CN109576195A - 一株假单胞菌及其在降解土霉素上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)T4,其保藏号为CGMCC No.13051,已于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。该菌可应用于降解水体中土霉素,其方法是将所述细菌应用到水体环境中,实现降解土霉素。通过培养本发明的细菌,用于去除水体中残留的土霉素污染物,减少土霉素对环境、人类及动物产生的危害。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一株假单胞菌及其在降解土霉素的上的应用。
背景技术
药品和个人护理用品(Pharmaceuticals and personal care products,PPCPs)作为一类新型污染物正日益受到人们的广泛关注.据欧盟(EU)统计,现在约有3000种PPCPs被用于医药,如止痛药、抗生素等。其中兽用抗生素(Veterinary antibiotics,VAs)作为促生剂和预防疾病药物在水产和家禽养殖上的频繁使用,使其不断进入环境中。
土霉素(OTC)是常见的四环素类抗生素之一,一种广谱型抗生素。在世界范围内大量使用,由于土霉素并不能被动物很好的吸收,大约有40%-90%的抗生素以其母体或者代谢产物的形式排入到环境并被检出。在美国,它是十大促生剂抗生素之一,在其地表水中检测到OTC可达到0.34μg·L-1。澳大利亚城市水中OTC含量可达0.35μg·L-1,丹麦土壤中OTC的范围为2.5-50mg·kg-1。我国是抗生素使用大国,仅2013年OTC的使用量达到1360t。
OTC污水处理厂中其浓度和达到20-800mg·L-1。土霉素长期的积累会破坏生态系统的持续发展和人类健康。因此,有效地去除水体等环境中的OTC显得尤为重要。
目前,对环境中残留抗生素的处理方法已进行了大量的研究和实践,包括高级氧化法、活性炭吸附法、低温等离子体技术和膜生物反应器等。但是,这些处理方法成本高,程序复杂。因此,微生物降解抗生素逐渐引起了人们的关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为:如何提供一株可有效降解土霉素的菌株,以及应用该降解菌株去除水体中残留的土霉素,减轻土霉素对自然环境、动植物及人类健康造成的严重影响。
本发明的技术方案为:
一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)T4,其保藏号为CGMCC No.13051,已于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
假单胞菌CGMCC No.13051在降解土霉素上的应用。
进一步地,上述所述的应用为将假单胞菌CGMCC No.13051用于降解水体中的土霉素。
一种去除水体中土霉素的方法,将假单胞菌CGMCC No.13051加入到含有土霉素的水体中,对土霉素进行降解。
进一步地,所述假单胞菌CGMCC No.13051以种子液的形式加入,种子液菌体浓度为3×108CFU/mL,接种量为1%。
进一步地,所述水体中土霉素的初始含量为5mg·L-1-100mg·L-1,优选含量为50mg·L-1。
进一步地,所述水体中需添加Fe3+离子,使Fe3+离子含量为1g/L。
进一步地,降解的pH为3-9,优选pH为7。
进一步地,降解的温度为25℃-40℃,优选温度40℃。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的假单胞菌CGMCC No.13051能降解土霉素,用来去除不同水体中残留的土霉素,减少对环境的不良影响;对实际水体中土霉素的降解率可达88%。
保藏信息:
假单胞菌(Pseudomonas sp.)T4,其保藏号为CGMCCNo.13051,已于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为本发明的假单胞菌CGMCC No.13051对土霉素的去除效果柱状图。
图2为本发明的假单胞菌CGMCC No.13051在不同碳源物质中对土霉素的降解效果柱状图。
图3为本发明的假单胞菌CGMCC No.13051在不同金属离子作用下对土霉素的降解效果柱状图;Fe3+以FeCl3﹒6H2O的形式加入,含量为1g/L,Cu2+以CuSO4﹒5H2O的形式加入,含量为1g/L。
图4为本发明的假单胞菌CGMCC No.13051在含有不同初始浓度土霉素培养液中对土霉素去除率和反应液吸光度的实验结果图;A和B分别为控制组(不加Fe3+)和实验组(加Fe3+)在不同底物浓度下土霉素的降解率,C和D分别为A和B在600nm处的吸光度值。
图5为本发明的假单胞菌CGMCC No.13051在不同温度条件下对土霉素去除率和反应液吸光度的实验结果图;A和B分别为控制组(不加Fe3+)和实验组(加Fe3+)在不同温度下土霉素的降解率,C和D分别为A和B在600nm处的吸光度值。
图6为本发明的假单胞菌CGMCC No.13051在不同pH培养液中对土霉素去除率和反应液吸光度的实验结果图;A和B分别为控制组(不加Fe3+)和实验组(加Fe3+)在不同pH下土霉素的降解率,C和D分别为A和B在第0和144小时,反应液在600nm处的吸光度值。
图7显示了将假单胞菌CGMCC No.13051应用于三种不同水体中对土霉素的降解效果柱状图。
具体实施方式
实施例用的试剂和材料:
生化试剂:盐酸土霉素(OTC,纯度>97%,德国),甲醇和乙腈为HPLC级,去离子水、氯化钠(NaCl)、氯化氨(NH4Cl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸镁(MgSO4)、牛肉膏、淀粉、酵母膏、麦芽糖、蛋白胨、正己烷、三氯甲烷(CHCl3)、柠檬酸(C6H8O7·H2O)、Na2EDTA、FeCl3·6H2O、CuSO4·5H2O。
材料:污水处理厂(污水)、养殖用水和池塘水。
土霉素降解菌株的富集、分离与纯化
菌种富集
采集菌肥,称取菌肥10g,加至装有100mL灭菌蒸馏水的三角瓶中(250mL,内含玻璃珠),在恒温摇床上以30℃,200r/min震荡30min,取出后静置;吸取1mL菌肥浸出液,装入100mL富集培养基的500mL的三角瓶中,30℃,150r/min震荡条件下,暗培养2天;然后取10mL培养液转入新的相同的培养基中,在相同的条件下继续富集培养一次;
无机盐液体富集培养基组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH至7.0,分装到250mL三角瓶中,高压灭菌,在超净工作台中添加土霉素,添加浓度依次为25、50、100mg/L,摇匀。
菌株分离
吸取100uL上述富集培养液,分别一一对应涂布于上面所述3种不同土霉素浓度的无机盐固体培养基平板上,置于30℃条件下遮光培养2天;
无机盐固体培养基的组成为:氯化铵1g,磷酸二氢钾0.5g,磷酸氢二钾1.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠1g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH至7.0,高压灭菌。在倒平板前,在培养基中添加土霉素,添加浓度与无机盐液体富集培养基相同。
经筛选,得到一株对土霉素有较好降解效果的菌株,命名为T4,经委托专业的鉴定机构鉴定,该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.),已于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏号为CGMCCNo.13051,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
实验例
将筛选得到的假单胞菌CGMCC No.13051以一定接种量接种到装有100mL无机盐培养液的250-mL锥形瓶中,调节pH值,向锥形瓶中加入土霉素标准品,在恒温摇床中培养(调节温度和转速)作为实验组,同时以不接种真菌的培养基为空白对照(排除外部环境对庆大霉素浓度的影响)。
按照去除率计算公式计算去除率:
去除率(%)=(C0-Ct)/C0×100
其中C0:实验组的土霉素初始浓度;Ct:反应结束后实验组的土霉素浓度。
以下分别就微生物降解条件的优化、土霉素初始浓度、温度、培养pH对土霉素的去除率的影响进行探究。以下分别描述实验方法及结果:
一、微生物降解条件的优化
1、微生物降解
培养条件是30℃、转速为150rpm、土霉素50mg·L-1、pH为7、假单胞菌CGMCCNo.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、装液量为100mL,培养液为无机盐培养基,每个处理设置三个重复,同时每种培养基设置三个空白对照(control)。
由图1可知,在为期7天的时间内,实验组的降解率可达到35%,控制组的降解率只有19%。由于土霉素是一种特殊的抗生素,在水体中会发生自发的降解。因此,选择假单胞菌CGMCC No.13051降解土霉素。
2、不同碳源物质
培养条件是30℃、转速为150rpm、土霉素50mg·L-1、pH为7、假单胞菌CGMCCNo.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、装液量为100mL,培养液为无机盐培养基,淀粉、麦芽糖、牛肉精蛋白胨、酵母精为不同碳源,每个处理设置三个重复,同时每种培养基设置三个空白对照(control)。
由图2可知,淀粉作为碳源,土霉素的降解率较高。但是,相比于无机盐培养基,土霉素的降解率高于前四种。因此,选择无机盐作为反应液。
3、不同金属离子
培养条件是30℃、转速为150rpm、土霉素50mg·L-1、pH为7、假单胞菌CGMCCNo.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、装液量为100mL,培养液为无机盐培养基,1g/LFe3 +和1g/L Cu2+作为不同的金属离子,每个处理设置3个重复。
由图3可知,Fe3+的作用下土霉素的降解率可以达到65.33%,Cu2+的作用下,土霉素的降解率为34.00%。Fe3+可以明显的促进土霉素的降解。因此,选择Fe3+作为实验金属离子。
二、影响因素
1、不同的底物浓度对土霉素降解的影响
培养条件是30℃、转速为150rpm、pH为7、假单胞菌CGMCC No.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、1g/L Fe3+、培养液为无机盐、装液量为100mL,设置5个底物浓度梯度,分别为5、10、25、50、100mg·L-1。每个处理设置3个重复。
由图4可知,土霉素在不同底物浓度下的降解率为50>25>10>5>100mg·L-1。不添加Fe3+的反应液吸光度为0.05-0.12,而添加Fe3+的反应液吸光度为0.05-0.70。因此,选择50mg·L-1土霉素浓度,1g/L Fe3+。
2、不同温度对土霉素降解的影响
培养条件是30℃、转速为150rpm、pH为7、假单胞菌CGMCC No.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、1g/L Fe3+、培养液为无机盐、装液量为100mL,设置4个温度梯度,分别为25、30、35、40℃。每个处理设置3个重复。
由图5可知,土霉素在不同温度下的降解率为40℃>35℃>30℃>25℃。温度对于反应体系的吸光度有着很显著的影响。因此,选择40℃。
3、不同pH对土霉素降解的影响
培养条件是40℃、转速为150rpm、pH为7、假单胞菌CGMCC No.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、1g/L Fe3+、培养液为无机盐、装液量为100mL,设置7个pH梯度,3、4、5、6、7、8、9。
由图6可知,不同pH对土霉素降解率为pH=7>6>8>9>5>4>3。pH对降解反应有着显著地影响。因此,选择pH=7。
三、抗性基因
培养条件是40℃、转速为150rpm、pH=7、假单胞菌CGMCC No.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、1g/L Fe3+、培养液为无机盐、装液量为100mL,对反应一周内的常见四环素类抗性基因tet(M),tet(A),tet(O)和tet(W)进行实施检测。
表1抗性基因的检测
a--控制组(不加Fe3+),b--实验组(加Fe3+),c、d、e、f分别为第1、3、5、7天取样时间,undetected为未检测到该种抗性基因。
由表1可知,并未检测到抗性基因。表明该方法并不会带入或传播抗性基因。
四、在实际水体中的应用
培养条件是40℃、转速为150rpm、pH=7、假单胞菌CGMCC No.13051的接种量为1mL(3×108CFU/mL)、1g/L Fe3+、反应液为工业污水、养殖用水和池塘水,体积为100ml。
由图7可知,只加假单胞菌CGMCC No.13051,三种水体中的降解率可达到45%,在Fe3+的促进作用下,三种水体中的降解率可达到88%。
综上,假单胞菌CGMCC No.13051对土霉素去除效果的优化条件是:所述假单胞菌CGMCC No.13051以种子液的形式加入,种子液菌体浓度为3×108CFU/mL,接种量为1%;1g/L Fe3+、50mg·L-1土霉素、40℃,pH=7。在优化条件下,假单胞菌CGMCC No.13051在液体培养基中对土霉素去除率可达81.57%,对实际水体中土霉素的降解率可达88%。
Claims (10)
1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)T4,其保藏号为CGMCC No.13051,已于2016年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
2.假单胞菌CGMCC No.13051在降解土霉素上的应用。
3.根据权利要求2所述的假单胞菌CGMCC No.13051在降解土霉素上的应用,其特征在于,所述应用为将假单胞菌CGMCC No.13051用于降解水体中的土霉素。
4.一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,将假单胞菌CGMCC No.13051加入到含有土霉素的水体中,对土霉素进行降解。
5.根据权利要求4所述的一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,所述假单胞菌CGMCC No.13051以种子液的形式加入,种子液菌体浓度为3×108CFU/mL,接种量为1%。
6.根据权利要求4所述的一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,所述水体中土霉素的初始含量为5mg·L-1-100mg·L-1。
7.根据权利要求6所述的一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,所述水体中土霉素的初始含量含量为50mg·L-1。
8.根据权利要求4所述的一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,所述水体中需添加Fe3+离子,使Fe3+离子含量为1g/L。
9.根据权利要求4所述的一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,对土霉素进行降解时水体的pH为3-9,温度为25℃-40℃。
10.根据权利要求4所述的一种去除水体中土霉素的方法,其特征在于,对土霉素进行降解时水体的pH为7,温度40℃。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190405 |
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