TW201730331A - 以含有鈷之培養基所得之類胡蘿蔔素產生細菌所進行之類胡蘿蔔素的發酵製造方法 - Google Patents

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Abstract

提供由微生物培養而以高收率且安定的製造類胡蘿蔔素的方法。類胡蘿蔔素產生細菌的培養方法，其係使用含有0.005μmol/L至20μmol/L的濃度的鈷或鈷鹽的培養基，培養類胡蘿蔔素產生細菌為特徵。

Description

以含有鈷之培養基所得之類胡蘿蔔素產生細菌所進行之類胡蘿蔔素的發酵製造方法
本發明是關於以類胡蘿蔔素產生細菌的類胡蘿蔔素的微生物學的製造方法。詳細而言，本發明是關於以產生還原蝦紅素(astaxanathin)、斑螯黃質(canthaxanthin)、玉米黃質(zeaxanthin)、β-隱黃質(β-cryptoxanthin)、茄紅素(lycopene)、β-胡蘿蔔素(β-carotene)、金盞花紅素(adonirubin)、金盞花黃質(adonixanthin)、海膽酮(echinenone)、海星酮(asteroidenone)及3-羥基海膽酮(3-hydroxyechinenone)等類胡蘿蔔素的微生物的發酵，製造該類胡蘿蔔素的方法。
類胡蘿蔔素是使用作為飼料添加物、食品添加物、醫藥品等有用的天然色素。在類胡蘿蔔素中，包含還原蝦紅素、斑螯黃質、玉米黃質、β-隱黃質、茄紅素、β-胡蘿蔔素、金盞花紅素、金盞花黃質、海膽酮、海星酮及3-羥基海膽酮等。其中尤其還原蝦紅素有用於作為養殖 魚的鮭魚、鱒魚、嘉鱲魚等的體色改善劑、家禽類的卵黃色改善劑等的飼料添加物。又，天然的還原蝦紅素是作為安全的食品添加物及健康食品素材而在產業上的價值高。金盞花黃質及金盞花紅素，與還原蝦紅素同樣作為飼料添加物、食品添加物、醫藥品等的用途而受期待。
再者，β-胡蘿蔔素是使用作為飼料添加物、食品添加物、醫藥品等，斑螯黃質是使用作為飼料添加物、食品添加物、化粧品等，玉米黃質是使用作為食品添加物、飼料添加物等。再者，茄紅素、海膽酮、β-隱黃質、3-羥基海膽酮、海星酮等也作為飼料添加物、食品素材等的使用而受期待。該等的類胡蘿蔔素的製造方法而言，已知有化學合成法，由天然物的萃取法，由微生物的培養的產生方法等。
還原蝦紅素的化學合成法而言，已知有由β-胡蘿蔔素的變換的方法(Pure Appl.Chem.,57,741,1985(非專利文獻1))及由C15鏻鹽合成的方法(Helv.Chim.Acta,64,2436,1981(非專利文獻2))。由天然物的萃取法而言，由於還原蝦紅素是存在於鮭魚、嘉鱲魚等魚類及蝦、蟹、磷蝦等甲殼類，亦可能由該等萃取而採取。
由微生物的類胡蘿蔔素的生產方法而言，有：由綠藻類兩生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的培養法(日本特開2007-97584號公報(專利文獻1))、由紅色酵母法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的發酵法(日本特開平11-69969號公報(專利文獻2))，由屬於副球菌屬(Paracoccus) 的細菌(以下，也稱為「副球菌屬(Paracoccus)細菌」的發酵法，由屬於短波單胞菌屬(Brevundimonas)的細菌的發酵法(日本特開2006-340676號公報(專利文獻3))，由屬於赤桿菌屬(Erythrobacter)的細菌的發酵法(日本特開2008-259449號公報(專利文獻4))等的報告。生產類胡蘿蔔素的副球菌屬(Paracoccus)細菌的例而言，可舉E-396株及A-581-1株(日本特開平7-79796號公報(專利文獻5)及International Journal of Systematic Bacteriology(1999),49,277-282(非專利文獻3))。其他的產性類胡蘿蔔素生的屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌而言，可舉馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)MH1株(日本特表2001-512030號公報(專利文獻6))、海雲台副球菌(Paracoccus haeundaensis)BC74171株(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2004),54,1699-1702(非專利文獻4))、副球菌屬(Paracoccus)細菌N-81106株(日本特開2007-244205號公報(專利文獻7))、玉米黃質副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2003),53,231-238(非專利文獻5))及副球菌屬(Paracoccus sp.)PC-1株(WO 2005/118812號小冊(專利文獻8))等。
但是，在前述的類胡蘿蔔素的製造方法是有幾個問題點。例如，以化學合成法製造的類胡蘿蔔素由安全性的觀點給予消費者不好的印象。由天然物萃取的類胡蘿蔔素與化學合成法相比為製造成本格外高。以微生物的 製造中，以綠藻類及酵母的培養的產生是生產性低並且微生物有堅固的細胞壁，因此由培養物的類胡蘿蔔素萃取困難。
另一方面，以屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌製造類胡蘿蔔素時，有該菌體的增殖速度快速，類胡蘿蔔素的生產性高，由培養物的類胡蘿蔔素萃取容易等優點，有幾種培養方法及製造方法的報告。
舉例而言，日本特開2007-143492號公報(專利文獻9)說明在培養中添加鐵鹽的方法，WO2010/044469號小冊(專利文獻10)說明在培養基添加胺基酸的方法，日本特開2011-188795號公報(專利文獻11)說明在培養基添加生物素的方法，又，日本特開2012-139164號公報(專利文獻12)說明在培養基添加鈣化合物至3.6mM以上的方法。但是，以副球菌屬(Paracoccus)細菌的類胡蘿蔔素的發酵中，培養基成分對培養方法及製造方法有甚麼樣的影響，則詳細內容不明。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2007-97584號公報
[專利文獻2]日本特開平11-69969號公報
[專利文獻3]日本特開2006-340676號公報
[專利文獻4]日本特開2008-259449號公報
[專利文獻5]日本特開平7-79796號公報
[專利文獻6]日本特表2001-512030號公報
[專利文獻7]日本特開2007-244205號公報
[專利文獻8]WO2005/118812號小冊
[專利文獻9]日本特開2007-143492號公報
[專利文獻10]WO2010/044469號小冊
[專利文獻11]日本特開2011-188795號公報
[專利文獻12]日本特開2012-139164號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985
[非專利文獻2]Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981
[非專利文獻3]International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282
[非專利文獻4]International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702
[非專利文獻5]International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238
本發明者等以類胡蘿蔔素產生細菌製造類胡蘿蔔素為目的而實施培養時，面臨類胡蘿蔔素的生產性隨培養批次而有大變動，有時該細菌完全不生育，有不能安定製造的重大的課題。
本發明是有鑑於這樣的實際情況而完成的，其目的是 提供由微生物培養而以高收率且安定的製造類胡蘿蔔素的方法。
生產性因培養批次而變動的原因而言，可以設想不適當的通氣/攪拌、溫度的變動、pH的變動、溶存氧電極的性能異常、種菌的活性的變動、培養基原料的批別間差異、水中微量成分的變動、由於培養基滅菌引起的營養源的損失及抑制物質的生成、磁氣/振動的影響、電的刺激、雜菌污染、由裝置混入抑制物質等的種種原因，其原因究明實極困難。
本發明者等，為了解決上述課題而花費極大的勞力及時間，而精心研究，累積了多次的檢討的結果，發現培養基中的鈷為類胡蘿蔔素生產細菌的生育及類胡蘿蔔素的生產的重要因子，培養基中的鈷濃度過低時微生物不生育，而鈷濃度過高時微生物也是不生育。再者，本發明者等究明，在以往的方法中，由培養基的原料、水或發酵設備的金屬部分等，成為夾雜物而微量地混入於培養基的鈷的量是適量時，類胡蘿蔔素生產細菌的生育良好，且類胡蘿蔔素的生產濃度高的培養可以成立，混入的鈷的量沒有達到適量時培養不能成立，所以不能做安定的製造。
又，本發明者等發現，對培養所必要的鈷的量是微量，有適於培養的濃度範圍，並確認，在以往的技術中誰都沒有注意到的，培養基中的鈷的濃度對類胡蘿蔔素產生細菌的生育及類胡蘿蔔素生產是非常重要的要素。
即，本發明者等首次闡明，鈷為對類胡蘿蔔素產生細菌的生育及在類胡蘿蔔素生產上為必需的營養素，又其濃度有適當的範圍，而完成本發明的以類胡蘿蔔素產生細菌製造類胡蘿蔔素的微生物學上的製造方法，而解決了製造上的課題，使藉由微生物的安定的製造類胡蘿蔔素的方法得以實現。
本發明具有以下的特徵。
(1)類胡蘿蔔素高產生細菌的培養方法，其係使用以0.005μmol/L至20μmol/L的濃度含有鈷或鈷鹽的培養基培養類胡蘿蔔素產生細菌為特徵。
(2)類胡蘿蔔素高產生細菌的製造方法，其係使用以0.005μmol/L至20μmol/L的濃度含有鈷或鈷鹽的培養基，培養類胡蘿蔔素產生細菌為特徵。
(3)類胡蘿蔔素的製造方法，其係使用以0.005μmol/L至20μmol/L的濃度含有鈷或鈷鹽的培養基，培養類胡蘿蔔素產生細菌，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素為特徵。
(4)如在(1)至(3)的任1項所述的方法，培養基中的鈷或鈷鹽的濃度是0.005μmol/L至8μmol/L。
(5)如在(1)至(4)的任1項所述的方法，類胡蘿蔔素是，由還原蝦紅素、斑螯黃質、玉米黃質、β-隱黃質、茄紅素、β-胡蘿蔔素、金盞花紅素、金盞花黃質、海膽酮、海星酮及3-羥基海膽酮所成群組選出的至少一種。
(6)如在(1)至(5)的任1項所述的方法，類胡蘿蔔素產生細菌是屬於副球菌屬(Paracoccus)、短波單胞菌屬 (Brevundimonas)或赤桿菌屬(Erythrobacter)的細菌。
(7)如在(1)至(6)的任1項所述的方法，類胡蘿蔔素產生細菌是含有與16S核糖體RNA對應的DNA之鹼基序列是與序列編號1所述的鹼基序列有95%以上的同源性的DNA的細菌。
(8)如在(1)至(7)的任1項所述的方法，類胡蘿蔔素產生細菌是E-396株(FERM BP-4283)或A-581-1株(FERM BP-4671)或該等的變異株。
(9)類胡蘿蔔素高產生細菌，係由(2)及(4)至(8)的任1項所述的方法所製造。
(10)類胡蘿蔔素高產生細菌，乾燥菌體中含有至少36mg/g的類胡蘿蔔素。
(11)含有鈷的類胡蘿蔔素高產生細菌。
依照本發明，則不受培養基成分、水等原料的製造商、品級、生產批別、生產地的影響，以及發酵設備的材質、製造場所等的影響，而提供可安定得高生產性的類胡蘿蔔素的生產細菌或類胡蘿蔔素的製造方法。
第1圖表示培養基中的鈷存在濃度與菌體生育OD610及總類胡蘿蔔素生產濃度的關係圖。
第2圖表示培養基中的鈷存在濃度與菌體生育OD610及總類胡蘿蔔素生產濃度在低濃度域(0.001-0.1μmol/L)的 關係圖。
第3圖表示培養基中的鈷存在濃度與菌體生育OD610及總類胡蘿蔔素生產濃度在高濃度域(1-100μmol/L)的關係圖。
第4圖表示培養基中的鈷存在濃度與菌體生育OD610及總類胡蘿蔔素生產濃度在低濃度域(0-0.05μmol/L)的關係圖。
第5圖表示在添加氯化鈷的培養基及沒有添加的培養基的總類胡蘿蔔素量的批次間的差異圖。
以下，將本發明更詳細說明。本發明的範圍不受該等的說明所限定，對於以下的例示以外，在不損傷本發明的趣旨的範圍內也可以適宜變更而進行。
又，本說明書的表所述的數值，視所進行的實驗，有改變有效數字或四捨五入的數字的位數(下1位、下2位)等而表示的情況。因此，合計值所述的數值，與將各數值合計的值有不一致的情況。
本發明是關於將類胡蘿蔔素產生細菌安定的培養，製造類胡蘿蔔素的方法，本方法是在培養基中鈷或鈷鹽以規定濃度範圍內存在為特徵。
由本發明的方法，則可以將類胡蘿蔔素產生細菌安定的培養，安定的製造高濃度的類胡蘿蔔素。
本發明所用的細菌而言，只要是能產生類胡蘿蔔素的細菌則沒有任何限定，例如可舉屬於副球菌屬 (Paracoccus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、赤桿菌屬(Erythrobacter)的細菌。
較佳者是使用屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌、屬於短波單胞菌屬(Brevundimonas)的細菌或屬於赤桿菌屬(Erythrobacter)的細菌，更佳者是使用屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌。副球菌屬(Paracoccus)、赤桿菌屬(Erythrobacter)及短波單胞菌屬(Brevundimonas)，皆被分類為變形菌門(Proteobacteria)、α型變形菌綱(Alphaproteobacteria)，在細菌分類學上有共通性，因此在本發明中，可以使用屬於該等的屬的細菌。
在屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌中，類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)、馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)、海雲台副球菌(Paracoccus haeundaensis)及玉米黃質副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)可優先使用，特別是類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)可優先使用。作為屬於副球菌屬(Paracoccus)的細菌的具體的菌株的例，可舉類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株及副球菌屬(Paracoccus)細菌A-581-1株(FERM BP-4671)，該等的變異株也在本發明中可優先使用。
屬於赤桿菌屬(Erythrobacter)的類胡蘿蔔素產生細菌而言，例如可舉赤桿菌屬(Erythrobacter)JPCC M種(日本特開2008-259452)、赤桿菌屬(Erythrobacter)JPCC O種(日本特開2008-259449)等。
屬於短波單胞菌屬(Brevundimonas)的類胡蘿蔔素產生細菌而言、例如可舉短波單胞菌屬(Brevundimonas)SD212株(特開2009-27995)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)FERM P-20515,20516株(特開2006-340676)、波囊短波單胞菌(Brevundimonas vesicularis)(Gene,Vol.379,p.101-108,1 Sep 2006)等。
又，作為類胡蘿蔔素產生細菌，較佳是使用與對應於16S核糖體RNA的DNA鹼基序列是與被記載為序列編號1的E-396株的鹼基序列有高同源性的細菌。這裡所言的鹼基序列的同源性，較佳是95%以上，更佳是96%以上、再佳是97%以上、特佳是98%以上、最佳是99%以上。
與對應於16S核糖體RNA的DNA鹼基序列，意指將16S核糖體RNA鹼基序列中的U(尿嘧啶(uracil))以T(胸腺嘧啶(thymine))取代的鹼基序列。
根據該16S核糖體RNA鹼基序列的同源性的微生物的分類法，近年成為主流。以往的微生物的分類法，因為根據以往的運動性、營養要求性、糖的資化性等菌學的性質之故，產生因自然突然變異的形質變化等時，有將微生物錯誤分類的情況。相對於此，16S核糖體RNA鹼基序列是遺傳上極為安定，根據其同源性的分類法是比以往的分類法格外提高分類的信頼度。
類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株的16S核糖體RNA鹼基序列，與其他的類胡蘿蔔 素產生細菌馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)DSM 11574株、副球菌屬(Paracoccus)細菌N-81106株、海雲台副球菌(Paracoccus haeundaensis)BC 74171株、副球菌屬(Paracoccus)細菌A-581-1株、玉米黃質副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)ATCC 21588株、及副球菌屬(Paracoccus sp.)PC-1株的16S核糖體RNA鹼基序列的同源性，各分別為99.7%、99.7%、99.6%、99.4%、95.7%、及95.4%，可知該等是在分類學上極為近緣的菌株。因此，該等的菌株可說是形成產生類胡蘿蔔素的細菌的一個群組。因此，該等的菌株較佳使用於本發明，而可有效率的產生類胡蘿蔔素。
在本發明中，也可使用類胡蘿蔔素的生產性經改良的變異株。經改良的變異株的例而言，可舉還原蝦紅素生產能高的菌株(日本特開2001-95500)、選擇性地多產生斑螯黃質的菌株(日本特開2003-304875)、選擇性地多產生玉米黃質及β-隱黃質的菌株(日本特開2005-87097)、選擇性地多產生茄紅素的菌株(日本特開2005-87100)。
類胡蘿蔔素的生產性經改良的變異株，可由變異處理及篩選而取得。變異處理的方法是只要能引發變異則無特別的限定。例如，可使用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)及甲磺酸乙酯(EMS)等變異劑的化學的方法，紫外線照射及X線照射等物理的方法，基因重組及轉位子(transposon)等生物學的方法等。受變異處理的細菌是沒有特別的限定，但是較佳為類胡蘿蔔素產生細菌。又，變異株亦可為由自然引起的突然變異所生成者。
變異株的篩選方法是沒有特別的限定，例如，可例示由洋菜培養基上的菌落的色調而選出目的之變異株的方法之外，在試管、燒瓶、發酵槽等培養變異株，由利用吸光度、高速液體層析法、薄層層析法等的類胡蘿蔔素色素分析而選出目的的變異株的方法等。
變異及篩選的製程可進行1次，又，例如亦可由突然變異處理及篩選獲得變異株，將其再由變異處理及篩選而取得生產性經改良的變異株的方式，將變異及篩選製程重複進行2次以上。
作為本發明使用的類胡蘿蔔素產生細菌的例所舉例的E-396株，係在日本國獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄託中心，如下所述受國際寄託。
生物材料寄託機構：日本國獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄託中心(舊名稱：通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所)〒305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6
用於識別的標示：E-396
受寄託編號：FERM BP-4283
原寄託日：1993年4月27日
又，作為本發明使用的類胡蘿蔔素產生細菌的其他的例所舉例的A-581-1株，在上述機關如以下所述受國際寄託。
用於識別的標示：A-581-1
受寄託編號：FERM BP-4671
原寄託日：1994年5月20日
在本發明中，將上述的類胡蘿蔔素產生細菌，以含有規定濃度的鈷或鈷鹽的培養基培養，則可安定的生產高濃度的類胡蘿蔔素。
產生的類胡蘿蔔素是沒有特別的限定，但例如為還原蝦紅素、斑螯黃質、玉米黃質、β-隱黃質、茄紅素、β-胡蘿蔔素、金盞花紅素、金盞花黃質、海膽酮、海星酮或3-羥基海膽酮，較佳為還原蝦紅素、斑螯黃質、玉米黃質或β-隱黃質，更佳為還原蝦紅素或玉米黃質。由本發明製造的類胡蘿蔔素可為一種，亦可為複數種組合。
以下說明在本發明中培養上述細菌的方法。
本發明是關於使用含有規定濃度的鈷或鈷鹽的培養基培養類胡蘿蔔素產生細菌的方法。
在本發明中將鈷或鈷鹽添加於培養基，使該培養基含有規定濃度的方法是沒有特別限制，但例如，較佳可使用由氯化鈷、硝酸鈷、甲酸鈷、乙酸鈷、氧化鈷、溴化鈷、碳酸鈷、硫酸鈷、環烷酸鈷、油酸鈷、硬脂酸鈷、硫氰酸鈷、粉末鈷、氰鈷胺等選出的鈷化合物的1種或2種以上，以成為規定濃度範圍內的方式添加於培養基的方法。該等的鈷化合物可為無水物亦可為水合物。鈷化合物，較佳在培養開始前的進料時添加於培養基，亦可在培養開始後單次、逐次或連續的添加。
另外的添加方法，使用將作為夾雜物而含有微量鈷的培養基原料，以成為規定的鈷濃度範圍內的方式添加的方法。有含有微量的鈷的可能性的培養基原料，例如，可例示玉米漿(corn steep liquor)、PHARMAMEDIA®、大豆粕、大豆粉、花生粕、大豆蛋白腖(soy peptone)、可溶酒糟(distiller’s soluble)、乾燥酵母、酵母萃取物、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、鐵鹽類、錳鹽類、銅鹽類、鋅鹽類、鉬鹽類、鎳鹽類、硒鹽類、磷酸鹽類、鎂鹽類、鈣鹽類、水等。可使用將該等培養基原料的1種或2種以上以成為規定的鈷濃度範圍內的方式添加的方法。在該方法中，在培養基原料中含有的鈷的量，因製造商、生產批別、產地等而有變動的情況，也可將原料中的鈷含量適宜管理。該等作為夾雜物而含有微量的鈷的培養基原料，較佳是培養開始前的進料時添加於培養基，但亦可在培養開始後單次、或逐次的或連續的添加。
再另外的添加方法，亦可由所使用的含有鈷的材質所成的發酵設備，一邊使鈷溶出至規定的鈷濃度範圍內的方式而一邊培養。在攪拌軸、攪拌軸的軸承、密封部分等使用含有鈷的超合金而使鈷溶出也是包含在該方法內。在該方法中，溶出的鈷量會因設備的狀態等而變動，過少時則做為營養源不足，過多時會抑制生產，所以也可以分析培養基中的鈷濃度而適宜管理。
較佳亦可進行將由上述的添加鈷化合物的方法、添加作為夾雜物而含有微量的鈷的培養基原料的方法、及由含 有鈷的材質的發酵設備溶出而添加的方法中選出2種以上組合。
鈷化合物添加的時間點，有將從種培養基帶進來的鈷以在最終階段的生產用培養基中達到規定的濃度範圍內的方式而添加於種培養基的方法，或在種培養基及最終階段的生產培養基的二者添加鈷而使最終階段的生產培養基達到規定的濃度範圍內的方法，及在培養的最終階段在所使用的培養基添加該化合物的方法。
我們獲知在本發明中，在培養基中含有的鈷或鈷鹽的濃度過低或過高都不能使微生物的生育及類胡蘿蔔素的生產充分進行。這個見解，認為是濃度過低則做為營養源不足，又，過高則抑制微生物的生育及類胡蘿蔔素的生產的緣故。
培養基中的鈷或鈷鹽的濃度下限，較佳是0.005μmol/L以上、0.006μmol/L以上，更佳是0.01μmol/L以上，再佳是0.02μmol/L以上。濃度上限，較佳是20μmol/L以下，更佳是10μmol/L以下、9μmol/L以下、8μmol/L以下、7μmol/L以下、6μmol/L以下、5μmol/L以下，再佳是4μmol/L以下、3μmol/L以下、2μmol/L，最佳是1μmol/L以下。在本發明中，適宜選擇上述濃度上限及濃度下限，而可做為對培養必要的鈷等的濃度範圍，例如，0.005μmol/L至20μmol/L、0.006μmol/L至20μmol/L、0.01μmol/L至8μmol/L、0.02μmol/L至8μmol/L、0.02μmol/L至7μmol/L、0.02μmol/L至 6μmol/L、0.02μmol/L至1μmol/L等的範圍。但，上述範圍是例示，而不受該等的濃度範圍所限定。
在本發明的培養所用的類胡蘿蔔素生產用培養基，含有規定濃度的鈷或鈷鹽的培養基，但鈷以外，如類胡蘿蔔素產生細菌會生育，而能生產類胡蘿蔔素則可添加任意的成分。含有這種添加物的培養基可為任一種，但使用含有碳源、氮源、無機鹽類及視需要之維生素類等的培養基為佳。
碳源而言，例如，可舉葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇及麥芽糖等糖類，乙酸、富馬酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸、丙二酸及丙酮酸等有機酸，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、異丁醇及甘油等醇類，大豆油、米糠油、橄欖油、玉米油、胡麻油及亞麻仁油等油脂類等，其中較佳是使用葡萄糖或蔗糖。該等的碳源中，可使用1種或2種以上。在培養前的培養基(起始培養基)添加的量是因碳源的種類而有不同，但適宜調整即可，通常，在培養基每1L添加1至100g，佳者是2至50g。又，碳源不僅是添加於起始培養基，較佳亦可進行在培養中逐次的或連續的追加供給。
作為氮源，無機鹽而言，在硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽類，硝酸鉀等硝酸鹽類，氨及尿素等中，使用1種或2種以上。添加量是因氮源的種類而有不同，但適宜調整即可，通常，對培養基每1L添加0.1g至20g，較佳是0.2至10g。
又，有機氮源而言，例如，在玉米漿(包含過濾處理物)、PHARMAMEDIA®、大豆粕、大豆粉、花生粕、大豆蛋白腖、可溶酒糟、乾燥酵母、酵母萃取物、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、穀胺酸、天冬胺酸等中，使用1種或2種以上。添加濃度因氮源的種類而有不同，但適宜調整即可，通常，0至80g/L、較佳是1至30g/L。
無機氮源及有機氮源，通常添加於起始培養基，較佳亦可進行逐次的或連續的追加供給。
無機鹽類而言，例如，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉等磷酸鹽類，硫酸鎂、氯化鎂等鎂鹽類，硫酸鐵、氯化鐵等鐵鹽類，氯化鈣、碳酸鈣等鈣鹽類，碳酸鈉、氯化鈉等鈉鹽類，硫酸錳等錳鹽類，硫酸銅等銅鹽類，硫酸鋅等鋅鹽類，鉬酸鈉等鉬鹽類，硫酸鎳等的鎳鹽類，硒酸鈉等的硒鹽類，鎢酸鈉等的鎢鹽類，氯化鋁等鋁鹽類，氯化鉻等鉻鹽類，硼酸及碘化鉀等中，使用1種或2種以上。添加量因無機鹽的種類而有不同，但適宜調整即可，通常，對培養基每1L添加0.0001至15g。磷酸鹽類、鎂鹽類、鈣鹽類、鈉鹽類及鐵鹽類，較堆為0.02至15g/L，添加錳鹽類、銅鹽類、鋅鹽類、鉬鹽類、鎳鹽類、硒鹽類、鎢鹽類、鋁鹽類、鉻鹽類、硼酸、碘化鉀等時，則0.1至15mg/L為較佳濃度。無機鹽類通常添加於起始培養基，亦可逐次的或連續的追加供給。
維生素類而言，例如，可使用氰鈷胺、核黃素、泛酸、吡哆醇、硫胺素、抗壞血酸、葉酸、菸鹼酸、 對胺基安息香酸、生物素、肌醇、膽鹼等。添加比率因維生素類的種類而有不同，但適宜調整即可、通常，對培養基每1L添加0.001至1000mg，較佳是0.01至100mg。維生素類是通常添加於起始培養基，亦可逐次的或連續的追加供給。
在本發明中，為了抑制培養液的發泡較佳使用消泡劑。消泡劑的種類只要有抑制泡的發生或有消除發生的泡的作用，且對產生細菌的抑制作用少則任何發泡劑都可以。例如，可例示醇系消泡劑、聚醚系消泡劑、酯系消泡劑、脂肪酸系消泡劑、聚矽氧系消泡劑、磺酸系消泡劑等。添加量因消泡劑的種類而有不同，但適宜調整即可、通常，對培養基每1L添加0.01g至10g。
消泡劑通常添加於殺菌前的起始培養基。再者，亦可在培養中途連續的或間歇的追加添加。培養中途添加消泡劑的方法而言，可例示以感測器感知泡而自動添加的方法，以程序計時計每隔一定時間添加的方法，與生育速度連動的方式將進料用碳源、氮源或pH調整劑等混合而添加的方法等。添加於起始培養基的消泡劑及培養中途添加於培養液的消泡劑可為同種，但配合作用亦可使用不同的種類。
在本發明中，培養基的初期pH是調整在2至12，較佳是6至9，更佳是6.5至8.0。培養中較佳維持上述範圍的pH。pH調整劑而言，可例示氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、碳酸鈉水溶液、氨水、氨氣、硫酸水溶 液或該等的混合物。
在本發明中，培養基是在滅菌處理後，使用於細菌的培養。滅菌處理，只要為所屬技術領域者，則可適宜進行。例如，將適當的容器中的培養基以高壓釜加熱滅菌即可。或者，以滅菌過濾器過濾滅菌即可。
在本發明中，類胡蘿蔔素產生細菌，在如上述調製的培養基接種菌，在規定的條件下培養。接種菌，係由使用試管、燒瓶或發酵槽等種培養而將菌株適宜增殖，將所得的培養液添加於類胡蘿蔔素生產用培養基而實施。用於種培養的培養基，只要類胡蘿蔔素產生細菌能良好地增殖的培養基則沒有特別的限定，但需要含有生育所必要的最低限的鈷或鈷鹽。
培養是在適當的培養容器中進行。培養容器可因培養容量而適宜選擇，例如，可舉試管、燒瓶、發酵槽等。
培養溫度是15至40℃，較佳是20至35℃，更佳是25℃至32℃，通常是1日至18日，較佳是2至12日，更佳是3至8日，在好氣條件下進行培養。好氣條件而言，例如，可舉振盪培養或通氣攪拌培養等，較佳將溶存氧濃度調控在一定的範圍。溶存氧濃度的調控，例如，變化攪拌迴轉數、通氣量、內壓等而可適宜實施。溶存氧濃度較佳調控在0.3至10ppm，更佳是0.5至7ppm，再佳是1至5ppm。
在本發明中，培養類胡蘿蔔素產生細菌後的 類胡蘿蔔素產生細菌的菌體數可由OD測定。又，培養類胡蘿蔔素產生細菌所得的培養物中的類胡蘿蔔素，或由培養物採取的類胡蘿蔔素的定量，可由高速液體層析進行。如上述在培養類胡蘿蔔素產生細菌後，可由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
培養物，例如，可舉培養液、培養上清、菌體濃縮液、濕菌體、乾燥菌體、菌體溶解物等。培養上清可將培養液離心處理或過濾處理，而由培養液除去菌體而調製。菌體濃縮液可將培養液離心分離或膜過濾濃縮而得。濕菌體可將培養液離心或過濾而得。乾燥菌體可將濕菌體或菌體濃縮液以一般性的乾燥方法乾燥而得。如此所得含有類胡蘿蔔素的乾燥菌體可將其直接作為飼料添加物而使用。
所得的乾燥菌體中，至少含有36mg/g，例如36mg/g、37mg/g、38mg/g、39mg/g或40mg/g的類胡蘿蔔素。由所使用的菌體而乾燥菌體中所含的類胡蘿蔔素的量會變動，但例如含有36mg/g至50mg/g，更佳是含有36mg/g至45mg/g的類胡蘿蔔素。含有該等量的細菌也包含在本發明中。因此，本發明提供乾燥菌體中至少含有36mg/g的類胡蘿蔔素的類胡蘿蔔素高產生細菌(例如屬於副球菌屬(Paracoccus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)或赤桿菌屬(Erythrobacter)的細菌)。
在本發明中將類胡蘿蔔素由上述培養物採取的方法是沒有特別限定，只要類胡蘿蔔素能安定而有效率地回收則任何方法都可以。該等的方法，只要為所屬技術 領域者則能由公知的萃取、精製技術中適宜選擇而進行。又，在本發明中，也可將上述培養物使用作為含有類胡蘿蔔素的組成物。
在進行萃取之前，將培養物以使用鹼試劑或界面活性劑等的化學性處理，使用溶菌酵素、脂質分解酵素及蛋白分解酵素等的生化學處理，或超音波或粉碎等的物理性處理中，亦可進行1種或2種以上的處理。
例如，要將類胡蘿蔔素由培養物萃取時，用於萃取及清洗的溶媒是沒有特別的限定，但可舉甲醇、乙醇、異丙醇等低級醇類，丙酮、四氫呋喃、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸等。
如要盡量防止萃取操作中的類胡蘿蔔素的氧化時，可在氮氣等惰性氣體環境下處理。又，亦可選擇在醫藥品或食品使用的抗氧化劑而添加於萃取溶媒。或者，亦可組合該等的處理。又，為了盡量防止類胡蘿蔔素因光而分解，亦可在遮光條件下進行。
如此可以將所得的萃取物直接使用作為類胡蘿蔔素，也可再精製後使用。
分離在萃取操作後的萃取物中殘留的細菌等的方法是沒有特別的限定，但可使用膜濾過、離心分離、傾析等。
由萃取液獲得類胡蘿蔔素沉澱物的方法而言，一般是可舉加熱及/或減壓濃縮或晶析。此外，類胡蘿蔔素色素在 低溫下的析出，可由酸/鹼藥劑或各種鹽類的析出，不經濃縮而分離類胡蘿蔔素色素。在工業上使用時，晶析為佳。
所得的類胡蘿蔔素沉澱物，為了清洗必要時亦可以少量的低級醇類等溶媒懸浮攪拌。清洗的手法是沒有特別的限定，但例如，可舉在懸浮攪拌後濾取的方法或由沉澱物的上方通液的方法等，作為在實用上較佳的方法。
經如上述所得的培養物、萃取物或精製物，可分別單獨使用作為類胡蘿蔔素，也可將該等以任意的比率混合而使用。
[實施例]
以下，舉實施例更具體的說明本發明，但本發明的範圍不受以下的實施例所限定。
又，在實施例中的類胡蘿蔔素類的定量是使用高速液體層析(HPLC)如以下的方式進行。
管柱是將兩支Inertsil SIL-100A，5μm( 4.6mm×250mm)(GL Science製)連結使用。溶出是將移動相的正己烷：四氫呋喃：甲醇混合液(40：20：1)在室溫附近一定的溫度下每分鐘通入1.0mL而進行。在測定時，將試樣溶解於四氫呋喃而以移動相稀釋100倍的溶液20μL作為注入量，管柱溶離液的檢出是在波長470nm進行。又，為了定量的標準品是使用Sigma公司製還原蝦紅素(Cat.No.A9335)。標準液的還原蝦紅素濃度的設定是測定標準液的477nm的吸光度(A)及以上述條件進行HPLC分析時的還原蝦紅素峰的面積百分率%(B)後，使用以下的式進行。
還原蝦紅素的濃度(mg/L)=A÷2150×B×100
[實施例1]
將下述的組成的培養基(蔗糖30g/L、玉米漿30g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L，pH7.2)8ml放入於內徑18mm的附綿塞試管而在121℃高壓釜滅菌15分鐘，調製種用試管培養基。種用試管培養基的原料是使用確認菌體的生育充分的批別原料。
其次將下述的組成的培養基(葡萄糖30g/L、玉米漿過濾處理物30g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、聚矽氧系消泡劑0.2g/L)7.2ml放入於內徑18mm的附棉塞試管的生產用試管培養基，準備5支。生產用試管培養基的原料是使用確認菌體生育不充分的批別原料。
在上述生產用試管的第1支(試管1)添加0.8ml的微量金屬類的混合水溶液，該混合水溶液是調製成為在最終的培養基中的濃度(終濃度)是第1表所述的濃度方式(氯化鈷6水合物0.1mg/L=0.42μmol/L)，第2支(試管2)是添加0.8ml成為第2表的濃度方式的核酸類的混合水溶液，調製成為，第3支(試管3)是添加0.8ml的成為第3表的濃度方式的維生素類的混合水溶液，第4支(試管4)是添加0.8ml的成為3g/L的濃度方式的檸檬酸三鈉2水合 物的水溶液，然後第5支(試管5)是添加離子交換水0.8ml。培養基是以氫氧化鈉水溶液或硫酸水溶液調整為pH7.2，在121℃高壓釜滅菌20分鐘。
將類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株(FERM BP-4283)菌接種於種用試管培養基，在28℃，以300spm振盪培養2日後，將該培養液在5種類的生產用試管培養基各分別接種菌0.05ml，在28℃，以300spm振盪培養4日。
將培養液的菌體生育由OD610(610nm的光學密度)測定的結果，5種類的生產用試管培養基中，只有添加微量金屬類的試管表現良好的生育(第4表)。
[實施例2]
將種用試管培養基以與實施例1所述的方法相同的方法調製。其次將下述的組成的培養基(葡萄糖30g/L、玉米漿過濾處理物30g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、聚矽氧系消泡劑0.2g/L)7.2ml放入於內徑18mm的附棉塞試管的生 產用試管培養基，準備13支。生產用試管培養基的原料是使用確認菌體的生育不充分的批別原料。
將第1表所述的12種的微量金屬類調製各別成為第1表所述的終濃度方式的0.8ml溶液，將該溶液各分別添加於12支的上述生產用試管後，剩餘的1支則添加離子交換水0.8ml。培養基是以氫氧化鈉水溶液或硫酸水溶液調整為pH7.2，在121℃高壓釜滅菌20分鐘。
將類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株(FERM BP-4283)在種用試管培養基接種菌，在28℃，以300spm振盪培養2日後，將該培養液在13種類的生產用試管培養基各分別接種菌0.05ml，在28℃，以300spm振盪培養4日。
在培養後的菌體生育由OD610測定的結果，只有添加氯化鈷6水合物的試管表現良好的生育(第5表)。
[實施例3]
將種用試管培養基以與實施例1所述的方法相同的方法調製。其次將下述的組成的培養基(葡萄糖30g/L、玉米漿過濾處理物30g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、聚矽氧系消泡劑0.2g/L)7.2ml放入於內徑18mm的附棉塞試管的生 產用試管培養基，準備12支。生產用試管培養基的原料是使用確認菌體的生育不充分的批別原料。
將氯化鈷6水合物以終濃度成為0、0.0001、0.001、0.002、0.005、0.01、0.1、0.25、1、2、5及10mg/L(即0、0.00042、0.0042、0.0084、0.021、0.042、0.42、1.1、4.2、8.4、21及42μmol/L)的方式製成0.8ml的水溶液而添加於12支的上述生產用試管。培養基是以氫氧化鈉水溶液或硫酸水溶液調整為pH7.2，在121℃高壓釜滅菌20分鐘。
將類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株(FERM BP-4283)在種用試管培養基接種菌，在28℃，以300spm振盪培養2日後，將該培養液在鈷濃度不同的12種類的生產用試管培養基各分別接種菌0.05ml，在28℃，以300spm振盪培養4日。
將在另外準備的沒有添加氯化鈷6水合物的前述生產用試管培養基中接種菌後的鈷濃度使用ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)測定的結果是0.002μmol/L。將在沒有添加氯化鈷的培養基中的鈷存在濃度及添加氯化鈷的濃度合併而算出培養基中的鈷存在濃度(第6表)。
在培養4日後，將培養液的菌體生育由OD610，類胡蘿蔔素的濃度由HPLC測定的結果示於第6表。又將培養基中的鈷存在濃度與菌體生育OD610及總類胡蘿蔔素生產濃度的關係示於第1圖。又，將鈷存在濃度的高濃度範圍及低濃度範圍的刻度擴大而描繪的圖式於第 2圖至第4圖。由第2圖至第4圖，明示產生類胡蘿蔔素有效果的濃度範圍是，0.005μmol/L以上、8μmol/L以下，較有效果的濃度範圍是0.01μmol/L以上、8μmol/L以下，更有效果的濃度範圍是0.02μmol/L以上、8μmol/L以下。
鈷濃度過低時細菌數及類胡蘿蔔素生產量是隨用量增加而增加，過高時細菌數及類胡蘿蔔素生產量都隨用量增加而減低，可知類胡蘿蔔素的生產上有鈷的適當的濃度範圍的存在。
[實施例4]
將種用試管培養基以與實施例1所述的方法相同的方 法調製。其次，將製造商、批別不同的原料組合，以下述的組成的培養基(葡萄糖30g/L、玉米漿過濾處理物30g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、聚矽氧系消泡劑0.2g/L)製成在第7表所示的A、B、C、D、E的5種，將7.2ml放入於內徑18mm的附棉塞試管的生產用試管培養基，準備各2支計10支。
其次，以培養基的終濃度成為0.1mg/L(即0.42μmol/L)的方式調製氯化鈷6水合物的水溶液0.8ml，添加於A、B、C、D、E的各1支後，其他的各1支是作為陰性對照而添加離子交換水0.8ml。培養基是以氫氧化鈉水溶液或硫酸水溶液調整為pH7.2，在121℃高壓釜滅菌20分鐘。
將類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)E-396株(FERM BP-4283)在種用試管培養基接種菌，在28℃，以300spm振盪培養2日後，將該培養液在鈷濃度不同的5種類的生產用試管培養基(計10支)各分別接種菌0.05ml，在28℃，以300spm振盪培養4日。
培養4日後，將培養液的菌體生育由OD610，類胡蘿蔔素的濃度由HPLC測定，沒有添加氯化鈷時的結果(將另外準備的沒有添加氯化鈷6水合物的生產用試管培養基中的種接種菌後的鈷濃度使用ICP-MS測定)示於第8表，添加時的結果示於第9表，總類胡蘿蔔素的比較示 於第5圖。沒有添加氯化鈷時，因培養基原料的製造商、批別而生育及類胡蘿蔔素生產濃度的變異大。特別是在鈷的存在濃度低的培養基的批別A及D中為類胡蘿蔔素生產濃度極低。另一方面，添加氯化鈷的終濃度0.1mg/L時，不論培養基原料的製造商、批別為何，可看到安定而高的細菌的生育性及類胡蘿蔔素生產性，可知培養基中的鈷濃度在適當的範圍內的重要性。
[實施例5]
將類胡蘿蔔素副球菌(Paracocus carotinifaciens)E-396株以N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍變異處理，以含有0.4mmol/L的可滅蹤(Clomazone)的試管培養基培養10日。將該培養液在含有0.3mmol/L的膦胺黴素(Fosmidomycin)的洋菜培養基上塗布而培養，選出紅色的色調濃的菌落。分析所選出的菌株的培養液中的類胡蘿蔔素，選出還原蝦紅素生產性有提高的變異株CF-358株。
將下述的組成的培養基(葡萄糖20g/L、玉米漿過濾處理物5g/L、磷酸二氫鉀0.54g/L、磷酸氫二鉀2.78g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、醇系消泡劑0.2g/L，pH7.5)100ml放入於500ml容量的附棉塞三角瓶在121℃高壓釜滅菌20分鐘，調製種用燒瓶培養基5瓶。種用燒瓶培養基的原料是確認有充分生育的批別原料。
其次，將下述的組成的培養基(葡萄糖40g/L、玉米漿過濾處理物30g/L、硫酸銨0.5g/L、穀胺酸鈉1水合物6g/L、磷酸二氫鉀2.25g/L、磷酸氫二鈉12水合物5.7g/L、氯化鈣2水合物0.1g/L、硫酸鎂7水合物0.5g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、生物素0.1mg/L、醇系消泡劑0.5g/L)2.0L放入於5L容量的發酵槽作為生產培養基，將其準備5槽。
以終濃度成為0、0.01、0.1、1及5mg/L(即0、0.042、0.42、4.2及21μmol/L)的方式將氯化鈷6水合物添加於上述生產用發酵槽。培養基在121℃高壓釜滅菌30分鐘，冷卻後，以20%氫氧化鈉水溶液將pH調整為7.2。在沒有添加氯化鈷的發酵槽的培養基中將種接種菌後的鈷濃度使用ICP-MS測定的結果是0.003μmol/L。
在上述選出的變異株類胡蘿蔔素副球菌(Paracoccus carotinifaciens)CF-358株在種用燒瓶培養基接種菌，在28℃以100rpm迴轉振盪培養2日後，將培養液80ml在各發酵槽接種菌。在28℃，以計量錶壓力0.01MPa 之通氣量1.5vvm的通氣攪拌培養進行5日。培養中自動供給15%氨水而維持pH在7.2。將攪拌迴轉數自動變化而維持培養液中的溶存氧濃度在2至4ppm。將醇系消泡劑自動添加而抑制發泡。
對培養終了時的培養液，將菌體生育由OD610，類胡蘿蔔素的濃度由HPLC測定(第10表)。添加氯化鈷而使終濃度為0.042至31μmol/L時表現高的總類胡蘿蔔素生產濃度，但沒有添加時則生產濃度低。
[實施例6]
將下述的組成的培養基(蔗糖30g/L、玉米漿30g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1g/L，pH7.2)8ml放入於內徑18mm的附棉塞試管，在121℃高壓釜殺菌15分鐘，調製種用試管培養基。種用試管培養基的原料是確認菌體有充分生育的批別原料。
其次將下述的組成的培養基(葡萄糖40g/L、磷酸二氫鉀0.54g/L、磷酸氫二鉀2.78g/L、硫酸銨1.5g/L、氯化鈣2水合物1g/L、氯化鈉3g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物0.5g/L、硫酸錳5水合物5mg/L、硼酸5mg/L、硫酸鋅7水合物5mg/L、鉬酸鈉2水合物2mg/L、硫酸銅5水合物2mg/L、碘化鉀1mg/L、鎢酸鈉1mg/L、硫酸鎳6水合物1mg/L、硒酸鈉0.1mg/L、氯化鋁(Ⅲ)6水合物0.1mg/L、氯化鉻(Ⅲ)6水合物0.1mg/L、肌肉肌醇50mg/L、抗壞血酸30mg/L、吡哆醇鹽酸鹽20mg/L、泛酸鈣15mg/L、核黃素10mg/L、對胺基安息香酸10mg/L、膽鹼10mg/L、氰鈷胺5mg/L、硫胺素鹽酸鹽1mg/L、葉酸1mg/L、菸鹼酸1mg/L、生物素0.1mg/L、聚醚系消泡劑0.2g/L)7.2ml放入於內徑18mm的附棉塞試管，準備7支。生產用試管培養基的原料是使用確認菌體的生育不充分的批別原料。
以終濃度成為0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1及10mg/L(即0、0.00042、0.0042、0.042、0.42、4.2及 42μmol/L)的方式調製氯化鈷6水合物的0.8ml水溶液，各分別添加於上述生產用試管。培養基是以氫氧化鈉水溶液或硫酸水溶液調整為pH7.2，在121℃高壓釜滅菌20分鐘。
將副球菌屬(Paracoccus)細菌A-581-1株(FERM BP-4671)在種用試管培養基接種菌，在29℃，以300spm振盪培養2日後，將該培養液在鈷濃度不同的7種類的生產用試管培養基各分別接種菌0.05ml，在29℃，以300spm振盪培養4日。
將在另外準備的沒有添加氯化鈷6水合物的生產用試管培養基中將種接種菌後的鈷濃度使用ICP-MS測定的結果是0.002μmol/L。
培養4日後，將培養液的菌體生育由OD610，類胡蘿蔔素的濃度由HPLC測定的結果與培養基中鈷的總濃度合併而示於第11表。與E-396株之外由土壤分離發現的副球菌屬(Paracoccus)細菌A-581-1株中，與E-396株同樣，鈷濃度過低或過高時，生育及類胡蘿蔔素的生產都顯著的低。
[實施例7]
將種用試管培養基以與實施例1所述的方法相同的方法調製。其次將下述的組成的培養基(葡萄糖30g/L、玉米漿過濾處理物30g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鈉12水合物3.8g/L、氯化鈣2水合物5.0g/L、硫酸鎂7水合物0.7g/L、硫酸鐵7水合物1.0g/L、聚矽氧系消泡劑0.2g/L)7.2ml放入於內徑18mm的附棉塞試管的生產用試管培養基，準備9支。生產用試管培養基的原料是使用確認菌體的生育不充分的批別原料。
以終濃度成為0、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、5及10mg/L(即0、0.00042、0.0042、0.021、0.042、0.42、4.2、21及42μmol/L)的方式調製氯化鈷6水合物的水溶液0.8ml，各分別添加於上述的9支生產用試管。培養 基是以氫氧化鈉水溶液或硫酸水溶液調整為pH7.2，在121℃高壓釜滅菌20分鐘。
將玉米黃質副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)ATCC 21588株在種用試管培養基接種菌，在28℃，以300spm振盪培養2日後，將該培養液在鈷濃度不同的9種類生產用試管培養基各分別接種菌0.05ml，在28℃，以300spm振盪培養4日。
將在另外準備的沒有添加氯化鈷6水合物的生產用試管培養基中將種接種菌後的鈷濃度，使用ICP-MS測定的結果是0.002μmol/L。
培養4日後，將培養液的菌體生育由OD610，類胡蘿蔔素的濃度由HPLC測定的結果示於第12表。鈷濃度過低或過高，生育及類胡蘿蔔素生產都顯著的低，在玉米黃質副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)的玉米黃質及β-隱黃質的生產中，可知鈷的適當的濃度範圍與其他的副球菌屬(Paracoccus)細菌同樣。
[序列表自由本文]
n是代表a,c,g或t(存在位置：1350)。
【生物材料寄存】 國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.日本國、獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄託中心、1993年4月27日、FERM BP-04283
2.日本國、獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄託中心、1994年5月20日、FERM BP-04671
<110> 捷客斯能源股份有限公司
<120> 以含有鈷之培養基所得之類胡蘿蔔素產生細菌所進行之類胡蘿蔔素的發酵製造方法
<130> P1474
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> E-396
<220>
<221> misc_feature
<222> (1350)..(1350)
<223> n為a、c、g、或t
<400> 1
由於本案的圖為實驗數據圖，並非本案的代表圖。
故本案無指定代表圖。

Claims (11)

  1. 一種類胡蘿蔔素高產生細菌的培養方法，其特徵係使用含有0.005μmol/L至20μmol/L的濃度的鈷或鈷鹽的培養基，培養類胡蘿蔔素產生細菌。
  2. 一種類胡蘿蔔素高產生細菌的製造方法，其特徵係使用含有0.005μmol/L至20μmol/L的濃度的鈷或鈷鹽的培養基，培養類胡蘿蔔素產生細菌。
  3. 一種類胡蘿蔔素的製造方法，其特徵係使用含有0.005μmol/L至20μmol/L的濃度的鈷或鈷鹽的培養基培養類胡蘿蔔素產生細菌，由所得的培養物採取類胡蘿蔔素。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的方法，其中，培養基中的鈷或鈷鹽的濃度是0.005μmol/L至8μmol/L。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的方法，其中，類胡蘿蔔素是由還原蝦紅素、斑螯黃質、玉米黃質、β-隱黃質、茄紅素、β-胡蘿蔔素、金盞花紅素、金盞花黃質、海膽酮、海星酮及3-羥基海膽酮所成之群中選出之至少一者。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的方法，其中，類胡蘿蔔素產生細菌是屬於副球菌屬(Paracoccus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)或赤桿菌屬(Erythrobacter)的細菌。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的方法， 其中，類胡蘿蔔素產生細菌是含有與16S核糖體RNA對應的DNA的細菌，且該DNA之鹼基序列與序列編號1所述的鹼基序列有95%以上的同源性。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的方法，其中，類胡蘿蔔素產生細菌是E-396株(FERM BP-4283)或A-581-1株(FERM BP-4671)或該等的變異株。
  9. 一種類胡蘿蔔素高產生細菌，其係以如申請專利範圍第2項及第4項至第8項中任一項所述的方法所製造者。
  10. 一種類胡蘿蔔素高產生細菌，其係在乾燥菌體中含有至少36mg/g的類胡蘿蔔素。
  11. 一種含有鈷的類胡蘿蔔素高產生細菌。
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