JP5838552B2 - 新規微生物及びそれを用いたカロテノイドの生産方法 - Google Patents
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TSTT052株を表1に示す培地3mLに植菌し、試験管中、25℃、150rpmで1晩振とう培養を行った。この培養液のうち1mLを1.5mLエッペンドルフチューブに移し、15000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をpH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液(以下緩衝液Aとする)1mLに懸濁し、次いで3mg/mLのN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(以下NTGとする)水溶液10μLを加え、60分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Aに再懸濁する操作を2回繰り返してNTGを除去した。さらに、表1に示す培地1mLにこの菌体を懸濁し、試験管中、25℃、150rpmで5時間振とう培養した。得られた培養液を適度に希釈し、寒天15g/Lを加えて固化した表1に示す組成の平板培地に塗布して、25℃で1週間静置培養を行った。生育してきたコロニーのうち赤色の強いものを選別し、フラスコ培養による変異株の評価に供した。
実施例1で選別した変異株を、表1に示す培地3mLに植菌し、試験管中、25℃、150rpmで1晩振とう培養した。次いでこの培養液0.5mLを、100mL容バッフル付三角フラスコに入れた表1に示す培地60mLへ植菌し、25℃、120rpmで6日間振とう培養を行った。培養中は培養液を適宜抜き取り、濁度(OD660nm)、残存グルコース濃度、培地pH、及びカロテノイド生産量を経時的に分析した。カロテノイド生産量の定量は以下のように行った。まず培養液1mLを1.5mL容エッペンドルフチューブに移し、15000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体を20μLの純水に懸濁し、次いで480μLのジメチルホルムアミド、及び500μLのアセトンを順次加え振とうすることでカロテノイドを抽出した。抽出残渣を15,000rpm、5分間の遠心分離により除去した後、市販の液体クロマトグラフィー用カラム(TSKgel−ODS80TMカラム、東ソー株式会社製)を用いた高速液体クロマトグラフィー(以下HPLCとする)で各種カロテノイドを定量した。
表1に示す培地60mLにTSN47R3株を植菌し、100mLバッフル付三角フラスコ中、25℃、120rpmで1晩振とう培養を行い前々培養とした。次いでこの培養液3mLを、500mL容バッフル付三角フラスコに入れた表3に示す培地100mLへ植菌し、25℃、120rpmで1晩振とう培養を行い前培養とした。次いで、表4に示す培地1.8Lを全容3.0L発酵槽(サクラ精機社製、TFLC−3)に入れ、121℃、20分間で滅菌後、得られた前培養液を90mL植菌し、約170時間培養した。発酵槽の操作は次のようにした。まず、発酵槽の培養温度は22℃、pHは7.0から7.2とし、pHの調整は10%のアンモニア水溶液を用いた。また発酵槽の攪拌速度は、培養開始時には516rpmとし、培養が進むにつれて徐々に攪拌速度を上げ、培養117時間において594rpmまで上昇させた。培養過程に発生する炭素源不足は、70%グルコースを適宜添加することにより補った。グルコース濃度は、10g/Lで培養を開始し、培養18時間後にグルコースの添加を開始して、0.5g/L〜33g/Lとなるように調節した。培養開始から117時間経過した時点でグルコースの添加を終了し、0.2M硫酸第1鉄7水和物の水溶液25mLを培養液に追加した。
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- カロテノイド生産性パラコッカス属細菌TSN47R3株(FERM P−22034)。
- カロテノイド生産性パラコッカス属細菌TSN47R3株(FERM P−22034)を培養し、菌体からアスタキサンチンを回収することを特徴とする、アスタキサンチンの製造方法。
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