KR20230169930A

KR20230169930A - 카로테노이드를 생산하는 미생물

Info

Publication number: KR20230169930A
Application number: KR1020237023061A
Authority: KR
Inventors: 다이치 구와하라
Original assignee: 에네오스 가부시키가이샤
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-12-18
Also published as: JPWO2022220014A1; WO2022220014A1; EP4328317A1

Abstract

본 발명은, 생산 효율이 향상된 β-크립토크산틴의 제조 방법의 제공을 목적으로 한다. 본 발명에 의해, 파라콕쿠스속 세균을 소정의 용존 산소 농도로 배양하여 β-크립토크산틴을 제조하는 방법으로서, 상기 파라콕쿠스속 세균이 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이거나 ; 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균인, 상기 방법이 제공된다.

Description

카로테노이드를 생산하는 미생물

본 발명은, β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 생산하는 세균 또는 상기 카로테노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 β-크립토크산틴을 생산하는 세균 또는 β-크립토크산틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.

카로테노이드는, 사료 첨가물, 식품 첨가물, 의약품 등으로서 유용한 천연 색소이다. 카로테노이드에는, 예를 들면 제아크산틴, β-카로텐, β-크립토크산틴, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 리코펜, 포에니코크산틴, 아도니크산틴, 에키네논, 아스테로이데논 및 3-하이드록시에키네논 등이 포함된다.

카로테노이드 중에서도, β-크립토크산틴은, 감귤류에 포함되고, 항종양 효과를 갖는 것이 알려져 있고 (비특허문헌 1), 또한 골다공증 예방에 효과가 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 2). β-크립토크산틴은, 건강 식품 소재나 사료 배합제로서의 용도도 알려져 있다.

또한, 제아크산틴이나 β-크립토크산틴 등의 카로테노이드는, 닭 등의 가금류의 사료에 첨가하여, 당해 사료를 가금류에 주면, 난황에 축적된다. 이들 카로테노이드는, 유효한 생리 작용을 갖는 점에서, 이들 카로테노이드를 축적한 난황은 기능성 계란으로서 유용하다.

특허문헌 1 에는, 파라콕쿠스속 세균을 사용한 제아크산틴 등의 카로테노이드의 제조 방법이 개시되어 있다. 이 제조 방법에 의해 제아크산틴뿐만 아니라 β-크립토크산틴도 생산되지만, 배양액당 또는 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴의 생산량은 충분한 것은 아니다.

또한, 특허문헌 2 에도, 파라콕쿠스속 세균을 사용한 제아크산틴의 제조 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 2 의 방법에 의해 얻어지는 β-크립토크산틴의 생산량도, 충분한 것은 아니다.

일본 공개특허공보 2005-87097 WO2011/122616 팜플렛

Tsushima M. 등, 「Biol. Pharm. Bull.」, 1995년, 제18권, 제2호, pp. 227-233 Yamaguchi M 등, 「ACS Symp Ser (Am Chem Soc)」, 2008년, 제993호, pp. 408-418

이러한 사정 하에, 생산 효율이 향상된 β-크립토크산틴의 제조 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자는, 예의 연구를 실시하여, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드의 제조 방법으로서, β-크립토크산틴의 생산 효율이 향상된 상기 방법을 알아내었다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1]

파라콕쿠스속 세균을 배양하여 β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법으로서,

용존 산소 전극에 의해 측정한 배양액 중의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하는 것을 포함하고,

상기 파라콕쿠스속 세균이, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이거나 ; 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균인, 상기 방법.

[1]’

파라콕쿠스속 세균을 배양하여 β-크립토크산틴을 제조하는 방법으로서,

[2]

β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법으로서,

파라콕쿠스속 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도의 배양액으로 배양하는 공정을 포함하고,

당해 배양액의 용존 산소 농도가, 용존 산소 전극에 의해 측정되는 것이며,

상기 파라콕쿠스속 세균이, 황색 ∼ 등색, 예를 들어 황색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이거나 ; 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균인, 상기 방법.

[2]’

β-크립토크산틴을 제조하는 방법으로서,

[3]

(a) 배양액 중에서 파라콕쿠스속 세균을 증식시키거나, 또는 배양액을 측정 파장 610 nm 로 측정한 탁도가, 제 1 배양 공정 개시시의 탁도와 비교하여 5 이상 증가할 때까지 파라콕쿠스속 세균을 배양하는 제 1 배양 공정과,

(b) 제 1 배양 공정 종료 후, 상기 파라콕쿠스속 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도의 배양액으로 배양하는 제 2 배양 공정을 포함하고,

[3]’

β-크립토크산틴을 제조하는 방법으로서,

[4]

상기 제 2 배양 공정의 배양 시간이 10 시간 이상 100 시간 이하인, [3] 또는 [3]' 에 기재된 방법.

[5]

상기 제 1 배양 공정의 배양 시간이 10 시간 이상 70 시간 이하인, [3], [3]' 또는 [4] 에 기재된 방법.

[6]

황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이, 적색을 나타내는 콜로니를 형성하는 파라콕쿠스속 세균을 변이 처리하고, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써 취득되는 것인, [1] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[6]’

황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이, 파라콕쿠스속 세균을 변이 처리하고, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써 취득되는 것이고, 또한, 황색 ∼ 등색을 나타내지 않는 콜로니를 형성하는 세균과 비교하여 향상된 β-크립토크산틴의 생산성을 갖는, [1] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[7]

상기 내인성 crtW 유전자가, 서열 번호 1 로 나타내는 염기 서열에 적어도 90 ％ 동일한 염기 서열을 포함하는, [1] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[8]

상기 crtW 효소가, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열에 적어도 90 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는 [1] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[9]

β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드가, β-크립토크산틴인, [1] ∼ [8] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[10]

내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한, 파라콕쿠스속 세균.

[10] 의 파라콕쿠스속 세균은, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드 또는 β-크립토크산틴을 생산할 수 있다. 또한, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성할 수 있다.

본 발명에 의해, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 생산하는 세균을 제공할 수 있다. 본 발명은, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 생산하는 세균을 소정의 용존 산소 농도로 배양함으로써, β-크립토크산틴의 산생량을 향상시킬 수 있다.

도 1 은 아스타크산틴의 생합성 경로를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 범위는 이들 설명에 한정되지 않고, 이하의 예시 이외에 대해서도, 본 발명의 취지를 저해하지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다.

본 발명은, 카로테노이드의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 생산되는 카로테노이드는 β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함한다. 일 양태에 있어서, 카로테노이드는 β-크립토크산틴이고, 본 발명은 β-크립토크산틴의 생산 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, β-크립토크산틴을 생산하는 세균 (이하, 「본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균」이라고도 한다) 을, 용존 산소 농도 (DO) 0.8 ppm 이하에서 배양하여, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 여기서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 편의상 β-크립토크산틴 생산 세균이라고 칭하지만, β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴을 생산하는 것이 가능하다. 본 발명의 제조 방법에서는, 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하지 않고 배양한 경우와 비교하여 β-크립토크산틴을 고수율, 예를 들어 배양액당 10 mg/L 이상의 β-크립토크산틴을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조 방법은, β-크립토크산틴의 생산량을 증가시키는 방법을 포함한다. 또, 본 발명은, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 생산하는 효모에 있어서도 실시할 수 있다. 당업자라면, 세균에 관한 명세서의 기재를 적절하게 효모에 적용할 수 있다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균으로서 사용되는 세균은, β-카로텐, β-크립토크산틴 또는 제아크산틴을 생산하는 세균이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 파라콕쿠스속에 속하는 세균 (이하, 「파라콕쿠스속 세균」이라고도 한다) 이 사용된다. 파라콕쿠스속 세균은, 예를 들면, 파라콕쿠스·카로티니파시엔스 (Paracoccus carotinifaciens), 파라콕쿠스·마르쿠시 (Paracoccus marcusii), 파라콕쿠스·해운댄시스 (Paracoccus haeundaensis), 파라콕쿠스·제아크산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens) 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직하게 사용되는 파라콕쿠스속 세균은, 파라콕쿠스·카로티니파시엔스이다. 파라콕쿠스속 세균의 구체적인 균주의 예로서, Paracoccus carotinifaciens E-396 주 (FERM BP-4283) 및 파라콕쿠스속 세균 A-581-1 주 (FERM BP-4671) 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 적색을 나타내는 콜로니를 형성하는 이들 균주를 변이시켜, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하도록 한 변이주, 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 변이주가, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균으로서 바람직하게 사용된다. 아스타크산틴을 생산하는 세균에 있어서는, β-크립토크산틴은 생산되지 않거나, 생산되더라도 그 산생량은 매우 적기 때문에, 변이주는, 변이 전의 친주와 비교하여, 이론적으로는 배양시의 용존 산소 농도에 관계없이 β-크립토크산틴을 많이 생산하게 된다.

본 발명의 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이다.

또한, 본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 를 산생하는 것이 불가능한 세균이다.

다른 양태에 있어서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은 예를 들어, 아스타크산틴을 생산하는 세균을 변이시켜, 변이 전의 세균과 비교하여 β-크립토크산틴을 다량으로 생산하도록 한 파라콕쿠스속 세균을 사용할 수 있다. 이와 같은 세균으로서, 예를 들어, 생산되는 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴 산생량이 변이 전의 세균보다 높은 세균을 들 수 있다.

이러한 β-크립토크산틴 생산 세균은 본 발명에 포함된다.

도 1 은 β-카로텐을 출발 물질로 하는, 아스타크산틴의 생합성 경로를 나타내는 도면이다. 도 1 에 나타내는 카로테노이드는, 모두 동일한 수의 탄소-탄소의 이중 결합을 갖는다. β-카로텐의 색은 황색 ∼ 등색, 아스타크산틴은 적색과 같이, 카로테노이드의 색은, crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 에 의해 부가되는 케톤 (C＝O 기) 의 유무에 의존한다. 즉, crtW 효소가 정상적으로 기능함으로써, 카로테노이드의 β-이오논 고리에 케톤이 카로테노이드의 탄소-탄소의 이중 결합에 대해 공액으로 도입되면, 흡수 파장이 장파장측으로 시프트되기 때문에, 카로테노이드의 색은 황색 ∼ 등색에서 적색으로 변화한다 (도 1 의 「케토화」). 기능적인 crtW 효소 (즉 케톤을 부가하는 능력을 갖는 crtW 효소) 를 산생하는 세균에서는, 분자 구조 내에 케톤을 1 개 또는 2 개 갖고, 적색을 나타내는 아도니크산틴, 아도니루빈, 아스타크산틴 등이 합성되기 때문에, 형성되는 콜로니도 적색을 나타낸다. 한편, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균은, 케톤이 부가된 카로테노이드를 생산하지 않는다. 이것은, 황색∼등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균에서는, 기능적인 crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 가 산생되어 있지 않은 것을 의미한다. 즉, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니는, 이론적으로는 분자 구조 내에 케톤을 갖지 않는 카로테노이드 (β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴) 를 생산한다. 따라서, β-크립토크산틴 생산 세균은, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 선발함으로써 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 아스타크산틴을 생산하는 세균을 β-크립토크산틴 생산 세균을 얻을 때의 친주로서 사용할 수 있다. 아스타크산틴을 생산하는 세균에 있어서는, crtW 효소가 정상적으로 기능하기 때문에, β-크립토크산틴은 생산되지 않거나, 생산되더라도 그 산생량은 매우 적다. 즉, 아스타크산틴을 생산하는 세균에 있어서는, 케톤의 부가를 담당하는 crtW 효소가 수산화 효소보다 우위로 기능하여 (또는 crtW 효소의 반응 속도가 수산화 효소의 반응 속도보다 현저하게 빠르기 때문에), 아스타크산틴 생합성 경로의 출발 물질인 β-카로텐이, β-크립토크산틴이 아니라 에키네논으로 변환되는 것으로 생각되고 있다 (도 1 참조). 한편, 실시예에 있어서 취득된 본 발명에 관련된 균주에서는, β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴의 생산이 검출되고, 아스타크산틴의 생산은 검출되지 않았다. 이것은, β-크립토크산틴 생산 세균은, crtW 효소가 기능하지 않거나, 기능하더라도 그 활성은 매우 약한 것을 나타내고 있다. 실제로, 실시예에서 취득된 β-크립토크산틴 생산 세균은, crtW 효소에 변이를 가지고 있었다. 이러한 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균은, β-크립토크산틴 생산 세균에 포함된다.

이와 같이, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, crtW 효소 활성을 갖지 않기 때문에, 아스타크산틴의 생합성 경로의 출발 물질인 β-카로텐은, 수산화되어 β-크립토크산틴이 생산된다 (도 1 참조). 생산된 β-크립토크산틴은, 동일하게 수산화되어 제아크산틴으로 변환될 수 있다. 따라서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴을 생산하는 것이 가능하다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 가 기능하지 않는 (기능적이지 않은) 것, 혹은 β-크립토크산틴 생산 세균이 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없는 것은, crtW 효소의 효소 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 가 기능하지 않는 (기능적이지 않은) 것, 혹은 β-크립토크산틴 생산 세균이 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없는 것은, 케톤이 부가된 카로테노이드, 예를 들어 아스타크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴 등이 생산되지 않거나, 생산되더라도 산생량이 극히 미량인 것을 HPLC 등의 측정에 의해 확인할 수 있다. 또, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 가 기능하지 않는 (기능적이지 않은) 것, 혹은 세균이 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없는 것은, 형성하는 콜로니의 색이, 황색 ∼ 등색을 정색하는 것을 시인함으로써도 확인 가능하다. 또한, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 crtW 효소 (β-카로텐케톨라아제) 가 기능하지 않는 (기능적이지 않은) 것, 혹은 세균이 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없는 것은, 유전자 해석에 의해 세균의 crtW 유전자의 염기 서열 또는 crtW 효소의 아미노산 서열로부터도 확인할 수 있다.

1. β-크립토크산틴 생산 세균의 제조

(1) 돌연 변이

아스타크산틴 생산 세균을 변이 처리하여, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 취득하는 방법을 이하에 예시한다.

본 발명에 있어서, 아스타크산틴 생산 세균을 변이 처리한 변이주를, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균으로 사용할 수 있다. 이와 같은 변이주로는, 예를 들어 WO2011/122616 에 기재된 변이주, 일본 공개특허공보 2005-87097 에 기재된 변이주를 들 수 있다.

변이의 친주로는 아스타크산틴을 생산하는 세균이면 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 파라콕쿠스속 세균이 사용된다. 아스타크산틴을 생산하는 파라콕쿠스속 세균 중에서는, 파라콕쿠스·카로티니파시엔스 (Paracoccus carotinifaciens), 파라콕쿠스·마르쿠시 (Paracoccus marcusii), 파라콕쿠스·해운댄시스 (Paracoccus haeundaensis), 파라콕쿠스·제아크산티니파시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens) 가 바람직하게 사용되고, 특히 파라콕쿠스·카로티니파시엔스가 바람직하게 사용된다. 파라콕쿠스속 세균의 구체적인 균주의 예로서, Paracoccus carotinifaciens E-396 주 (FERM BP-4283) 및 파라콕쿠스속 세균 A-581-1 주 (FERM BP-4671) 를 들 수 있고, 이들 균주를 변이시킨 변이주도 친주로서 바람직하게 사용된다. 변이의 친주로서 이용되는 아스타크산틴 생산 세균으로서, 바람직하게는, 그 16S 리보솜 RNA 에 대응하는 DNA 의 염기 서열이, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열과 실질적으로 동일한 세균을 들 수 있다. 여기서, 서열 번호 7 의 DNA 염기 서열은, E-396 주의 16S 리보솜 RNA 에 대응하는 DNA 의 염기 서열이다.

본 명세서에 있어서, 실질적으로 동일하다는 것은, DNA 의 염기 서열 결정시의 에러 빈도 등을 고려하여, 염기 서열이 90 ％ 이상, 91 ％ 이상, 92 ％ 이상, 93 ％ 이상, 94 ％ 이상, 95 ％ 이상, 96 ％ 이상, 97 ％ 이상, 98 ％ 이상, 99 ％ 이상 또는 100 ％ 동일한 것을 의미한다.

아스타크산틴 생산 세균을 변이 처리하는 방법은, 돌연 변이를 유발하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 및 에틸메탄술포네이트 (EMS) 등의 변이제에 의한 화학적 방법, 자외선 조사 및 X 선 조사 등의 물리적 방법, 유전자 재조합 및 트랜스포존 등에 의한 생물학적 방법 등을 사용할 수 있다. 또는 자연스럽게 일어나는 자발적 돌연 변이여도 된다. 변이 처리는 1 회여도 되고, 또, 예를 들어 이 돌연 변이 처리에 의해 아스타크산틴을 고생산하는 변이체를 얻어, 이것을 추가로 돌연 변이 처리하는 2 회 이상의 변이 처리를 실시해도 된다.

(2) 내인성 crtW 유전자의 변이

일 양태에 있어서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 원래 갖는 내인성의 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되기 때문에, 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없다. 이러한 결실 또는 불활성화는, crtW 유전자의 코드 서열 및 crtW 유전자를 발현시키는 프로모터의 적어도 어느 것을 표적으로 할 수 있다. 예를 들면, crtW 유전자의 결실 또는 불활성화는, 미스센스 변이 (염기 치환에 의한 다른 아미노산으로의 변이), 난센스 변이 (종지 코돈으로의 변이), 프레임 시프트 변이 (유전자 중으로의 염기의 삽입 및/또는 결실), 인프레임 변이 등을 포함하지만, 결과적으로 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없는 결실 또는 불활성화이면 되고, 이것에 한정되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 「crtW 효소」 또는 「β-카로텐케톨라아제」 는, 카로테노이드 말단의 고리 구조 (β-이오논 고리) 에 케톤을 도입하는 반응에 관여하는 효소이다. 세균, 예를 들면 파라콕쿠스속 세균의 내인성의 crtW 유전자 및 crtW 효소는, 당업자에게 공지이며, 당업자는 본 발명에 적절히 이용할 수 있다. 일례로서, 파라콕쿠스·카로티니파시엔스의 crtW 효소의 염기 서열 (crtW 유전자) 및 아미노산 서열을, 서열 번호 1 및 서열 번호 2 에 각각 나타낸다.

추가의 실시양태에서는, crtW 유전자는, 서열 번호 1 에 적어도 80 ％ 동일한, 예를 들면 적어도 85 ％, 90 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 또는 99 ％ 이상 동일한 염기 서열을 가져도 된다. 또, 다른 실시양태에서는, crtW 유전자는, 서열 번호 2 에 적어도 80 ％ 동일한, 예를 들면 적어도 85 ％, 90 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 또는 99 ％ 이상 동일한 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 가져도 된다. 또한, 다른 실시양태에서는, crtW 효소는, 서열 번호 1 에 적어도 80 ％ 동일한, 예를 들면 적어도 85 ％, 90 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 또는 99 ％ 이상 동일한 염기 서열로 코드되는 아미노산 서열을 가져도 된다. 또한, 다른 실시양태에서는, crtW 효소는, 서열 번호 2 에 적어도 80 ％ 동일한, 예를 들면 적어도 85 ％, 90 ％, 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％, 또는 99 ％ 이상 동일한 아미노산 서열을 가져도 된다. 이들 변이형의 crtW 유전자가 코드하는 단백질 또는 crtW 효소는, β-카로텐케톨라아제 활성을 갖는다.

crtW 효소의 기능에 관여하는 아미노산이 알려져 있다. 예를 들어, crtW 효소의 H65 (아미노산 서열의 65 번째의 히스티딘), H69, H103, H106, H107, H184, H218, H219, H221, H222, D117, F130 등의 아미노산은, crtW 효소의 활성에 완전 또는 부분적으로 필요하다고 알려져 있다 (Rick et al., Appl Environ Microbiol. 2006 Sep ; 72(9) : 5829-37). Rick 등은 crtW 효소에 변이를 가한 세균으로, 제아크산틴의 산생 비율이 증가된 것을 보고하고 있다. 따라서, 이들 아미노산을 성질이 상이한 아미노산으로 변이시킨 crtW 효소는 완전히 또는 부분적으로 기능하지 않고, 세균은 β-크립토크산틴을 산생하는 것이 예상된다. 본 발명의 일 양태에 있어서, crtW 유전자의 결실 또는 불활성화는, 이들 아미노산을 알라닌 또는 성질이 상이한 아미노산으로 변이시키는 유전자의 변이를 포함한다. 성질이 상이한 아미노산으로의 변이는, 염기성 아미노산 (히스티딘 등) 으로부터 중성 아미노산 (티로신 등) 또는 산성 아미노산으로의 변이, 산성 아미노산 (아스파라긴산 등) 으로부터 중성 아미노산 또는 염기성 아미노산으로의 변이, 중성 아미노산 (방향족 아미노산인 페닐알라닌) 으로부터 산성 아미노산 또는 염기성 아미노산으로의 변이가 포함된다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명에 있어서의 부분적으로 또는 완전히 결실 또는 불활성화된 crtW 유전자는, 예를 들면 서열 번호 3 또는 5 의 염기 서열 또는 서열 번호 4 또는 6 의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 갖지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명에 있어서의 부분적 또는 완전하게 결실 또는 불활성화된 crtW 효소는, 예를 들면 서열 번호 3 또는 5 의 염기 서열로 코드되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 또는 6 의 아미노산 서열을 갖지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, ZXA-3 주는, 유전자 해석의 결과, ZXA-23 주와 동일한 지점에 변이를 갖는 것이 확인되었다. ZXA-3 주의 crtW 의 염기 서열과 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 6 이다.

[표 1-1]

[표 1-2]

crtW 효소의 활성은, 예를 들면 유전자 시퀀싱을 사용하여 간접적으로 결정할 수 있다. 이와 같이 하여, 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화의 돌연 변이를 용이하게 동정할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능」이라는 용어는, crtW 효소의 활성이 없거나 또는 실질적으로 없는 것을 의미한다. 더욱 상세하게는, 「기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능」이라는 용어는, crtW 효소 활성이 아스타크산틴 생산 세균의 crtW 효소 활성의 20 ％ 미만인 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 crtW 효소 활성은, 야생형 crtW 효소 활성의 20 ％ 미만, 15 ％ 미만, 바람직하게는 10 ％ 미만, 보다 바람직하게는 5 ％ 미만, 보다 더 바람직하게는 1 ％ 미만이다. 전술한 바와 같이, 가장 바람직하게는, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균은, 그 crtW 효소 활성은 검출 불능이거나, 또는 실질적으로 혹은 완전히 상실되어 있다.

「crtW 효소 활성」은, 카로테노이드에 케톤을 부가하는 능력을 의미하고, 예를 들어, β-카로텐을 에키네논으로 변환하는 활성, 에키네논을 칸타크산틴으로 변환하는 활성, β-크립토크산틴을 아스테로이데논으로 변환하는 활성, β-크립토크산틴을 3-하이드록시에키네논으로 변환하는 활성, 3-하이드록시에키네논을 아도니루빈으로 변환하는 활성, 제아크산틴을 아도니크산틴으로 변환하는 활성, 아스트로이데논을 아도니루빈으로 변환하는 활성, 아도니크산틴을 아스타크산틴으로 변환하는 활성이 포함된다.

본 발명에 있어서는, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균은, 분자 생물학적 방법을 사용하는 당해 기술 분야에서 이미 알려진 임의의 수단에 의해 얻거나, 또는 상기의 변이 처리에 의해 얻어지는 변이체의 스크리닝에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 내인성 crtW 유전자 또는 crtW 가 발현되는 프로모터는, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능하도록 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어 있다. 유전자 파괴의 기술은, 당분야에서 이미 알려진 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 내인성 crtW 유전자의 코드 영역을, 완전 또는 부분적으로 제거하거나, 혹은 불활성화하거나, 또는 프로모터 영역을 완전 또는 부분적으로 제거 혹은 돌연 변이 유발에 의해 불활성화할 수 있다. 또는, 내인성 crtW 유전자에 녹인 변이를 실시하고, 그것에 의해 내인성 코드 서열을 파괴해도 된다. 예를 들어, 미성숙 종지 코돈 또는 프레임 시프트 변이를 도입할 수 있다. 기능적인 crtW 효소가 전혀 또는 실질적으로 산생되지 않는 한, crtW 유전자는 미스센스 변이 또는 넌센스 변이를 포함할 수 있다.

상기와 같은 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균도 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균에 포함되고, 당업자는 당분야의 기술 상식에 기초하여 제조할 수 있다.

(3) 상기 (1) 및 (2) 의 기재에 기초하여, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 취득할 수 있다. 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 변이 전의 세균 (예컨대, 친주) 과 비교하여, 이론적으로는 배양시의 용존 산소 농도에 관계없이 β-크립토크산틴을 다량으로 생산하게 된다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 변이 전의 세균보다, 생산되는 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴 산생량이 높은 것이 기대된다. β-크립토크산틴의 산생량은, 대상 세균을 배양하여 얻어진 배양액 중의 카로테노이드량을 분석함으로써 측정할 수 있다.

예를 들어, 생산균의 생육에 필요하고, 카로테노이드를 생성하는 성분을 포함하는 배지에서 배양을 실시한다. 배양 방법은 시험관, 플라스크 등에 있어서의 진탕 배양, 통기 교반 배양 등 어느 방법이어도 된다. 카로테노이드 화합물의 분석 방법은, 카로테노이드 화합물을 분리 검출할 수 있는 방법이면 무엇이든 되지만, 예를 들면, 고속 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 취득은, 예를 들어, 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴의 산생 비율이 높은 변이주를 선발함으로써 실시할 수 있다. 총 카로테노이드량이란, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, β-카로텐, 에키네논, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-하이드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등의 카로테노이드의 총량을 나타낸다. β-크립토크산틴의 비율은, 변이 전의 세균 (예컨대, 친주) 의 β-크립토크산틴의 생산 비율보다 높은 것이 최저한의 조건인데, 예컨대, 생산되는 총 카로테노이드량에 대하여 β-크립토크산틴을 바람직하게는 20 ％(w/w) 이상, 보다 바람직하게는 40 ％(w/w) 이상, 더욱 바람직하게는 60 ％(w/w) 이상의 β-크립토크산틴 비율을 나타내는 변이주를 선발해도 된다. 본 발명에는, 변이 전의 세균으로서 아스타크산틴을 생산하는 세균을 사용할 수 있지만, 일반적으로 아스타크산틴을 생산하는 세균은, β-크립토크산틴을 생산하지 않거나, 생산하더라도 생산량은 극히 소량이다. 예를 들어, 아스타크산틴을 생산하는 파라콕쿠스속에 속하는 세균을 배양하고, 생산된 카로테노이드의 양의 예를 이하에 나타낸다. 세균의 배양 및 카로테노이드의 측정은 실시예에 기재한 방법과 동일한 방법으로 실시하였다.

[표 2]

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, (1) 또는 (2) 의 변이 처리 후에 한천 배지 상에 콜로니를 형성시키고, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써 효율적으로 선택하는 것이 가능하다. β-크립토크산틴을 생산하는 세균은, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하므로, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 선발함으로써, β-크립토크산틴을 생산하는 목적의 세균 (본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균) 을 효율적으로 선택할 수 있다. 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균이 β-크립토크산틴을 생산하는 것은, 선택한 콜로니를 시험관이나 플라스크 등에서 배양하고, β-크립토크산틴을 정량하여, β-크립토크산틴의 생산량을 구함으로써 확인해도 된다. 선발하는 콜로니의 색은, 황색, 등색 또는 황색과 등색 사이의 색으로, 아스타크산틴 등을 생산하는 세균의 콜로니가 나타내는 적색과는 분명히 상이하기 때문에, 이 방법에 의해 목적의 세균을 간편하고 또한 확실하게 선택할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 변이 전의 세균 (예를 들어, 친주) 과 비교하여 내인성의 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능하다. 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어 있는 것은, 세균에 포함되는 crtW 유전자를 해석에 의해 확인할 수 있다. 해석은, 예를 들어, 유전자 서열 결정, RT-PCR 법, 실시간 PCR 해석, 서던 블롯 해석, 노던 블롯 해석 등의 공지된 기술을 사용하여 실시할 수 있다. 또, 기능적인 crtW 효소를 산생할 수 없는 것은, 웨스턴 블롯 해석, 면역 염색 등에 의해 crtW 효소의 발현을 확인하는 것이나, 케토화된 카로테노이드의 산생량의 측정 등의 crtW 효소 활성의 측정에 의해 확인할 수 있다.

2. 본 발명의 제조 방법

본 발명은, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 소정의 용존 산소 농도 하에 배양하여, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 있어서, 배양액 중의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하는 것을 포함하는, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 배양하여 β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법, 혹은, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도의 배양액으로 배양하는 공정을 포함하는, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법이 개시된다. 본 발명의 제조 방법에 있어서 제조되는 카로테노이드는, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴에서 선택되는 1 이상의 카로테노이드이다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명의 제조 방법에 있어서 제조되는 카로테노이드는, β-크립토크산틴이다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 배양 중의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 낮게 조정하면, β-크립토크산틴이 효율적으로 생산되어 배양액당 β-크립토크산틴의 생산량이 높거나, 혹은, 생산되는 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴 농도가 높아진다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, β-크립토크산틴 및 β-카로텐이 효율적으로 생산된다.

β-크립토크산틴을 효율적으로 생산하기 위해서, 배양액 중의 용존 산소 농도를, 0.8 ppm 이하, 바람직하게는 0.7 ppm 이하, 보다 바람직하게는 0.6 ppm 이하, 더욱 바람직하게는 0.5 ppm 이하, 가장 바람직하게는 0.4 ppm 이하로 조정한다. 배양액 중의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 의 조건 하에서 배양함으로써, 배양액당 β-크립토크산틴량을 높일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「％」 및 「ppm」의 값은, 체적비를 의미하고, 「1 ppm」은 「1 mg/L」와 동일한 의미이다. 배양액의 질량은, 동일한 체적을 갖는 물의 질량과 거의 동일하고, 양자가 동일한 경우에 「ppm」의 값은 질량비를 의미하고, 「1 ppm」은 「1 mg/kg」과 동일한 의미이다.

배양액 중의 용존 산소는, 용존 산소 전극에 의해 측정된다. 용존 산소 전극은, 예를 들어, 마루비시 바이오엔지사 제조 (형번 : OX-2500) 를 사용하여 측정할 수 있다. 용존 산소 전극은, 대기 중에 5 분간 방치했을 때의 산소량을 100 ％, 50 g/L 의 아황산나트륨 수용액 중에 5 분간 방치했을 때의 산소량을 0 ％ 로 하여 교정한다. 대기 하의 수중에서는, 용존 산소 농도는 8 ppm 에서 평형 상태가 되기 때문에, 대기 중에 5 분간 방치했을 때의 산소량 100 ％ 는, 수중에 있어서의 용존 산소 농도 8 ppm 으로 환산된다.

용존 산소 농도의 조정은, 통상 배양에서 이용되는 방법으로 제어된다. 예를 들면, 용존 산소 전극에 의해 측정한 배양액 중의 용존 산소 농도에 따라, 배양조 내에 공급하는 공기 혹은 산소의 유량을 자동적으로 조정하는 방법, 용존 산소 전극에 의해 측정한 배양액 중의 용존 산소 농도에 따라 교반 날개의 회전 속도 또는 회전수를 자동적으로 조절하는 방법, 혹은 통기량 및 회전 속도 또는 회전수의 양방을 조정하는 방법을 이용할 수 있다.

본 방법에 있어서 배양에 사용하는 배지 (이하, 「β-크립토크산틴 생산용 배지」라고도 한다) 는, 배양액 중의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하에서 배양했을 때에 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균이 생육되고, β-크립토크산틴을 생산하는 것이면 어느 것이어도 된다. 탄소원, 질소원, 무기염류 및 필요에 따라 비타민류 등을 함유하는 배지가 바람직하게 사용된다.

탄소원으로는, 예를 들면 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 트레할로오스, 만노오스, 만니톨 및 말토오스 등의 당류, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산 및 피루브산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올 및 글리세롤 등의 알코올류, 대두유, 쌀겨유, 올리브유, 옥수수유, 참기름 및 아마인유 등의 유지류 등을 들 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 또는 수크로오스가 사용된다. 또한, 이들 탄소원을, 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여 이용할 수 있다. 배양 전의 배지 (시발 배지) 에 첨가하는 탄소원의 양은, 탄소원의 종류에 따라 상이하고 적절히 조정하면 충분하지만, 통상 배지 1 L 당 1 ∼ 100 g, 바람직하게는 2 ∼ 50 g 이다. 또, 탄소원은 시발 배지에 첨가할 뿐만 아니라, 배양 도중에 축차적 또는 연속적으로 추가 공급하는 것도 바람직하게 실시된다.

본 명세서에 있어서, 수치 범위에 대해 「∼」를 사용한 기재에서는, 특별히 언급이 없는 한, 하한값 및 상한값을 포함하는 것으로 한다. 예를 들어, 「1 ∼ 100」이라는 기재에서는, 하한값인 「1」, 상한값인 「100」모두 포함하는 것으로 한다. 즉, 「1 ∼ 100」은, 「1 이상 100 이하」와 동일한 의미이다.

무기 질소원으로는, 예를 들어 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염류, 질산칼륨 등의 질산염류, 암모니아 및 우레아 등을 들 수 있고, 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 첨가량은, 질소원의 종류에 따라 상이하고 적절히 조정하면 충분하지만, 통상 배지 1 L 에 대하여 0.1 g ∼ 20 g, 바람직하게는 0.2 ∼ 10 g 이다.

유기 질소원으로는, 예를 들면, 콘스티프리카 (여과 처리물을 포함한다), 파마메디아, 콩깻묵, 대두분, 피너츠밀, 글루타민산나트륨, 디스틸러즈솔루블 및 건조 효모 등을 들 수 있고, 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여 이용할 수 있다. 첨가 농도는 질소원의 종류에 따라 상이하고 적절히 조정하면 충분하지만, 통상 배지에 있어서 0 ∼ 80 g/L, 바람직하게는 0 ∼ 30 g/L 이다.

무기 질소원 및 유기 질소원은, 통상 시발 배지에 첨가하지만, 축차적 또는 연속적으로 추가 공급하는 것도 바람직하게 실시된다.

무기염류로는, 예를 들면, 인산 2 수소칼륨, 인산수소 2 칼륨, 인산수소 2 나트륨 등의 인산염류, 황산마그네슘, 염화마그네슘 등의 마그네슘염류, 황산철, 염화철 등의 철염류, 염화칼슘, 탄산칼슘 등의 칼슘염류, 탄산나트륨, 염화나트륨 등의 나트륨염류, 황산망간 등의 망간염류, 염화코발트 등의 코발트염류, 황산구리 등의 구리염류, 황산아연 등의 아연염류, 몰리브덴산나트륨 등의 몰리브덴염류, 황산니켈 등의 니켈염류, 셀렌산나트륨 등의 셀렌염류, 붕산 및 요오드화칼륨 등을 들 수 있고, 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 첨가량은 무기염의 종류에 따라 상이하고 적절히 조정하면 충분하지만, 통상 배지 1 L 에 대하여 0.0001 ∼ 15 g 이다. 인산염류, 마그네슘염류, 칼슘염류, 나트륨염류 및 철염류에서는, 배지에 있어서의 농도는, 0.02 ∼ 15 g/L 가 바람직하고, 망간염류, 코발트염류, 구리염류, 아연염류, 몰리브덴염류, 니켈염류, 셀렌염류, 붕산, 요오드화칼륨 등을 첨가하는 경우에는, 0.1 ∼ 15 mg/L 가 바람직한 농도이다. 무기염류는 통상 시발 배지에 첨가하지만, 축차적 또는 연속적으로 추가 공급해도 된다.

비타민류로는, 예를 들어 시아노코바라민, 리보플라빈, 판토텐산, 피리독신, 티아민, 아스코르브산, 엽산, 니아신, p-아미노벤조산, 이노시톨, 콜린, 비오틴 등을 사용할 수 있다. 첨가 비율은 비타민류의 종류에 따라 상이하고 적절히 조정하면 충분하지만, 통상 배지 1 L 에 대하여 0.001 ∼ 1000 mg 이고, 바람직하게는 0.01 ∼ 100 mg 이다. 비타민류는 통상 시발 배지에 첨가하지만, 축차적 또는 연속적으로 추가 공급해도 된다.

본 발명에 있어서, 배양액의 발포를 억제하기 위해 소포제가 바람직하게 사용된다. 소포제의 종류는 기포의 발생을 억제하거나 또는 발생한 기포를 제거하는 작용이 있고, 또한 생산균에 대한 저해 작용이 적은 것이면 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 알코올계 소포제, 폴리에테르계 소포제, 에스테르계 소포제, 지방산계 소포제, 실리콘계 소포제, 술폰산계 소포제 등을 예시할 수 있다. 소포제의 첨가량은, 소포제의 종류에 따라 상이하고 적절히 조정하면 충분하지만, 통상 배지 1 L 에 대하여 0.01 g ∼ 10 g 이다.

소포제는 통상 살균 전의 시발 배지에 첨가한다. 또한, 소포제를 배양 도중에 연속적 또는 간헐적으로 추가 첨가해도 된다. 배양 도중에 소포제를 첨가하는 방법으로는, 예를 들면 센서로 기포를 감지하여 자동 첨가하는 방법, 프로그램 타이머로 일정 시간마다 첨가하는 방법, 생육 속도에 연동하도록 피드용 탄소원, 질소원 또는 pH 조정제 등과 혼합하여 첨가하는 방법 등을 들 수 있다. 시발 배지에 첨가하는 소포제와 배양 도중에 배양액에 첨가하는 소포제는 동종이어도 되지만, 작용에 맞추어 상이한 종류를 사용할 수도 있다.

본 방법에 있어서, 배양 개시시의 배지의 pH 는 2 ∼ 12, 바람직하게는 6 ∼ 9, 보다 바람직하게는 6.5 ∼ 8.0 으로 조정한다. 배양 중에도 상기 범위의 pH 를 유지하는 것이 바람직하다. pH 를 유지하는 방법으로서, 발효조 내에 설치한 pH 전극으로 배양액의 pH 를 온라인으로 측정하여, 알칼리를 자동 공급하는 방법이 바람직하다. pH 조정제로는, 예를 들어 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 탄산나트륨 수용액, 암모니아수, 암모니아 가스, 황산 수용액 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

본 방법에 있어서, 배지는 살균 처리한 후, 세균의 배양에 사용된다. 살균 처리는, 당업자라면 적절히 실시할 수 있다. 예를 들어, 적절한 용기 중의 배지를 오토클레이브로 가열 멸균하면 된다. 혹은, 멸균 필터에 의해 여과 멸균하면 된다. 혹은, 재킷 가열과 스팀 불어넣음에 의해 멸균하면 된다. 글루코오스 등의 탄소원은 다른 배지 성분과 함께 가열 살균하면 갈변하므로 별도로 살균해도 된다. 비타민류나 미량의 금속류는 주배지와 함께 가열 살균해도 되지만, 실활이나 침전화를 방지하기 위해서 별도로 살균해도 된다.

본 방법에 있어서, β-크립토크산틴 생산 세균은, 상기와 같이 조제된 β-크립토크산틴 생산용 배지에 식균되어, 소정의 조건에서 배양된다. 식균은, 시험관, 플라스크 혹은 발효조 등을 사용한 시드 배양에 의해 균주를 적절히 늘리고, 얻어진 배양액을 β-크립토크산틴 생산용 배지에 첨가함으로써 실시해도 된다 (본 배양).

본배양 전에 시드 배양을 실시해도 되고, 시드 배양은, 당업자에게 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 시드 배양에 사용하는 배지는, β-크립토크산틴 생산 세균이 양호하게 증식하는 배지이면 특별히 한정되지 않는다.

배양은 적절한 배양 용기에 있어서 실시된다. 배양 용기는 배양 용량에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 시험관, 플라스크, 발효조 등을 들 수 있다.

배양 온도는, 예를 들어 15 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 35 ℃, 보다 바람직하게는 25 ℃ ∼ 32 ℃ 이다. 또한, 배양 기간을 통상 1 일 ∼ 20 일, 바람직하게는 1 ∼ 12 일, 보다 바람직하게는 2 ∼ 8 일, 특히 바람직하게는 3 ∼ 7 일로 할 수 있다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은 호기적 조건에서 배양된다. 호기 조건으로는, 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등을 들 수 있다. 본 배양에 있어서는, 전술한 바와 같이, 용존 산소 농도가 조정된다.

본 배양 개시 후부터 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균이 충분히 증식할 때까지, 호기적 조건에서 배양된다 (제 1 배양 공정). 호기적 조건 하에서의 배양 (제 1 배양 공정) 은, β-크립토크산틴 생산용 배지에서의 배양 개시 후 5 ∼ 80 시간, 바람직하게는 10 ∼ 70 시간, 바람직하게는 10 ∼ 60 시간, 보다 바람직하게는 10 ∼ 50 시간, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 40 시간, 보다 바람직하게는 10 ∼ 36 시간 실시한다. 또는 제 1 배양 공정은, 20 ∼ 80 시간, 20 ∼ 60 시간, 20 ∼ 40 시간, 20 ∼ 36 시간 실시해도 된다. 이 때의 용존 산소 농도는 0.8 ppm 이상이며, 예를 들어 1 ppm 이상, 바람직하게는 1.5 ppm 이상, 보다 바람직하게는 2 ppm 이상이다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 제 1 배양 공정은, 측정 파장 610 nm 로 측정한 배양액의 탁도가 제 1 배양 공정의 개시시의 탁도와 비교하여, 적어도 5 이상 증가할 때까지 계속할 수 있다. 제 1 배양 공정의 개시시부터의 탁도의 증가는, 적어도 5 이상, 바람직하게는 10 이상, 보다 바람직하게는 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상 또는 20 이상이다. 예를 들면, 10 ∼ 36 시간 배양하면, 탁도의 상승률이 높고, 그 경우의 탁도의 상승은 약 20 ∼ 400 이다.

또한, 제 1 배양 공정에서는, 상기와 같이 용존 산소 농도는 0.8 ppm 이하로 유지되는 것이 아니라, 용존 산소 농도는 배양 개시부터 서서히 감소하고, 감소 피크를 맞이한 후 상승으로 전환된다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 제 1 배양 공정은, 용존 산소 농도가 가장 낮아질 때까지 계속해도 된다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균이 충분히 증식된 후, 배양액의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하의 조건 하에서 배양함으로써, β-크립토크산틴을 효율적으로 생산할 수 있다 (제 2 배양 공정). 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균이 충분히 증식되기 전에 용존 산소를 0.8 ppm 이하에서 배양하면 세균이 충분히 증식되지 않기 때문에, β-크립토크산틴의 수율 저하로 이어질 수 있다. 따라서, 배양액 중에서 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 증식시킨 후, 0.8 ppm 이하의 용존 산소 배양액으로 배양함으로써 효율적으로 β-크립토크산틴을 생산할 수 있다. 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균은, 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정한 후, 5 ∼ 200 시간, 바람직하게는 10 ∼ 150 시간, 더욱 바람직하게는 10 시간 ∼ 100 시간, 20 ∼ 80 시간, 30 ∼ 60 시간, 40 ∼ 60 시간, 예를 들어 40 시간 배양할 수 있다. 이 동안의 배양 중, 용존 산소 농도는 0.8 ppm 이하로 유지된다.

따라서, 본 발명의 β-크립토크산틴의 제조 방법은,

(i) 증식시킨 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균 또는 측정 파장 610 nm 로 측정한 배양액의 탁도가 제 1 배양 공정의 개시시의 탁도와 비교하여 5 이상 증가한 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균의 배양액에 있어서의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하고,

(ii) 상기 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도 배양액으로 배양하는,

제 2 배양 공정을 포함할 수 있다. 상기 방법에 의해, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드가 제조된다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명의 β-크립토크산틴의 제조 방법은, (a) 배양액 중에서 파라콕쿠스속 세균을 증식시키거나, 또는 배양액을 측정 파장 610 nm 로 측정한 탁도가, 제 1 배양 공정 개시시의 탁도와 비교하여 5 이상 증가할 때까지 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 배양하는 제 1 배양 공정과,

(b) 제 1 배양 공정 종료 후, 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도의 배양액으로 배양하는 제 2 배양 공정

을 포함할 수 있다. 상기 방법에 의해, β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드가 제조된다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 상기에 따라 배양함으로써, β-크립토크산틴을 효율적으로 생산할 수 있다. 최종적으로 얻어지는 배양 종료 후의 배양액 중의 β-크립토크산틴의 생산량은, 배양액당 10 mg/L 이상, 15 mg/L 이상, 20 mg/L 이상일 수 있다. 또한, 최종적으로 얻어지는 배양 종료 후의 배양액 중의 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴의 생산 농도는, 3.5 질량％ 이상, 4 질량％ 이상, 4.5 질량％ 이상일 수 있다.

본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 배양하여 얻어지는 배양액 중의 카로테노이드, 또는 배양액으로부터 채취된 카로테노이드의 정량은, 예를 들어, 고속 액체 크로마토그래피에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 제조 방법은, 배양물로부터 β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 회수하는 공정을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같이 본 발명의 β-크립토크산틴 생산 세균을 배양하여, 얻어지는 배양액은, β-크립토크산틴 또는 β-크립토크산틴을 포함하는 카로테노이드로서 그대로 사용해도 되고, 혹은, 배양액으로부터 예를 들어 배양 상청, 균체 농축물 (균체 농축액), 습균체, 건조 균체, 균체 용해물 등을 조제하여, 이들 조제물을 사용해도 된다. 나아가서는, 이들 배양액 또는 조제물로부터 β-크립토크산틴 등의 카로테노이드를 추출, 정제 등에 의해 채취할 수 있다.

배양 상청은, 배양액을 원심 처리 또는 여과 처리함으로써, 배양액으로부터 균체를 제거하여 조제하면 된다. 균체 농축물 (균체 농축액) 은, 배양액을 원심 분리, 막 여과 농축 또는 데칸테이션함으로써 얻을 수 있다. 습균체는, 배양액을 원심 또는 여과함으로써 얻을 수 있다. 건조 균체는, 배양액, 습균체 또는 균체 농축물 (균체 농축액) 을 일반적인 건조 방법에 의해 건조시킴으로써 얻을 수 있다.

균체 농축물을 얻는 공정에 있어서 배양액의 pH 는 특별히 한정되지 않지만, 카로테노이드가 침강되기 쉽게 하기 위해서, 배양액을 산성으로 해도 된다. 산성 조건은 산성역이면 어느 pH 여도 되지만, 바람직하게는 pH 6.5 이하, 보다 바람직하게는 pH 5.5 이하, 더욱 바람직하게는 pH 5.0 이하이다. 불필요한 성분의 제거 효과를 높이기 위해서, 물로 배양액을 희석시키고 나서 농축하는 것도 바람직하게 실시된다. 또한, 원심 분리, 여과 분리, 데칸테이션과의 조작에 있어서 물을 첨가해도 된다.

원심 분리에 사용하는 원심 분리기는 연속식이어도 되고 배치식이어도 되지만, 바람직하게는 연속식이 사용된다. 원심 분리기의 타입으로는, 예를 들면 바구니형, 다실형, 데칸타형, 디스크형 (노즐형, 디슬러지형), 튜블러형, 로터형의 원심 분리기를 들 수 있다.

여과 분리에 사용되는 막 여과 장치는 스태틱형이어도 되고 크로스 플로우형이어도 되지만, 로딩을 방지하기 쉬운 크로스 플로우형이 바람직하다. 막의 재질은, 예를 들어 여과지, 여과포, 화학 섬유, 세라믹 등을 예시할 수 있다.

건조의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 분무 건조, 유동 건조, 분무 유동 조립 건조, 드럼 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 건조 후에 미분말화하기 위해서, 건조 균체를 분쇄하는 것도 바람직하게 실시된다. 분쇄의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 비터 밀, 해머 밀, 볼 밀, 비즈 밀 등을 들 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 β-크립토크산틴 등의 카로테노이드 또는 β-크립토크산틴을 포함하는 카로테노이드 함유 건조 균체 조성물 등의 조제물을 그대로, 예를 들어, 사료용 또는 식품용의 첨가물로서 사용할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, β-크립토크산틴 등의 카로테노이드 또는 카로테노이드를 상기 배양액 또는 조제물로부터 채취하는 방법은, 특별히 한정되지 않고, 카로테노이드가 안정적으로 효율적으로 회수되는 어느 방법이어도 된다. 이들 방법은, 당업자라면 공지된 추출이나 정제 기술로부터 적절히 선택하여 실시할 수 있다.

얻어진 추출물, 조제물, 정제물 등은, β-크립토크산틴 등의 카로테노이드 또는 카로테노이드로서 각각 단독으로 사용할 수 있고, 혹은 이들을 임의의 비율로 혼합하여 사용할 수도 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

1. 균주의 제조

Paracoccus carotinifaciens E-396 주 (FERM BP-4283) 를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 변이 처리하고, 적색이 진한 콜로니를 선택하였다. 선택한 균주를 시험관에서 배양하고, 카로테노이드 농도를 측정하여, 아스타크산틴 생산능이 높은 변이주 LP-26 주를 선택하였다. 다음에 LP-26 주를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 변이 처리하고, 황색 ∼ 등색의 콜로니를 선택하여, BC-60, BC-65, BCA-26, ZXA-3, ZXA-23 주를 얻었다. LP-26 주의 1 회의 변이 처리당, 원하는 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 적어도 1 개 취득할 수 있었다.

용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하지 않고 배양한 경우, 취득한 5 개의 균주는 모두 β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴을 산생하였다 (「3」). 또한, 동일하게 취득한 185 주에 대해서도, 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하지 않고, 5 L 용량의 배양조 (12 주) 또는 시험관 레벨 (185 주) 로 배양을 실시한 결과, β-크립토크산틴, β-카로텐 및 제아크산틴을 산생하는 것이 확인되었다.

[표 3]

2. 균주의 배양

상기 「1」에서 얻어진 균주를, 다음과 같이 배양하였다.

(시드 배양)

시드 배양에 사용한 배지의 조성은 다음과 같다 : 수크로오스 30 g/L, 콘스티프리커 15 g/L, 인산 2 수소칼륨 0.54 g/L, 인산수소 2 칼륨 2.8 g/L, 염화칼슘 2 수화물 0.3 g/L, 황산마그네슘 7 수화물 14.3 g/L, 황산철 7 수화물 0.3 g/L, 소포제 0.1 g/L, pH 7.2.

상기 조성의 배지 2 L 를 5 L 용량의 배양조 (자 퍼멘터) 에 넣고, 121 ℃, 30 분 증기 살균하여, 시드 배지를 제조하였다. 시드 배지에 「1.」에서 얻어진 균주를 식균하고, 28 ℃ 에서 30 시간, 400 rpm 으로 교반하여 배양을 실시하였다. 이때의 용존 산소 농도는 4.8 ppm 이었다. 시드 배양에 있어서, 탁도는 20 증가하였다.

(본 배양)

다음으로, 시드 배양을 거친 배양액 216 ml 분을 색소 생산용 배지가 1.8 L 들어간 5 L 용량의 통기 교반 배양조 (자 퍼멘터) 에 식균하였다. 28 ℃ 에서 배양을 실시하였다. 본 배양 개시로부터 10 ∼ 36 시간 (제 1 배양 공정) 경과후, 배양액 중의 용존 산소가 0.8 ppm 이하가 되도록 용존 산소 농도를 컨트롤하고, 0.8 ppm 이하의 상태를 40 ∼ 60 시간 유지하였다 (제 2 배양 공정). 제 1 배양 공정의 개시시부터 제 1 배양 공정의 종료시의 탁도 (측정 파장 610 nm) 의 증가는 20 ∼ 400 이었다. 용존 산소 농도는, 용존 산소 전극과 교반 날개의 모터를 연동시켜, 용존 산소 농도값에 따라 교반 날개의 회전 속도를 자동적으로 조절함으로써 조정하였다. 또한, 교반 날개의 최저 회전 속도는 455 rpm 으로 설정하였다. 배양 중의 pH 는, 14 ％ 암모니아수를 연속적으로 적하함으로써 7.0 ∼ 7.4 로 제어하였다. 글루코오스는 생육과 함께 소비되기 때문에, 배양액 중의 글루코오스 농도가 5 ∼ 30 g/L 로 유지되도록 첨가하였다. β-크립토크산틴량의 측정용으로, 0.8 ppm 이하의 상태를 40 ∼ 60 시간 유지한 배양액의 일부를 채취하였다.

색소 생산용 배지의 조성을 이하에 나타낸다 : 글루코오스 40 g/L, 인산 2 수소칼륨 2.3 g/L, 인산수소 2 칼륨 5.7 g/L, 황산암모늄 2.3 g/L, L-글루타민산나트륨 1 수화물 6 g/L, 염화칼슘 2 수화물 1.0 g/L, 염화나트륨 3 g/L, 황산마그네슘 7 수화물 4.5 g/L, 황산철 7 수화물 1.0 g/L, 황산망간 5 수화물 0.1 mg/L, 붕산 5 mg/L, 황산아연 7 수화물 1.4 mg/L, 몰리브덴산나트륨 2 수화물 2.3 mg/L, 황산구리 5 수화물 0.63 mg/L, 요오드화칼륨 1.0 mg/L, 염화코발트 6 수화물 0.10 mg/L, 텅스텐산나트륨 1 mg/L, 황산니켈 6 수화물 1 mg/L, 셀렌산나트륨 0.1 mg/L, 염화알루미늄 (III) 6 수화물 0.1 mg/L, 염화크롬 (III) 6 수화물 0.1 mg/L, myo-이노시톨 50 mg/L, 아스코르브산 30 mg/L, 피리독신염산염 20 mg/L, 판토텐산칼슘 15 mg/L, 리보플라빈 10 mg/L, p-아미노벤조산 10 mg/L, 콜린 10 mg/L, 시아노코바라민 5 mg/L, 티아민염산 30 mg/L, 엽산 1 mg/L, 니아신 15 mg/L, 비오틴 0.050 mg/L, 폴리에테르계 소포제 0.5 g/L.

[측정 방법]

용존 산소의 측정은, 이하의 장치를 사용하였다.

DO 측정 장치 : 마루비시 바이오엔지사 제조, 형번 OX-2500

배양액의 탁도는 다음과 같이 측정하였다. 배양액의 탁도는, 범용 분광 광도계에 의해 측정된다. 탁도는, 예를 들어, 엘마 판매 회사 제조 (형번 : AE-450) 를 사용하여 측정할 수 있다. 탁도는, 광로 길이 1 cm 의 석영 큐벳트를 이용하고, 측정 파장을 610 nm 로 설정하여, 그 흡광도로부터 산출한다. 물의 측정값을 0 으로 하여 교정한다. 흡광도는 0-1 사이의 값을 취하지만, 값이 1 에 지나치게 가까우면 정확하게 측정할 수 없을 가능성이 있기 때문에, 0.7 이하의 측정값이 되도록 필요에 따라 배양액을 물로 희석시키고 나서 측정한다. 희석한 배양액의 탁도는, 측정으로 얻은 흡광도에 희석 배율을 곱하여 보정함으로써 산출된다.

3. β-크립토크산틴의 측정

β-크립토크산틴, 제아크산틴 및 β-카로텐량은 HPLC (Waters 사 제조, alliance (세퍼레이션 모듈 e2695, 디텍터 2489)) 를 이용하여 측정하였다.

칼럼은 Inertsil SIL-100A, 5 ㎛ (φ4.6 mm × 250 mm) (지엘 사이언스 제조) 를 2 개 연결하여 사용하였다. 용출은, 이동상인 n-헥산 : 테트라하이드로푸란 : 메탄올 혼합액 (20 : 40 : 1) 을 사용하고, 실온 부근 일정한 온도에서 매분 1.0 mL 의 유속으로 실시하였다.

상기 「2.」에서 채취한 배양액을 n-헥산 : 테트라하이드로푸란 : 메탄올 혼합액 (40 : 20 : 1) 으로 용해하고, 얻어진 샘플을 이동상으로 10 배 희석한 액 20 μL 를 컬럼에 주입하였다. 칼럼 용리액의 검출은 파장 455 nm 였다. 또, 정량을 위한 표준품으로는, EXTRASYNTHESE S.A. 제조 β-크립토크산틴 (Cat. No.0317S), 제아크산틴 (Cat. No.0307S) 및 후지 필름 와코 순약사 제조 β-카로텐 (Cat. No.031-05531) 을 사용하였다.

결과를 이하에 나타낸다.

[표 4]

상기 「1.」에서 취득한 5 개의 균주 (BC-60, BC-65, BCA-26, ZXA-3, ZXA-23 주) 모두에서 β-크립토크산틴, β-카로텐 및 β-크립토크산틴을 생산하였다. 표 4 의 결과로부터, 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도로 β-카로테노이드 생산 세균을 배양함으로써, β-카로테노이드의 산생량이 향상되는 것이 나타났다. 특히, 배양액당 β-크립토크산틴량이나 총 카로테노이드량에 대한 β-크립토크산틴 농도는, 용존 산소 농도를 0.8 ppm 초과로 배양한 경우 (비교예) 와 비교하여 현저하게 향상되었다.

또, 측정된 카로테노이드는, 모두 β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴이고, 아도니크산틴이나 아스타크산틴의 생산은 검출되지 않았다.

4. 균의 유전자 해석

(1) BC-60 주 및 BC-65 주의 유전자 해석

BC-60 주 및 BC-65 주의 유전자를 해석하였다. 그 결과, CrtW 유전자에 변이를 갖는 것이 분명해졌다.

[표 5]

BC-60 및 BC-65 는, 모두 CrtW 유전자 상의 트립토판을 코드하는 코돈 (ugg) 이 스톱 코돈 (uga : 표 5 에서는 「TGA」로서 기재되고, A 가 굵은 글씨로 표기되어 있다) 으로 변이되고 있었다. 즉, crtW 유전자는, 스톱 코돈 (트립토판→스톱) 을 갖기 때문에 단백 합성이 중간에 멈추고, crtW 효소는 정상적으로 기능하지 못하고 있음을 알 수 있다.

(2) ZXA-23 주의 유전자 해석

ZXA-23 의 유전자를 분석하였다. 그 결과, CrtW 유전자에 변이를 갖고, CrtW 효소 아미노산 서열의 65 번째의 히스티딘을 코드하는 코돈 (cau) 으로부터 티로신을 코드하는 코돈 (uau : 표 6 에서는 「TAT」로서 기재되고, 최초의 T 가 굵은 글씨로 표기되어 있다) 으로 변이되고 있는 것이 분명해졌다.

[표 6]

(3) ZXA-3 주의 유전자 해석

ZXA-3 의 유전자를 해석하였다. 그 결과, CrtW 유전자에 변이를 갖고, CrtW 효소 아미노산 서열의 65 번째의 히스티딘을 코드하는 코돈 (cau) 으로부터 티로신을 코드하는 코돈 (uau : 표 6 에서는 「TAT」로서 기재되고, 최초의 T 가 굵은 글씨로 표기되어 있다) 으로 변이되고 있는 것이 분명해졌다 (서열 번호 5 및 서열 번호 6). ZXA-3 주에 있어서의 변이는, ZXA-23 주에 있어서의 변이와 동일하였다.

CrtW 효소 아미노산 서열의 65 번째 히스티딘은, CrtW 효소 활성에 중요한 것이 나타나 있다 (Rick et al., Appl Environ Microbiol. 2006 Sep ; 72(9) : 5829-37). 변이된 CrtW 효소에서는, 정전하를 갖는 염기성 아미노산인 히스티딘이, 전하를 갖지 않는 중성 아미노산인 티로신으로 변이되어 있어, 효소 활성이 현저하게 저해되는 것이 추찰된다.

이상의 결과로부터, 이들 변이주는, 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되고, 그것에 의해 기능적인 crtW 효소 (β 카로텐케톨라아제) 를 산생하는 것이 불가능하다는 것이 뒷받침된다.

또, 세균에 있어서 crtW 효소가 기능하고 있는 경우에는, crtW 효소에 의한 변환에 의해, β 카로텐이나 제아크산틴이 아도니크산틴으로 변화하기 때문에, 아도니크산틴이 생산된다. 세균이 생산하는 아도니크산틴은 HPLC 에 의해 검출된다. 한편, 본원발명에 관련된 균주에 대해서는, 모두 HPLC 에 의해 아도니크산틴은 검출되지 않았다. 따라서, 본원발명에 관련된 균주는, 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 β 카로텐케톨라아제를 생산하는 것이 불가능하다고 할 수 있다.

산업상 이용가능성

SEQUENCE LISTING <110> ENEOS Corporation <120> Microorganisms producing carotenoids <130> G2784WO <150> JP2021-067540 <151> 2021-04-13 <150> JP2021-160741 <151> 2021-09-30 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 729 <212> DNA <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 1 atgagcgcac atgccctgcc caaggcagat ctgaccgcca ccagtttgat cgtctcgggc 60 ggcatcatcg ccgcgtggct ggccctgcat gtgcatgcgc tgtggtttct ggacgcggcg 120 gcgcatccca tcctggcggt cgcgaatttc ctggggctga cctggctgtc ggtcggtctg 180 ttcatcatcg cgcatgacgc gatgcatggg tcggtcgtgc cggggcgccc gcgcgccaat 240 gcggcgatgg gccagcttgt cctgtggctg tatgccggat tttcctggcg caagatgatc 300 gtcaagcaca tggcccatca tcgccatgcc ggaaccgacg acgacccaga tttcgaccat 360 ggcggcccgg tccgctggta cgcccgcttc atcggcacct atttcggctg gcgcgagggg 420 ctgctgctgc ccgtcatcgt gacggtctat gcgctgatgt tgggggatcg ctggatgtac 480 gtggtcttct ggccgttgcc gtcgatcctg gcgtcgatcc agctgttcgt gttcggcact 540 tggctgccgc accgccccgg ccacgacgcg ttcccggacc gccacaatgc gcggtcgtcg 600 cggatcagcg accccgtgtc gctgctgacc tgctttcact ttggcggtta tcatcacgaa 660 caccacctgc acccgacggt gccttggtgg cgcctgccca gcacccgcac caagggggac 720 accgcatga 729 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 2 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Val Ala 35 40 45 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala 50 55 60 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Met Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe 165 170 175 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp 225 230 235 240 Thr Ala <210> 3 <211> 729 <212> DNA <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 3 atgagcgcac atgccctgcc caaggcagat ctgaccgcca ccagtttgat cgtctcgggc 60 ggcatcatcg ccgcgtggct ggccctgcat gtgcatgcgc tgtggtttct ggacgcggcg 120 gcgcatccca tcctggcggt cgcgaatttc ctggggctga cctggctgtc ggtcggtctg 180 ttcatcatcg cgcatgacgc gatgcatggg tcggtcgtgc cggggcgccc gcgcgccaat 240 gcggcgatgg gccagcttgt cctgtggctg tatgccggat tttcctggcg caagatgatc 300 gtcaagcaca tggcccatca tcgccatgcc ggaaccgacg acgacccaga tttcgaccat 360 ggcggcccgg tccgctggta cgcccgcttc atcggcacct atttcggctg gcgcgagggg 420 ctgctgctgc ccgtcatcgt gacggtctat gcgctgatgt tgggggatcg ctggatgtac 480 gtggtcttct ggccgttgcc gtcgatcctg gcgtcgatcc agctgttcgt gttcggcact 540 tggctgccgc accgccccgg ccacgacgcg ttcccggacc gccacaatgc gcggtcgtcg 600 cggatcagcg accccgtgtc gctgctgacc tgctttcact ttggcggtta tcatcacgaa 660 caccacctgc acccgacggt gccttggtga cgcctgccca gcacccgcac caagggggac 720 accgcatga 729 <210> 4 <211> 229 <212> PRT <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 4 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Val Ala 35 40 45 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala 50 55 60 His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 125 Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro 130 135 140 Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Met Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr 145 150 155 160 Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe 165 170 175 Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro 180 185 190 Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu 195 200 205 Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His 210 215 220 Pro Thr Val Pro Trp 225 <210> 5 <211> 729 <212> DNA <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 5 atgagcgcac atgccctgcc caaggcagat ctgaccgcca ccagtttgat cgtctcgggc 60 ggcatcatcg ccgcgtggct ggccctgcat gtgcatgcgc tgtggtttct ggacgcggcg 120 gcgcatccca tcctggcggt cgcgaatttc ctggggctga cctggctgtc ggtcggtctg 180 ttcatcatcg cgtatgacgc gatgcatggg tcggtcgtgc cggggcgccc gcgcgccaat 240 gcggcgatgg gccagcttgt cctgtggctg tatgccggat tttcctggcg caagatgatc 300 gtcaagcaca tggcccatca tcgccatgcc ggaaccgacg acgacccaga tttcgaccat 360 ggcggcccgg tccgctggta cgcccgcttc atcggcacct atttcggctg gcgcgagggg 420 ctgctgctgc ccgtcatcgt gacggtctat gcgctgatgt tgggggatcg ctggatgtac 480 gtggtcttct ggccgttgcc gtcgatcctg gcgtcgatcc agctgttcgt gttcggcact 540 tggctgccgc accgccccgg ccacgacgcg ttcccggacc gccacaatgc gcggtcgtcg 600 cggatcagcg accccgtgtc gctgctgacc tgctttcact ttggcggtta tcatcacgaa 660 caccacctgc acccgacggt gccttggtgg cgcctgccca gcacccgcac caagggggac 720 accgcatga 729 <210> 6 <211> 242 <212> PRT <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 6 Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu 1 5 10 15 Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His 20 25 30 Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Val Ala 35 40 45 Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala 50 55 60 Tyr Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn 65 70 75 80 Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp 85 90 95 Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr 100 105 110 Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala 115 120 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Claims

파라콕쿠스속 세균을 배양하여 β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법으로서,
용존 산소 전극에 의해 측정한 배양액 중의 용존 산소 농도를 0.8 ppm 이하로 조정하는 것을 포함하고,
상기 파라콕쿠스속 세균이, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이거나 ; 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균인, 상기 방법.
β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법으로서,
파라콕쿠스속 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도의 배양액으로 배양하는 공정을 포함하고,
당해 배양액의 용존 산소 농도가, 용존 산소 전극에 의해 측정되는 것이며,
상기 파라콕쿠스속 세균이, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이거나 ; 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균인, 상기 방법.
β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드를 제조하는 방법으로서,
(a) 배양액 중에서 파라콕쿠스속 세균을 증식시키거나, 또는 배양액을 측정 파장 610 nm 로 측정한 탁도가, 제 1 배양 공정 개시시의 탁도와 비교하여 5 이상 증가할 때까지 파라콕쿠스속 세균을 배양하는 제 1 배양 공정과,
(b) 제 1 배양 공정 종료 후, 상기 파라콕쿠스속 세균을 0.8 ppm 이하의 용존 산소 농도의 배양액으로 배양하는 제 2 배양 공정을 포함하고,
당해 배양액의 용존 산소 농도가, 용존 산소 전극에 의해 측정되는 것이며,
상기 파라콕쿠스속 세균이, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이거나 ; 또는 내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한 세균인, 상기 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 제 2 배양 공정의 배양 시간이 10 시간 이상 100 시간 이하인, 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 제 1 배양 공정의 배양 시간이 10 시간 이상 70 시간 이하인, 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 형성하는 세균이, 적색을 나타내는 콜로니를 형성하는 파라콕쿠스속 세균을 변이 처리하고, 황색 ∼ 등색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써 취득되는 것인, 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 내인성 crtW 유전자가, 서열 번호 1 로 나타내는 염기 서열에 적어도 90 ％ 동일한 염기 서열을 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 crtW 효소가, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열에 적어도 90 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
β-카로텐, β-크립토크산틴 및 제아크산틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 카로테노이드가, β-크립토크산틴인, 방법.
내인성 crtW 유전자가 부분적 또는 완전히 결실 또는 불활성화되어, 기능적인 crtW 효소를 산생하는 것이 불가능한, 파라콕쿠스속 세균.