WO2022220014A1 - カロテノイドを生産する微生物 - Google Patents

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WO2022220014A1
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cryptoxanthin
crtw
bacterium
culture
producing
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大知 桑原
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Ｅｎｅｏｓ株式会社
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    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Definitions

  • the present invention relates to a bacterium that produces at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -cryptoxanthin, ⁇ -carotene and zeaxanthin, or a method for producing the carotenoid.
  • the present invention also relates to a ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium or a method for producing ⁇ -cryptoxanthin.
  • Carotenoids are natural pigments that are useful as feed additives, food additives, and pharmaceuticals.
  • Carotenoids include, for example, zeaxanthin, ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin, astaxanthin, canthaxanthin, lycopene, phenoxanthin, adonixanthin, echinenone, asteroidenone and 3-hydroxyechinenone.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • ⁇ -Cryptoxanthin is also known to be used as a health food material and feed compounding agent.
  • carotenoids such as zeaxanthin and ⁇ -cryptoxanthin are added to poultry feed such as chickens, and when the feed is fed to poultry, they accumulate in egg yolks. Since these carotenoids have effective physiological actions, egg yolks in which these carotenoids are accumulated are useful as functional eggs.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing carotenoids such as zeaxanthin using Paracoccus bacteria. This production method produces not only zeaxanthin but also ⁇ -cryptoxanthin, but the amount of ⁇ -cryptoxanthin produced per culture medium or relative to the total amount of carotenoids is not sufficient.
  • Patent Document 2 also discloses a method for producing zeaxanthin using Paracoccus bacteria. The production amount of ⁇ -cryptoxanthin obtained by the method of Patent Document 2 is also not sufficient.
  • the present inventors have conducted intensive research and found a method for producing at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin, wherein the production efficiency of ⁇ -cryptoxanthin is improved. found a way. That is, the present invention is as follows.
  • a method for producing at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin by culturing Paracoccus bacteria comprising: Including adjusting the dissolved oxygen concentration in the culture medium measured by the dissolved oxygen electrode to 0.8 ppm or less, said Paracoccus bacterium is a bacterium that forms colonies exhibiting a yellow to orange color; or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated and is incapable of producing a functional crtW enzyme.
  • the above method which is a bacterium.
  • a method for producing ⁇ -cryptoxanthin by culturing Paracoccus bacteria comprising: Including adjusting the dissolved oxygen concentration in the culture medium measured by the dissolved oxygen electrode to 0.8 ppm or less, said Paracoccus bacterium is a bacterium that forms colonies exhibiting a yellow to orange color; or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated and is incapable of producing a functional crtW enzyme.
  • the above method which is a bacterium.
  • a method for producing at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin A step of culturing Paracoccus bacteria in a culture solution having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less, The dissolved oxygen concentration of the culture solution is measured by a dissolved oxygen electrode, said Paracoccus bacterium is a bacterium that forms colonies exhibiting a yellow to orange color, such as yellow; or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated to produce a functional crtW enzyme.
  • a method for producing ⁇ -cryptoxanthin comprising: A step of culturing Paracoccus bacteria in a culture solution having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less, The dissolved oxygen concentration of the culture solution is measured by a dissolved oxygen electrode, said Paracoccus bacterium is a bacterium that forms colonies exhibiting a yellow to orange color, such as yellow; or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated to produce a functional crtW enzyme.
  • a method for producing at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin, (a) Proliferate Paracoccus bacteria in the culture solution, or until the turbidity of the culture solution measured at a measurement wavelength of 610 nm increases by 5 or more compared to the turbidity at the start of the first culture step.
  • a first culturing step of culturing (b) after the first culturing step, including a second culturing step of culturing the Paracoccus bacterium in a culture solution having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less,
  • the dissolved oxygen concentration of the culture solution is measured by a dissolved oxygen electrode, said Paracoccus bacterium is a bacterium that forms colonies exhibiting a yellow to orange color; or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated and is incapable of producing a functional crtW enzyme.
  • the above method which is a bacterium.
  • [3]' A method for producing ⁇ -cryptoxanthin, comprising: (a) Proliferate Paracoccus bacteria in the culture solution, or until the turbidity of the culture solution measured at a measurement wavelength of 610 nm increases by 5 or more compared to the turbidity at the start of the first culture step.
  • a first culturing step of culturing (b) after the first culturing step, including a second culturing step of culturing the Paracoccus bacterium in a culture solution having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less,
  • the dissolved oxygen concentration of the culture solution is measured by a dissolved oxygen electrode, said Paracoccus bacterium is a bacterium that forms colonies exhibiting a yellow to orange color; or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated and is incapable of producing a functional crtW enzyme.
  • the above method which is a bacterium.
  • the present invention can provide a bacterium that produces at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin.
  • the present invention increases the amount of ⁇ -cryptoxanthin produced by culturing bacteria that produce at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin at a predetermined dissolved oxygen concentration. can be improved.
  • FIG. 1 shows the biosynthetic pathway of astaxanthin.
  • the present invention relates to a method for producing carotenoids.
  • Carotenoids produced by the method of the present invention include at least one selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin.
  • the carotenoid is ⁇ -cryptoxanthin
  • the present invention relates to methods of producing ⁇ -cryptoxanthin. That is, the present invention involves culturing a bacterium that produces ⁇ -cryptoxanthin (hereinafter also referred to as "the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention") at a dissolved oxygen concentration (DO) of 0.8 ppm or less, and producing ⁇ -carotene.
  • DO dissolved oxygen concentration
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention which is referred to as ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium for convenience, is capable of producing ⁇ -cryptoxanthin, ⁇ -carotene and zeaxanthin.
  • the yield of ⁇ -cryptoxanthin is high compared to the case of culturing without adjusting the dissolved oxygen concentration to 0.8 ppm or less, for example, ⁇ -cryptoxanthin of 10 mg / L or more per culture solution Can produce xanthine.
  • the production method of the present invention includes a method for increasing the production of ⁇ -cryptoxanthin.
  • the present invention can also be practiced in yeast that produces at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin.
  • a person skilled in the art can apply the description of the specification regarding bacteria to yeast as appropriate.
  • the bacterium used as the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is not particularly limited as long as it produces ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin or zeaxanthin.
  • genus bacteria genus bacteria
  • Paracoccus bacteria include, for example, Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii, Paracoccus haeundaensis, and Paracoccus zeaxanthinifaciens.
  • the Paracoccus bacterium preferably used in the present invention is Paracoccus carotinifaciens.
  • Paracoccus bacteria include Paracoccus carotinifaciens E-396 strain (FERM BP-4283) and Paracoccus bacteria A-581-1 strain (FERM BP-4671).
  • these strains that form red colonies are mutated to form yellow to orange colonies, or the endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated.
  • Mutant strains that have been modified and are unable to produce a functional crtW enzyme are preferably used as the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria of the present invention.
  • ⁇ -cryptoxanthin is not produced, or even if it is produced, the amount of ⁇ -cryptoxanthin produced is very small. A large amount of ⁇ -cryptoxanthin is produced regardless of the dissolved oxygen concentration at that time.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is a bacterium that forms yellow to orange colonies.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention has the endogenous crtW gene partially or completely deleted or inactivated and has a functional crtW enzyme ( ⁇ -carotene It is a bacterium incapable of producing tolases.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is, for example, a bacterium of the genus Paracoccus that has been mutated from an astaxanthin-producing bacterium so as to produce a larger amount of ⁇ -cryptoxanthin than the bacterium before the mutation.
  • a bacterium of the genus Paracoccus that has been mutated from an astaxanthin-producing bacterium so as to produce a larger amount of ⁇ -cryptoxanthin than the bacterium before the mutation.
  • examples of such bacteria include bacteria that produce a higher amount of ⁇ -cryptoxanthin relative to the total amount of carotenoids produced than the bacterium before mutation.
  • Such ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria are included in the present invention.
  • Fig. 1 is a diagram showing the biosynthetic pathway of astaxanthin using ⁇ -carotene as a starting material.
  • the carotenoids shown in FIG. 1 all have the same number of carbon-carbon double bonds.
  • ⁇ -carotene ketolase ⁇ -carotene ketolase
  • the color of the carotenoids changes from yellow-orange to red (“ketolation” in FIG. 1).
  • Bacteria that produce a functional crtW enzyme i.e., a crtW enzyme that has the ability to add ketones
  • the formed colonies also have a red color.
  • bacteria that form colonies exhibiting a yellow-orange color do not produce ketone-tagged carotenoids. This means that bacteria forming colonies exhibiting a yellow-orange color do not produce a functional crtW enzyme ( ⁇ -carotene ketolase).
  • an astaxanthin-producing bacterium can be used as a parent strain when obtaining a ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium. Since the crtW enzyme functions normally in astaxanthin-producing bacteria, ⁇ -cryptoxanthin is not produced or, if it is produced, its production amount is very small. That is, in bacteria that produce astaxanthin, the crtW enzyme responsible for adding ketones functions more favorably than the hydroxylase (or because the reaction rate of the crtW enzyme is significantly faster than the reaction rate of the hydroxylase), resulting in astaxanthin production.
  • ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention does not have crtW enzymatic activity, ⁇ -carotene, which is the starting material in the astaxanthin biosynthetic pathway, is hydroxylated to produce ⁇ -cryptoxanthin. (See FIG. 1).
  • the ⁇ -cryptoxanthin produced can likewise be hydroxylated and converted to zeaxanthin. Therefore, the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention can produce ⁇ -cryptoxanthin, ⁇ -carotene and zeaxanthin.
  • the crtW enzyme ( ⁇ -carotene ketolase) of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention does not function (non-functional), or the inability of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium to produce a functional crtW enzyme is determined by the fact that the crtW enzyme can be confirmed by measuring the enzymatic activity of
  • the crtW enzyme ( ⁇ -carotene ketolase) of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention does not function (non-functional), or the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium cannot produce a functional crtW enzyme, It can be confirmed by measurement by HPLC or the like that ketone-added carotenoids such as astaxanthin, adonirubin, adonixanthin, etc.
  • the crtW enzyme ( ⁇ -carotene ketolase) of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention does not function (non-functional), or that the bacterium is unable to produce a functional crtW enzyme, is the color of the formed colony. However, it can also be confirmed by visually observing that it develops a yellow to orange color. Furthermore, it was confirmed by genetic analysis that the crtW enzyme ( ⁇ -carotene ketolase) of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention does not function (non-functional) or that the bacterium cannot produce a functional crtW enzyme. It can also be confirmed from the nucleotide sequence of the crtW gene or the amino acid sequence of the crtW enzyme.
  • Mutation of ⁇ -Cryptoxanthin-Producing Bacteria A method of mutating an astaxanthin-producing bacterium to obtain the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is exemplified below.
  • a mutant strain obtained by mutagenizing an astaxanthin-producing bacterium can be used as the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention.
  • Such mutants include, for example, the mutants described in WO2011/122616 and the mutants described in JP-A-2005-87097.
  • the parent strain for the mutation may be any bacterium that produces astaxanthin, but preferably a bacterium of the genus Paracoccus is used.
  • Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii, Paracoccus haeundaensis, and Paracoccus zeaxanthinifaciens are among the paracoccus bacteria that produce astaxanthin. It is preferably used, and Paracoccus carotinifaciens is particularly preferably used.
  • Examples of specific strains of Paracoccus bacteria include Paracoccus carotinifaciens E-396 strain (FERM BP-4283) and Paracoccus bacteria A-581-1 strain (FERM BP-4671), and these strains are mutated.
  • Mutant strains are also preferably used as parent strains.
  • the astaxanthin-producing bacterium used as the mutation parent strain preferably includes a bacterium in which the base sequence of the DNA corresponding to the 16S ribosomal RNA is substantially the same as the base sequence shown in SEQ ID NO:7.
  • the DNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 is the DNA nucleotide sequence corresponding to the 16S ribosomal RNA of strain E-396.
  • substantially identical means that the nucleotide sequence is 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, taking into account the error frequency in determining the DNA base sequence. % or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% identical.
  • the method of mutating astaxanthin-producing bacteria is not particularly limited as long as it induces mutation.
  • chemical methods with mutagens such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and ethyl methanesulfonate (EMS), physical methods such as ultraviolet irradiation and X-ray irradiation, genetic recombination and Biological methods and the like using transposons and the like can be used.
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • physical methods such as ultraviolet irradiation and X-ray irradiation
  • transposons and the like can be used.
  • it may be a spontaneous mutation that occurs naturally.
  • the mutagenesis treatment may be performed once, or two or more mutagenesis treatments may be performed, such as obtaining a mutant
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention functions because the originally endogenous crtW gene is partially or completely deleted or inactivated. unable to produce the correct crtW enzyme. Such deletion or inactivation may target the coding sequence of the crtW gene and/or the promoter that drives expression of the crtW gene.
  • deletion or inactivation of the crtW gene includes missense mutations (mutations to other amino acids due to base substitution), nonsense mutations (mutations to stop codons), frameshift mutations (insertion of bases into the gene and/or deletions), in-frame mutations, etc., but are not limited to deletions or inactivations that cannot result in the production of a functional crtW enzyme.
  • crtW enzyme or " ⁇ -carotene ketolase” is an enzyme that participates in a reaction that introduces a ketone into the terminal ring structure ( ⁇ -ionone ring) of carotenoids.
  • the endogenous crtW gene and crtW enzyme of bacteria eg, bacteria of the genus Paracoccus, are known to those skilled in the art and can be used as appropriate for the present invention by those skilled in the art.
  • the crtW enzyme nucleotide sequence (crtW gene) and amino acid sequence of Paracoccus carotinifaciens are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the crtW gene has a nucleotide sequence that is at least 80% identical, such as at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more identical to SEQ ID NO:1. good too.
  • the crtW gene has an amino acid sequence that is at least 80% identical, such as at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more identical to SEQ ID NO:2. It may have an encoding base sequence.
  • the crtW enzyme is at least 80% identical to SEQ ID NO: 1, e.g. It may have an amino acid sequence encoded.
  • the crtW enzyme has an amino acid sequence that is at least 80% identical, such as at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more identical to SEQ ID NO:2.
  • the proteins or crtW enzymes encoded by these mutant crtW genes have ⁇ -carotene ketolase activity.
  • amino acids involved in the function of the crtW enzyme are known.
  • amino acids such as H65 (histidine at position 65 in the amino acid sequence), H69, H103, H106, H107, H184, H218, H219, H221, H222, D117, F130, etc. of the crtW enzyme are fully or partially responsible for the activity of the crtW enzyme.
  • Rick et al. Appl Environ Microbiol. 2006 Sep;72(9):5829-37.
  • Rick et al. reported that a bacterium with a mutated crtW enzyme produced an increased proportion of zeaxanthin.
  • deletion or inactivation of the crtW gene involves mutation of the gene such that these amino acids are mutated to alanine or amino acids of different nature. Mutations to amino acids with different properties include mutations of basic amino acids (such as histidine) to neutral amino acids (such as tyrosine) or acidic amino acids, mutations of acidic amino acids (such as aspartic acid) to neutral or basic amino acids, Mutations from neutral amino acids (the aromatic amino acid phenylalanine) to acidic or basic amino acids are included.
  • basic amino acids such as histidine
  • neutral amino acids such as tyrosine
  • acidic amino acids such as aspartic acid
  • the partially or completely deleted or inactivated crtW gene of the present invention is, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 5 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 6. Sequences include, but are not limited to.
  • the partially or completely deleted or inactivated crtW enzyme of the present invention is, for example, the amino acid sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 5 or SEQ ID NO: 4 or 6 amino acid sequences, but is not limited to these.
  • the ZXA-3 strain was confirmed to have mutations at the same sites as the ZXA-23 strain.
  • the nucleotide and amino acid sequences of crtW of strain ZXA-3 are SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the activity of the crtW enzyme can be indirectly determined using, for example, gene sequencing. In this way partial or complete deletions or inactivating mutations can be readily identified.
  • the term "inability to produce a functional crtW enzyme” means no or substantially no activity of the crtW enzyme. More specifically, the term “incapable of producing a functional crtW enzyme” means that the crtW enzymatic activity is less than 20% of the crtW enzymatic activity of the astaxanthin-producing bacterium.
  • the crtW enzymatic activity of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria of the present invention is less than 20%, less than 15%, preferably less than 10%, more preferably less than 5%, even more preferably 1% of the wild-type crtW enzymatic activity.
  • crtW enzymatic activity means the ability to add ketones to carotenoids, e.g., the activity of converting ⁇ -carotene to echinenone, the activity of converting echinenone to canthaxanthin, the activity of converting ⁇ -cryptoxanthin to asteroidenone.
  • activity activity to convert ⁇ -cryptoxanthin to 3-hydroxyechinenone, activity to convert 3-hydroxyechinenone to adonibin, activity to convert zeaxanthin to adonixanthin, activity to convert astroidenone to adonibin , the activity of converting adonixanthin to astaxanthin.
  • bacteria incapable of producing a functional crtW enzyme are obtained by any means known in the art using molecular biological methods, or mutated It can be obtained by screening the body.
  • the endogenous crtW gene of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention or the promoter under which crtW is expressed is partially or completely deleted or inactivated such that it is incapable of producing a functional crtW enzyme.
  • Gene disruption techniques that are known in the art can be used.
  • the coding region of the endogenous crtW gene can be wholly or partially removed or inactivated, or the promoter region can be wholly or partially removed or inactivated by mutagenesis.
  • the endogenous crtW gene may be knock-in mutated, thereby disrupting the endogenous coding sequence.
  • premature stop codons or frameshift mutations can be introduced.
  • the crtW gene can contain missense or nonsense mutations so long as no or substantially no functional crtW enzyme is produced.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria of the present invention include bacteria that are unable to produce a functional crtW enzyme as described above, and those skilled in the art can produce them based on the common general knowledge in the field.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention can be obtained.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention theoretically produces a large amount of ⁇ -cryptoxanthin, regardless of the dissolved oxygen concentration during cultivation, as compared with the bacterium before mutation (for example, the parent strain). .
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is expected to produce a higher amount of ⁇ -cryptoxanthin relative to the total amount of carotenoids produced than the bacterium before mutation.
  • the amount of ⁇ -cryptoxanthin produced can be measured by analyzing the amount of carotenoids in the culture solution obtained by culturing the target bacterium.
  • the culture method may be any method such as shaking culture in a test tube, flask or the like, or aeration stirring culture. Any method for analyzing carotenoid compounds can be used as long as it can separate and detect carotenoid compounds. For example, high performance liquid chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, and the like can be used.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention can be obtained, for example, by selecting mutant strains that produce a high ratio of ⁇ -cryptoxanthin to total carotenoids.
  • the total amount of carotenoids means the total amount of carotenoids such as astaxanthin, canthaxanthin, adonixanthin, ⁇ -carotene, echinenone, zeaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, 3-hydroxyechinenone, asteroidenone and adonirubine.
  • the minimum condition is that the ratio of ⁇ -cryptoxanthin is higher than the production ratio of ⁇ -cryptoxanthin of the bacterium (for example, the parent strain) before mutation.
  • astaxanthin-producing bacteria can be used as bacteria before mutation, but in general, astaxanthin-producing bacteria do not produce ⁇ -cryptoxanthin, or if they do, the production amount is extremely small.
  • an example of the amount of carotenoid produced by culturing an astaxanthin-producing bacterium belonging to the genus Paracoccus is shown below. Culture of bacteria and measurement of carotenoids were carried out in the same manner as described in Examples.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention can be efficiently selected by forming colonies on an agar medium after the mutation treatment of (1) or (2) and selecting yellow to orange colonies. is. Since ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria form yellow to orange colonies, by selecting yellow to orange colonies, the desired ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium (the ⁇ - Cryptoxanthin-producing bacteria) can be efficiently selected.
  • the selected colony is cultured in a test tube, flask, or the like, ⁇ -cryptoxanthin is quantified, and the production amount of ⁇ -cryptoxanthin is determined.
  • the color of the colonies to be selected is yellow, orange, or a color between yellow and orange, which is clearly different from the red color of colonies of bacteria that produce astaxanthin, etc. Therefore, this method can be used to easily and reliably identify target bacteria. can be selected to
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention has an endogenous crtW gene partially or completely deleted or inactivated compared to the bacterium (eg, parent strain) before mutation. , unable to produce a functional crtW enzyme. Partial or complete deletion or inactivation of the endogenous crtW gene can be confirmed by analysis of the crtW gene contained in the bacterium. Analysis can be performed using known techniques such as gene sequencing, RT-PCR, real-time PCR analysis, Southern blot analysis, Northern blot analysis, and the like.
  • the inability to produce a functional crtW enzyme can be confirmed by confirming the expression of the crtW enzyme by Western blot analysis, immunostaining, etc., or by measuring the crtW enzyme activity such as by measuring the amount of keto carotenoid produced. can do.
  • the production method of the present invention involves culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention under a predetermined dissolved oxygen concentration, and producing at least one selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin. of carotenoids.
  • the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin by culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention including adjusting the dissolved oxygen concentration in the culture medium to 0.8 ppm or less or a step of culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention in a culture medium having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less, ⁇ -carotene, ⁇ -
  • a method for producing at least one carotenoid selected from the group consisting of cryptoxanthin and zeaxanthin is disclosed.
  • the carotenoid produced by the production method of the present invention is one or more carotenoids selected from ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin.
  • the carotenoid produced in the production method of the present invention is ⁇ -cryptoxanthin.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture of the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is adjusted to a low level of 0.8 ppm or less, ⁇ -cryptoxanthin is efficiently produced, and the amount of ⁇ -cryptoxanthin produced per culture medium is high.
  • the concentration of ⁇ -cryptoxanthin relative to the total carotenoids produced is increased.
  • ⁇ -cryptoxanthin and ⁇ -carotene are efficiently produced.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture medium is 0.8 ppm or less, preferably 0.7 ppm or less, more preferably 0.6 ppm or less, and still more preferably 0.5 ppm or less, Most preferably, it is adjusted to 0.4 ppm or less.
  • the amount of ⁇ -cryptoxanthin per culture medium can be increased.
  • the values of "%" and “ppm” refer to volume ratios, and "1 ppm” is synonymous with "1 mg/L”.
  • the mass of culture medium is approximately equal to the mass of water with the same volume, and when both are equal, the value "ppm” means mass ratio, and "1 ppm” means the same as “1 mg/kg”.
  • Dissolved oxygen in the culture medium is measured with a dissolved oxygen electrode.
  • the dissolved oxygen electrode can be measured using, for example, Marubishi Bioengineering Co., Ltd. model number: OX-2500.
  • the dissolved oxygen electrode is calibrated with an oxygen content of 100% when left in the atmosphere for 5 minutes and an oxygen content of 0% when left in a 50 g/L sodium sulfite aqueous solution for 5 minutes. Since the dissolved oxygen concentration in water under the atmosphere reaches an equilibrium state at 8 ppm, the oxygen content of 100% when left in the atmosphere for 5 minutes is converted to a dissolved oxygen concentration of 8 ppm in water. Adjustment of the dissolved oxygen concentration is controlled by a method commonly used in culture.
  • the method of automatically adjusting the flow rate of air or oxygen supplied to the culture tank, the dissolved oxygen in the culture solution measured by the dissolved oxygen electrode A method of automatically adjusting the rotation speed or number of rotations of the stirring blades according to the concentration, or a method of adjusting both the air flow rate and the rotation speed or number of rotations can be used.
  • the medium used for culturing in this method (hereinafter also referred to as “ ⁇ -cryptoxanthin production medium”) is the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention when cultured at a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less grows and produces ⁇ -cryptoxanthin.
  • a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and, if necessary, vitamins and the like is preferably used.
  • carbon sources examples include sugars such as glucose, sucrose, lactose, fructose, trehalose, mannose, mannitol and maltose, organic acids such as acetic acid, fumaric acid, citric acid, propionic acid, malic acid, malonic acid and pyruvic acid.
  • alcohols such as , ethanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol and glycenol
  • oils and fats such as soybean oil, bran oil, olive oil, corn oil, sesame oil and linseed oil; Claus is used.
  • these carbon sources can be used singly or in combination of two or more.
  • the amount of carbon source to be added to the medium (initial medium) before culture varies depending on the type of carbon source and may be adjusted appropriately, but is usually 1 to 100 g, preferably 2 to 50 g per liter of medium.
  • the carbon source is preferably added not only to the starting medium, but also sequentially or continuously during the culture.
  • inorganic nitrogen sources include ammonium salts such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate; nitrates such as potassium nitrate; ammonia and urea; can.
  • the amount to be added varies depending on the type of nitrogen source and may be adjusted appropriately, but is usually 0.1 g to 20 g, preferably 0.2 to 10 g, per 1 L of medium.
  • Organic nitrogen sources include, for example, corn steep liquor (including filtered products), pharmacomedia, soybean meal, soybean flour, peanut meal, monosodium glutamate, distiller's solubles and dry yeast, and one of these Alternatively, two or more kinds can be used in combination.
  • the concentration to be added varies depending on the type of nitrogen source and may be adjusted appropriately, but is usually 0 to 80 g/L, preferably 0 to 30 g/L in the medium.
  • Inorganic nitrogen sources and organic nitrogen sources are usually added to the starting medium, but it is also preferable to additionally supply them sequentially or continuously.
  • inorganic salts include phosphates such as potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and disodium hydrogen phosphate; magnesium salts such as magnesium sulfate and magnesium chloride; iron salts such as iron sulfate and iron chloride; Calcium salts such as calcium chloride and calcium carbonate, sodium salts such as sodium carbonate and sodium chloride, manganese salts such as manganese sulfate, cobalt salts such as cobalt chloride, copper salts such as copper sulfate, zinc salts such as zinc sulfate, molybdic acid molybdenum salts such as sodium; nickel salts such as nickel sulfate; selenium salts such as sodium selenate; The amount to be added varies depending on the type of inorganic salt and may be adjusted appropriately, but is usually 0.0001 to 15 g per 1 L of medium.
  • the concentration in the medium is preferably 0.02 to 15 g/L, manganese salts, cobalt salts, copper salts, zinc salts, molybdenum salts, nickel salts, When adding selenium salts, boric acid, potassium iodide, etc., the preferred concentration is 0.1 to 15 mg/L.
  • Inorganic salts are usually added to the starting medium, but may be supplemented sequentially or continuously.
  • vitamins for example, cyanocobalamin, riboflavin, pantothenic acid, pyridoxine, thiamine, ascorbic acid, folic acid, niacin, p-aminobenzoic acid, inositol, choline, biotin, etc. can be used.
  • the addition ratio varies depending on the type of vitamins and may be adjusted as appropriate.
  • Vitamins are usually added to the starting medium, but may be supplemented sequentially or continuously.
  • an antifoaming agent is preferably used to suppress foaming of the culture solution.
  • Any type of antifoaming agent may be used as long as it has the effect of suppressing the generation of foams or erasing the generated foams and has little inhibitory effect on the producing bacteria.
  • alcohol antifoaming agents, polyether antifoaming agents, ester antifoaming agents, fatty acid antifoaming agents, silicon antifoaming agents, sulfonic acid antifoaming agents and the like can be used.
  • the amount of antifoaming agent to be added varies depending on the type of antifoaming agent and may be adjusted appropriately, but is usually 0.01 g to 10 g per 1 L of medium.
  • Antifoaming agents are usually added to the starting medium before sterilization. Furthermore, an additional antifoaming agent may be added continuously or intermittently during the culture. Methods for adding antifoaming agents during cultivation include, for example, automatic addition after detecting bubbles with a sensor, addition at regular intervals using a program timer, feeding carbon sources and nitrogen feeds in conjunction with the growth rate. and a method of mixing with a source or a pH adjuster and the like.
  • the antifoaming agent added to the starting medium and the antifoaming agent added to the culture medium during the culture may be of the same type, but different types may be used according to their actions.
  • the pH of the medium at the start of culture is adjusted to 2-12, preferably 6-9, more preferably 6.5-8.0. It is preferable to maintain the pH within the above range during the culture.
  • a method for maintaining the pH a method of measuring the pH of the culture solution online with a pH electrode installed in the fermenter and automatically supplying alkali is preferable.
  • pH adjusters include sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, ammonia water, ammonia gas, sulfuric acid aqueous solution, and mixtures thereof.
  • the medium is used for culturing bacteria after being sterilized.
  • the sterilization treatment can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • media in suitable containers may be heat sterilized in an autoclave.
  • it may be sterilized by filtration through a sterilizing filter.
  • it may be sterilized by jacket heating and steam blowing.
  • a carbon source such as glucose may be sterilized separately because it turns brown when heat sterilized together with other medium components.
  • Vitamins and trace metals may be heat sterilized together with the main medium, but may be sterilized separately to prevent deactivation and precipitation.
  • ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria are inoculated into the ⁇ -cryptoxanthin-producing medium prepared as described above and cultured under predetermined conditions. Inoculation may be performed by appropriately increasing the strain by seed culture using a test tube, flask, fermenter, or the like, and adding the obtained culture solution to the medium for producing ⁇ -cryptoxanthin (main culture).
  • Seed culture may be performed before main culture, and seed culture can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • the medium used for seed culture is not particularly limited as long as it allows the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacteria to grow well.
  • Cultivation is carried out in an appropriate culture vessel.
  • the culture vessel can be appropriately selected according to the culture capacity, and examples thereof include test tubes, flasks, and fermenters.
  • the culture temperature is, for example, 15-40°C, preferably 20-35°C, more preferably 25-32°C.
  • the culture period is usually 1 to 20 days, preferably 1 to 12 days, more preferably 2 to 8 days, particularly preferably 3 to 7 days.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is cultured under aerobic conditions. Aerobic conditions include, for example, shaking culture, aeration stirring culture, and the like. In the main culture, the dissolved oxygen concentration is adjusted as described above. After starting the main culture, the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is cultured under aerobic conditions until it grows sufficiently (first culture step). Culturing under aerobic conditions (first culturing step) takes 5 to 80 hours, preferably 10 to 70 hours, 10 to 60 hours, more preferably 10 to 80 hours after initiation of culture in a medium for producing ⁇ -cryptoxanthin. It is carried out for 50 hours, more preferably 10 to 40 hours, more preferably 10 to 36 hours.
  • the first culturing step may be carried out for 20-80 hours, 20-60 hours, 20-40 hours, 20-36 hours.
  • the dissolved oxygen concentration at this time is 0.8 ppm or higher, for example, 1 ppm or higher, preferably 1.5 ppm or higher, and more preferably 2 ppm or higher.
  • the first culturing step can be continued until the turbidity of the culture solution measured at a measurement wavelength of 610 nm increases by at least 5 or more compared to the turbidity at the start of the first culturing step. .
  • the increase in turbidity from the start of the first culture step is at least 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more , 19 or more, or 20 or more.
  • the rate of increase in turbidity is high, in which case the increase in turbidity is about 20-400.
  • the dissolved oxygen concentration is not maintained at 0.8 ppm or less as described above, and the dissolved oxygen concentration gradually decreases from the start of the culture, and then rises after reaching a decreasing peak.
  • the first culturing step may continue until the dissolved oxygen concentration is lowest.
  • ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention After the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention has grown sufficiently, ⁇ -cryptoxanthin can be efficiently produced by culturing the culture medium under conditions where the dissolved oxygen concentration is 0.8 ppm or less (Section two culture steps). If the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is cultured at a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less before it grows sufficiently, the bacterium will not grow sufficiently, which may lead to a decrease in the yield of ⁇ -cryptoxanthin.
  • ⁇ -cryptoxanthin can be efficiently produced by growing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention in a culture solution and then culturing it in a culture solution containing 0.8 ppm or less of dissolved oxygen. can.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is 5 to 200 hours, preferably 10 to 150 hours, more preferably 10 to 100 hours, 20 to 80 hours, It can be cultured for 30 to 60 hours, 40 to 60 hours, eg 40 hours. During this period of culture, the dissolved oxygen concentration is maintained at 0.8 ppm or less.
  • the method for producing ⁇ -cryptoxanthin of the present invention is (i) The ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention grown or the ⁇ of the present invention in which the turbidity of the culture solution measured at a measurement wavelength of 610 nm has increased by 5 or more compared to the turbidity at the start of the first culture step - Adjust the dissolved oxygen concentration in the culture solution of cryptoxanthin-producing bacteria to 0.8 ppm or less, (ii) culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention in a culture solution having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less; A second culturing step can be included. At least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin is produced by the above method.
  • the method for producing ⁇ -cryptoxanthin of the present invention comprises (a) growing Paracoccus bacteria in a culture solution, or measuring the turbidity of the culture solution at a measurement wavelength of 610 nm, a first culturing step of culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention until the turbidity increases by 5 or more compared to the turbidity at the start of the first culturing step; (b) a second culturing step of culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention in a culture solution having a dissolved oxygen concentration of 0.8 ppm or less after the first culturing step; and At least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin is produced by the above method.
  • ⁇ -cryptoxanthin By culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention as described above, ⁇ -cryptoxanthin can be produced efficiently.
  • the amount of ⁇ -cryptoxanthin finally obtained in the culture solution after completion of the culture can be 10 mg/L or more, 15 mg/L or more, or 20 mg/L or more per culture solution.
  • the production concentration of ⁇ -cryptoxanthin relative to the total amount of carotenoids in the finally obtained culture solution after completion of the culture may be 3.5% by mass or more, 4% by mass or more, or 4.5% by mass or more.
  • Carotenoids in the culture solution obtained by culturing the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention or carotenoids collected from the culture solution can be quantified, for example, by high-performance liquid chromatography.
  • the production method of the present invention can further include a step of recovering at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin from the culture.
  • the ⁇ -cryptoxanthin-producing bacterium of the present invention is cultured as described above, and the resulting culture medium may be used as it is as ⁇ -cryptoxanthin or a carotenoid containing ⁇ -cryptoxanthin, or
  • culture supernatants, cell concentrates (cell concentrates), wet cells, dried cells, cell lysates, etc. may be prepared and these preparations may be used.
  • carotenoids such as ⁇ -cryptoxanthin can be collected from these culture solutions or preparations by extraction, purification, and the like.
  • the culture supernatant can be prepared by centrifuging or filtering the culture solution to remove the bacterial cells from the culture solution.
  • a bacterial cell concentrate (bacterial cell concentrate) can be obtained by centrifuging, concentrating by membrane filtration, or decanting the culture solution.
  • Wet cells can be obtained by centrifuging or filtering the culture solution.
  • Dried cells can be obtained by drying a culture medium, wet cells or a cell concentrate (cell concentrate) by a general drying method.
  • the pH of the culture solution is not particularly limited in the process of obtaining the bacterial cell concentrate, but the culture solution may be acidified in order to facilitate sedimentation of carotenoids.
  • the acidic condition may be any pH within the acidic range, preferably pH 6.5 or less, more preferably pH 5.5 or less, and still more preferably pH 5.0 or less.
  • water may be added during operations such as centrifugation, filtration separation, and decantation.
  • the centrifuge used for centrifugation may be a continuous type or a batch type, but the continuous type is preferably used.
  • Examples of the type of centrifuge include basket type, multi-chamber type, decanter type, disc type (nozzle type, disludge type), tubular type, and rotor type centrifuges.
  • the membrane filtration device used for filtration separation may be of the static type or the cross-flow type, but the cross-flow type is preferable because it is easy to prevent clogging.
  • membrane materials include filter paper, filter cloth, chemical fibers, and ceramics.
  • drying method is not particularly limited, examples thereof include spray drying, fluidized drying, spray fluidized granulation drying, drum drying, and freeze drying. It is also preferable to pulverize the dried cells in order to finely powder them after drying.
  • the method of pulverization is not particularly limited, but examples thereof include beater mill, hammer mill, ball mill, bead mill and the like.
  • a preparation such as a carotenoid such as ⁇ -cryptoxanthin or a carotenoid-containing dry cell composition containing ⁇ -cryptoxanthin obtained in this way can be used as it is, for example, as an additive for feed or food. .
  • the method for collecting carotenoids such as ⁇ -cryptoxanthin or carotenoids from the culture solution or preparation is not particularly limited, and any method that stably and efficiently collects carotenoids may be used. These methods can be appropriately selected from known extraction and purification techniques by those skilled in the art.
  • the obtained extracts, preparations, purified products, etc. can be used individually as carotenoids such as ⁇ -cryptoxanthin or carotenoids, or they can be used by mixing them at any ratio.
  • All five strains obtained produced ⁇ -cryptoxanthin, ⁇ -carotene and zeaxanthin when cultured without adjusting the dissolved oxygen concentration to 0.8 ppm or less (“3”).
  • the 185 strains obtained in the same manner were also cultured in a 5 L volume culture tank (12 strains) or test tube level (185 strains) without adjusting the dissolved oxygen concentration to 0.8 ppm or less. - was confirmed to produce cryptoxanthin, ⁇ -carotene and zeaxanthin.
  • the strain obtained in "1" above was cultured as follows.
  • seed culture The composition of the medium used for seed culture is as follows: sucrose 30 g/L, corn steep liquor 15 g/L, potassium dihydrogen phosphate 0.54 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 2.8 g/L, 0.3 g/L calcium chloride dihydrate, 14.3 g/L magnesium sulfate heptahydrate, 0.3 g/L iron sulfate heptahydrate, 0.1 g/L defoamer, pH 7.2.
  • Two liters of the medium having the above composition was placed in a 5-liter culture vessel (jar fermenter) and steam sterilized at 121° C.
  • the dissolved oxygen concentration was adjusted by interlocking the dissolved oxygen electrode and the stirring blade motor, and automatically adjusting the rotation speed of the stirring blade according to the dissolved oxygen concentration value. Also, the minimum rotation speed of the stirring blade was set to 455 rpm.
  • the pH during cultivation was controlled at 7.0 to 7.4 by continuously dropping 14% aqueous ammonia. Since glucose is consumed with growth, it was added so that the glucose concentration in the culture medium was maintained at 5 to 30 g/L. A portion of the culture solution that had been kept at 0.8 ppm or less for 40 to 60 hours was sampled for measuring the amount of ⁇ -cryptoxanthin.
  • the composition of the chromogenic medium is shown below: glucose 40 g/L, potassium dihydrogen phosphate 2.3 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 5.7 g/L, ammonium sulfate 2.3 g/L, sodium L-glutamate 1 Hydrate 6 g/L, Calcium chloride dihydrate 1.0 g/L, Sodium chloride 3 g/L, Magnesium sulfate heptahydrate 4.5 g/L, Iron sulfate heptahydrate 1.0 g/L, Sulfuric acid Manganese pentahydrate 0.1 mg/L, boric acid 5 mg/L, zinc sulfate heptahydrate 1.4 mg/L, sodium molybdate dihydrate 2.3 mg/L, copper sulfate pentahydrate 0.1 mg/L.
  • Dissolved oxygen was measured using the following equipment.
  • DO measuring device Model number OX-2500 manufactured by Marubishi Bioengineering Co., Ltd.
  • the turbidity of the culture solution was measured as follows. The turbidity of the culture solution is measured with a general-purpose spectrophotometer. The turbidity can be measured, for example, using a product manufactured by Elma Sales Company (model number: AE-450). The turbidity is calculated from the absorbance by using a quartz cuvette with an optical path length of 1 cm, setting the measurement wavelength to 610 nm. Calibrate the measured value of water as 0. Absorbance takes a value between 0 and 1, but if the value is too close to 1, it may not be measured correctly. then measure. The turbidity of the diluted culture solution is calculated by correcting the absorbance obtained by the measurement by multiplying it by the dilution factor.
  • the measured carotenoids were all ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin, and zeaxanthin, and no production of adonixanthin or asaxanthin was detected.
  • the 65th histidine in the CrtW enzyme amino acid sequence has been shown to be important for CrtW enzyme activity (Rick et al., Appl Environ Microbiol. 2006 Sep;72(9):5829-37).
  • the positively charged basic amino acid histidine is mutated to the uncharged neutral amino acid tyrosine, which is presumed to significantly impair the enzymatic activity.
  • the present invention can provide a bacterium that produces at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin.
  • the present invention increases the amount of ⁇ -cryptoxanthin produced by culturing bacteria that produce at least one carotenoid selected from the group consisting of ⁇ -carotene, ⁇ -cryptoxanthin and zeaxanthin at a predetermined dissolved oxygen concentration. can be improved.

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Abstract

本発明は、生産効率の向上したβ－クリプトキサンチンの製造方法の提供を目的とする。本発明により、パラコッカス属細菌を所定の溶存酸素濃度で培養してβ－クリプトキサンチンを製造する方法であって、前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法が提供される。

Description

カロテノイドを生産する微生物
　本発明は、β－クリプトキサンチン、β－カロテンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを生産する細菌または前記カロテノイドを製造する方法に関する。また、本発明は、β－クリプトキサンチンを生産する細菌またはβ－クリプトキサンチンを製造する方法に関する。
　カロテノイドは、飼料添加物、食品添加物、医薬品等として有用な天然色素である。カロテノイドには、例えばゼアキサンチン、β－カロテン、β－クリプトキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、リコペン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノンおよび３－ヒドロキシエキネノン等が含まれる。
　カロテノイドの中でも、β－クリプトキサンチンは、柑橘類に含まれ、抗腫瘍効果を有することが知られており（非特許文献１）、また骨粗鬆症予防に効果があることが報告されている（非特許文献２）。β－クリプトキサンチンは、健康食品素材や飼料配合剤としての用途も知られている。
　また、ゼアキサンチンやβ－クリプトキサンチン等のカロテノイドは、ニワトリ等の家禽類の飼料に添加し、当該飼料を家禽類に与えると、卵黄に蓄積する。これらのカロテノイドは、有効な生理作用を有することから、これらカロテノイドを蓄積した卵黄は機能性卵として有用である。
　特許文献１には、パラコッカス属細菌を使用したゼアキサンチン等のカロテノイドの製造方法が開示されている。この製造方法によりゼアキサンチンだけでなくβ－クリプトキサンチンも生産されるが、培養液当たりまたは総カロテノイド量に対するβ－クリプトキサンチンの生産量は十分なものではない。
　また、特許文献２にも、パラコッカス属細菌を使用したゼアキサンチンの製造方法が開示されている。特許文献２の方法により得られるβ－クリプトキサンチンの生産量も、十分なものではない。
特開２００５－８７０９７ ＷＯ２０１１／１２２６１６パンフレット
Tsushima M.ら, 「Biol. Pharm. Bull.」, 1995年, 第18巻, 第2号，pp. 227-233 Yamaguchi Mら, 「ACS Symp Ser(Am Chem Soc)」, 2008年, 第993号, pp. 408-418
　このような事情の下、生産効率の向上したβ－クリプトキサンチンの製造方法の開発が求められている。
　本発明者は、鋭意研究を行い、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドの製造方法であって、β－クリプトキサンチンの生産効率が向上した前記方法を見出した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
　パラコッカス属細菌を培養してβ－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法であって、
　溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整することを含み、
　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
［１］’
　パラコッカス属細菌を培養してβ－クリプトキサンチンを製造する方法であって、
　溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整することを含み、
　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
［２］
　β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法であって、
　パラコッカス属細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する工程を含み、
　当該培養液の溶存酸素濃度が、溶存酸素電極により測定されるものであり、
　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色、例えば黄色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
［２］’
　β－クリプトキサンチンを製造する方法であって、
　パラコッカス属細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する工程を含み、
　当該培養液の溶存酸素濃度が、溶存酸素電極により測定されるものであり、
　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色、例えば黄色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
［３］
　β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法であって、
（ａ）培養液中でパラコッカス属細菌を増殖させる、または培養液を測定波長６１０ｎｍで測定した濁度が、第一培養工程開始時の濁度と比較して５以上増加するまでパラコッカス属細菌を培養する第一培養工程と、
（ｂ）第一培養工程終了後、前記パラコッカス属細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する第二培養工程を含み、
　当該培養液の溶存酸素濃度が、溶存酸素電極により測定されるものであり、
　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
［３］’
　β－クリプトキサンチンを製造する方法であって、
（ａ）培養液中でパラコッカス属細菌を増殖させる、または培養液を測定波長６１０ｎｍで測定した濁度が、第一培養工程開始時の濁度と比較して５以上増加するまでパラコッカス属細菌を培養する第一培養工程と、
（ｂ）第一培養工程終了後、前記パラコッカス属細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する第二培養工程を含み、
　当該培養液の溶存酸素濃度が、溶存酸素電極により測定されるものであり、
　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
［４］
　前記第二培養工程の培養時間が１０時間以上１００時間以下である、［３］または［３］’に記載の方法。
［５］
　前記第一培養工程の培養時間が１０時間以上７０時間以下である、［３］、［３］’または［４］に記載の方法。
［６］
　黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌が、赤色を呈するコロニーを形成するパラコッカス属細菌を変異処理し、黄色～橙色を呈するコロニーを選択することにより取得されるものである、［１］～［５］のいずれか1項に記載の方法。
［６］’
　黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌が、パラコッカス属細菌を変異処理し、黄色～橙色を呈するコロニーを選択することにより取得されるものであり、かつ、黄色～橙色を呈さないコロニーを形成する細菌と比較して向上したβ－クリプトキサンチンの生産性を有する、［１］～［５］のいずれか1項に記載の方法。
［７］
　前記内因性ｃｒｔＷ遺伝子が、配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９０％同一な塩基配列を含む、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］
　前記ｃｒｔＷ酵素が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む［１］～［６］のいずれか1項に記載の方法。
［９］
　β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドが、β－クリプトキサンチンである、［１］～［８］のいずれか1項に記載の方法。
［１０］
　内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能である、パラコッカス属細菌。
　［１０］のパラコッカス属細菌は、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイド又はβ－クリプトキサンチンを生産することができる。また、黄色～橙色を呈するコロニーを形成することができる。
　本発明により、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを生産する細菌を提供することができる。本発明は、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを生産する細菌を所定の溶存酸素濃度で培養することにより、β－クリプトキサンチンの産生量を向上させることができる。
アスタキサンチンの生合成経路を示す図である。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に限定されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
　本発明は、カロテノイドの生産方法に関する。本発明の方法で生産されるカロテノイドはβ－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種を含む。一態様において、カロテノイドはβ－クリプトキサンチンであり、本発明は、β－クリプトキサンチンの生産方法に関する。すなわち、本発明は、β－クリプトキサンチンを生産する細菌（以下、「本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌」ともいう）を、溶存酸素濃度（ＤＯ）０．８ｐｐｍ以下で培養し、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法に関する。ここで、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、便宜上β－クリプトキサンチン生産細菌と称するが、β－クリプトキサンチン、β－カロテンおよびゼアキサンチンを生産することが可能である。本発明の製造方法では、溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整せずに培養した場合と比較して、β－クリプトキサンチンを高収率、例えば、培養液当たり１０ｍｇ／Ｌ以上のβ－クリプトキサンチンを生産することができる。したがって、本発明の製造方法は、β－クリプトキサンチンの生産量を増加させる方法を含む。また、本発明は、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを生産する酵母においても実施することができる。当業者であれば、細菌に関する明細書の記載を適宜酵母に適用することができる。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌として用いられる細菌は、β－カロテン、β－クリプトキサンチン又はゼアキサンチンを生産する細菌であれば、特に限定されないが、例えば、パラコッカス属に属する細菌（以下、「パラコッカス属細菌」ともいう）が用いられる。パラコッカス属細菌は、例えば、パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)、パラコッカス・マークシイ(Paracoccus marcusii)、パラコッカス・ヘウンデンシス(Paracoccus haeundaensis)、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス(Paracoccus zeaxanthinifaciens)が挙げられる。本発明において好ましく用いられるパラコッカス属細菌は、パラコッカス・カロティニファシエンスである。パラコッカス属細菌の具体的な菌株の例として、Paracoccus carotinifaciens E-396株（FERM BP-4283）およびパラコッカス属細菌A-581-1株（FERM BP-4671）が挙げられる。本発明において、赤色を呈するコロニーを形成するこれらの菌株を変異させ、黄色～橙色を呈するコロニーを形成するようにした変異株、又は内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な変異株が、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌として好ましく用いられる。アスタキサンチンを生産する細菌においては、β－クリプトキサンチンは生産されないか、生産されたとしてもその産生量は非常に少ないことから、変異株は、変異前の親株と比較して、理論的には培養時の溶存酸素濃度にかかわらずβ－クリプトキサンチンを多く生産するようになる。
　本発明の一実施態様において、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である。
　また、本発明の別の実施態様において、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）を産生することが不可能な細菌である。
　別の態様において、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、例えば、アスタキサンチンを生産する細菌を変異させ、変異前の細菌と比較してβ－クリプトキサンチンを多量に生産するようにしたパラコッカス属細菌を用いることができる。このような細菌として、例えば、生産される総カロテノイド量に対するβ－クリプトキサンチン産生量が変異前の細菌よりも高い細菌が挙げられる。
　このようなβ－クリプトキサンチン生産細菌は本発明に含まれる。
　図１はβ－カロテンを出発物質とする、アスタキサンチンの生合成経路を示す図である。図１に示されるカロテノイドは、いずれも同じ数の炭素－炭素の二重結合を有する。β－カロテンの色は黄色～橙色、アスタキサンチンは赤色というように、カロテノイドの色は、ｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）により付加されるケトン（Ｃ＝Ｏ基）の有無に依存する。すなわち、ｃｒｔＷ酵素が正常に機能することにより、カロテノイドのβ－イオノン環にケトンがカロテノイドの炭素－炭素の二重結合に対して共役に導入されると、吸収波長が長波長側にシフトするため、カロテノイドの色は黄色～橙色から赤色に変化する（図１の「ケト化」）。機能的なｃｒｔＷ酵素（すなわちケトンを付加する能力を有するｃｒｔＷ酵素）を産生する細菌では、分子構造内にケトンを1個または２個有し、赤色を呈するアドニキサンチン、アドニルビン、アスタキサンチンなどが合成されるため、形成されるコロニーも赤色を呈する。一方、黄色～橙色を示すコロニーを形成する細菌は、ケトンが付加されたカロテノイドを生産しない。このことは、黄色～橙色を示すコロニーを形成する細菌では、機能的なｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）が産生されていないことを意味する。すなわち、黄色～橙色を示すコロニーは、理論的には分子構造内にケトンを有さないカロテノイド（β－クリプトキサンチン、β－カロテンおよびゼアキサンチン）を生産する。よって、β－クリプトキサチン生産細菌は、黄色～橙色を示すコロニーを選抜することにより容易に選択することができる。
　本発明においては、アスタキサンチンを生産する細菌をβ－クリプトキサンチン生産細菌を得る際の親株として使用し得る。アスタキサンチンを生産する細菌においては、ｃｒｔＷ酵素が正常に機能するため、β－クリプトキサンチンは生産されないか、生産されたとしてもその産生量は非常に少ない。すなわち、アスタキサンチンを生産する細菌においては、ケトンの付加を担うｃｒｔＷ酵素が水酸化酵素よりも優位に機能し（あるいはｃｒｔＷ酵素の反応速度が水酸化酵素の反応速度よりも著しく速いため）、アスタキサンチン生合成経路の出発物質であるβ－カロテンが、β－クリプトキサンチンではなくエキネノンに変換されると考えられている（図１参照）。一方、実施例において取得された本発明に係る菌株では、β－クリプトキサンチン、β－カロテン及びゼアキサンチンの生産が検出され、アスタキサンチンの生産は検出されなかった。このことは、β－クリプトキサンチン生産細菌は、ｃｒｔＷ酵素が機能しないか、機能したとしてもその活性は非常に弱いことを示している。実際に、実施例で取得されたβ－クリプトキサンチン生産細菌は、ｃｒｔＷ酵素に変異を有していた。かかる機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌は、β－クリプトキサンチン生産細菌に含まれる。
　このように、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、ｃｒｔＷ酵素活性を有さないために、アスタキサンチンの生合成経路の出発物質であるβ－カロテンは、水酸化され、β－クリプトキサンチンが生産される（図１参照）。生産されたβ－クリプトキサンチンは、同様に水酸化されてゼアキサンチンに変換され得る。したがって、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、β－クリプトキサンチン、β－カロテンおよびゼアキサンチンを生産することが可能である。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌のｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）が機能しない（機能的でない）こと、あるいはβ－クリプトキサンチン生産細菌が機能的なｃｒｔＷ酵素を産生できないことは、ｃｒｔＷ酵素の酵素活性を測定することにより確認することができる。例えば、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌のｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）が機能しない（機能的でない）こと、あるいはβ－クリプトキサンチン生産細菌が機能的なｃｒｔＷ酵素を産生できないことは、ケトンが付加されたカロテノイド、例えばアスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン等が生産されないか、生産されたとしても産生量がごく微量であることをＨＰＬＣ等の測定により確認することができる。また、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌のｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）が機能しない（機能的でない）こと、あるいは細菌が機能的なｃｒｔＷ酵素を産生できないことは、形成するコロニーの色が、黄色～橙色を呈色することを視認することによっても確認可能である。さらに、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌のｃｒｔＷ酵素（β－カロテンケトラーゼ）が機能しない（機能的でない）こと、あるいは細菌が機能的なｃｒｔＷ酵素を産生できないことは、遺伝子解析により細菌のｃｒｔＷ遺伝子の塩基配列またはｃｒｔＷ酵素のアミノ酸配列からも確認できる。
１．β－クリプトキサンチン生産細菌の作製
（１）突然変異
　アスタキサンチン生産細菌を変異処理し、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を取得する方法を以下に例示する。
　本発明において、アスタキサンチン生産細菌を変異処理した変異株を、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌として用いることができる。このような変異株としては、例えばＷＯ２０１１／１２２６１６に記載の変異株、特開２００５－８７０９７に記載の変異株が挙げられる。
　変異の親株としてはアスタキサンチンを生産する細菌であればいずれでもよいが、好ましくはパラコッカス属細菌が用いられる。アスタキサンチンを生産するパラコッカス属細菌の中では、パラコッカス・カロティニファシエンス(Paracoccus carotinifaciens)、パラコッカス・マークシイ(Paracoccus marcusii)、パラコッカス・ヘウンデンシス(Paracoccus haeundaensis)、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス(Paracoccus zeaxanthinifaciens)が好ましく用いられ、特に、パラコッカス・カロティニファシエンスが好ましく用いられる。パラコッカス属細菌の具体的な菌株の例として、Paracoccus carotinifaciens E-396株（FERM BP-4283）およびパラコッカス属細菌A-581-1株（FERM BP-4671）が挙げられ、これらの菌株を変異させた変異株も親株として好ましく用いられる。変異の親株として用いられるアスタキサンチン生産細菌として、好ましくは、その１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が、配列番号７で示される塩基配列と実質的に同一の細菌が挙げられる。ここで、配列番号７のＤＮＡ塩基配列は、Ｅ－３９６株の１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列である。
　本明細書において、実質的に同一であるとは、ＤＮＡの塩基配列決定の際のエラー頻度等を考慮し、塩基配列が、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５%以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％同一であることを意味する。
　アスタキサンチン生産細菌を変異処理する方法は、突然変異を誘発するものであれば特に限定されない。例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）およびエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等の変異剤による化学的方法、紫外線照射およびＸ線照射等の物理的方法、遺伝子組換えおよびトランスポゾン等による生物学的方法等を用いることができる。あるいは自然に起こる自発的突然変異でもよい。変異処理は１回でもよいし、また、例えばこの突然変異処理によりアスタキサンチンを高生産する変異体を得て、これをさらに突然変異処理するというように２回以上の変異処理を行ってもよい。
（２）内因性ｃｒｔＷ遺伝子の変異
　一態様において、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、元来有する内因性のｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化されるために、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することができない。このような欠失または不活性化は、ｃｒｔＷ遺伝子のコード配列およびｃｒｔＷ遺伝子を発現させるプロモーターの少なくともいずれかを標的とし得る。例えば、ｃｒｔＷ遺伝子の欠失または不活性化は、ミスセンス変異（塩基置換による他アミノ酸への変異）、ナンセンス変異（終止コドンへの変異）、フレームシフト変異（遺伝子中への塩基の挿入及び/又は欠失）、インフレーム変異等を包含するが、結果として機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することができない欠失または不活性化であればよく、これに限定されない。
　本明細書において、「ｃｒｔＷ酵素」または「β－カロテンケトラーゼ」は、カロテノイドの末端の環構造（β－イオノン環）にケトンを導入する反応に関与する酵素である。細菌、例えば、パラコッカス属細菌の内因性のｃｒｔＷ遺伝子およびｃｒｔＷ酵素は、当業者に公知であり、当業者は本発明に適宜利用することができる。一例として、パラコッカス・カロティニファシエンスのｃｒｔＷ酵素の塩基配列（ｃｒｔＷ遺伝子）およびアミノ酸配列を、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示す。
　さらなる実施態様では、ｃｒｔＷ遺伝子は、配列番号１に少なくとも８０％同一な、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上同一な塩基配列を有してもよい。また、別の実施態様では、ｃｒｔＷ遺伝子は、配列番号２に少なくとも８０％同一な、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上同一なアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。また、別の実施態様では、ｃｒｔＷ酵素は、配列番号１に少なくとも８０％同一な、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上同一な塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有してもよい。さらにまた、別の実施態様では、ｃｒｔＷ酵素は、配列番号２に少なくとも８０％同一な、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上同一なアミノ酸配列を有していてもよい。これらの変異型のｃｒｔＷ遺伝子がコードするタンパク質またはｃｒｔＷ酵素は、β－カロテンケトラーゼ活性を有する。
　ｃｒｔＷ酵素の機能に関与するアミノ酸が知られている。例えば、ｃｒｔＷ酵素のＨ６５（アミノ酸配列の６５番目のヒスチジン）、Ｈ６９、Ｈ１０３、Ｈ１０６、Ｈ１０７、Ｈ１８４、Ｈ２１８、Ｈ２１９、Ｈ２２１、Ｈ２２２、Ｄ１１７、Ｆ１３０などのアミノ酸は、ｃｒｔＷ酵素の活性に完全または部分的に必要であることが知られている（Rick et al.,Appl Environ Microbiol. 2006 Sep;72(9):5829-37）。Rick等はｃｒｔＷ酵素に変異を加えた細菌で、ゼアキサンチンの産生比率が増加したことを報告している。したがって、これらのアミノ酸を性質の異なるアミノ酸に変異させたｃｒｔＷ酵素は完全にまたは部分的に機能せず、細菌はβ－クリプトキサンチンを産生することが予想される。本発明の一態様において、ｃｒｔＷ遺伝子の欠失または不活性化は、これらのアミノ酸をアラニンまたは性質の異なるアミノ酸に変異させるような遺伝子の変異を含む。性質の異なるアミノ酸への変異は、塩基性アミノ酸（ヒスチジンなど）から中性アミノ酸（チロシンなど）または酸性アミノ酸への変異、酸性アミノ酸（アスパラギン酸など）から中性アミノ酸または塩基性アミノ酸への変異、中性アミノ酸（芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン）から酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸への変異が含まれる。
　本発明の一態様において、本発明における部分的または完全に欠失または不活性化されたｃｒｔＷ遺伝子は、例えば、配列番号３または５の塩基配列または配列番号４または６のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するが、これらに限定されるわけではない。また、本発明の別の態様において、本発明における部分的または完全に欠失または不活性化されたｃｒｔＷ酵素は、例えば、配列番号３または５の塩基配列にコードされるアミノ酸配列または配列番号４または６のアミノ酸配列を有するが、これらに限定されるわけではない。なお、ＺＸＡ－３株は、遺伝子解析の結果、ＺＸＡ－２３株と同じ箇所に変異を有することが確認された。ＺＸＡ－３株のｃｒｔＷの塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｃｒｔＷ酵素の活性は、例えば遺伝子シークエンシングを用いて間接的に決定することができる。このようにして、部分的又は完全な欠失又は不活性化の突然変異を容易に同定することができる。
　本明細書において、「機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能」という用語は、ｃｒｔＷ酵素の活性がない又は実質的にないことを意味する。さらに詳しくは、「機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能」という用語は、ｃｒｔＷ酵素活性が、アスタキサンチン生産細菌のｃｒｔＷ酵素活性の２０％未満であることを意味する。例えば、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌のｃｒｔＷ酵素活性は、野生型ｃｒｔＷ酵素活性の２０％未満、１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、更により好ましくは１％未満である。前述したように、最も好ましくは、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌は、そのｃｒｔＷ酵素活性は検出不能であるか、又は実質的若しくは完全に失われている。
　「ｃｒｔＷ酵素活性」は、カロテノイドにケトンを付加する能力を意味し、例えば、β－カロテンをエキネノンに変換する活性、エキネノンをカンタキサンチンに変換する活性、β－クリプトキサンチンをアステロイデノンに変換する活性、β－クリプトキサンチンを３－ヒドロキシエキネノンに変換する活性、３－ヒドロキシエキネノンをアドニルビンに変換する活性、ゼアキサンチンをアドニキサンチンに変換する活性、アストロイデノンをアドニルビンに変換する活性、アドニキサンチンをアスタキサンチンに変換する活性が含まれる。
　本発明においては、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌は、分子生物学的方法を用いる当該技術分野で既知の任意の手段によって得るか、または上記の変異処理により得られる変異体のスクリーニングによって得ることができる。本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌の内因性ｃｒｔＷ遺伝子またはｃｒｔＷが発現されるプロモーターは、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能なように部分的または完全に欠失または不活性化されている。遺伝子破壊の技術は、当分野で既知のものを使用することができる。例えば、内因性ｃｒｔＷ遺伝子のコード領域を、完全または部分的に除去する、もしくは不活化する、またはプロモーター領域を完全または部分的に除去もしくは突然変異誘発によって不活化することができる。あるいは、内因性ｃｒｔＷ遺伝子にノックイン変異を施し、それにより内因性コード配列を破壊してもよい。例えば、未成熟終止コドンまたはフレームシフト変異を導入することができる。機能的なｃｒｔＷ酵素が全くまたは実質的に産生されない限り、ｃｒｔＷ遺伝子はミスセンス変異またはナンセンス変異を包含することができる。
　上記のような機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌も本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌に含まれ、当業者は当分野の技術常識に基づき作製することができる。
（３）上記（１）および（２）の記載に基づき、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を取得することができる。本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、変異前の細菌（例えば、親株）と比較して、理論的には培養時の溶存酸素濃度にかかわらずβ－クリプトキサンチンを多量に生産するようになる。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、変異前の細菌よりも、生産される総カロテノイド量に対するβ－クリプトキサンチン産生量が高いことが期待される。β－クリプトキサンチンの産生量は、対象の細菌を培養して得られた培養液中のカロテノイド量を分析することにより測定することができる。
　例えば、生産菌の生育に必要で、カロテノイドを生成する成分を含む培地で培養を行う。培養方法は試験管、フラスコ等における振とう培養、通気撹拌培養等いずれの方法でもよい。カロテノイド化合物の分析方法は、カロテノイド化合物を分離検出できる方法なら何でも良いが、例えば、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等を用いることができる。本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌の取得は、例えば、総カロテノイド量に対するβ－クリプトキサンチンの産生比率の高い変異株を選抜することにより行うことができる。総カロテノイド量とは、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β－カロテン、エキネノン、ゼアキサンチン、β－クリプトキサンチン、３－ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、アドニルビン等のカロテノイドの総量を示す。β－クリプトキサンチンの比率は、変異前の細菌（例えば、親株）のβ－クリプトキサンチンの生産比率より高いことが最低限の条件であるが、例えば、生産される総カロテノイド量に対してβ－クリプトキサンチンを好ましくは２０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは４０％（ｗ／ｗ）以上、さらに好ましくは６０％（ｗ／ｗ）以上のβ－クリプトキサンチン比率を示す変異株を選抜してもよい。本発明には、変異前の細菌としてアスタキサンチンを生産する細菌を使用し得るが、一般にアスタキサンチンを生産する細菌は、β－クリプトキサンチンを生産しないか、生産したとしても生産量は極めて少量である。例えば、アスタキサンチンを生産するパラコッカス属に属する細菌を培養し、生産されたカロテノイドの量の例を以下に示す。細菌の培養及びカロテノイドの測定は実施例に記載した方法と同様の方法で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、（１）または（２）の変異処理後に寒天培地上にコロニーを形成させ、黄色～橙色を呈するコロニーを選択することで効率的に選択することが可能である。β－クリプトキサンチンを生産する細菌は、黄色～橙色を呈するコロニーを形成することから、黄色～橙色を呈するコロニーを選抜することで、β－クリプトキサンチンを生産する目的の細菌（本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌）を効率的に選択することができる。本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌がβ－クリプトキサンチンを生産することは、選択したコロニーを試験管やフラスコ等で培養し、β－クリプトキサンチンを定量し、β－クリプトキサンチンの生産量を求めることにより確認してもよい。選抜するコロニーの色は、黄色、橙色または黄色と橙色の間の色であり、アスタキサンチン等を生産する細菌のコロニーの呈する赤色とは明らかに異なるため、この方法により目的の細菌を簡便にかつ確実に選択し得る。
　本発明の別の態様において、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、変異前の細菌（例えば、親株）と比較して内因性のｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能である。内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化されていることは、細菌に含まれるｃｒｔＷ遺伝子を解析により確認することができる。解析は、例えば、遺伝子配列決定、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ解析、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析などの公知の技術を用いて実施することができる。また、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生できないことは、ウェスタンブロット解析、免疫染色等によりｃｒｔＷ酵素の発現を確認することや、ケト化されたカロテノイドの産生量の測定などのｃｒｔＷ酵素活性の測定によって確認することができる。
２．本発明の製造方法
　本発明は、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を所定の溶存酸素濃度下に培養して、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法に関する。本明細書において、培養液中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整することを含む、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を培養してβ－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法、あるいは、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する工程を含む、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法が開示される。本発明の製造方法において製造されるカロテノイドは、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンから選択される1以上のカロテノイドである。本発明の別の態様において、本発明の製造方法において製造されるカロテノイドは、β－クリプトキサンチンである。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌の培養中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に低く調整すると、β－クリプトキサンチンが効率的に生産され、培養液当たりのβ－クリプトキサンチンの生産量が高く、あるいは、生産される総カロテノイド量に対するβ-クリプトキサンチン濃度が高くなる。本発明の別の態様において、β－クリプトキサンチン及びβ－カロテンが効率的に生産される。
　β－クリプトキサンチンを効率的に生産するために、培養液中の溶存酸素濃度を、０．８ｐｐｍ以下、好ましくは０．７ｐｐｍ以下、より好ましくは０．６ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０．５ｐｐｍ以下、最も好ましくは０．４ｐｐｍ以下に調整する。培養液中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍの条件下で培養することにより、培養液当たりのβ-クリプトキサンチン量を高めることができる。
　本明細書において、「％」および「ｐｐｍ」の値は、体積比を意味し、「１ｐｐｍ」は「１ｍｇ／Ｌ」は同じ意味である。培養液の質量は、同一の体積を有する水の質量とほぼ等しく、両者が等しい場合に「ｐｐｍ」の値は質量比を意味し、「１ｐｐｍ」は「１ｍｇ／ｋｇ」は同じ意味である。
　培養液中の溶存酸素は、溶存酸素電極により測定される。溶存酸素電極は、例えば、丸菱バイオエンジ社製（型番：ＯＸ-２５００）を用いて測定することができる。溶存酸素電極は、大気中に５分間放置したときの酸素量を１００％、５０ｇ／Lの亜硫酸ナトリウム水溶液中に５分間放置したときの酸素量を０％として校正する。大気下の水中では、溶存酸素濃度は８ｐｐｍで平衡状態になるため、大気中に５分間放置したときの酸素量１００％は、水中における溶存酸素濃度８ｐｐｍに換算される。
　溶存酸素濃度の調整は、通常培養で用いられる方法で制御される。例えば、溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度に応じて、培養槽内に供給する空気あるいは酸素の流量を自動的に調整する方法、溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度に応じて攪拌羽根の回転速度または回転数を自動的に調節する方法、あるいは通気量および回転速度または回転数の両方を調整する方法を用いることができる。
　本方法において培養に用いる培地（以下、「β－クリプトキサンチン生産用培地」ともいう）は、培養液中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下で培養した際に本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌が生育し、β－クリプトキサンチンを生産するものであればいずれでもよい。炭素源、窒素源、無機塩類および必要に応じてビタミン類等を含有する培地が好ましく用いられる。
　炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトールおよびマルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸およびピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノールおよびグリセノール等のアルコール類、大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油およびアマニ油等の油脂類等が挙げられ、好ましくはグルコースまたはシュークロースが用いられる。また、これらの炭素源を、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。培養前の培地（始発培地）に添加する炭素源の量は、炭素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌ当たり１～１００ｇ、好ましくは２～５０ｇである。また、炭素源は始発培地に添加するだけでなく、培養途中に逐次的または連続的に追加供給することも好ましく行われる。
　本明細書において、数値範囲について「～」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値および上限値を含むものとする。例えば、「１～１００」という記載では、下限値である「１」、上限値である「１００」のいずれも含むものとする。すなわち、「１～１００」は、「１以上１００以下」と同じ意味である。
　無機窒素源としては、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩類、硝酸カリウム等の硝酸塩類、アンモニアおよび尿素等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。添加量は、窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．１ｇ～２０ｇ、好ましくは０．２～１０ｇである。
　有機窒素源としては、例えば、コーンスティープリカー（ろ過処理物を含む）、ファーマメディア、大豆粕、大豆粉、ピーナッツミール、グルタミン酸ナトリウム、ディスティラーズソルブルおよび乾燥酵母等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。添加濃度は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地において０～８０ｇ／Ｌ、好ましくは０～３０ｇ／Ｌである。
　無機窒素源および有機窒素源は、通常始発培地に添加するが、逐次的または連続的に追加供給することも好ましく行われる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム等のリン酸塩類、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグネシウム塩類、硫酸鉄、塩化鉄等の鉄塩類、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩類、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム等のナトリウム塩類、硫酸マンガン等のマンガン塩類、塩化コバルト等のコバルト塩類、硫酸銅等の銅塩類、硫酸亜鉛等の亜鉛塩類、モリブデン酸ナトリウム等のモリブデン塩類、硫酸ニッケル等のニッケル塩類、セレン酸ナトリウム等のセレン塩類、ホウ酸およびヨウ化カリウム等が挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。添加量は無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０００１～１５ｇである。リン酸塩類、マグネシウム塩類、カルシウム塩類、ナトリウム塩類および鉄塩類では、培地における濃度は、０．０２～１５ｇ／Ｌが好ましく、マンガン塩類、コバルト塩類、銅塩類、亜鉛塩類、モリブデン塩類、ニッケル塩類、セレン塩類、ホウ酸、ヨウ化カリウム等を加える場合には、０．１～１５ｍｇ／Ｌが好ましい濃度である。無機塩類は通常始発培地に添加するが、逐次的または連続的に追加供給してもよい。
　ビタミン類としては、例えば、シアノコバラミン、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、アスコルビン酸、葉酸、ナイアシン、ｐ－アミノ安息香酸、イノシトール、コリン、ビオチン等を用いることができる。添加割合はビタミン類の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．００１～１０００ｍｇであり、好ましくは０．０１～１００ｍｇである。ビタミン類は通常始発培地に添加するが、逐次的または連続的に追加供給してもよい。
　本発明において、培養液の発泡を抑えるために消泡剤が好ましく用いられる。消泡剤の種類は泡の発生を抑制するかまたは発生した泡を消す作用があり、かつ生産菌に対する阻害作用の少ないものであれば何れでもよい。例えば、アルコール系消泡剤、ポリエーテル系消泡剤、エステル系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、シリコン系消泡剤、スルフォン酸系消泡剤等を例示することができる。消泡剤の添加量は、消泡剤の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０１ｇ～１０ｇである。
　消泡剤は通常殺菌前の始発培地に添加する。さらに、消泡剤を培養途中に連続的または間欠的に追加添加してもよい。培養途中に消泡剤を添加する方法としては、例えばセンサーで泡を感知して自動添加する方法、プログラムタイマーで一定時間ごとに添加する方法、生育速度に連動するようにフィード用炭素源、窒素源またはｐＨ調整剤等と混合して添加する方法等が挙げられる。始発培地に添加する消泡剤と培養途中に培養液に添加する消泡剤とは同種でもよいが、作用に合わせて異なる種類を用いることもできる。
　本方法において、培養開始時の培地のｐＨは２～１２、好ましくは６～９、より好ましくは６．５～８．０に調整する。培養中も上記範囲のｐＨを維持することが好ましい。ｐＨを維持する方法として、発酵槽内に設置したｐＨ電極で培養液のｐＨをオンラインで測定し、アルカリを自動供給する方法が好ましい。ｐＨ調整剤としては、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、アンモニア水、アンモニアガス、硫酸水溶液またはこれらの混合物が挙げられる。
　本方法において、培地は殺菌処理した後、細菌の培養に用いられる。殺菌処理は、当業者であれば、適宜行うことができる。例えば、適切な容器中の培地をオートクレーブで加熱滅菌すればよい。あるいは、滅菌フィルターによりろ過滅菌すればよい。あるいは、ジャケット加熱とスチーム吹き込みにより滅菌すればよい。グルコース等の炭素源は他の培地成分と一緒に加熱殺菌すると褐変するので別に殺菌してもよい。ビタミン類や微量の金属類は主培地と一緒に加熱殺菌しても良いが、失活や沈殿化を防ぐために別に殺菌しても良い。
　本方法において、β－クリプトキサンチン生産細菌は、上記のように調製されたβ－クリプトキサンチン生産用培地に植菌され、所定の条件で培養される。植菌は、試験管、フラスコあるいは発酵槽等を用いたシード培養により菌株を適宜増やし、得られた培養液をβ－クリプトキサンチン生産用培地に加えることで行ってもよい（本培養）。
　本培養の前にシード培養を実施しても良く、シード培養は、当業者に公知の方法に従い実施することができる。シード培養に用いる培地は、β－クリプトキサンチン生産細菌が良好に増殖する培地であれば特に限定されない。
　培養は、適切な培養容器において行われる。培養容器は培養容量により適宜選択することができ、例えば、試験管、フラスコ、発酵槽等を挙げることができる。
　培養温度は、例えば１５～４０℃、好ましくは２０～３５℃、より好ましくは２５℃～３２℃である。また、培養期間を通常１日～２０日間、好ましくは１～１２日間、より好ましくは２～８日間、特に好ましくは３～７日間としえる。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は好気的条件で培養される。好気条件としては、例えば、振とう培養または通気撹拌培養等が挙げられる。本培養においては、前述のとおり、溶存酸素濃度が調整される。
　本培養開始後から本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌が十分増殖するまで、好気的条件で培養される（第一培養工程）。好気的条件下での培養（第一培養工程）は、β－クリプトキサンチン生産用培地での培養開始後５～８０時間、好ましくは１０～７０時間、１０～６０時間、より好ましくは１０～５０時間、さらに好ましくは１０～４０時間、より好ましくは１０～３６時間実施する。あるいは、第一培養工程は、２０～８０時間、２０～６０時間、２０～４０時間、２０～３６時間実施してもよい。このときの溶存酸素濃度は、０．８ｐｐｍ以上であり、例えば、１ｐｐｍ以上、好ましくは１．５ｐｐｍ以上、より好ましくは２ｐｐｍ以上である。
　本発明の一態様において、第一培養工程は、測定波長６１０ｎｍで測定した培養液の濁度が第一培養工程の開始時の濁度と比較して、少なくとも５以上増加するまで続けることができる。第一培養工程の開始時からの濁度の増加は、少なくとも５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上または２０以上である。例えば、１０～３６時間培養すると、濁度の上昇率が高く、その場合の濁度の上昇は約２０～４００である。
　また、第一培養工程では、上記のとおり溶存酸素濃度は０．８ｐｐｍ以下に保持されるものではなく、溶存酸素濃度は培養開始から徐々に減少し、減少ピークを迎えた後上昇に転ずる。本発明の別の態様において、第一培養工程は、溶存酸素濃度が最も低くなるまで続けてもよい。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌が十分増殖した後、培養液の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下の条件下で培養することで、β－クリプトキサンチンを効率的に生産することができる（第二培養工程）。本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌が十分増殖する前に溶存酸素を０．８ｐｐｍ以下で培養すると細菌が十分に増殖しないため、β－クリプトキサンチンの収率の低下につながり得る。したがって、培養液中で、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を増殖させた後に、０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素の培養液で培養することによって、効率的にβ－クリプトキサンチンを生産することができる。本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌は、溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整した後、５～２００時間、好ましくは１０～１５０時間、より好ましくは１０時間～１００時間、２０～８０時間、３０～６０時間、４０～６０時間、例えば４０時間培養することができる。この間の培養中、溶存酸素濃度は０．８ｐｐｍ以下に保持される。
　したがって、本発明のβ－クリプトキサンチンの製造方法は、
（ｉ）増殖させた本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌または測定波長６１０ｎｍで測定した培養液の濁度が第一培養工程の開始時の濁度と比較して５以上増加した本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌の培養液における溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整し、
（ｉｉ）前記本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する、
第二培養工程を含むことができる。上記方法により、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドが製造される。
　また、本発明の別の態様において、本発明のβ－クリプトキサンチンの製造方法は、（ａ）培養液中でパラコッカス属細菌を増殖させる、または培養液を測定波長６１０ｎｍで測定した濁度が、第一培養工程開始時の濁度と比較して５以上増加するまで本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を培養する第一培養工程と、
（ｂ）第一培養工程終了後、本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する第二培養工程、
とを含むことができる。上記方法により、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドが製造される。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を上記にしたがい培養することにより、β－クリプトキサンチンを効率的に生産することができる。最終的に得られる培養終了後の培養液中のβ－クリプトキサンチンの生産量は、培養液あたり１０ｍｇ／Ｌ以上、１５ｍｇ／Ｌ以上、２０ｍｇ／Ｌ以上であり得る。また、最終的に得られる培養終了後の培養液中の総カロテノイド量に対するβ－クリプトキサンチンの生産濃度は、３．５質量％以上、４質量％以上、４．５質量％以上であり得る。
　本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を培養して得られる培養液中のカロテノイド、または培養液から採取されたカロテノイドの定量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。
　本発明の製造方法は、培養物からβ－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを回収する工程をさらに含有することができる。例えば、上記のように本発明のβ－クリプトキサンチン生産細菌を培養し、得られる培養液は、β－クリプトキサンチンまたはβ－クリプトキサンチンを含むカロテノイドとしてそのまま使用してもよく、あるいは、培養液から例えば培養上清、菌体濃縮物(菌体濃縮液)、湿菌体、乾燥菌体、菌体溶解物等を調製して、これら調製物を使用してもよい。さらには、これら培養液または調製物からβ－クリプトキサンチン等のカロテノイドを抽出、精製等により採取することができる。
　培養上清は、培養液を遠心処理またはろ過処理することで、培養液から菌体を除いて調製すればよい。菌体濃縮物(菌体濃縮液)は、培養液を遠心分離、膜ろ過濃縮またはデカンテーションすることにより得ることができる。湿菌体は、培養液を遠心またはろ過することにより得ることができる。乾燥菌体は、培養液、湿菌体または菌体濃縮物(菌体濃縮液)を一般的な乾燥方法によって乾燥させることにより得ることができる。
　菌体濃縮物を得る工程において培養液のｐＨは特に限定されないが、カロテノイドが沈降しやすくするために、培養液を酸性にしてもよい。酸性条件は酸性域であればいずれのｐＨでもよいが、好ましくはｐＨ６．５以下、より好ましくはｐＨ５．５以下、さらに好ましくはｐＨ５．０以下である。不要な成分の除去効果を高めるために、水で培養液を希釈してから濃縮することも好ましく行われる。また、遠心分離、ろ過分離、デカンテーションとの操作において水を加えてもよい。
　遠心分離に用いる遠心分離機は連続式でもバッチ式でもよいが、好ましくは連続式が用いられる。遠心分離機のタイプとしては、例えばかご型、多室型、デカンター型、ディスク型(ノズル型、ディスラッジ型)、チューブラー型、ローター型の遠心分離機が挙げられる。
　ろ過分離に用いられる膜ろ過装置はスタティック型でもクロスフロー型でも良いが、目詰まりを防止しやすいクロスフロー型が好ましい。膜の材質は、例えばろ紙、ろ布、化学繊維、セラミック等を例示することができる。
　乾燥の方法は特に限定されないが、例えば噴霧乾燥、流動乾燥、噴霧流動造粒乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。乾燥後に微粉末化するために、乾燥菌体を粉砕することも好ましく行われる。粉砕の方法は特に限定されないが、例えばビータミル、ハンマーミル、ボールミル、ビーズミル等が挙げられる。
　このようにして得られたβ－クリプトキサンチン等のカロテノイドまたはβ－クリプトキサンチンを含むカロテノイド含有乾燥菌体組成物などの調製物をそのまま、例えば、飼料用または食品用の添加物として用いることができる。
　また、本発明おいて、β－クリプトキサンチン等のカロテノイドまたはカロテノイドを上記培養液または調製物から採取する方法は、特に限定されず、カロテノイドが安定に効率よく回収されるいずれの方法でもよい。これらの方法は、当業者であれば公知の抽出や精製技術から適宜選択して行うことができる。
　得られた抽出物、調製物、精製物等は、β－クリプトキサンチン等のカロテノイドまたはカロテノイドとしてそれぞれ単独で用いることができ、あるいはこれらを任意の割合で混合して用いることもできる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
１．菌株の作製
　Paracoccus carotinifaciens E-396株(FERM BP-4283)をＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジンで変異処理し、赤色の濃いコロニーを選択した。選択した菌株を試験管で培養し、カロテノイド濃度を測定し、アスタキサンチン生産能が高い変異株ＬＰ－２６株を選択した。次にＬＰ－２６株をＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジンで変異処理し、黄色～橙色のコロニーを選択し、ＢＣ－６０、ＢＣ－６５、ＢＣＡ－２６、ＺＸＡ－３、ＺＸＡ－２３株を得た。ＬＰ－２６株の1回の変異処理あたり、所望の黄色～橙色を呈するコロニーが少なくとも１つ取得できた。
　溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整せずに培養した場合、取得した５つの菌株は全てβ－クリプトキサンチン、β－カロテンおよびゼアキサンチンを産生した（「３」）。また、同様に取得した１８５株についても、溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整せずに、５Ｌ容量の培養槽（１２株）または試験管レベル（１８５株）で培養を行ったところ、β－クリプトキサンチン、β－カロテンおよびゼアキサンチンを産生することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
２．菌株の培養
　上記「１」で得られた菌株を、以下のように培養した。
（シード培養）
　シード培養に用いた培地の組成は以下のとおりである：シュークロース３０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物０．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物１４．３ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物０．３ｇ／Ｌ、消泡剤０．１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２。
　上記組成の培地２Ｌを５Ｌ容量の培養槽（ジャーファーメンター）に入れ、１２１℃、３０分蒸気殺菌し、シード培地を作製した。シード培地に「１．」で得られた菌株を植菌し、２８℃で３０時間、４００ｒｐｍで攪拌し培養を行った。この時の溶存酸素濃度は４．８ｐｐｍであった。シード培養において、濁度は２０増加した。
（本培養）
　次に，シード培養を経た培養液２１６ｍｌ分を色素生産用培地が１．８Ｌ入った５Ｌ容量の通気撹拌培養槽（ジャーファーメンター）に植菌した。２８℃で培養を行った。本培養開始から１０～３６時間（第一培養工程）経過後、培養液中の溶存酸素が０．８ｐｐｍ以下となるように溶存酸素濃度をコントロールし、０．８ｐｐｍ以下の状態を４０～６０時間保持した（第二培養工程）。第一培養工程の開始時から第一培養工程の終了時の濁度（測定波長６１０ｎｍ）の増加は、２０～４００であった。溶存酸素濃度は、溶存酸素電極と撹拌羽根のモーターとを連動させ、溶存酸素濃度値に応じて攪拌羽根の回転速度を自動的に調節することにより調整した。また、攪拌羽根の最低回転速度は４５５ｒｐｍに設定した。培養中のｐＨは、１４％アンモニア水を連続的に滴下することで７．０～７．４に制御した。グルコースは生育とともに消費されるため、培養液中のグルコース濃度が５～３０ｇ／Ｌに維持されるように添加した。β－クリプトキサンチン量の測定用に、０．８ｐｐｍ以下の状態を４０～６０時間保持した培養液の一部を採取した。
　色素生産用培地の組成を以下に示す：グルコース４０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．３ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５．７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．３ｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム１水和物６ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物１．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物４．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物１．０ｇ／Ｌ、硫酸マンガン５水和物０．１ｍｇ／Ｌ、ホウ酸５ｍｇ／Ｌ，硫酸亜鉛７水和物１．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水和物２．３ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水和物０．６３ｍｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム１．０ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水和物０．１０ｍｇ／Ｌ、タングステン酸ナトリウム１ｍｇ／Ｌ、硫酸ニッケル６水和物１ｍｇ／Ｌ、セレン酸ナトリウム０．１ｍｇ／Ｌ、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）６水和物０．１ｍｇ／Ｌ、塩化クロム（ＩＩＩ）６水和物０．１ｍｇ／Ｌ、ｍｙｏ－イノシトール５０ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸３０ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩２０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１５ｍｇ／Ｌ、リボフラビン１０ｍｇ／Ｌ、ｐ－アミノ安息香酸１０ｍｇ／Ｌ、コリン１０ｍｇ／Ｌ、シアノコバラミン５ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸３０ｍｇ／Ｌ、葉酸１ｍｇ／Ｌ、ナイアシン１５ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．０５０ｍｇ／Ｌ、ポリエーテル系消泡剤０．５ｇ／Ｌ。
［測定方法］
　溶存酸素の測定は、以下の装置を用いた。
DO測定装置：丸菱バイオエンジ社製、型番OX-2500
　培養液の濁度は次のとおり測定した。培養液の濁度は、汎用分光光度計により測定される。濁度は、例えば、エルマ販売会社製（型番：ＡＥ-４５０）を用いて測定することができる。濁度は、光路長１ｃｍの石英キュベットを用い、測定波長を６１０ｎｍに設定し、その吸光度から算出する。水の測定値を０として校正する。吸光度は０－１の間の値をとるが、値が１に近すぎると正しく測定できない可能性があるため、０．７以下の測定値となるよう必要に応じて培養液を水で希釈してから測定する。希釈した培養液の濁度は、測定で得た吸光度に、希釈倍率をかけて補正することで算出される。
３．β－クリプトキサンチンの測定
　β－クリプトキサンチン、ゼアキサンチンおよびβ－カロテン量はHPLC（Waters社製、alliance(セパレーションモジュールe2695, ディテクター2489)）を用いて測定した。
　カラムはInertsil SIL-100A，5μｍ（φ4.6 mm×250 mm）（ジーエルサイエンス製）を２本連結して使用した。溶出は、移動相であるｎ－ヘキサン：テトラヒドロフラン：メタノール混合液（２０：４０：１）を用い、室温付近一定の温度にて毎分１．０ｍＬの流速で行った。
　上記「２．」で採取した培養液をｎ－ヘキサン：テトラヒドロフラン：メタノール混合液（４０：２０：１）で溶解し、得られたサンプルを移動相にて１０倍希釈した液２０μＬをカラムに注入した。カラム溶離液の検出は波長４５５ｎｍであった。また、定量のための標準品としては、EXTRASYNTHESE S.A.製β－クリプトキサンチン（Ｃａｔ．Ｎｏ．０３１７Ｓ）、ゼアキサンチン（Ｃａｔ．Ｎｏ．０３０７Ｓ）および富士フイルム和光純薬社製β－カロテン（Ｃａｔ．Ｎｏ．０３１－０５５３１）を用いた。
　結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記「１．」で取得した５つの菌株（ＢＣ－６０、ＢＣ－６５、ＢＣＡ－２６、ＺＸＡ－３、ＺＸＡ－２３株）の全てでβ－クリプトキサンチン、β－カロテン及びβ－クリプトキサンチンが生産した。表４の結果から、０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度でβ－カロテノイド生産細菌を培養することにより、β－カロテノイドの産生量が向上することが示された。特に、培養液当たりのβ－クリプトキサンチン量や総カロテノイド量に対するβ－クリプトキサンチン濃度は、溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ超で培養した場合（比較例）と比較して著しく向上した。
　また、測定されたカロテノイドは、いずれもβ－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンであり、アドニキサンチンやアスアキサンチンの生産は検出されなかった。
４．菌の遺伝子解析
（１）ＢＣ－６０株およびＢＣ－６５株の遺伝子解析
　ＢＣ－６０株およびＢＣ－６５株の遺伝子を解析した。その結果、ＣｒｔＷ遺伝子に変異を有することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＢＣ－６０およびＢＣ－６５は、いずれもＣｒｔＷ遺伝子上のトリプトファンをコードするコドン（ｕｇｇ）がストップコドン（ｕｇａ：表５では「ＴＧＡ」として記載され、Ａが太字で表記されている）に変異していた。すなわち、ｃｒｔＷ遺伝子は、ストップコドン（トリプトファン→ストップ）を有するためにタンパク合成が途中で止まり、ｃｒｔＷ酵素は正常に機能していないことが分かる。
（２）ＺＸＡ－２３株の遺伝子解析
　ＺＸＡ－２３の遺伝子を解析した。その結果、ＣｒｔＷ遺伝子に変異を有し、ＣｒｔＷ酵素アミノ酸配列の６５番目のヒスチジンをコードするコドン（ｃａｕ）からチロシンをコードするコドン（ｕａｕ：表６では「ＴＡＴ」として記載され、最初のＴが太字で表記されている）へ変異していることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（３）ＺＸＡ－３株の遺伝子解析
　ＺＸＡ－３の遺伝子を解析した。その結果、ＣｒｔＷ遺伝子に変異を有し、ＣｒｔＷ酵素アミノ酸配列の６５番目のヒスチジンをコードするコドン（ｃａｕ）からチロシンをコードするコドン（ｕａｕ：表６では「ＴＡＴ」として記載され、最初のＴが太字で表記されている）へ変異していることが明らかとなった（配列番号５および配列番号６）。ＺＸＡ－３株における変異は、ＺＸＡ－２３株における変異と同じであった。
　ＣｒｔＷ酵素アミノ酸配列の６５番目のヒスチジンは、ＣｒｔＷ酵素活性に重要であることが示されている（Rick et al.,Appl Environ Microbiol. 2006 Sep;72(9):5829-37）。変異したＣｒｔＷ酵素では、正電荷を有する塩基性アミノ酸であるヒスチジンが、電荷を有さない中性アミノ酸であるチロシンに変異しており、酵素活性が著しく損なわれることが推察される。
　以上の結果より、これらの変異株は、内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、それにより機能的なｃｒｔＷ酵素（βカロテンケトラーゼ）を産生することが不可能であることが裏付けられる。
　また、細菌においてｃｒｔＷ酵素が機能している場合は、ｃｒｔＷ酵素による変換により、βカロテンやゼアキサンチンがアドニキサンチンに変化するため、アドニキサンチンが生産される。細菌が生産するアドニキサンチンはHPLCにより検出される。一方、本願発明に係る菌株については、いずれもＨＰＬＣによりアドニキサンチンは検出されていない。したがって、本願発明に係る菌株は、内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なβカロテンケトラーゼを生産することが不可能であるといえる。
　本発明により、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを生産する細菌を提供することができる。本発明は、β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを生産する細菌を所定の溶存酸素濃度で培養することにより、β－クリプトキサンチンの産生量を向上させることができる。

Claims (10)

  1. 　パラコッカス属細菌を培養してβ－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法であって、
    　溶存酸素電極により測定した培養液中の溶存酸素濃度を０．８ｐｐｍ以下に調整することを含み、
    　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
  2. 　β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法であって、
    　パラコッカス属細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する工程を含み、
    　当該培養液の溶存酸素濃度が、溶存酸素電極により測定されるものであり、
    　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
  3. 　β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドを製造する方法であって、
    （ａ）培養液中でパラコッカス属細菌を増殖させる、または培養液を測定波長６１０ｎｍで測定した濁度が、第一培養工程開始時の濁度と比較して５以上増加するまでパラコッカス属細菌を培養する第一培養工程と、
    （ｂ）第一培養工程終了後、前記パラコッカス属細菌を０．８ｐｐｍ以下の溶存酸素濃度の培養液で培養する第二培養工程を含み、
    　当該培養液の溶存酸素濃度が、溶存酸素電極により測定されるものであり、
    　前記パラコッカス属細菌が、黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌である；または内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活性化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能な細菌である、前記方法。
  4. 　前記第二培養工程の培養時間が１０時間以上１００時間以下である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記第一培養工程の培養時間が１０時間以上７０時間以下である、請求項３または４に記載の方法。
  6. 　黄色～橙色を呈するコロニーを形成する細菌が、赤色を呈するコロニーを形成するパラコッカス属細菌を変異処理し、黄色～橙色を呈するコロニーを選択することにより取得されるものである、請求項１～５のいずれか1項に記載の方法。
  7. 　前記内因性ｃｒｔＷ遺伝子が、配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９０％同一な塩基配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記ｃｒｔＷ酵素が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか1項に記載の方法。
  9. 　β－カロテン、β－クリプトキサンチンおよびゼアキサンチンからなる群から選択される少なくとも1種のカロテノイドが、β－クリプトキサンチンである、請求項１～８のいずれか1項に記載の方法。
  10. 　内因性ｃｒｔＷ遺伝子が部分的または完全に欠失または不活化され、機能的なｃｒｔＷ酵素を産生することが不可能である、パラコッカス属細菌。
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