CN114686382A - 灰隔孢伏革菌f08及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株灰隔孢伏革菌F08(Peniophora simulans F08)，其保藏编号为CGMCC No.3.20903，分类命名是：Peniophora simulans；保藏日期：2022年3月28日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株对金霉素和土霉素有较好的降解率，对人体无毒无害，具有较好的应用前景。

Description

灰隔孢伏革菌F08及其应用

技术领域

本发明涉及灰隔孢伏革菌F08(Peniophora simulans F08)及其应用，属于利用微生物对水治理的技术领域。

背景技术

近年来，抗生素(antibiotics)被列为环境中的新兴污染物。残留在环境中的四环类抗生素对影响微生物的群落结构，并促进了施肥土壤中蔬菜作物对抗生素的吸收。在畜牧业和水产养殖业中大量使用抗生素伴随着一系列的环境污染问题。

目前，去除抗生素的技术主要分为三类，即物理法(吸附法、高压膜过滤法等方法)、化学法(臭氧氧化、类芬顿氧化、高铁盐酸氧化、光催化、电氧化等方法)和生物法(微生物降解、氧化还原酶降解)。

物理和化学技术应用广泛，高压膜过滤对抗生素去除有良好的效率，但将抗生素去除到低于检测阈值需要大量活性炭，成本高，且易对环境造成二次污染。臭氧氧化、类芬顿氧化、高铁盐酸氧化可以有效去除抗生素，但容易产生一些潜在的有毒副产物，并且能量消耗大。

过去的几年中，生物处理已经广泛应用于降解抗生素。生物技术是目前公认的最佳降解抗生素物质技术，特别是微生物降解、氧化还原酶降解用于大多数水处理。微生物降解抗生素可分为三个阶段，第一阶段微生物吸附，抗生素到达细胞表面或进入细胞；第二个阶段微生物在抗生素的刺激下，开始分泌一些胞外或孢内氧化还原酶；第三个阶段抗生素在氧化还原酶的作用下降解为无毒性的或低毒性的化合物。筛选可高效降解抗生素的菌株将具有非常广阔的市场前景。

众所周知，微生物降解是一种成本低廉、安全高效且环境友好的方法，其在处理抗生素等有机污染物的过程中发挥着至关重要的作用。通过国内外研究发现，目前所筛选出的对金霉素、土霉素具有降解能力的菌种较少。研究者不断从环境中筛选分离出能够降解四环素类抗生素的菌种。酵母菌、发酵丝状菌酵母等均具有抗生素的降解功能。沈颖等分离得到有效降解四环素的放线菌、真菌及细菌。杨正礼筛选出降解金霉素真菌,桔青霉(Penicillium citrinum)LJ318,草酸青霉(Penicillium oxalicum)LJ302。张惠艳考察哈茨木霉(Trichoderma harzianum)LJ245和LJ302菌株对金霉素的降解能力,LJ245和LJ302两株真菌LJ245能够在300mg/L的金霉素中生长且降解效率最高。冯福鑫等分离得到一株酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans XPY-10可以盐酸四环素为唯一碳源进行生长对600mg/L盐酸四环素降解率为83.63％。

发明内容

本发明从中国玉龙雪山土壤样品中筛菌，获得一株灰隔孢伏革菌F08，其保藏编号为CGMCC No.3.20903，分类命名是：Peniophora simulans；保藏日期：2022年3月28日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

菌株F08能够高效降解抗生素物质(降解率可达90％以上)，该菌可通过固定化方法应用于环境水资源的保护。

菌株灰隔孢伏革菌F08的形态特征：

菌落的组织性状呈绒毛状，菌落颜色为白色，菌落干燥。

灰隔孢伏革菌F08的降解培养基特征：

微好氧，生长温度范围10～30℃，最适生长温度范围为20～25℃。可以在pH 3.0～6.0的环境生长，其中最适pH为4.0～5.0。

本发明的有益效果：本发明的菌株可在常温条件有效降解抗生素物质，菌株耐受性较广，环境对其降解效率影响较小，环境低温、偏酸时能够高效降解抗生素物质，在环境水保护中具有重大意义，将灰隔孢伏革菌接种于环境水体中，相比化学和物理，安全性高，经济有效，不会造成二次污染；且菌株在高浓度时也不会对人体或环境产生危害作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为菌种F08菌落、菌丝形态图；

图2为Peniophora simulans F08的系统发育树图；

图3为菌种F08在不同培养温度下对金霉素、土霉素降解效果图；

图4为菌种F08在不同pH环境中对金霉素、土霉素降解效果图；

图5为菌种F08对不同浓度金霉素、土霉素降解效果图；

图6为固定化P.simulans F08在固定床中降解效果图；

图7为固定化菌丝颗粒的重复使用性能

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

菌株F08的富集及筛选

在分离筛选中，所用的样品为玉龙雪山冻土，用灭菌后的去离子水搅拌样品，得到样品液。将样品液通过PDA培养基富集培养稀释涂平板至PDA培养基中，在20℃、培养5天后，挑取不同形态的菌落，分离纯化直至形成单菌落。

将分离出来的单菌落进行抗生素降解实验，筛选出降解能力最强的菌种。该灰隔孢伏革菌F08菌种进行鉴定和保藏。

该菌在含有200mg/L金霉素的无机盐培养基中20℃培养5天后，可降解90％以上的金霉素；该菌在含有250mg/L土霉素的无机盐培养基中20℃培养5天后，可降解95％以上的土霉素。

筛选出的菌种保存在砂土管、冷冻干燥管中，将处于休眠状态。使用时将菌种进行活化，获得一定数量的纯菌种。

灰隔孢伏革菌F08培养方法，包括如下步骤：

菌种活化：将处于休眠状态的菌种接入PDA培养基中，于25℃活化7天。

上述所用的培养基配置方法如下：

PDA培养基按1L蒸馏水、将200g去皮土豆切成小块，加1L蒸馏水，煮沸至土豆软，8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min。

PDA平板按1L蒸馏水、将200g去皮土豆切成小块，加1L蒸馏水，煮沸至土豆软，8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，定容至1L，琼脂20，pH自然，121℃灭菌20min。

无机盐培养基按1L蒸馏水、3g葡萄糖，0.1g NH₄Cl，0.14g CuSO₄·5H₂O，1g KH₂PO₄，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.095g MgSO₄·7H₂O，0.1g CaCl₂·2H₂O，并在121℃灭菌20min，pH控制在4.5左右。

灰隔孢伏革菌F08菌种鉴定

1、形态观察

本发明菌株灰隔孢伏革菌F08为丝状真菌，菌丝呈毛绒状，前期洁白，培养一段时间略带浅黄色，如图1所示。

2、分子鉴定

取灰隔孢伏革菌F08菌株纯培养菌，以基因组DNA为模板，利用通用引物ITS扩增并测序，将测序所得到的基因序列经Blast搜索比对，该菌与Peniophora simulans有较高的同源性，鉴定为灰隔孢伏革菌，如图2所示，结合形态及ITS序列分析，将其命名为灰隔孢伏革菌(Peniophora simulans)F08。

不同pH条件下灰隔孢伏革菌F08降解金霉素、土霉素物质试验

本实验无机盐培养基装液量为100mL，使用0.5M NaOH和HCl调节降解培养基pH为2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0这八个梯度，121℃灭菌20min，在超净工作台中转接10mL菌液，在20℃、150r/min条件下培养5天后，取样，采用液相色谱的方法测定抗生素浓度。结果如图3所示。

不同温度条件下灰隔孢伏革菌F08降解金霉素、土霉素物质试验

本实验无机盐培养基装液量为100mL，121℃灭菌20min，在超净工作台中转接10mL菌液，调节摇床温度10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，摇床转速固定在150r/min条件下培养5天后，取样，采用液相色谱的方法测定抗生素浓度。结果如图4所示。

以上实验除了考察因素外，降解条件都是灰隔孢伏革菌F08培养液以10％(v/v)的接种量接种于含抗生素的无机盐培养基中，在20℃、150rpm下培养5天后，取样测定各条件培养基中抗生素的含量。以培养pH值、温度、抗生素浓度为横坐标，降解效率为纵坐标绘制各自曲线。由图3和图4可知，灰隔孢伏革菌F08降解金霉素的最适pH为4、降解土霉素的最适pH为4.5，最适温度均为20℃，当环境pH在3.0-5.0之间时，灰隔孢伏革菌F08均能高效降解抗生素物质，降解率均在75％以上。实施例中用到的抗生素为金霉素、土霉素。

灰隔孢伏革菌F08对高初始浓度抗生素物质浓度降解的探究

将灰隔孢伏革菌F08接种至浓度为100mg/L、125mg/L、150mg/L、175mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L抗生素物质的无机盐培养基中，判断灰隔孢伏革菌F08对不同浓度抗生素物质的降解能力。具体操作如下：配置400mg/mL的母液，过无菌膜后，按不同浓度100mg/L、125mg/L、150mg/L、175mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L抗生素物质加入无机盐培养基中，按10％接种量接种灰隔孢伏革菌F08，在20℃、150r/min的振荡培养箱中培养5天，培养后的培养基以4000r/min、5min离心，取上清液测抗生素浓度，采用液相色谱的方法测定抗生素物质的浓度。结果如图5所示，灰隔孢伏革菌F08经过5天后，200mg/L金霉素、250mg/L土霉素的降解率仍在90％以上。

灰隔孢伏革菌F08固定化方法

固定化载体按500mL蒸馏水、3.5～5％海藻酸钠粉末、0.5～1％玉米秸秆生物炭粉的配方配置，并在121℃灭菌20min。优选的，按500mL蒸馏水、4.5％海藻酸钠、0.7％活性炭的配方配置，并在121℃灭菌30min。

将活化的灰隔孢伏革菌F08倒入灭菌的50mL离心管中，于20℃、4000rpm离心5min，弃上清液，无菌水洗涤3-4次，弃上清液，保留沉淀。

将沉淀与固定化载体混合均匀，使用灭菌的500mL玻璃注射器压入CaCl₂溶液中，静置1h，灭菌的筛网过滤，无菌水洗涤，存放于4℃冰箱备用。

上述CaCl₂溶液按1L蒸馏水、3％CaCl₂的配方配置，并在121℃灭菌20min。

固定化灰隔孢伏革菌F08在固定床中降解工业废水中抗生素物质试验

本试验在固定床的填充率40％、停留时间1h、金霉素初始浓度200mg/L或土霉素初始浓度250mg/L下运行，12天，在12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h、264h、288h时收集出水口样品，采用液相色谱的方法测抗生素物质浓度。由图6可知，在无机盐培养基的理想体系中，固定化菌丝颗粒连续运行12天，降解率仍维持在95％以上，整个装置表现出好的稳定性。

所用液相色谱：

液相色谱操作条件：梯度洗脱：0-0.5min 90％A和10％B，0.5min-3min 90％A→60％A，3-8min 60％A；8-10min 90％A。色谱柱：BetaBasic-18柱(100mm x 2.1mm x 3μm)；柱温为40℃；流速为0.3mL/min；流动相A为0.1％甲酸，流动相B为乙腈+0.1％甲酸；检测波长360nm，检测波长；检测待测样品时的进样量为10uL。该处为金霉素、土霉素利用液相色谱检测方法。

标准曲线的绘制：

a、将金霉素、土霉素标准品用超纯水分别稀释成0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、10mg/L等几个浓度。

b、用液相色谱法检测a中各浓度，并记下各个浓度对应的峰面积。每次进样量为10μL，每次处理重复3次。

c、以浓度为横坐标峰面积的平均值为纵坐标做出标准曲线，并求得回归方程。

海藻酸钠-玉米秸秆生物炭粉固定化菌丝颗粒接种到装有抗生素培养基的摇瓶中，在最优条件下反应5天，取样测定抗生素物质浓度，回收固定化菌丝颗粒，加入新鲜降解培养基，重复上述实验6次，采用液相色谱法测定抗生素浓度。由图7可知，随着使用次数的增加，海藻酸钠-玉米秸秆生物炭粉固定化P.simulans F08颗粒对金霉素、土霉素降解效果，在6次的连续循环实验过程中一直有较好的降解率，6次后降解率仍在80％以上。表明固定化后的P.simulans F08生物量高且稳定、不易流失、活性高、耐毒害能力强，可连续应用，非常合适应用于灰隔孢伏革菌F08对抗生素的降解中。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.灰隔孢伏革菌F08，其保藏编号为CGMCC No.3.20903，分类命名是：Peniophorasimulans；保藏日期：2022年3月28日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的灰隔孢伏革菌F08在降解抗生素中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗生素为金霉素和土霉素。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将灰隔孢伏革菌(Peniophora simulans)F08用海藻酸钠、玉米秸秆生物炭粉和氯化钙固定后用于降解水体中的抗生素。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，固定化载体按500mL蒸馏水、3.5～5wt％海藻酸钠粉末、0.5～1wt％玉米秸秆生物炭粉的配方配置，并在121℃灭菌20min。

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