KR20090062566A - 카로티노이드를 고농도로 생산하는 미생물 및 이를 이용한카로티노이드 생산 방법 - Google Patents

카로티노이드를 고농도로 생산하는 미생물 및 이를 이용한카로티노이드 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파라코커스 RF1(Paracoccus sp . RF1) 균주 및 상기 균주를 이용한 카로티노이드(carotenoid) 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파라코커스(Paracoccus sp . MBIC01143) 균주를 방사선 조사를 통하여 얻어진 변이주 파라코커스 RF1 및 상기 변이주를 이용한 아스타잔틴(astaxanthin)을 포함하는 카로티노이드를 모균주보다 7배 이상 고효율로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 아스잔틴을 포함하는 카로티노이드의 대량 생산 기술은 화장품, 식품 및 사료 등 다양한 산업에 유용하게 사용될 수 있다.
파라코커스(Paracoccus sp.), 아스타잔틴(astaxanthin), 카로티노이드(carotenoid), 방사선 조사, 돌연변이

Description

카로티노이드를 고농도로 생산하는 미생물 및 이를 이용한 카로티노이드 생산 방법{A microorganism producing carotenoid with high concentration and a method for producing carotenoid using said microorganism}
본 발명은 파라코커스 RF1(Paracoccus sp . RF1) 균주 및 상기 균주를 이용한 카로티노이드(carotenoid) 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파라코커스(Paracoccus sp . MBIC01143) 균주를 방사선 조사를 통하여 얻어진 변이주 파라코커스 RF1 및 상기 변이주를 이용한 아스타잔틴(astaxanthin)을 포함하는 카로티노이드의 고효율 생산 방법에 관한 것이다.
카로티노이드(carotenoid)는 항산화 활성을 가지고 있는 C40 이소프레노이드 화합물(isoprenoid compounds)로서 자연계에 널리 분포되어 있는 한 군의 색소를 총칭하며, 현재까지 알려진 카로티노이드는 6백여 종에 이른다. 이들은 각각 다른 형태로 존재하며 분자 구조에 따라서도 노란색, 적색, 주홍색, 주황색 등 여러 색으로 존재한다. 그 예로 β-카로텐(β-carotene; 당근의 주황색 색소), 라이코 펜(licopene; 토마토의 적색 색소), 푸코잔틴(fucoxanthin; 해조류의 황갈색 또는 갈색 색소) 등이 있다. 카로티노이드는 인체 내에서 비타민 A의 전구체로서의 역할을 하며, 산화 방지 효과와 유해산소 소거작용, 암세포 증식 억제작용 및 발암 억제작용이 강하여 순환기 질환, 암 및 성인병 등을 예방하는 효능을 가진 것으로 알려져 있다. 최근에는 카로티노이드가 직접적인 자외선에 의한 신체의 면역기능을 향상시켜 자외선 노출로부터 피부의 손상을 줄여주거나 멜라닌 생성을 억제함이 밝혀지면서 유럽이나 미국에서 미용 소재로 각광을 받기 시작했다. 현재 카로티노이드는 건강식품 소재(영양 보충제), 인간을 대상으로 한 약학적 제제와 식품 착색제 또는 동물용 사료의 색소 등으로 사용되고 있다.
아스타잔틴(astaxanthin)은 주로 새우, 붉은 도미류(red seabream), 연어(salmon) 및 바다가재(lobsters) 등과 같은 해양 동물 조직에 존재하는 것으로 알려져 있다(Fujita et al., Nippon Suisan Gakkaishi ., 49: 1855-1869, 1983; Johnson, E. A., Crit . Rev . Biotechnol ., 11: 297-326, 1991; Nelis et al., J. Appl. Bacteriol ., 70: 181-191, 1991). 아스타잔틴은 정상적인 호기적 대사과정 중 활성산소가 세포 내 DNA, 단백질, 지질 등을 손상시키는 것과 더불어 세포와 조직의 노화 및 발암을 유발하는 반응을 억제할 뿐만 아니라, 유리 라디칼(hydroxy or peroxy radicals)의 생성을 억제하는 작용을 한다(Palozza et al., Arch . Biochem. Biophys ., 297: 291-295, 1992; Shimidzu et al., Fish Sci ., 62: 134-137, 1996). 또한, 면역 조절 활성(immune modulatory activity) 및 심장 조절 효 과(cardioprotective effect)를 갖는 것으로 알려졌다(Jyonuchi et al., Nutr . Cancer, 19:269-280, 1993). 특히, 아스타잔틴의 항산화력은 다른 카로티노이드의 10배 이상이고, α-토코페롤(tocopherol)의 100배 이상인 것으로 알려져 있으며, 현재까지 아스타잔틴의 독성(toxicity)에 대해서는 보고된 바 없다. 따라서, 아스타잔틴은 신경질환(neurodegenerative diseases), 암(cancer), 면역질환(immune disorders) 및 심장혈관질환(cardiovascular diseases) 등을 포함하는 다양한 질환의 치료 및 예방에 이용되고 있고, 이에 대한 연구가 계속 되고 있다(Beal, H. F., The Neuroscientist, 3:21-27, 1991; Chew et al., Anticancer Res., 19:1849-1853, 1999; Murillo E., Arch. Latinoam. Nutr., 42:409-413, 1992). 또한, 아스타잔틴은 산업적으로 색소증진 물질로 이용되고 있으며, 우리나라에서는 '파피아 색소'라는 명칭으로 식품첨가물로 등록되어 있다. 이러한 이유로 아스타잔틴의 수요는 매년 15% 이상의 소비성장을 보이고 있으며, 이에 따라 아스타잔틴의 중요성이 대두되고 있다.
최근에 스위스의 호프만-라로췌(F. Hoffman-LaRoche)사에서 아스타잔틴의 화학 합성법을 개발하였으나, 화학합성으로 제조된 아스타잔틴은 천연 아스타잔틴에 비해 낮은 생체 흡수율을 보이고, 식품 첨가제로서의 안전성에 문제가 되고 있어 유럽의 일부 국가에서만 사용이 허가된 상태이다. 따라서, 천연 아스타잔틴의 합성법에 관심이 집중되고 있으며, 아스타잔틴을 생산하는 미생물을 이용한 아스타잔틴의 제조에 상업적 관심이 일고 있다. 현재 아스타잔틴을 생산하는 것으로 알려진 미생물로는 효모인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma), 녹색조류인 해마토코 커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 그람-양성균 브레비박테리움 103(Brevibacterium 103), 그람-음성균 아그로박테리움 아우란티아컴(Agrobacterium aurantiacum), 파라코커스 마르쿠시아이(Paracoccus marcusii) 및 파라코커스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) 등이 알려져 있다. 그러나, 이러한 미생물들은 높은 함량으로 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 생산하지 못하기 때문에, 고농도로 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 생산할 수 있는 균주의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자는 파라코커스 속의 미생물을 방사선 조사를 통하여 얻어진 돌연변이주 중에서 높은 함량으로 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 생산할 수 있는 균주를 선별함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 방사선 조사를 통하여 얻어진 높은 함량으로 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 생산할 수 있는 파라코커스 FR1 균주 및 이를 이용한 카로티노이드 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 11222BP로 기탁된 카로티노이드의 고효율 생산이 가능한 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 변이 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 파라코커스 속(Paracoccus sp.) 균주에 방사선을 조사하여 돌연변이 시키는 단계; 및
2) 단계 1)의 돌연변이된 균주를 배지에 배양하여 카로티노이드의 함량이 증가된 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 카르티노이드를 고효율로 생산하는 파라코커스 속 변이 균주를 제조하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 수탁번호 KCTC 11222BP로 기탁된 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계;
2) 단계 1)의 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)의 상등액을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 카로티노이드를 분리하는 단계를 포함하는 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 파라코커스(Paracoccus sp . MBIC01143) 균주를 방사선 조사를 통하여 얻은 변이주 파라코커스 RF1은 아스타잔틴(astaxanthin)을 포함하는 카로티노이드를 모균주 보다 7배 이상 고효율로 생산할 수 있음을 확인하였고, 아스타잔틴은 여러 가지 중요한 생물학적 기능을 가지며 화장품, 식품 및 사료 산업 등에 유용하게 이용되는 물질임이 알려져 있으므로, 본 발명의 변이주 및 이를 이용한 아스타잔틴의 대량 생산 기술은 화장품, 식품 또는 사료 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 11222BP로 기탁된 카로티노이드의 고효율 생산이 가능한 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 변이균주를 제공한다.
상기 변이균주는 하기와 같은 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조된다.
1) 파라코커스 속(Paracoccus sp.) 균주에 방사선을 조사하여 돌연변이 시키 는 단계; 및
2) 단계 1)의 돌연변이된 균주를 배지에 배양하여 카로티노이드의 함량이 증가된 변이주를 선별하는 단계,
상기의 방법에 있어서, 단계 1)의 파라코커스 속 균주는 파라코커스 MBICO1143인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 방사선은 감마선, 전자선 또는 이온빔 등이 모두 사용될 수 있으며, 감마선을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90 및 세슘(Cs)-137로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성 동위원소로부터 방출되는 감마선을 사용하여 조사할 수 있으며, 코발트(Co)-60 방사성 동위원소로부터 방출되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 감마선의 조사선량은 시간당 30 ~ 100 Gy인 것이 바람직하고, 총 흡수선량은 100 ~ 500 Gy인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 방사선 조사는 미생물의 염색체 구조를 파괴하여, 염색체 구조를 재결합시키는데서 발생하는 돌연변이를 야기시킨다. 본 발명에서는 파라코커스(Paracoccus sp . MBIC01143) 모균주가 초기 대수증식기(early log phase)까지 자란 이후에 멸균수로 세척 및 생리식염수에 현탁한 후 코발트(Co)-60 감마선 조사시설을 이용하여 실온에서 시간당 50 Gy의 선량율로 100 Gy의 총 흡수선량을 얻도록 조사하였다.
상기의 방법에 있어서, 단계 2)의 배양은 MB(Marine broth), DMB(diluted marine broth), NB(nutrient broth), DNB(diluted nutrient broth), tryptic soy broth, Zobell's broth, DZB(dilute zobell broth) 또는 이들의 변형 배지를 이용 하는 것이 바람직하고 MB(Marine broth) 배지를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 배양은 배양온도가 20 ~ 30 ℃인 것이 바람직하고 25 ℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 배양은 3 ~ 5일간 배양하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 방사선 조사 이후의 미생물 현탁액을 멸균수로 균체의 농도가 한 평판 배지 당 200개 정도 되도록 희석하여 MB(Marine Broth) 배지에 도말한 다음 25℃에서 3 ~ 5일간 배양하였다.
상기의 방법에 있어서, 단계 2)의 선별은 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 모균주의 카로티노이드 함량에 비해 5 ~ 10배의 증가한 것을 선별하는 것이 바람직하고 7 ~ 8배 증가한 것을 선별하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 야생형 파라코커스 및 변이주 파라코커스의 세포 성장 속도 및 최종 세포 농도를 비교하기 위해, 상기 각각의 균주의 배지에 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과 야생형 파라코커스는 2시간, 변이주 파라코커스 RF1는 5시간에 각각 대수기(exponential phase)에 도달했지만 대수 증식기에서의 균체성장속도(specific growth rate)는 야생주와 변이주에서 비슷한 값을 가졌으며, 최종 세포 농도도 유사하였다.
본 발명에서는 야생형 파라코커스 및 변이주 파라코커스의 카로티노이드 농도를 비교하기 위해, 상기 미생물들을 각각 원심분리 후, 세척하고 세포를 파쇄한 후 다시 배양 및 원심분리하여 상등액에 추출된 카로티노이드 함량을 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과 본 발명에서 개발한 변이주 파라코커스 RF1의 카로티노이드 함량이 야생형(wild-type)의 함량에 비해 약 7배 증가하였다.
본 발명자들은 기존의 파라코커스 균주보다 카로티노이드 함량이 현저히 높은 변이주를 "파라코커스 RF1(Paracoccus sp . RF1)"이라 명명하고, 상기 균주는 2007년 10월 22일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11222BP).
또한, 본 발명은
1) 수탁번호 KCTC 11222BP로 기탁된 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 변이균주를 배지에서 배양하는 단계;
2) 단계 1)의 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및
3) 단계 2)의 상등액을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 카로티노이드를 분리하는 단계를 포함하는 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 고효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 단계 1)의 배양은 MB(Marine broth), DMB(diluted marine broth), NB(nutrient broth), DNB(diluted nutrient broth), tryptic soy broth, Zobell's broth, DZB(dilute zobell broth) 또는 이들의 변형 배지를 이용하는 것이 바람직하고 MB(Marine broth) 배지를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에서, 단계 3)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용 한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피를 이용한 카로티노이드 분리방법은 문헌(Kang, M.-J et al., Journal of Microbiology and Biotechnology 15 (4), pp. 880-886, 2005)을 참고하였다.
상기 방법에서, 고효율은 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 모균주에 비해 5 ~ 10배 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해서 한정되지는 않는다.
< 실시예 1> 방사선 조사에 의한 파라코커스 균주의 돌연변이 제조
본 발명자들은 파라코커스크 MBIC01143(Paracoccus sp . MBIC01143) 미생물(Marine Biotechnology Institute Culture collection(MBIC), -75-1 Heita, Kamaishi, Iwate 026-0001, Japan)이 초기 대수증식기(early log phase)까지 자란 이후에 상기 미생물을 멸균수로 2회 세척한 후 0.95% 생리식염수(saline solution)에 600nm에서의 흡광도가 1이 되도록 현탁하였다. 감마선 조사는 한국원자력연구원 방사선과학연구소 내 선원 3000 Ci, Co-60 감마선 조사시설을 이용하여 실온(12±1℃)에서 시간당 50 Gy의 선량율로 조사하였다. 미생물 현탁액의 감마선 조사 선량은 100 Gy의 총 흡수선량을 얻도록 하였으며, 흡수선량 확인은 알라닌 방사선 량계(alanine dosimeter)를 사용하였고, 총 흡수선량의 오차는 ±5%였다.
방사선 조사 이후의 미생물 현탁액을 멸균수로 균체의 농도가 한 평판배지당 200개 정도 되도록 희석하여 MB(Marine Broth agar)(Difco 0979)에 도말한 다음 25℃에서 3 ~ 5일간 배양 후 돌연변이주를 분리하였다. 상기 방법에 의해 얻어진 변이주 중에서 야생주보다 특징적으로 색깔이 짙은 변이주를 선별하여 MB(Marine Broth) 액체배지에 진탕 배양하여 카로티노이드의 함량을 측정하였다.
상기 돌연변이주 중에서 기존의 파라코커스 균주보다 카로티노이드 함량이 현저히 높은 변이주를 "파라코커스 RF1(Paracoccus sp . RF1)"이라 명명하고, 상기 균주는 2007년 10월 22일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11222BP).
< 실시예 2> 세포 생장 속도 측정
본 발명자들은 변이주 파라코커스 RF1 및 야생주 파라코커스의 성장 속도를 측정하여 비교하였다. 야생주와 변이주를 각각 20 mL의 MB(Marine Broth)에 접종하여 진탕 인큐베이터(shaking incubator)에서 25℃, 150 rpm으로 배양하였다. Ultrospec 2100 pro UV/Visible 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도(optical density)를 측정함으로써 MB(Marine Broth)에서의 각 균주의 세포 생장(cell growth)을 측정하였다. 상기 측정 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 야생형 파라코커스는 2시간 만에 대수기(exponential phase)에 도달하는 반면, 변이주 파라코커스 RF1는 5시간에 대수기에 도달했다. 그러나, 대수증식기에서의 균 체성장속도(specific growth rate)는 야생주와 변이주에서 비슷한 값을 가졌으며, 최종 세포 농도 역시 유사하였다.
< 실시예 3> 카로티노이드 함량 측정
본 발명자들은 카로티노이드의 농도 분석을 위해 미생물을 원심분리(3,000 rpm, 10분)후, 세척하고 고순도 아세톤(acetone) 1mL을 넣고 호모제나이저(homogenizer)로 세포를 파쇄한 후 20분간 배양 후, 원심 분리하여 상등액에 추출된 카로티노이드 함량을 측정하였다. 상기 추출물에 대해 Ultrospec 2100 pro UV/Visible 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 474 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 변이주의 카로티노이드 함량은 야생주에 비하여 약 7배 이상 증가하였다.
야생주 및 변이주의 카로티노이드 함량 비교
샘플 야생주 대비 상대 농도(%)
야생주 파라코커스(Paracoccus sp.) 100
변이주 파라코커스(Paracoccus sp.) RF1 724
도 1은 본 발명의 수탁번호 KCTC 11222BP로 기탁된 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 변이 균주 및 모균주인 파라코커스(Paracoccus sp . MBIC01143) 균주의 성장 곡선을 비교하여 나타낸 그래프이다.

Claims (17)

  1. 수탁번호 KCTC 11222BP로 기탁된 카로티노이드의 고효율 생산이 가능한 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 변이 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 모균주에 비해 카르티노이드를 5 ~ 10배의 고효율로 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 1) 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 균주에 방사선을 조사하여 돌연변이 시키는 단계; 및
    2) 단계 1)의 돌연변이된 균주를 배지에서 배양하여 카로티노이드의 함량이 증가된 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 카르티노이드를 고효율로 생산하는 파라코커스 속 변이 균주를 제조하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 균주는 파라코커스 MBICO1143인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 방사선은 감마선, 전자선 및 이온빔으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 방사선은 감마선인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 감마선은 코발트(Co)-60, 크립톤(Kr)-85, 스트론튬(Sr)-90 및 세슘(Cs)-137로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방사성 동위원소로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 감마선은 코발트(Co)-60 방사성 동위원소로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 방사선은 시간당 30 ~ 100 Gy의 선량으로 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 방사선은 총 흡수선량이 100 ~ 500 Gy이 되도록 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 3항에 있어서, 단계 2)의 배지는 MB(Marine broth), DMB(diluted marine broth), NB(nutrient broth), DNB(diluted nutrient broth), tryptic soy broth, Zobell's broth, DZB(dilute zobell broth) 또는 이들의 변형 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 3항에 있어서, 단계 2)의 배양은 20 ~ 30 ℃의 온도에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 3항에 있어서, 단계 2)의 배양은 3 ~ 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 3항에 있어서, 단계 2)의 선별은 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 모균주 의 카로티노이드의 함량에 비해 5 ~ 10배의 증가한 것을 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 1) 제 1항의 균주를 배지에서 배양하는 단계;
    2) 단계 1)의 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 상등액을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 카로티노이드를 분리하는 단계를 포함하는 아스타잔틴을 포함하는 카로티노이드를 고효율로 생산하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 단계 1)의 배지는 MB(Marine broth), DMB(diluted marine broth), NB(nutrient broth), DNB(diluted nutrient broth), tryptic soy broth, Zobell's broth, DZB(dilute zobell broth) 또는 이들의 변형 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 고효율은 파라코커스 속(Paracoccus sp .) 모균주의 카로티노이드 생산량에 비해 5 ~ 10배인 것을 특징으로 하는 방법.
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