KR101848426B1 - 발효에 의한 제아잔틴 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 미생물 발효를 이용하여 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 미생물학적 생산에 의해 글루콘산의 농도를 낮게 억제하면서 고농도의 제아잔틴을 저비용으로 생산할 수 있다. 본 발명에 의해 생산되는 제아잔틴 함유 카로테노이드는 사료용 및 식품용의 소재로서 유용하다.

Description

발효에 의한 제아잔틴 생산방법{METHOD FOR PRODUCING ZEAXANTHIN BY FERMENTATION}
본 발명은 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 미생물 발효를 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다.
카로테노이드(carotenoid)는 사료첨가물, 식품첨가물, 의약품 등으로서 유용한 천연색소이다. 카로테노이드에는 예를 들면, 제아잔틴(zeaxanthin), β-카로틴(β-carotene), β-크립토잔틴(β-cryptoxanthin), 아스타잔틴(astaxanthin), 칸타잔틴(cantaxanthin), 리코펜(lycopene), 페오니코잔틴(pheonicoxanthin), 아도니잔틴(adonixanthin), 에키네논(echinenone), 아스테로이데논(asteroidenone) 및 3-히드록시에키네논(3-hydroxyechinenone) 등이 포함된다.
카로테노이드 중에서 제아잔틴은 옥수수 등 여러 가지의 식물에 함유되어 있는 천연의 황색 색소로서 사료에 첨가되어 닭 등 집에서 기르는 새류의 노른자, 고기, 표피의 색조를 개선하는 용도 및 식품의 착색료로서 그 용도가 공지되어 있다. 또한, 제아잔틴은 강력한 항산화 작용(비특허문헌 1) 및 항종양 효과(비특허문헌 2)를 가지고 있는 것으로 개시되어 있다. 나아가, 제아잔틴은 루테인(lutein)과 함께 망막 및 수정체에 존재하며 눈의 건강 유지에 관여한다고 개시되어 있다(비특허문헌 3). 이러한 생리적 효과에 근거하여 제아잔틴은 건강식품 소재, 화장품 소재 및 의약품 소재로서 유용하다.
β-크립토잔틴은 감귤류에 포함되어 있으며 항종양 효과(비특허문헌 2) 및 골다공증 예방 효과(비특허문헌 4)를 가지고 있는 것으로 개시되어 있어 건강식품 소재 및 사료 배합제로서 유용하다.
β-카로틴은 프로비타민 A 작용 및 항산화 작용을 가지고 있어 사료첨가물, 식품첨가물, 천연착색료 등으로서 널리 사용되고 있다.
제아잔틴, β-크립토잔틴 또는 β-카로틴을 닭 등 집에서 기르는 새류의 사료에 첨가하여 먹이면 이러한 성분들이 노른자에 축적된다. 상술한 바와 같이, 카로테노이드는 유효한 생리적 효과를 가지고 있기 때문에 카로테노이드가 축적된 노른자는 기능성 알로서 유용하다.
한편, 제아잔틴의 생산방법으로는 예를 들면, 옥소이소포론의 비대칭환원에 의해 얻은 광학활성 히드록시케톤을 원료로 이용하는 화학 합성법(비특허문헌 5) 및 옥수수 종자로부터 추출하는 방법이 공지되어 있다. 또한, 제아잔틴을 메리골드(marigold)로부터 추출하는 방법(특허문헌 1)도 공지되어 있지만, 메리골드 유래 카로테노이드의 주성분은 루테인으로 제아잔틴의 함량은 낮다.
제아잔틴을 생산하는 미생물의 예로는 스피루리나(Spilulina) 속 조류(algae)(특허문헌 2), 나노크로리스(Nannochloris) 속 미세조류(microalgae)(특허문헌 3), 플렉시박터(Flexibacter) 속 세균(bateria)(특허문헌 4), 알테로모나스(Alteromonas) 속 세균(특허문헌 5), 플라보박테리윰(Flavobacterium) 속 세균 및 아그로박테리움·아우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum) 세균(비특허문헌 6)이 알려져 있다. 또한, 카로테노이드를 생산하는 세균으로 알려진 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균에 있어서, 예를 들면 파라코쿠스·제아잔티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens) ATCC 21588주(비특허문헌 7), 파라코쿠스·카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) 세균 E-396주의 변이주(특허문헌 6), 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균 A-581-1주의 변이주(특허문헌 6) 및 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균의 변이주(특허문헌 7)가 제아잔틴을 생산하는 것으로 공지되어 있다.
그러나, 상술한 제아잔틴의 화학 합성법은 유기용매를 사용하기 때문에 안전성 및 최근 천연물 지향의 측면에서 문제가 있고, 조류 배양에 의한 제아잔틴의 생산은 생산성이 낮기 때문에 실용적이지 않다. 또한, 식물로부터 제아잔틴을 추출하는 경우에는 제아잔틴의 함량이 낮아 비용이 많이 들고 기후에 따라 좌우되기 때문에 안정한 공급이 곤란하다는 단점이 있다.
한편, 파라코쿠스 속 세균은 증식속도가 빠르고, 생산성이 높으며, 추출이 용이하다 등의 이점이 있지만 배양액 중 현저한 양의 글루콘산을 생산하기 위해서 탄소원이 불필요하게 사용될 뿐 아니라, 축적된 글루콘산이 제아잔틴의 생산을 억제하기 때문에 제조비용 효율 측면에서 충분한 농도의 제아잔틴을 축적하여 생산할 수 없다. 따라서, 저렴한 가격으로, 안정한 공급이 가능하며, 높은 안정성을 갖는 제아잔틴의 생산방법이 요구되고 있다.
특개평 8-92205호 공보 특개평 10-155430호 공보 특개평 7-59558호 공보 특개평 5-328978호 공보 특개평 5-49497호 공보 특개평 2005-87097호 공보 특개평 2007-151475호 공보
Nobuyoshi Shidzu 등, Fisheries Science, 1996년, 제 62권, 제1호, pp. 134-137 Tsushima M. 등, Biol. Pharm. Bull., 1995년, 제 18권, 제2호, pp. 227-233 FOOD Style 21, 1999년, 제 3권, 제 3호, pp. 50-53 Yamaguchi M. 등, ACS Symp Ser(Am Chem Soc), 2008년, 제 993호, pp. 408-418 Paust J. 등, Pure Appl. Chem., 1991년, 제 63권, 제 1호, pp. 45-58 Akihiro Yokoyama 및 Wataru Miki, FEMS Microbiology Letters, 1995년, 제 128권, pp. 139-144 Alan Berry 등, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003년, 제 53권, pp. 231-238
본 발명은 상술한 바와 같은 현 시점의 요구에 부응하기 위한 것으로, 그 목적은 저렴한 가격으로, 글루콘산의 생산을 억제하면서, 고농도의 제아잔틴을 미생물학적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 여러 가지 검토한 결과, 제아잔틴을 생산하는 세균의 배양에 있어서 배양지에 비오틴(biotin)을 첨가하여 글루콘산의 생산농도를 낮게 유지하면서 고농도의 제아잔틴을 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 이하를 포함한다.
(1) 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 생산하는 세균을 비오틴 함유 배양지에서 배양하는 공정을 포함하며, 배양 종료 후 비오틴 비함유 배양지의 배양액과 비교하여 글루콘산의 생산농도가 낮고 제아잔틴 생산농도가 높은 것을 특징으로 하는 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 생산하는 방법.
(2) (1)의 방법에 있어서, 배양 종료 후의 배양액 중 글루콘산의 생산농도가 80 g/L 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
(3) (1)의 방법에 있어서, 배양 종료 후의 배양액 중 글루콘산의 생산량이 소비한 탄소원의 30 %(w/w) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
(4) (1)의 방법에 있어서, 생산된 카로테노이드가 β-크립토잔틴을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
(5) (1)의 방법에 있어서, 생산된 카로테노이드가 β-카로틴을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
(6) (1)의 방법에 있어서, 배양지 당 비오틴의 농도가 0.001 mg/L 내지 50 mg/L인 것을 특징으로 하는 방법.
(7) (1)의 방법에 있어서, 배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 제아잔틴의 함량이 2 mg/g 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(8) (1)의 방법에 있어서, 배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 폴리-β-히드록시부티레이트(PHB)의 함량이 30 %(w/w) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
(9) (1)의 방법에 있어서, 상기 세균이 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
(10) (1)의 방법에 있어서, 상기 세균이 아스타잔틴을 생산하는 파라코쿠스 속 세균을 변이 처리하여 제아잔틴을 생산하도록 한 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
(11) (1)의 방법에 있어서, 상기 세균이 모균주와 비교하여 글루콘산 생산능이 저하된 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
(12) (1)의 방법에 있어서, 상기 세균이 모균주와 비교하여 폴리-β-히드록시부티레이트(PHB) 생산능이 저하된 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
(13) (1)의 방법에 있어서, 상기 세균이 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기 서열이 서열목록 1로 기재되는 염기 서열과 실질적으로 상동인 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
(14) (1)의 방법에 있어서, 상기 세균이 E-396주(FERM BP-4283) 또는 A-581-1주(FERM BP-4671)에서 유래한 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
(15) (1)의 방법에 의해 생산된 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 함유하는 카로테노이드 조성물로서, 배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 PHB 함량이 30 %(w/w) 이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
(16) (1)의 방법에 의해 수득한 배양액을 건조시켜 생산된 제아잔틴을 포함하는 카로테노이드 함유 건조균 조성물로서, 조성물 당 제아잔틴의 함량이 2 mg/g 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
본 명세서는 본 발명의 우선권의 기초가 되는 일본 특허출원 2010-079415호의 명세서에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명에 따르면, 미생물학적 생산에 의해 글루콘산의 농도를 낮게 억제하면서 고농도의 제아잔틴을 저비용으로 생산할 수 있다. 본 발명에 의해 생산되는 제아잔틴 함유 카로테노이드는 사료용 및 식품용 소재로 유용하다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 단, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니며, 하기 예시 이외에도 본 발명의 취지를 해치지 않는 범위에서 적당히 변경하여 실시할 수 있다.
본 발명은 제아잔틴을 함유하는 카로테노이드를 생산하는 세균(이하, "카로테노이드를 생산하는 세균" 또는 "제아잔틴을 생산하는 세균" 이라고 칭한다)을 비오틴 함유 배양지에서 배양하여 제아잔틴 함유 카로테노이드를 생산하는 방법(이하, "본 발명의 방법" 이라고 칭한다)에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 배양 종료 후 비오틴 함유 카로테노이드를 생산하는 세균의 배양액을 이와 유사한 비오틴 비함유 배양지의 배양액과 비교하면, 배양 종료 후의 배양액 중 글루콘산의 생산농도는 낮고 제아잔틴 생산농도는 높다. 본 발명의 방법에 따르면, 배양지에 비오틴을 첨가하여 글루콘산의 생산농도를 억제하면서 고농도의 제아잔틴을 저비용으로 생산하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법에서 이용되는 세균으로서는 제아잔틴을 생산하는 세균이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균이 이용된다. 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균 중 바람직하게는 파라코쿠스·카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens), 파라코쿠스·마르쿠시(Paracoccus marcusii), 파라코쿠스·해운댄시스(Paracoccus haeundaensis), 파라코쿠스·제아잔티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)가 이용되고, 특히 바람직하게는 파라코쿠스 카로티니파시엔스(Pracoccus carotinifaciens)가 이용된다. 파라코구스(Paracoccus) 속에 속하는 세균의 구체적인 균주의 예로서는 파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) E-396주(FERM BP-4283) 및 파라코구스(Paracoccus) 속 세균 A-581-1주(FERM BP-4671)를 들 수 있고, 또한 이러한 균주를 변이한 것 중 모균주와 비교하여 제아잔틴을 우선적으로 생산하는 변이주도 본 발명의 방법에서 바람직하게 이용된다. 또한, 제아잔틴을 생산하는 세균의 구체적인 균주의 또 다른 예로서 파라코쿠스 제아잔티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens) ATCC 21588주(비특허문헌 7)를 들 수 있다.
또한, 제아잔틴을 생산하는 세균으로서 바람직하게는 16S 리보솜 RNA에 대응하는 DNA의 염기 서열이 배열 번호 1에 기재되는 E-396주의 염기 서열과 실질적으로 상동인 세균이 이용된다. 여기서, "실질적으로 상동인"은 DNA의 염기 서열 결정시 에러 빈도 등을 고려하여 염기 서열이 바람직하게는 95 % 이상, 보다 바람직하게는 96 % 이상, 보다 더 바람직하게는 97 % 이상, 특히 바람직하게는 98 % 이상, 가장 바람직하게는 99 % 이상 상동인 것을 의미한다. 상동성은 예를 들면 유전자 해석 프로그램인 Clustal W에 의해 결정될 수 있다.
나아가, "16S 리보솜 RNA에 대응하는 DNA의 염기 서열"이란 16S 리보솜 RNA의 염기 서열 중 U(우라실)이 T(티민)으로 치환된 염기 서열을 의미한다.
상기 16S 리보솜 RNA의 염기 서열의 상동성에 근거한 미생물의 분류법은 최근 주류가 되었다. 종래의 미생물의 분류법은 종래 공지된 진균학적 특성, 예컨대 운동성, 영양 요구성, 당 이용성 등에 근거하고 있기 때문에, 자연 돌연변이에 의한 형질의 변화 등이 생겼을 경우 미생물을 잘못 분류하는 경우가 있었다. 반면, 16S 리보솜 RNA의 염기 서열은 지극히 유전적으로 안정하기 때문에, 이러한 상동성에 근거한 분류법은 종래의 분류법에 비해 분류의 신뢰도가 현격히 향상되었다.
파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) E-396주의 16S 리보솜 RNA의 염기 서열과 다른 카로테노이드를 생산하는 세균 예컨대, 카라코쿠스 마르쿠시(Paracoccus marcusii) DSM 11574주(International Journal of Systematic Bacteriology (1998), 48, 543-548), 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균 N-81106주(특개평 2007-244205호 공보), 파라코쿠스 해운댄시스(Paracoccus haeundaensis) BC 74171주(Jae Hyung Lee 등, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004년, 제 54권, pp.1699-1702), 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균 A-581-1주, 파라코쿠스 제아잔티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens) ATCC 21588주 및 파라코쿠스(Paracoccus) 속 PC-1주(WO 2005/118812호)의 16S 리보솜 RNA의 염기 서열과의 사이의 상동성은 각각 99.7 %, 99.7 %, 99.6 %, 99.4 %, 95.7 % 및 95.4 %로서 이들은 분류학적으로 매우 가까운 균주임을 알 수 있다. 따라서, 이러한 균주는 카로테노이드를 생산하는 세균으로서 하나의 그룹을 형성하고 있다고 할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 아스타잔틴 생산하는 세균을 변이 처리하여 모균주와 비교하여 제아잔틴을 우선적으로 생산하는 변이주를 이용할 수 있다. 이러한 변이주로서는, 예를 들면 특허문헌 6에 개시된 변이주, 특허문헌 7에 개시된 변이주 등을 들 수 있다.
아스타잔틴 생산하는 세균을 변이 처리하여 제아잔틴을 우선적으로 생산하는 변이주를 수득하는 방법을 하기에 예시한다.
변이의 모균주로서는 아스타잔틴을 생산하는 세균이면 제한이 없지만, 바람직하게는 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균이 이용된다. 아스타잔틴을 생산하는 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균 중, 바람직하게는 파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens), 파라코쿠스 마르쿠시(Paracoccus marcusii), 파라코쿠스 해운댄시스(racoccus haeundaensis)가 이용되고, 특히 바람직하게는 파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens)가 이용된다. 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균의 구체적인 균주의 예로서는 파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) E-396주(FERM BP-4283) 및 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균 A-581-1주(FERM BP-4671)를 들 수 있고, 바람직하게는 이러한 균주를 변이시켜 아스타잔틴의 생산성을 향상시킨 변이주가 모균주로서 이용된다. 또한, 변이의 모균주로서 이용되는 아스타잔틴 생산하는 세균으로는 16S 리보솜 RNA에 대응하는 DNA의 염기 서열이 배열 번호 1에 기재되는 E-396주의 염기 서열과 실질적으로 상동인 세균이 바람직하게 이용된다. 여기서, "실질적으로 상동인"은 DNA의 염기 서열 결정시 에러 빈도 등을 고려하여, 염기 서열이 바람직하게는 95 % 이상, 보다 바람직하게는 96 % 이상, 보다 더 바람직하게는 97 % 이상, 특히 바람직하게는 98 % 이상, 가장 바람직하게는 99 % 이상 상동인 것을 의미한다.
아스타잔틴 생산하는 세균을 변이 처리하는 방법은 돌연변이를 유발하는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 에틸메탄술포네이트(EMS) 등의 돌연변이유발원을 이용한 화학적 방법, 자외선 조사 및 X선 조사 등의 물리적 방법, 유전자 재조합 또는 가동성 유전인자 등에 의한 생물학적 방법 등이 이용될 수 있다. 또는 자연스럽게 일어나는 자발적 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 상기 변이 처리는 1회 또는 그 이상, 예를 들면 상기 돌연변이 처리에 의해 아스타잔틴의 생산성이 높은 변이체를 얻고, 이를 한번 더 돌연변이 처리할 수 있다. 본 발명에 있어서, 변이 처리 후 고체 배양지 상에 형성된 콜로니(colony)를 무작위로 선택할 수도 있지만, 선택효율을 향상시키기 위해서는 모균주의 적색 내지 적홍색 콜로니와 비교하여 황색 내지 주황색을 나타내는 콜로니를 선택할 수 있다.
아스타잔틴 생산하는 세균을 변이 처리하여 얻을 수 있었던 변이주 중에서 생산된 제아잔틴의 총 카로테노이드 양에 대한 비율이 특히 높은 변이주를 선발하는 방법은 변이주를 배양하여 얻을 수 있었던 배양액 중의 카로테노이드 화합물을 분석하는 것이다. 상기 배양 방법은 예를 들면 다음과 같다. 즉, 제아잔틴을 생산하는 세균의 생육에 필요하고 카로테노이드 화합물을 생산하는 성분을 포함한 배양지에서 배양을 실시한다. 배양 방법은 시험관, 플라스크 등에서의 진탕 배양, 환기교반 배양 등 임의의 방법일 수 있다. 카로테노이드 화합물의 분석 방법은 카로테노이드 화합물을 분리 검출할 수 있는 방법이라면 제한되지 않지만, 예를 들면 고속 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 페이퍼 크로마토그래피 등이 이용될 수 있다. 본 발명에 의한 제아잔틴을 생산하는 세균은 총 카로테노이드 양에 대한 생산된 제아잔틴의 양의 비율이 높은 변이주를 선발하는 것에 의해 수득할 수 있다. 여기서, "총 카로테노이드 양"은 아스타잔틴, 칸타잔틴, 아도니잔틴, β-카로틴, 에키네논, 제아잔틴, β-크립토잔틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등 카로테노이드 화합물의 총량을 나타낸다. 상기 선발의 기준이 되는 제아잔틴의 비율은 변이 처리 전 모균주의 제아잔틴 생산 비율보다 높은 것이 최저 조건이지만, 생산된 총 카로테노이드 양에 대하여 제아잔틴의 비율이 바람직하게는 20 %(w/w) 이상, 보다 바람직하게는 40 %(w/w) 이상, 보다 더 바람직하게는 60 %(w/w) 이상으로 나타내는 변이주가 선발된다.
본 발명의 방법에 있어서, 제아잔틴을 생산하는 세균을 변이 처리하여 모균주와 비교하여 제아잔틴의 생산성이 향상된 변이주를 선택하여 이용할 수 있다. 제아잔틴의 생산성이 향상된 변이주의 구체적인 수득 방법으로는 상술한 바와 같은 변이 처리 후, 예를 들면 한천 배지상에서 진한 주황색을 나타내는 콜로니를 선택하여, 개개의 변이주를 시험관, 플라스크 등에서 배양하고, 제아잔틴을 정량한 후, 제아잔틴 생산농도가 높은 변이주를 선발하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 모균주와 비교하여 PHB(폴리-β-히드록시부티레이트)의 생산능이 저하된 변이주를 이용할 수 있다. 예를 들면 상술한 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균으로부터 해당 변이주가 유도될 수 있다. 제아잔틴을 생산하는 세균은 저장 탄소원으로서 세포 내에 PHB를 축적한다고 알려져 있다. PHB를 축적하면 그만큼 배양지의 탄소원을 불필요하게 소비하게 되므로, 제조비용 저감을 위해서는 PHB를 최소한으로 축적시키는 것이 바람직하다. 따라서, 변이 처리 및 스크리닝를 통해서 PHB의 축적이 적거나 혹은 전혀 축적하지 않는 변이주를 수득하는 것이 효과적이다. PHB를 소량으로 생산하는 변이주의 구체적인 수득 방법으로는 상술한 바와 같은 변이 처리 후, 예를 들면 개개의 변이주를 시험관, 플라스크, 한천 배지 등에서 배양하고, PHB를 정량한 후, PHB의 생산량이 적은 변이주를 선발하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 모균주와 비교하여 글루콘산의 생산능이 저하된 변이주가 이용될 수 있다. 예를 들면 상술의 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균으로부터 해당 변이주가 유도될 수 있다. 글루콘산을 생산하면 그만큼 배양지의 탄소원을 불필요하게 소비하게 되고, 현저한 양의 생산된 글루콘산이 축적되면 세균의 생육이나 카로테노이드 생산을 억제하게 된다. 따라서, 글루콘산의 생산을 최소한으로 하는 것이 카로테노이드의 생산에 효과적이다. 글루콘산을 소량으로 생산하는 변이주의 구체적인 수득 방법으로는 상술한 바와 같은 변이 처리 후, 예를 들면 개개의 변이주를 시험관, 플라스크 등에서 배양하고, 배양액의 pH를 측정하여 pH의 저하가 적은 변이주를 선발한 후, 한번 더 배양액 중의 글루콘산의 양을 측정하여 글루콘산의 생산량이 적은 변이주를 선발하는 방법을 들 수 있다.
상술한 바와 같은 제아잔틴의 생산성이 개량된 변이주, PHB의 생산능이 저하된 변이주, 글루콘산의 생산능이 저하된 변이주 등 바람직한 성질이 부여된 변이주를 각각 수득할 수도 있지만, 이러한 성질을 2종 이상 겸비하도록 변이 처리 및 스크리닝을 반복 수행할 수도 있다. 또한, 단일 변이 처리한 것과 2종 이상의 스크리닝 방법을 조합하여 2종 이상의 성질이 부여된 변이주를 수득할 수도 있다. 이러한 2종 이상의 바람직한 성질을 갖는 변이주를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용한 카로테노이드를 생산하는 세균의 예로서 E-396주는 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 하기와 같이 국제 기탁되어 있다.
국제 기탁 당국: 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터
(구명칭: 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소)
(우) 305-8566
일본 이바라키현 츠쿠바시동 1가 1번지 1 중앙 제 6
식별을 위한 표시: E-396
수탁 번호: FERM BP-4283
원기탁일: 헤세이 5년(1993년) 4월 27 일
또한, 본 발명의 방법에서 사용한 카로테노이드를 생산하는 세균의 다른 예로서 A-581-1주는 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 하기와 같이 국제 기탁되어있다.
국제 기탁 당국: 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터
(구명칭: 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소)
(우)305-8566
일본 이바라키현 츠쿠바시동 1가 1번지 1 중앙 제 6
식별을 위한 표시: A-581-1
수탁 번호: FERM BP-4671
원기탁일: 헤세이 6년(1994년) 5월 20 일
제아잔틴 이외에 본 발명의 방법에 의해 생산되는 카로테노이드는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 β-카로틴, β-크립토잔틴, 아스타잔틴, 칸타잔틴, 아도니잔틴, 페니코키산틴, 에키네논, 아스테로이데논, 3-히드록시에키네논 및 리코펜을 들 수 있고, 바람직하게는 β-카로틴 및 β-크립토잔틴을 들 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산되는 카로테노이드는 1종 또는 다수 종의 조합일 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 상기 세균을 배양하는 방법을 하기에 설명한다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양에 이용하는 제아잔틴 생산용 배양지는 비오틴이 첨가된 배양지 중 제아잔틴을 생산하는 세균의 생육 및 제아잔틴 생산이 가능한 임의의 것일 수 있고, 바람직하게는 탄소원, 질소원, 무기 염류 및 필요에 따라서 비타민류 등을 함유하는 배양지를 이용한다. 즉, 비오틴은 본 발명의 방법에 따른 제아잔틴을 생산하는 세균의 생육 및 제아잔틴의 생산이 가능한 배양지에 첨가한다.
탄소원으로서는, 예를 들면 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 푸룩토오스, 트레할로스, 만노오스, 만니톨 및 말토오스 등의 당류, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말릭산, 말론산 및 피루브산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 이소부탄올 및 글리세롤 등의 알코올류, 대두유, 미강유, 올리브유, 옥수수유, 참기름 및 아마인유 등의 유지류 등을 들 수 있고, 바람직하게는 글루코오스 또는 수크로오스를 이용한다. 이들 탄소원 중 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다. 배양전의 배양지(초기배양지)에 첨가하는 탄소원의 양은 탄소원의 종류에 따라 적당히 조정 가능하지만, 통상적으로는 배양지 1 L 당 1-100 g, 바람직하게는 2-50 g이다. 또한, 탄소원은 초기배양지에 첨가할 수 있고, 바람직하게는 배양 도중에 순서대로 또는 연속적으로 추가 공급할 수도 있다.
무기 질소원으로서는, 예를 들면 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 인 산암모늄 등의 암모늄염류, 질산칼륨 등의 질산염류, 암모니아 및 요소 등을 들 수 있고, 이들 중 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다. 첨가량은 질소원의 종류에 의해 따라 적당히 조정 가능하지만, 통상적으로는 배양지 1 L 당 0.1-20 g, 바람직하게는 0.2-10 g이다.
유기 질소원으로서는, 예를 들면 옥수수침지액((corn steep liquor)여과 처리물 포함)), 파마메디아(pharmamedia), 대두박, 대두가루, 땅콩박(peanut meal), 글루탐산나트륨, 주정박즙(Distillers' solubles) 및 건조 효모 등을 들 수 있고, 이들 중 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다. 첨가 농도는 질소원의 종류에 따라 적당히 조정 가능하지만, 통상적으로는 배양지 당 0-80 g/L, 바람직하게는 0-30 g/L이다.
무기 질소원 및 유기 질소원은 통상적으로 초기배양지에 첨가하지만, 바람직하게는 순서대로 또는 연속적으로 추가 공급할 수 있다.
무기 염류로서는, 예를 들면 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산수소이나트륨등의 인산염류, 황산마그네슘, 염화마그네슘 등의 마그네슘염류, 황산철, 염화철 등의 철염류, 염화칼슘, 탄산칼슘 등의 칼슘염류, 탄산나트륨, 염화나트륨 등의 나트륨염류, 황산망간 등의 망간염류, 염화코발트 등의 코발트염류, 황산구리 등의 동염류, 황산아연 등의 아연염류, 몰리브덴산나트륨 등의 몰리브덴염류, 황산니켈 등의 니켈염류, 셀렌산나트륨 등의 셀렌염류, 붕산 및 요오드화칼륨 등을 들 수 있고, 이들 중 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다. 첨가량은 무기염의 종류에 따라 적당히 조정 가능하지만, 통상적으로 배양지 1 L 당 0.0001-15 g이다. 인산염류, 마그네슘염류, 칼슘염류, 나트륨염류 및 철염류의 경우 배양지 당 농도는 0.02-15 g/L가 바람직하고, 망간염류, 코발트염류, 동염류, 아연염류, 몰리브덴염류, 니켈염류, 셀렌염류, 붕산, 요오드화칼륨 등을 첨가하는 경우에는 0.1-15 mg/L가 바람직한 농도이다. 무기 염류는 통상적으로 초기배양지에 첨가하지만, 순서대로 또는 연속적으로 추가 공급할 수 있다.
비오틴 이외의 비타민류로서는, 예를 들면 시아노코발라민, 리보플라빈, 판토텐산, 피리독신, 티아민, 아스코르브산, 엽산, 나이아신, p-아미노벤조산, 이노시톨, 콜린 등을 이용할 수 있다. 첨가 비율은 비타민류의 종류에 따라 적당히 조정 가능하지만, 통상적으로는 배양지 1 L 당 0.001-1000 mg이며, 바람직하게는 0.01-100 mg이다. 비타민류는 통상적으로 초기배양지에 첨가하지만, 순서대로 또는 연속적으로 추가 공급할 수 있다.
본 발명의 방법의 특징은 비오틴을 첨가한 배양지 속에서 제아잔틴을 생산하는 세균을 배양하는 것이다. 비오틴 함유 배양지에서 제아잔틴을 생산하는 세균을 배양하여, 글루콘산의 농도를 낮게 억제하면서 고농도의 제아잔틴을 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에서 이용하는 비오틴은 DL-형 또는 D-형일 수 있지만, 바람직하게는 D-형을 이용한다. 비오틴은 통상적으로 초기배양지에 첨가하지만, 배양 도중에 간헐적으로 또는 연속적으로 첨가할 수 있고, 또한 초기배양지에 첨가한 다음 배양 도중에 간헐적으로 또는 연속적으로 추가로 첨가할 수 있다. 비오틴은 주배양지와 혼합하여 살균할 수 있지만, 따로 살균하여 첨가할 수도 있다. 비오틴의 살균 방법은 특별히 한정되지 않고, 가열살균 또는 여과살균을 이용할 수 있다.
첨가하는 비오틴의 배양지 당 농도에 있어서 특별히 하한은 없지만, 바람직하게는 0.001 mg/L 이상, 보다 바람직하게는 0.005 mg/L 이상, 보다 더 바람직하게는 0.01 mg/L 이상, 특히 바람직하게는 0.02 mg/L 이상이다. 또한 비오틴의 첨가농도에 있어서 특별히 상한은 없지만, 바람직하게는 50 mg/L 이하, 보다 바람직하게는 20 mg/L 이하, 보다 더 바람직하게는 10 mg/L 이하, 특히 바람직하게는 5 mg/L 이하, 가장 바람직하게는 2 mg/L 이하이다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양액의 발포를 억제하기 위해서 바람직하게는 소포제를 이용한다. 소포제의 종류에는 거품의 발생을 억제하거나 발생된 거품을 제거하는 작용이 있는 것 중 제아잔틴을 생산하는 세균에 대한 억제작용 적은 임의의 것일 수 있다. 예를 들면, 알코올계 소포제, 폴리에테르계 소포제, 에스테르계 소포제, 지방산계 소포제, 실리콘계 소포제, 술폰산계 소포제 등을 들 수 있다. 소포제의 첨가량은 소포제의 종류에 따라 적당히 조정 가능하지만, 통상적으로는 배양지 1 L 당 0.01-10 g이다.
소포제는 통상적으로 살균전의 초기배양지에 첨가한다. 또한 소포제를 배양 도중에 연속적으로 또는 간헐적으로 추가로 첨가할 수도 있다. 배양 도중에 소포제를 첨가하는 방법으로서는, 예를 들면 센서로 거품을 감지하여 자동적으로 첨가하는 방법, 프로그램 타이머를 사용하여 일정시간마다 첨가하는 방법, 생육 속도에 연동하도록 탄소원, 질소원 또는 pH 조정제 등과 혼합하여 첨가하는 방법 등을 들 수 있다. 초기배양지에 첨가하는 소포제와 배양 도중에 배양액에 첨가하는 소포제는 동종을 이용하거나, 작용에 따라 다른 종류를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 개시시 배양지의 pH는 2-12, 바람직하게는 6-9, 보다 바람직하게는 6.5-8.0로 조정한다. 배양 중에도 상기 범위의 pH를 유지하는 것이 바람직하다. pH를 유지하는 방법으로는 바람직하게는, 발효조 내 설치한 pH 전극으로 배양액의 pH를 온라인으로 측정하여 알칼리를 자동 공급하는 방법이 있다. pH 조정제로서는, 예를 들면 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 탄산나트륨 수용액, 암모니아수, 암모니아가스, 황산 수용액 또는 이러한 것들의 혼합물을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양지는 살균 처리한 후 세균의 배양에 이용한다. 살균 처리는 당업자에 의해 적절하게 수행될 수 있는 것으로 예를 들면, 적절한 용기 중의 배양지를 오토클레이브(autoclave)에서 가열살균하거나 살균필터를 이용하여 여과살균할 수 있다. 또는, 쟈켓 가열과 스팀 주입에 의해 살균할 수도 있다. 글루코오스 등의 탄소원은 다른 배양지 성분과 함께 가열살균하면 갈변하므로 따로 살균할 수 있다. 비타민류나 미량의 금속류는 주배양지와 함께 가열살균할 수 있지만 불활성화나 침전화를 방지하기 위해서 따로 살균할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 제아잔틴을 생산하는 세균을 상술한 바와 같이 생산한 비오틴 함유 배양지에 접종하여 소정의 조건으로 배양한다. 접종은 시험관, 플라스크 혹은 발효조 등을 이용한 종균배양에 의해 균주를 적당히 성장시키고, 배양액을 제아잔틴 생산용 비오틴 함유 배양지에 첨가하여 실시한다. 종균배양에 이용하는 배양지는 비오틴 함유 배양지 또는 비오틴 미함유 배양지일 수 있고, 제아잔틴을 생산하는 세균이 양호하게 증식하는 배양지인 경우 특별히 한정되지 않는다.
배양은 적절한 배양 용기에서 수행한다. 배양 용기는 배양 용량에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 시험관, 플라스크, 발효조 등을 들 수 있다.
배양 온도는 예를 들면 15-40 ℃, 바람직하게는 20-35 ℃, 보다 바람직하게는 25-32℃이다. 또한 배양 기간은 호기성 조건하에서, 통상적으로 1-20 일, 바람직하게는 2-12 일, 보다 바람직하게는 3-9 일, 특히 바람직하게는 4-7 일 동안 실시한다.
호기성 조건으로서는, 예를 들면 진탕 배양 또는 환기교반 배양 등을 들 수 있지만, 산소가 부족하면 제아잔틴을 생산하는 세균의 생육이나 카로테노이드 생산에 악영향을 미치므로, 용존 산소농도를 용존 산소전극으로 항상 모니터링하는 것이 바람직하다. 산소가 고갈되지 않도록 용존 산소농도를 조절하는 것이 바람직하다. 용존 산소농도의 조절은, 예를 들면 교반 회전수, 환기량, 내압, 환기 가스 중의 산소농도 등을 변화시키는 것으로 실시할 수 있다.
배양액 중의 용존 산소농도는 바람직하게는 0.5 ppm 이상, 보다 바람직하게는 1 ppm 이상, 보다 더 바람직하게는 1.5 ppm 이상으로 조절한다. 배양액 중의 용존 산소농도의 조절범위의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 8 ppm 이하, 보다 바람직하게는 7 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 6 ppm 이하, 특히 바람직하게는 5 ppm 이하이다.
본 발명의 방법에서 이용되는 세균은 배양액 중에서 글루콘산을 생산한다. 글루콘산을 생산하면 그만큼, 배양지 상의 탄소원을 불필요하게 소비하게 되고, 현저한 양의 글루콘산이 축적되면, 세균의 생육이나 카로테노이드 생산을 억제한다. 따라서, 글루콘산의 생산을 최소한으로 하는 것이 카로테노이드의 생산에는 효과적이다. 본 발명의 방법에 따르면, 배양지에 비오틴을 첨가하여 글루콘산의 생산량을 저하시킬 수 있다. 최종적으로 얻을 수 있는 배양 종료 후 배양액의 글루콘산의 생산농도는 바람직하게는 80 g/L 이하이며, 보다 바람직하게는 60 g/L 이하, 보다 더 바람직하게는 40 g/L 이하이며, 특히 바람직하게는 20 g/L 이하이며, 매우 바람직하게는 10 g/L 이하이며, 하한은 0 g/L이다. 또한, 배양 종료 후에 있어서, 소비 탄소원 당 글루콘산의 생산량은, 바람직하게는 30 %(w/w) 이하이며, 보다 바람직하게는 20 %(w/w) 이하, 보다 더 바람직하게는 10 %(w/w) 이하, 특히 바람직하게는 5 %(w/w) 이하이며, 하한은 없다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양지에 비오틴을 첨가하면 PHB(폴리-β-히드록시부티레이트)의 생산을 억제할 수 있다. 최종적으로 얻을 수 있는 배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 PHB 함량은 바람직하게는 30 %(w/w) 이하이며, 보다 바람직하게는 20 %(w/w) 이하, 보다 더 바람직하게는 10 %(w/w) 이하, 특히 바람직하게는 5 %(w/w) 이하이며, 하한은 0 %(w/w)이다. 특히, 배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 PHB 함량이 30 %(w/w) 이하인 배양액은 사료 첨가용으로 매우 적합하게 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 제아잔틴을 생산하는 세균을 배양해 얻을 수 있는 배양액중의 카로테노이드 또는 배양액으로부터 추출된 카로테노이드의 정량은, 예를 들면 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다.
상술한 바와 같이 제아잔틴을 생산하는 세균을 배양하여 얻을 수 있는 배양액은 카로테노이드로서 그대로 사용하거나, 배양액으로부터 예를 들면 배양 상층액, 균체 농축물(균체 농축액), 습균체, 건조균체, 균체용해물 등으로 조제하여, 이들의 조제물을 사용할 수도 있다. 또한, 이들 배양액 또는 조제물로부터 카로테노이드를 추출, 정제 등에 의해 수득할 수 있다.
배양 상층액은 배양액을 원심분리 또는 여과분리하여 배양액으로부터 균체를 제거하여 제조할 수 있다. 균체 농축물(균체 농축액)은 배양액을 원심분리, 막여과 농축 또는 디캔테이션(decantation)하여 얻을 수 있다. 습균체는 배양액을 원심분리 또는 여과하여 얻을 수 있다. 건조균체는 배양액, 습균체 또는 균체 농축물(균체 농축액)을 일반적인 건조 방법에 따라 건조시켜 얻을 수 있다.
균체 농축물을 얻는 공정에 있어서, 배양액의 pH는 특별히 한정되지 않지만 카로테노이드의 침전을 용이하게 하기 위해서 배양액을 산성화 할 수 있다. 산성 조건은 산성의 범위이면 pH의 제한이 없지만 바람직하게는 pH 6.5 이하, 보다 바람직하게는 pH 5.5 이하, 보다 더 바람직하게는 pH 5.0 이하이다.
균체 농축물의 배양액에 대한 농축률은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1.5-10배, 보다 더 바람직하게는 2-6배이다. 여기서 "농축률"이란, 예를 들면 농축율이 2배인 균체 농축물의 체적이 배양액의 체적의 2분의 1이 되는 것을 의미한다. 농축 공정에 있어서, 불필요한 성분의 제거효과를 높이기 위해서 물로 배양액을 희석한 후 농축하는 것도 바람직하다. 또한 원심분리, 여과분리 또는 디캔테이션 등의 농축 조작의 도중에 물을 첨가할 수도 있다. 농축 후에 물을 첨가하고 다시 농축할 수도 있다. 희석하는데 첨가하는 물의 양은 바람직하게는 배양액 체적의 0-10배, 보다 바람직하게는 0.2-6배, 보다 더 바람직하게는 0.3-3배이다.
원심분리에 이용하는 원심분리기는 연속식 또는 배치식일 수 있지만 바람직하게는 연속식이 이용된다. 원심분리기의 유형으로서는, 예를 들면 바구니형, 다실(multiple-chamber)형, 디캔터(decanter)형, 디스크형(노즐형/디슬러지형), 튜뷸라(tubular)형 및 로터(rotor)형의 원심분리기를 들 수 있다.
여과분리에 이용되는 막여과 장치는 정지(static)형 또는 직교류(cross-flow)형일 수 있지만, 막힘을 방지하기 쉬운 직교류형이 바람직하다. 막의 재질은 예를 들면 여과지, 옷감, 화학섬유, 세라믹 등을 들 수 있다.
건조의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 분무 건조, 유동 건조, 분무 유동 과립 건조, 드럼 건조, 동결건조 등을 들 수 있다. 건조 후에 미세분말화하기 위해서 건조균체를 분쇄하는 것도 바람직하다. 분쇄의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 비터 밀, 해머 밀, 볼 밀, 비드 밀 등을 들 수 있다.
상기와 같이 수득한 카로테노이드 함유 건조균 조성물을 그대로 사료용 또는 식품용의 첨가물로서 이용할 수 있다.
건조균 조성물 당 제아잔틴의 함량은 바람직하게는 2 mg/g 이상이며, 보다 바람직하게는 4 mg/g 이상, 보다 더 바람직하게는 6 mg/g 이상이다. 상한은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 50 mg/g 이하이며, 보다 바람직하게는 40 mg/g 이하, 보다 더 바람직하게는 30 mg/g 이하이다.
본 발명의 방법에 있어서, 카로테노이드를 상기 배양액 또는 조제물로부터 수득하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 카로테노이드를 안정하게 효율적으로 회수하는 임의의 방법일 수 있다. 이러한 방법은 당업자라면 공지의 추출이나 정제 기술로부터 적당히 선택하여 실시할 수 있다.
또한, 추출하기 전 배양액 또는 조제물을 염기성 시약이나 계면활성제 등을 이용한 화학적 처리, 용균효소, 지방분해효소 및 단백분해효소 등을 이용한 생화학 처리 또는 초음파 또는 분쇄 등의 물리적 처리 중에서, 1종 또는 2종 이상으로 처리할 수 있다.
예를 들면, 카로테노이드를 배양액 또는 조제물로부터 추출하는 경우, 추출 및 세정에 이용하는 용매는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알코올류, 아세톤, 테트라히드로퓨란, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 등을 들 수 있다.
추출 조작 중 카로테노이드의 산화를 최소화하고 싶은 경우에는, 질소 가스 등의 불활성 가스 분위기하에서 처리할 수 있다. 또한, 의약품이나 식품으로 이용되고 있는 산화 방지제를 선택하여 적당한 추출 용매에 이를 첨가할 수도 있다. 또는 이러한 처리들을 조합할 수도 있다.
또한, 빛에 의한 카로테노이드의 분해를 최소한으로 하기 위해서, 빛을 쬐지 않는 조건하에서 추출할 수도 있다.
이와 같이 수득한 추출물을 카로테노이드로서 그대로 이용하거나 추가로 정제하여 사용할 수도 있다.
추출 조작 후 추출액 등의 추출물로부터 세균 등을 분리하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 막여과, 원심분리, 디캔테이션 등을 들 수 있다.
추출물로부터 카로테노이드 침전물을 얻는 방법으로서는 일반적으로 가열 및/또는 감압 농축, 결정화 등을 들 수 있다. 또한, 저온에서 카로테노이드 색소의 침전 또는 산·알칼리 약제나 각종 염류에 의한 침전에 의해서 카로테노이드 색소를 농축하지 않고 분리할 수 있다. 공업적으로 이용하는 경우에는 결정화시키는 것이 바람직하다.
수득한 카로테노이드 침전물은 필요한 경우, 세정을 위해 소량의 저급 알코올류 등의 용매를 이용하여 현탁교반 시킬 수 있다.
세정의 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 현탁교반 후 여과하는 방법 또는 침전물 상으로 통액하는 방법 등 실용적인 바람직한 방법을 들 수 있다.
상기와 같이 수득한 배양액, 조제물, 추출물 또는 정제물은 카로테노이드로서 각각 단독으로 이용할 수도 있고 혹은 이들을 임의의 비율로 혼합하여 이용할 수도 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예에 있어서 카로테노이드류의 정량은 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 하기와 같은 조건으로 실시하였다.
컬럼은 Inertsil SIL-100A, 5μm(φ4.6×250 mm)(GL 사이언스 제)를 2개 연결하여 사용하였다. 이동상인 n-헥산/테트라히드로퓨란/메탄올 혼합액(40:20:1)을 실온 부근 일정한 온도에서, 분 당 1.0 mL 의 속도로 흘려주면서 용출시켰다. 측정을 위해서, 테트라히드로퓨란에 용해시킨 샘플을 이동상으로 100배 희석시키고, 상기 희석시킨 용액 20μL를 주입한 후, 컬럼 용리액을 파장 470 nm에서 검출하였다. 또한 정량을 위한 표준품으로서는 EXTRASYNTHESE 제 제아잔틴(Cat.No.0307 S)을 이용하였다. 표준액의 제아잔틴 농도의 설정은 453 nm에서 표준액의 흡광도(A) 및 상기 조건으로 HPLC 분석을 실시했을 때 제아잔틴 피크의 면적 백분율%(B)을 측정한 후, 하기의 식을 이용하여 계산하였다.
제아잔틴의 농도(mg/L) = A÷2327×B×100
[실시예 1]
파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) E-396주(FERM BP-4283)를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 변이 처리하여 황색 내지 주황색의 콜로니를 선택하였다. 선택한 균주의 배양액 중의 카로테노이드 농도를 측정한 후, 제아잔틴 생산능이 높은 변이주 ZX-3주를 선택하였다.
이하 조성의 배양지(수크로오스 30 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 인산이수소칼륨 1.5 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 3.8 g/L, 염화칼슘 2수화물 5.0 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.7 g/L, 황산철 7수화물 0.3 g/L, pH 7.2) 100 ml를 500 ml용량의 솜마개 처리한 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 20분 동안 오토클레이브(autoclave)에서 살균하여, 배정용 플라스크 배양지 7개를 준비하였다.
다음으로, 이하 조성의 배양지(글루코오스 20 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 황산암모늄 0.5 g/L, 인산이수소칼륨 2.25 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 5.7 g/L, 염화칼슘 2수화물 0.1 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.5 g/L, 황산철 7수화물 5 g/L, 알코올계 소포제 0.5 g/L) 2.0 L를 5 L용량의 발효조에 넣어, 이와 같은 발효조를 7개 준비하였다. 해당 발효조에 D-비오틴을 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 50 mg/L가 되도록 첨가하고, 121℃에서 40분 동안 오토클레이브에서 살균하였다.
상술한 파라코쿠스(Paracoccus) 속 제아잔틴을 생산하는 세균 ZX-3주의 백금 루프(platinum loopful)를 상기 준비한 배정용 플라스크 배양지에 접종하고, 29℃에서 2 일 동안 100 rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 상기 수득한 배양액 80 mL를 각각 상기 준비한 발효조에 도입하고, 29℃에서 환기량 1 vvm의 호기성 배양을 120시간 동안 실시하였다. 배양 중 pH가 7.1을 유지하도록 15 % 암모니아수를 이용하여 연속적으로 pH를 조절하였다. 글루코오스는 고갈되지 않도록 연속적으로 공급하였다. 또한, 최저 교반 회전수를 100 rpm으로 하면서, 배양 중기(intermediate phase)(미생물의 산소 소비가 가장 활발한 시기)에 배양액 중 용존 산소농도가 2 ppm을 유지하도록 교반 회전수를 변화시켰다. 기포 센서로 발포를 감지하면서, 알코올계 소포제를 자동적으로 첨가하여 발포를 억제시켰다.
배양 종료시 배양액 중 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도 및 건조균체량 당 PHB 함량을 측정하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 비오틴을 0.001-50 mg/L 첨가한 실험구에서는, 비오틴을 첨가하지 않은 실험구와 비교하여 제아잔틴의 농도가 높고, 글루콘산의 농도가 낮다는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 1에 있어서의 "당에 대한 글루콘산 수율%(w/w)"은 소비한 글루코오스의 총량에 대한 배양 종료시 글루콘산 생산량의 비율을 의미한다.
[표 1]
Figure 112012083055132-pct00001

[실시예 2]
파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균 A-581-1주(FERM BP-4671)를 에틸메탄술포네이트로 변이 처리하고 황색 콜로니를 선택하였다. 선택한 균주의 배양액 중 카로테노이드를 분석하여 제아잔틴을 생산하는 변이주 ZX-5주를 선택하였다.
이하 조성의 배양지(수크로오스 30 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 인산이수소칼륨 1.5 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 3.8 g/L, 염화칼슘 2수화물 5.0 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.7 g/L, 황산철 7수화물 0.3 g/L, pH 7.2) 100 ml를 500 ml용량의 솜마개 처리한 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 20분 동안 오토클레이브에서 살균하여, 배정용 플라스크 배양지 2개를 준비하였다.
다음으로, 이하 조성의 배양지(수크로오스 40 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 황산암모늄 0.5 g/L, 인산이수소칼륨 2.25 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 5.7 g/L, 염화칼슘 2수화물 0.1 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.5 g/L, 황산철 7수화물 5 g/L, 알코올계 소포제 0.5 g/L) 2.0 L를 5 L용량의 발효조에 넣어, 이와 같은 발효조를 2개 준비하였다. 해당 발효조에 D-비오틴을 각각 0 및 1.0 mg/L가 되도록 첨가하고, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브에서 살균하였다.
상술한 파라코쿠스(Paracoccus) 속 제아잔틴을 생산하는 세균 ZX-5주의 백금 루프를 상기 준비한 배정용 플라스크 배양지에 접종하고, 28℃에서 2 일 동안, 100 rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 상기 수득한 배양액 80 mL를 각각 상기 준비한 발효조에 도입하고, 28℃에서 환기량 1 vvm의 호기성 배양을 140시간 동안 실시하였다. 배양 중 pH가 7.2를 유지하도록 15 % 암모니아수를 이용하여 연속적으로 pH를 조절하였다. 수크로오스는 고갈되지 않도록 수차례 공급하였다. 또한, 최저 교반 회전수를 200 rpm으로 하면서, 배양 중기에 배양액 중 용존 산소농도가 1 ppm을 유지하도록 교반 회전수를 변화시켰다. 기포 센서로 발포를 감지하면서, 실리콘계 소포제를 자동적으로 첨가하여 발포를 억제시켰다.
배양 종료시 배양액 중 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도 및 건조균체량 당 PHB 함량을 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 비오틴을 첨가한 실험구에서는, 비오틴을 첨가하지 않은 실험구와 비교하여 제아잔틴의 농도가 높고, 글루콘산의 농도가 낮다는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 2에 있어서의 "당에 대한 글루콘산 수율%(w/w)"은 소비한 수크로오스의 총량에 대한 배양 종료시 글루콘산 생산량의 비율을 의미한다.
[표 2]
Figure 112012083055132-pct00002

[실시예 3]
이하 조성의 배양지(수크로오스 30 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 인산이수소칼륨 1.5 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 3.8 g/L, 염화칼슘 2수화물 5.0 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.7 g/L, 황산철 7수화물 0.3 g/L, pH 7.2) 100 ml를 500 ml용량의 솜마개 처리한 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 20분 동안 오토클레이브에서 살균하여, 배정용 플라스크 배양지를 준비하였다.
다음으로, 이하 조성의 배양지(글루코오스 30 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 황산암모늄 0.5 g/L, 인산이수소칼륨 2.25 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 5.7 g/L, 염화칼슘 2수화물 0.1 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.5 g/L, 황산철 7수화물 5 g/L, L-글루타민산 나트륨 1 수화물 6 g/L, 알코올계 소포제 0.5 g/L) 2.0 L를 5 L용량의 발효조에 넣어, 이와 같은 발효조를 2개 준비하였다. 해당 발효조에 D-비오틴을 각각 0 및 0.1 mg/L가 되도록 첨가하고, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브에서 살균하였다.
상술한 파라코쿠스 제아잔티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens) ATCC 21588주의 백금 루프를 상기 준비한 배정용 플라스크 배양지에 접종하고, 27℃에서 2 일 동안, 100 rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 상기 수득한 배양액 80 mL를 각각 상기 준비한 발효조에 도입하고, 27℃에서 환기량 1 vvm의 호기성 배양을 120시간 동안 실시하였다. 배양 중 pH가 7.2를 유지하도록 15 % 암모니아수를 이용하여 연속적으로 pH를 조절하였다. 글루코오스는 고갈되지 않도록 연속적으로 공급하였다. 또한, 최저 교반 회전수를 100 rpm으로 하면서, 배양 중기에 배양액 중 용존 산소농도가 3 ppm을 유지하도록 교반 회전수를 변화시켰다. 기포 센서로 발포를 감지하면서, 알코올계 소포제를 자동적으로 첨가하여 발포를 억제시켰다.
배양 종료시 배양액 중 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도 및 건조균체량 당 PHB 함량을 측정하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 비오틴을 첨가한 실험구에서는, 비오틴을 첨가하지 않은 실험구와 비교하여 제아잔틴의 농도가 높고, 글루콘산의 농도가 낮다는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 3에 있어서의 "당에 대한 글루콘산 수율%(w/w)"은 소비한 수크로오스의 총량에 대한 배양 종료시 글루콘산 생산량의 비율을 의미한다.
[표 3]
Figure 112012083055132-pct00003

[실시예 4]
파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) E-396주(FERM BP-4283)를 E-396주(FERM BP-4283)를 자외선 조사에 의해 변이 처리하여, 황색 내지 주황색의 콜로니를 선택하였다. 선택한 균주를 시험관에서 배양하여 배양액의 pH 저하가 적은 변이주를 선택하였다. 선택한 변이주의 시험관 배양액 중 글루콘산 농도 및 카로테노이드 농도를 측정한 후, 글루콘산 생산능이 낮고, 제아잔틴 생산능이 높은 변이주 ZX-6주를 선택하였다.
이하의 조성의 배양지(수크로오스 30 g/L, 파마메디아(pharmamedia) 10 g/L, 인산이수소칼륨 0.8 g/L, 인산수소이칼륨 4.2 g/L, 염화칼슘 2수화물 1 g/L, 황산마그네슘 7수화물 12 g/L, 황산철 7수화물 1 g/L, pH 7.2) 100 ml를 500 ml용량의 솜마개 처리한 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 20분 동안 오토클레이브에서 살균하여, 배정용 플라스크를 준비하였다.
다음으로, 이하 조성의 배양지(수크로오스 30 g/L, 파마메디아 20 g/L, 황산암모늄 1.5 g/L, 인산이수소칼륨 1.5 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 3.8 g/L, 염화칼슘 2수화물 0.1 g/L, 황산마그네슘 7수화물 4.5 g/L, 황산철 7수화물 5 g/L, L-글루타민산나트륨 1수화물 6 g/L, 실리콘계 소포제 1g/L) 2.0 L를 5 L용량의 발효조에 넣어, 이와 같은 발효조를 2개 준비하였다. 해당 발효조에 D-비오틴을 각각 0 및 5.0 mg/L가 되도록 첨가하고, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브에서 살균하였다.
상기에서 선택한 글루콘산의 생산능이 적은 파라코쿠스(Paracoccus) 속 제아잔틴을 생산하는 세균 ZX-6주의 백금 루프를 상기 준비한 배정용 플라스크 배양지에 접종하고, 28℃에서 3 일 동안, 100 rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 상기 수득한 배양액 80 mL를 각각 상기 준비한 발효조에 도입하고, 28℃에서 환기량 1 vvm의 호기성 배양을 120시간 동안 실시하였다. 배양 중 pH가 7.2를 유지하도록 25 % 암모니아수를 이용하여 연속적으로 pH를 조절하였다. 수크로오스는 고갈되지 않도록 연속적으로 공급하였다. 또한, 최저 교반 회전수를 100 rpm으로 하면서, 배양 중기에 배양액 중 용존 산소농도가 4 ppm을 유지하도록 교반 회전수를 변화시켰다. 기포 센서로 발포를 감지하면서, 지방산계 소포제를 자동적으로 첨가하여 발포를 억제시켰다.
상기 2가지 조건으로 배양을 실시하고, 배양 종료시(120시간 후) 배양액 중 카로테노이드 농도, 글루콘산농도 및 건조균체량 당 PHB 함량을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 비오틴을 첨가한 실험구에서는, 비오틴을 첨가하지 않은 실험구와 비교하여 제아잔틴의 농도가 높고, 글루콘산의 농도가 낮다는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 4에 있어서의 "당에 대한 글루콘산 수율%(w/w)"은 소비한 수크로오스의 총량에 대한 배양 종료시 글루콘산 생산량의 비율을 의미한다.
[표 4]
Figure 112012083055132-pct00004

[실시예 5]
파라코쿠스 카로티니파시엔스(Paracoccus carotinifaciens) E-396주(FERM BP-4283)를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 변이 처리하여 진한 적색의 콜로니를 선택하였다. 선택한 균주를 시험관에서 배양하여 배양액 중의 PHB 농도와 카로테노이드 농도를 측정한 후, PHB 생산능이 낮고, 아스타잔틴 생산능이 높은 변이주 LP-26주를 선택하였다. 그 후, LP-26주를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 변이 처리하여 황색 내지 주황식의 콜로니를 선택하였다. 선택한 균주를 시험관에서 배양하여 PHB 함량 및 카로테노이드 농도를 측정한 후, PHB 생산능이 낮고, 제아잔틴 생산능이 높은 변이주 ZXA-7주를 선택하였다.
이하 조성의 배양지(수크로오스 20 g/L, 옥수수침지액 5 g/L, 인산이수소칼륨 0.54 g/L, 인산수소이칼륨 2.78 g/L, 염화칼슘 2수화물 5 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.7 g/L, 황산철 7수화물 3 g/L, pH 7.2) 100 ml를 500 ml용량의 솜마개 처리한 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 20분 동안 오토클레이브에서 살균하여, 배정용 플라스크 배양지를 준비하였다.
다음으로, 이하 조성의 배양지(글루코오스 40 g/L, 옥수수침지액 30 g/L, 황산암모늄 0.5 g/L, 인산이수소칼륨 2.25 g/L, 인산수소이나트륨 12수화물 5.7 g/L, 염화칼슘 2수화물 0.1 g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.5 g/L, 황산철 7수화물 5 g/L, L-글루타민산 나트륨 1수화물 6 g/L, 알코올계 소포제 0.5 g/L) 2.0 L를 5 L용량의 발효조에 넣어, 이와 같은 발효조를 2개 준비하였다. 해당 발효조에 D-비오틴을 각각 0 및 0.5 mg/L가 되도록 첨가하고, 121℃에서 20분 동안 오토클레이브에서 살균하였다.
상기에서 선택한 PHB 생산능이 낮고, 제아잔틴의 생산능이 높은 파라코쿠스(Paracoccus) 속 세균 ZXA-7주의 백금 루프를 상기 준비한 배정용 플라스크 배양지에 접종하고, 27℃에서 2 일 동안, 150 rpm으로 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 상기 수득한 배양액 80 mL를 각각 상기 준비한 발효조에 도입하고, 27℃에서 환기량 1 vvm의 호기성 배양을 120시간 동안 실시하였다. 배양 중 pH가 7.1을 유지하도록 15 % 암모니아수를 이용하여 연속적으로 pH를 조절하였다. 글루코오스는 고갈되지 않도록 연속적으로 공급하였다. 또한, 최저 교반 회전수를 200 rpm으로 하면서, 배양 중기에 배양액 중 용존 산소농도가 6 ppm을 유지하도록 교반 회전수를 변화시켰다. 기포 센서로 발포를 감지하면서, 에스테르계 소포제를 자동적으로 첨가하여 발포를 억제시켰다.
배양 종료시 배양액 중 카로테노이드 농도, 글루콘산 농도 및 건조균체량 당 PHB 함량을 측정하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다. 비오틴을 첨가한 실험구에서는, 비오틴을 첨가하지 않은 실험구와 비교하여 제아잔틴의 생산성이 높다는 것을 알 수 있었다. 또한, 표 5에 있어서의 "당에 대한 글루콘산 수율%(w/w)"은 소비한 글루코오스의 총량에 대한 배양 종료시 글루콘산 생산량의 비율을 의미한다.
[표 5]
Figure 112012083055132-pct00005

[실시예 6]
실시예 1에서 수득한 제아잔틴 생산 변이주 ZX-3주를 이용하여, 실시예 1과 동일한 배양 조건하에서, 5 L 발효조에 D-비오틴을 1 mg/L의 농도로 첨가한 후, 120시간 동안 배양하였다.
상기 수득한 배양액을 황산을 이용하여 pH 4.5로 조정하고 원심분리하여 수득한 농축물에 농축전의 배양액과 동일한 체적이 되도록 물을 첨가하여 현탁시킨 후, 다시 원심분리하였다. 그 후, 농축물을 동결건조시켜 건조균을 수득하였다.
상기 수득한 건조균 당 제아잔틴의 함량은 4.1 mg/g이었다. 한편, 비교를 위해서 비오틴을 첨가하지 않고 동일하게 배양 및 건조시켜 수득한 건조균 당 제아잔틴의 함량은 1.3 mg/g이었다.
[실시예 7]
실시예 2에서 수득한 제아잔틴 생산 변이주 ZX-5주를 이용하여, 실시예 2와 동일한 배양 조건하에서, 5 L 발효조에 D-비오틴을 1 mg/L의 농도로 첨가하고 배양하였다.
상기 수득한 배양액을 MicrozaTM 정밀 여과막(Asahi Kasei Chemicals Corporation)을 이용하여 4배 농축하고, 농축액과 등량의 물을 첨가한 후, 추가로 여과 농축하였다. 수득한 농축물을 드럼건조기로 건조시켜, 건조균을 수득하였다.
상기 수득한 건조균 당 제아잔틴의 함량은 2.0 mg/g이었다.
[실시예 8]
실시예 4에서 수득한 배양액을 5 L용량의 발효조에 넣고 D-비오틴을 5 mg/L의 농도로 첨가한 후, 80 ℃에서 30분 동안 살균 처리하였다. 그 후, 배양액에 황산을 첨가하여 pH를 4.6으로 조정하고, 배양액과 등량의 물을 첨가한 후, 원심분리하여 6배 농축시켰다.
상기 농축물을 스프레이건조기로 건조시켜 수득한 건조균 당 제아잔틴의 함량은 6.6 mg/g이었다.
[실시예 9]
실시예 5에서 수득한 배양액에 D-비오틴을 5 mg/L의 농도로 첨가한 후, 직교류형 세라믹 필터를 이용하여 2.2배 여과 농축하고, 농축물과 등량의 물을 첨가한 후, 추가로 여과하여 농축액을 수득하였다.
상기 농축액을 드럼 건조시켜 수득한 건조균 당 제아잔틴의 함량은 24 mg/g이었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 참고로서 본 명세서에 포함된다.
National Institute of Bioscience and Human-technology FERMBP-4283 19930427 National Institute of Bioscience and Human-technology FERMBP-4671 19940520
<110> JX Nippon Oil & Energy Corporation <120> Method for producing zeaxanthin by fermentation <130> 12FPI-09-09 <150> JP2010-079415 <151> 2010-03-30 <150> PCT/JP2011/057794 <151> 2011-03-29 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1452 <212> DNA <213> Paracoccus carotinifaciens <400> 1 agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60 gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120 aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180 agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240 atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300 ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360 gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420 accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480 agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540 aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600 gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660 gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780 tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900 aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960 cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020 ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080 tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140 gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200 agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260 atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320 accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380 ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440 gatcacctcc tt 1452

Claims (16)

  1. 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 생산하는 세균을 비오틴 함유 배양지에서 배양하는 공정을 포함하며, 배양 종료 후 비오틴 비함유 배양지의 배양액과 비교하여 글루콘산의 생산농도가 낮고 제아잔틴 생산농도가 높은 것을 특징으로 하는 제아잔틴을 함유한 카로테노이드를 생산하는 방법으로서,
    상기 세균이 파라코쿠스(Paracoccus) 속에 속하는 세균이고,
    상기 배양지 당 비오틴의 농도가 0.001 mg/L 내지 50 mg/L이며,
    상기 배양 종료 후의 배양액 중 글루콘산의 생산농도가 0 g/L 초과 80 g/L 이하이고,
    배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 제아잔틴의 함량이 2 mg/g 이상 50 mg/g 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    배양 종료 후의 배양액 중 글루콘산의 생산량이 소비한 탄소원의 0 %(w/w) 초과 30 %(w/w) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    생산된 카로테노이드가 β-크립토잔틴을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    생산된 카로테노이드가 β-카로틴을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    배양지 당 비오틴의 농도가 0.02 mg/L 내지 50 mg/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    배양 종료 후 배양액의 건조균체량 당 폴리-β-히드록시부티레이트(PHB)의 함량이 0 %(w/w) 초과 30 %(w/w) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 세균이 아스타잔틴을 생산하는 파라코쿠스 속 세균을 변이 처리하여 제아잔틴을 생산하도록 한 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 세균이 모균주와 비교하여 글루콘산 생산능이 저하된 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 세균이 모균주와 비교하여 폴리-β-히드록시부티레이트(PHB) 생산능이 저하된 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 세균이 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기 서열이 서열목록 1로 기재되는 염기 서열과 95% 이상 상동인 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 세균이 기탁번호 FERM BP-4283의 E-396 균주 또는 기탁번호 FERM BP-4671의 A-581-1 균주에서 유래한 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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