存ＥＤＴＡ−第二鉄培地で成長させた後、細胞を４℃で遠心分離により収穫した。肉汁を先ず４２００ｇで２０分間遠心分離し、次いで上澄み液を取り、１３０００ｇで２０分間遠心分離した。細胞ペレットを滅菌した蒸留水中に再分散させ、再度１３０００ｇで遠心分離して細胞を洗浄した。沈殿した細胞ペレットを滅菌した蒸留水中に、６００nmにおける光学密度＞５に再分散させた。長期保存のために、分散物にグリセリン（１０体積％）を加え、アリコート（２ml）を液体窒素冷凍庫に保管した。保存または新しい培地に接種する前に接種物を洗浄するための上記の手順は、迅速な分解をもたらす条件を造り出すために採用した。幾つかの場合で、洗浄していない接種物を使用した場合、新しい培地における成長が遅れた、または通常観察される成長よりも著しく遅くなった。洗浄により沈殿物の多くが除去されることが光顕微鏡により確認される。あるいは、細胞は、２９−３１℃で２４時間維持した複合トリプチケース／大豆肉汁（ＢＢＬから）中で成長させることができる。その様にして成長させた細胞も、ＥＤＴＡ−第二鉄を含む水溶液に加えたときに、ＥＤＴＡ−第二鉄の分解に有効である。接種には、冷凍保存した細胞を加えた、または成長の後段階で種フラスコから細胞を収穫した。新たに収穫した場合、細胞は、最初の１３０００ｇにおける遠心分離以外は上記の様に調製し、それらの細胞を水または接種培地としての新しい培地に分散させた。電子顕微鏡培地を０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液中２％グルタルアルデヒドで２分間固定し、ホルムバール(Formvar) 被覆格子上に落とし、乾燥させ、１４゜で白金／パラジウムで真空被覆被覆した。ＪＥＯＬ−１００ＣＸ電子顕微鏡で回転陰影により顕微鏡写真を撮影した。株の確認代表的な試料を血液寒天およびマッコンキー寒天平板上で継代培養した。接種後、試料は、ＧＮＩカード（ビテックシステムス社、ヘーゼルウッド、ＭＯ６３０４２）を使用するビテックＡＭＳおよびＡＰＩラピッドＮＦＴ（ＡＰＩアナリタブプロダクツ、プレインビュー、ＮＹ１１８０３）システムを使用するＡＰ１２０Ｅによる、生物化学反応の分析による細菌の確認のために調製した。さらに、ドルッカー、微生物学における方法、９巻、Ｊ．Ｒ．ノリス、編集アカデミックプレス、ロンドン、５１〜１２５頁に記載されている全細胞脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析も使用して確認した。ＥＤＴＡ−第二鉄評価分析ＥＤＴＡ−第二鉄の測定の前に、エッペンドルフモデル５４１５遠心分離機で１４，０００ rpmで２分間遠心分離することにより、試料から細胞を分離した。次いで希釈試料中の最大ＥＤＴＡ−第二鉄濃度が０．９mM未満になる様に、試料を水または初期可動相で希釈した。ＨＰＬＣは、試料を注入するためのＷＩＳＰ７１２試料処理装置、可動相を配送するための２基のウォーターズ５１０ポンプ、第二鉄キレート検出のための３６０nmに設定したウォーターズ４９０多重波長検出器、およびクロマトグラムを表示、記憶、記入および分析するためのウォーターズ８４０データシステムを備えたモジュール式のウォーターズアソシエーツシステム（ミリポアコーポレーション、ミルフォード、ＭＡ０１７５７）を使用して行った。クロマトグラフィー分離は、３０マイクロリットルの試料を市販の長さ１５cm、内径４．６mmの逆相ＨＰＬＣカラム（スペルコ社、ベレフォンテ、Penn．１６８２３らか得たＬＣ１８）上に射出して行った。脱イオン水中、１ｇ／リットルの酢酸アンモニウム、０．５g/リットルのＰＤＴＡ、１．５ミリリットル／リットルの氷酢酸、０．５ミリリットル／リットルの水酸化アンモニウム、０．１ミリリットル／リットルのトリエチルアミン、および５ミリリットル／リットルのアセトニトリルからなる初期可動相により１．０ミリリットル／分でIsocratic 溶離することにより、ＥＤＴＡ−第二鉄を２分間の保持時間で溶離させた。射出から２．５分後、脱イオン水中、０．５g/リットルのＰＤＴＡ、０．１ミリリットル／リットルのトリエチルアミン、および６００ミリリットル／リットルのアセトニトリルからなる最終可動相への段階勾配により５．５分間で高度に保持されていた成分をカラムから洗い流した。さらに初期可動相への段階勾配を４分間使用することによりカラムを再平衡化した。計器は、０．０３〜０．９mMの濃度にわたる、緩衝液を含まない脱イオン水中のＥＤＴＡ−第二鉄アンモニウムの一連の標準を射出することにより毎日校正した。標準の面積応答の直線最小２乗回帰分析を使用して傾斜および横断値（ｒ− ２乗一般的に＞０．９９６）を求め、次いでこれを使用して測定面積からの試料に対する定量値を得た。正確さおよび精密さは、校正範囲全体にわたって５％より優れていると評価した。アンモニア／アンモニウム評価分析総アンモニアは、オリオンモデル９５ −１２アンモニア電極を使用して測定した（オリオンモデル９５−１２、オリオンリサーチ社の使用説明書に記載されている手順に従った。）。ＣＯＤ評価分析試料中のＣＯＤを評価するために、「水および廃水の標準試験方法」、米国公衆衛生協会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、第１６版、５３２−５３８頁（１９８５）の方法５０８Ｃに類似した、ハックケミカル社（ハック社、ラブランド、Ｃｏ１．８０５３９）の試験管比色定量法を使用した。鉄分評価分析水性試料中の総鉄分を評価するために、ストゥーキー、Anal．Chem．４２：７７９−７８１（１９７０）に記載されているストゥーキーのフェロジン法の改良方法を使用した。ＥＤＴＡ−第二鉄を含めて、存在するキレートから鉄陽イオンを放出させるために、「水および廃水の標準試験方法」、米国公衆衛生協会、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、第１６版、１４８頁（１９８５）の方法３０２Ｅから採用した手順を使用して試料をまず消化した。５０マイクロリットルの試料を、酸洗した、厚壁のねじキャップ付きの試験管（ハックＣＯＤ試験管と同等）に入れ、続いて５０マイクロリットルの濃硝酸および１００マイクロリットルの濃硫酸を加えた。この試験管のキャップをきつく締め、ハックリアクタープレー卜中で１５０℃で１５分間還流加熱した。冷却後、試験管のキャップを外し、再び反応器中に最高１０分間、ただし試験管が完全に乾燥するほど長くない時間置いた。冷却後、２００マイクロリッ卜ルの酸−フェロジン試薬（０．５１４ｇのフェロジン、１０ｇの塩酸ヒドロキシルアミン、および５０ミリリットルの濃塩酸を蒸留水に溶解し、１００mlに希釈したもの）を加えた。内容物をうずミキサーで混合し、次いで１．５ミリリットルの緩衝液（４０ｇの酢酸アンモニウムおよび３５ミリリットルの濃水酸化アンモニウムを蒸留水で１００ミリリットルに希釈したもの）を加えて pHを５〜９に調節した。次いで、試料を５．４ミリリットルの蒸留水で希釈した。２０〜１０００mg/L総鉄分濃度にわたる標準を純粋な硫酸第二鉄アンモニウムドデシル水和物から調製した。これらの標準は試料と同様に処理した。分光光度計（ハックＤＲ／３）で５６２nmで測定した標準の吸光度および標準の濃度から、直線最小２乗校正を行った。５０mg/Lを超える総鉄分の濃度において、既知の濃度のＥＤＴＡ−第二鉄を含む試料を使用して観察した精密さおよび正確さは５％より優れていた。実施例１−細菌の同定分離した株のアグロバクテリウム種、グラム陰性好気性菌としての同定は、ビテックＡＭＳ（ビテックシステムス、ヘーゼルウッド、ミズリー６３０４２− ２３９５）でビテックＧＮＩカード（グラム陰性同定カード、製品番号５１−１３０６）を使用して確率９９％で行った。分離した株の同定に使用した生物化学的試験および結果を表２に示す。この同定は、ＡＰＩラピッドＮＦＴストリップ（ＡＰＩアナリタブプロダクツ、プレインビュー、ニューヨーク１１８０３、製品番号８８８６−５００９５１）によっても９９．９％の確率で確認された。分離した株の同定に使用したこの生物化学的試験および結果は表３に示す。株の脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析もアグロバクテリウムとしての種類を確認した。上記の結果から、この微生物は一時的にアグロバクテリウムラジオバクターであると決定された。さらに、分離菌は、biovar１およびbiovar２を区別せずに独立して（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、ＭＤ）アグロバクテリウム種として代表された。したがって、この微生物はここではアグロバクテリウム種と呼ぶ。実施例２−成長研究微生物の様々な特性を決定するために成長研究を行った。この研究のために、上記の基本培地ならびに１００mMのリン酸塩緩衝液、および３５mMのＥＤＴＡ− 第二鉄ナトリウムをフェルンバッハフラスコ中で使用した。培養は、振とう培養機で２９℃で行った。試料を定期的に採取し、pH、ＥＤＴＡ−第二鉄濃度および６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定した。pHは、オリオン組合わせ電極およびコーニングpHメーターを使用して測定した。ＯＤは細菌成長の尺度として使用した。測定は、分解中に形成され、細菌成長のためにＯＤを妨害する鉄沈殿物を溶解させるために、０．１ＮＨＣｌに希釈して行った。フェルンバッハフラスコ中における成長の際に観察されたＯＤの増加を図１（ａ）に示す。図１（ｂ）には、フラスコ内のＥＤＴＡ−第二鉄の濃度を測定したpHと共にプロットする。このグラフは、３個のフラスコすべてにおいて光学密度が増加し、ＥＤＴＡ−第二鉄の濃度が減少し、pHが増加することを示している。pHが増加しない場合は、どのフラスコにおいてもＥＤＴＡ−第二鉄の代謝は観察されない。反対に、pHが８を超えて増加するのを抑制しないとＥＤＴＡ−第二鉄の消失は停止する。pH調節せずに、フラスコ中のＥＤＴＡ−第二鉄濃度が明らかに増加するのは、ＥＤＴＡ−第二鉄代謝が終わった後の蒸発による（pH＞９）。これらのフラスコのどれも蒸発に対する補正は行っていない。これらの数値に含まれるデータは、アグロバクテリウム種が成長する際にＥＤＴＡ−第二鉄が分解され、分解が終わると成長も終わることを立証している。実施例３−１リットル規模における培養分離菌を、pH調節できる様に２リットル培養機中で１リットル規模で成長させた。初期の培養機の肉汁は３５mMのＥＤＴＡ−第二鉄、１００mMのリン酸塩、および上記の基本培地を含む。さらに、ＦｅＣｌ₃を最終濃度１mMまで加えた。培養機に接種するために、株を振とうフラスコ中、上記と同じ培地中で、３１℃で２４時間成長させた。振とうフラスコから取り出した細胞を１３０００ｇで２０分間遠心分離することにより肉汁から分離した。これらの細胞を２００mlの新しい肉汁に再分散させ、培養機に入れ、初期総体積を１リットルにした。０．２ミクロンの無菌フィルターを通して空気を１リットル／分の流量でマルチゲン発酵装置（ニューブランズウィックサイエンティフィック社、エディソン、Ｎ．Ｊ．０８８１８）に通した。発酵装置（培養機）は磁気駆動プロベラ軸で５００rpm で攪拌した。水素イオン濃度を監視し、ＨＣｌを自動添加しながらpH７．４〜７．７に調節した。培養機の温度は３０±１℃に維持した。この結果を図２（ａ）および２（ｂ）に示す。培養が進行するにつれて観察されるＥＤＴＡ−第二鉄濃度の低下と平行して溶液中の鉄濃度も低下した。水溶液から基質が除去されるにつれて、アンモニウム含有量が増加した。さらに、ＣＯＤは低下したが、ＥＤＴＡ−第二鉄濃度の低下（９３％）に比例してはいない。細胞および沈殿物を除去するための遠心分離の後に測定した試料では、ＣＯＤは８８８０から２６４０mgＯ₂／リットルに低下（７０％低下）し、細胞および沈殿物がまだ存在する状態で測定した試料では、ＣＯＤは８８７０から３３９２mg Ｏ₂／リットルに低下（６２％低下）した。さらに、選択した試料を希釈し、細菌計数のためにＴＳＡ上で平板培養した。生存細菌の数は実験開始後４６から７０時間で減少し始めた。これは曲線の傾斜の折れ曲りと良く一致している。実施例４−抑制ＥＤＴＡ−第二鉄代謝に対する幾つかの因子の抑制効果を研究した。これらの実験は試験管中で標準条件、すなわち１００mMのリン酸塩緩衝液（pH７．４）、上記の基本培地、３５mMのＥＤＴＡ−第二鉄、６００nmにおける光学密度１に接種、初期体積３．５ml、試験管振とう培養機中で２９−３１℃で１から４日間の培養により行った。試験すべき抑制因子の濃縮物を４から６種類の異なった量で異なった無菌試験管に加え、残りの体積には脱イオン水を加えた。幾つかの成分の抑制効果に関するデー夕を表４に示す。表中の濃度は、試験する因子のどれも含まない試料と比較した、実験期間中にＥＤＴＡ−第二鉄の代謝を５０％低下させる濃度である。上記の特定薬品による抑制に加えて、分解中にアグロバクテリウム種によりＥＤＴＡ−第二鉄分解の末確認代謝物が形成され、生成物抑制を引き起こす。また、この微生物は光処理溶液中に見られる一つ以上の成分により抑制される。実施例５−成長基質としてのキレート成長のための基質として多くの金属キレートを試験した。これらの実験は、卓上振とう装置に配置した試験管中で３０℃で２４日間行った。培地は、初期リン酸塩緩衝液濃度が７１mMであり、初期光学密度が０．４になる様に接種物を計算した以外は、上記の成長抑制のための培地と同じであった。有機キレートの濃縮物は、最終濃度４および２０mMで試験管に加えた。金属を含む試料に関しては、キレート化剤のモル量に等しいモル量をＦｅＣｌ₃、ＮｉＣ１₂またはＣｕＳＯ₄ の濃縮物から加えた。接種物以外のすべての成分を加えた後、ＨＣｌまたはＫＯＨを使用して試料をpH７．４に調節した。２組の試験管を上記の様に調製したが、細菌の成長を防止するために、すべての試料に０．２５mlのＨｇＣｌ₂の２．５g/l 溶液を加えた。２４日後の試料における成長を、試料試験管の光学密度を、塩化第二水銀を加えた比較試料中の光学密度と比較することにより評価した（表５）。試験した両濃度において、それぞれの比較試料に比べて光学密度が５倍大きい基質は成長に好ましいと考えられた。実施例６−７．２リットル規模の培養通気、混合およびpHの制御を改善し、炭素および窒素の物質収支を決定するために、２８℃に維持した、コンピュータ制御式の１４リットルのヒェマップＣＦ３０００培養機（ヒェマップＡＧ、フォルケッツビル、スイス）中で７．２リットル体積で培養を行った。２つの、基本培地（上記）を含むＥＤＴＡ−第一鉄培地の６リットルバッチに、１．２リットルの同じ基本培地中に濃縮した、新たに収穫した細胞を接種した。培養物の一方には２５０ g/lのスクロースおよび２５０ g/lの酵母エキスも０．２g/分の一定率で供給した。この供給組成物はホーファー、Ｊ．バクテリオロジー、４１：１９３−２２４およびリッピンコットら、ザプロカリオテス、第１巻、スターら、編集、スプリンガー出版８４２−８４５頁のアグロバクテリアの収穫に関する以前の研究に基づいて選択した。図３（ａ）は、ＥＤＴＡ−第二鉄を唯一の炭素源とする培養においてＥＤＴＡ −第二鉄から可能な最大値の百分率として表した、ＥＤＴＡ−第二鉄のＣＯ₂およびＮＨ₃への累積転換を表すグラフである。さらに、ＣＯＤの減少百分率もプロットしてある。さらに、３つの曲線はすべて互いに平行であり、ＥＤＴＡ−第二鉄が効率的に鉱化されていることを示している。図３（ｂ）は、炭素源としてＥＤＴＡ−第二鉄だけが供給される培養における、可溶性鉄分およびＥＤＴＡ− 第二鉄の相対濃度を示す。炭素および／または窒素源（スクロース／酵母）を追加した培養では、実質的な分解が起きてはいるが、ＥＤＴＡ−第二鉄の分解および微生物の成長は活発ではない。特に、同じ培養期間では、ＥＤＴＡ−第二鉄の３７％が分解されたのに対し、図３（ｂ）に示す場合では８５％以上が分解されている。したがって、非殺閑性炭素源を含む廃液中のＥＤＴＡ−第二鉄の実質的な分解が期待できる。実施例７−アグロバクテリウム種（ＡＴＴＣ５５００２）による分解に対するＥＤＴＡ−第二鉄濃度の影響分離菌が耐えられる最高初期ＥＤＴＡ−第二鉄濃度を決定するために、１００ mMのリン酸塩緩衝液を加えた基本培地（上記）を使用して一連の試験管培養を３０℃±１℃で４８時間行った。初期ＥＤＴＡ−第二鉄濃度は２．９〜１４０mMであった。濃度低下の値（初期に加えられた濃度から４８時間後に残存する濃度を差し引いて計算した）を図４に示す。この実験中、pHは調節しなかった。分解の程度は初期pHに相関した。初期pHが低いほど、試験したすべての濃度に関して、より多くのＥＤＴＡ−第二鉄が分解された。分解は、初期pHが６．２では４８mMの基質を消費し、pH７．４では２８mMを消費する様に進行した。両方のデータにおいて、最大分解値は試験した最高濃度まで及んでいる。初期水素イオン濃度がより高い場合（pH６．２）、ＥＤＴＡ−第二鉄は２４mM ／日の限界速度で代謝され、初期イオン濃度が低い場合（pH７．４）、最高速度は１５mM／日である。実施例８−形態学分離菌の細胞を、唯一の炭素源としてトリプチケース大豆肉汁またはＥＤＴＡ −第二鉄を含む寒天平板上で成長させた（表１参照、１７ g/l寒天の培地Ｇ１）。各培養菌の幾つかのアリコート電子顕微鏡写真を上記の様に撮影した。これらの写真の例を図５（トリプチケース大豆肉汁）および図６（ＥＤＴＡ−第二鉄）に示す。両者とも、培養菌は長さ約２−３ミクロン、直径約１ミクロンの桿状菌からなる。ＥＤＴＡ−第二鉄上で成長した微生物上にのみ小さな黒色斑点が認められた。実施例で説明した様に、アグロバクテリウム種の培養菌は、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートの分解に使用できる。この方法は好ましくはその様な第二鉄キレートを含む水溶液に使用され、特にＥＤＴＡ−第二鉄、ＰＤＴＡ−第二鉄、またはこれらの混合物を水溶液から分解するのに適している。分解の速度および程度はpH、つまり水素イオン濃度により異なる。生物分解が進み、その様な第一鉄キレートが消費されるにつれて、細胞の量およびpHの両方が増加する。水素イオン濃度が１０^-8よりはるかに下に低下させる（pHが８より大きくなる）場合、分解および成長が止まる。酸を定期的に加えてpHが約８を超えないようにすることにより、より強力な分解が起こる。どの様な理論にも制限されることなく、これらの実験では、pH上昇の少なくとも一部の原因は、ＥＤＴＡ−第二鉄が代謝されるにつれて濃度が増加するアンモニアの生成により説明できる。アンモニア自体は微生物の成長を抑制する（表４）が、著しい、すなわち５０％以上の抑制は、これらの培養で生じる濃度よりも高い濃度で現れる。アグロバクテリウム種によるアミノポリカルボン酸の分解は、実施例により示される様に主として生物学的である。図４に示す様に、接種していない比較試料では、培養が進行するにつれて、光学密度もpHも著しく増加せず、ＥＤＴＡ−第二鉄の濃度も著しく低下しない。反対に、接種した試料では、分解が進むにつれて、培養中のＥＤＴＡ−第二鉄濃度の低下には常に光学密度およびpHの増加が伴う。最後に、接種した試料で観察されるアンモニア／アンモニウム濃度の急速な増加およびＣＯ₂の著しい放出は、基質の比較的完全な代謝を立証している。分解に対する光の影響はほとんど無い、または存在しないと考えられる。本発明の微生物により分解されるＥＤＴＡ−第二鉄からの有機炭素の鉱物化の効率は、図３（ａ）に示すデータから計算できる。３日目において、初期炭素の６４％が生じたＣＯ₂であると考えられる。この時点で溶液申に残存するＣＯＤは、遠心分離して細胞および関連する沈殿物を除去した後、最初に存在したＣＯＤの３９％（ＣＯＤに関して測定した値は蒸発に対して補正していないので、実際より大きく見積もってある）に相当する。測定（＜１０％相関）および蒸発の影響の両方に関連する最大可能誤差を計算にいれても、最初に存在した炭素の２０％未満が細胞に変換されたことになろう。１リットル培養のデータから、生物分解により比較的少量の細胞量が生じたことが確認される。溶液中に残存するＥＤＴＡ−第二鉄濃度が最初の濃度の７％になった実験の最後において、肉汁全体（細胞、沈殿物、および可溶性代謝物を含む）の中に残存するＣＯＤと、細胞および沈殿物を濾別した後の溶液（可溶性代謝物）中に残存するＣＯＤとの差は、最初の新しい肉汁中のＣＯＤの１０％未満である（７５２対８８７０mgＯ₂／リットル）。この差は、細胞材料中に取り込まれた、最大酸化性炭素を反映している。したがって、この微生物によるＥＤＴＡ−第二鉄の代謝は細胞量の増加ではなく、主として鉱物化につながる。ＣＯ₂および細胞量に加えて、未確認の分解生成物が溶液中に蓄積する。この生成物は、培養の最後で細胞および沈殿物を除去した後の溶液中に存在する残留ＣＯＤから明らかである。アグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ５５００２）は、存在する初期ＥＤＴＡ−第二鉄の９０％以上を分解する。しかし、ＣＯＤ低下は７０％に近付くだけである。したがって、最初にＥＤＴＡ−第二鉄として存在する炭素の２０−３０％は、培養の最後には未確認の代謝物として溶液中に残留する。これらの代謝物は微生物の成長を抑制することがある。理論にとらわれることは望ましくないが、本発明の微生物は鉄を必要とすると考えられる。このことは予備成長試験により示されている。これらの試験の幾つかで、大過剰のＥＤＴＡを含むＥＤＴＡ−第二鉄培地中でこの株を培養しようとするとき、様々な、時として長い遅延時間（３日間）が観察されている。上記の様な培地を調製するための通常の手順では、基本培地およびリン酸塩緩衝液からなる溶液にＥＤＴＡ−第二鉄を溶解させた。すべての成分を溶解させた後に、培地のpHを調節した。pHが増加するにつれて、水酸化鉄の特徴である赤− オレンジ色の羽毛状の沈殿が生じた。次いで培地を濾過滅菌したが、これが沈殿した鉄を除去し、溶液中に過剰のＥＤＴＡを残す。さらにpHが増加すると、この過剰分が大きくなる。実際、より大きな規模の培養で遅延相を確実に最小にするために、濾過滅菌した培養基に１ミリモルの塩化第二鉄を加え、濾過により除去された鉄の一部を置き換えた。この方法により最少遅延時間を数時間未満にした。鉄の不足に加えて、遅延時間は接種物の処理にも関連することが分かった。接種物を、細胞を洗浄せずに遠心分離により、使用したＥＤＴＡ−第二鉄培地から収穫した場合、細胞に加えて、著しい量の化学的沈殿物が存在することが分かった。この沈殿物は、強力なキレート化剤、ＥＤＴＡが分解された後に生じる不溶性の鉄塩であると考えられる。幾つかの実験では、上記の様に洗浄により接種物から沈殿物の大部分を除去しなかった場合、続く培養において遅い成長が観察された。この微生物のアミノポリカルボン酸第二鉄に対する優先性が著しいこと、および比較的高い基質濃度において有効であることから、この微生物は廃棄物処理戦略において有用である。清掃、汚染除去、またはスケール除去剤としての使用において、使用したＥＤＴＡまたは他のアミノポリカルボン酸の大部分が重金属、多くの場合鉄とキレート形成すると考えられる。十分に過剰の鉄が水系に存在し、または加えられ、非鉄金属キレートの平衡を強制的に第二鉄キレートにする場合、本発明の微生物はその様な環境で使用できる。したがって、本発明のもう一つの特徴は、アミノポリカルボン酸とキレート形成できる、Ｆｅ⁺³以外の金属陽イオンとアミノポリカルボン酸との金属キレートを含む水溶液からその様なキレートを除去するための方法であって、ａ）該金属キレートを含む水溶液に、該金属キレートの人部分が第一鉄キレートになる様に十分な量の第二鉄塩を加えること、およびｂ）該溶液のpHを約８以下に維持しながら、該溶液にアグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ５５００２）を加えることからなる方法に関する。一般的に、少なくとも金属キレートの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％が第二鉄キレートに転換される様に、十分な量の第二鉄塩を加える。ここで使用するための好適な第二鉄塩としては、硫酸第二鉄アンモニウム、硝酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸第二鉄、等の、該水溶液に可溶な第二鉄塩があるが、これらに限定するものではない。さらに、これに関して、水には不溶だが、酸性水溶液には可溶な、ある種の第二鉄塩は、その様な第二鉄塩が可溶であり、アグロバクテリウム種の微生物が耐えられる酸性の水性媒体を使用すれば、使用できることが分かっている。当業者には、上記の説明から、この方法に置ける各種の修正および変形が可能である。請求項の範囲内に人るその様な修正はすべてここに含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ２２Ｂ 3/18 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＴ，ＬＵ，ＮＬ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ブリートフェラー，ジェイムズエムアメリカ合衆国ニューヨーク州 14617 ロチェスターセヴィルドライヴ 267 (72)発明者スティール，ディーバーニーアメリカ合衆国アラバマ州 36830 オーバーンユニヴァーシティドライヴ 815 (72)発明者クーガン，ルイスエイアメリカ合衆国ニューヨーク州 14468 ヒルトンアップルウッドレーン 287

Claims

【特許請求の範囲】１．微生物アグロバクテリウム種、ＡＴＣＣ番号５５００２の生物学的純粋培養菌。２．前記培養菌が、アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートの一つ以上を含む水溶液から前記第二鉄キレートを除去できることを特徴とする請求の範囲第１項記載の生物学的純粋培養菌。３．前記アミノポリカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸、プピレンジアミン四酢酸またはそれらの混合物であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の生物学的純粋培養菌。４．アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートの分解方法であって、前記キレートをアグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌と組み合わせることを特徴とする方法。５．前記アミノポリカルボン酸がエチレンジアミン四酢酸、プロピレンジアミン四酢酸またはそれらの混合物であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。６．前記第二鉄キレートが水溶液中にあることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。７．前記水溶液がさらに他の炭素および／または窒素源を含むことを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。８．前記他の炭素および／または窒素源がスクロースおよび／または酵母エキスであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。９．水溶液が約８．０以下のpHに維持されることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。１０．水溶液に基本培地を加えることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。１２．水溶液に緩衝液を加えることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。１３．緩衝液がリン酸塩緩衝液であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の方法。１４．水溶液に、pHを約８．０以下に維持するのに十分な量で酸を加えることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。１５．酸が無機鉱酸であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。１６．アミノポリカルボン酸とキレート形成できる、Ｆｅ⁺³以外の金属陽イオンとアミノポリカルボン酸との金属キレートを含む水溶液からその様なキレートを除去するための方法であって、ａ）前記金属キレートを含む水溶液に、前記金属キレートの大部分が第二鉄キレートになる様に十分な量の第二鉄塩を加えること、およびｂ）前記溶液のpHを約８以下に維持しながら、前記溶液にアグロバクテリウム種（ＡＴＣＣ No.５５００２）を加えることを特徴とする方法。１７．アミノポリカルボン酸の第二鉄キレートを含む水溶液から鉄を回収する方法であって、ａ）アミノポリカルボン酸の一つ以上の第二鉄キレートを含む水溶液にアグロバクテリウム種の生物学的純粋培養菌を加えること、ｂ）その水溶液を、溶液から鉄が沈殿するのに十分な温度で、十分な時間、pH 約８以下に維持すること、およびｃ）前記鉄を回収することを特徴とする方法。