WO2014157457A1 - ゼアキサンチンの製造方法及び細菌の培養方法 - Google Patents

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zeaxanthin
mpa
culture
concentration
producing
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秀忠 永井
哲久 矢田
光利 東
季之 高橋
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Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to an efficient method for cultivating a zeaxanthin-producing microorganism under pressure conditions and an efficient method for producing zeaxanthin using the same.
  • Zeaxanthin is contained in various plants such as corn, added to feed as a natural yellow pigment, and is known for its use in improving the color of egg yolk, meat and epidermis in poultry such as chickens and as a food coloring agent. Moreover, it has a strong antioxidant action (Non-patent document 1), and an antitumor effect has been reported (Non-patent document 2). Zeaxanthin is known to exist in the retina and lens together with lutein and is involved in maintaining eye health (Non-patent Document 3). From these physiological effects, zeaxanthin is useful as a health food material, cosmetic material and pharmaceutical material.
  • Non-Patent Document 4 a chemical synthesis method using an optically active hydroxyketone obtained by asymmetric reduction of oxoisophorone as a raw material
  • Patent Document 5 a method of extracting from plant raw materials such as corn seed and marigold (Non-patent document 5, Patent document 1), Spirulina algae (patent document 2), Nannochloris microalgae (patent document 3), Flexibacter bacteria (patent document 4), Alteromonas bacteria (patent document 5)
  • production methods using microorganisms such as Flavobacterium genus (Non-patent Document 6), bacteria Agrobacterium aurantiacum (Non-patent document 7), and Paracoccus bacterium (Patent Documents 6-9) have been known.
  • zeaxanthin-producing microorganism a Paracoccus microorganism having a high ability to produce zeaxanthin (hereinafter referred to as “zeaxanthin-producing microorganism”) and uses the microorganism to improve efficiency. It has been reported that zeaxanthin can be produced specifically (Patent Document 10).
  • JP-A-8-092205 Japanese Patent Laid-Open No. 10-155430 Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-59558 Japanese Patent Laid-Open No. 5-328978 JP-A-5-49497 Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-79796 JP-A-8-9964 U.S. Pat.No. 5,607,839 U.S. Pat.No. 5,858,761 JP 2005-87097 A
  • the inventors of the present invention used the zeaxanthin-producing microorganism in a large culture tank (for example, a height of 10 m), or in a culture tank lacking oxygen supply capacity.
  • a large culture tank for example, a height of 10 m
  • a culture tank lacking oxygen supply capacity.
  • the amount of liquid to be applied is reduced (for example, 5 m in height) and the air phase is further pressurized, the microorganisms located at the bottom of the culture tank are It has been found that the zeaxanthin production ability and the growth ability of the microorganisms are significantly reduced due to the combined pressure of the gas phase.
  • the present invention provides a zeaxanthin-producing ability and a proliferating ability under a pressure condition that the zeaxanthin-producing microorganism can undergo in culture in a large-scale culture tank on a commercial scale without significantly reducing the zeaxanthin-producing ability and the proliferating ability of the microorganism. It is an object of the present invention to provide a method for cultivating a zeaxanthin-producing microorganism and a method for producing zeaxanthin using the culture method.
  • the inventors of the present invention used a chelating agent having an action of chelating iron element and solubilizing in the medium, for example, citric acid or a salt thereof, By cultivating a zeaxanthin-producing microorganism, the inventors have found that zeaxanthin-producing ability and proliferation ability can be maintained under a predetermined pressure condition without significantly reducing the zeaxanthin-producing ability and proliferation ability of the microorganism, and the present invention has been completed. I came to let you.
  • the present invention has the following features.
  • a method for producing zeaxanthin using a zeaxanthin-producing microorganism belonging to the genus Paracoccus (i) culturing the microorganism under an average pressure condition of 0.008 MPa or more and 0.08 MPa or less in a medium containing a chelating agent; and (ii) recovering the produced zeaxanthin from the culture, Including the above method.
  • step (ii) includes a step of obtaining a composition containing zeaxanthin by removing medium components and water from the culture and drying the culture medium.
  • a method of culturing a microorganism under a pressure condition of 0.008 to MPa and 0.08 to MPa comprising culturing a zeaxanthin-producing microorganism belonging to the genus Paracoccus in a medium containing a chelating agent.
  • zeaxanthin-producing ability and proliferation can be achieved without significantly reducing the zeaxanthin-producing ability and proliferation ability of the microorganism even under pressure conditions that the zeaxanthin-producing microorganism can undergo in culture in a large-scale culture tank on a commercial scale. It is possible to provide a method for cultivating a zeaxanthin-producing microorganism and a method for producing zeaxanthin using the culturing method that make it possible to maintain the performance.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a biosynthetic pathway of carotenoids of Paracoccus microorganisms.
  • FIG. 2 shows the measurement results of the zeaxanthin concentration (solid line) and the microorganism concentration (dotted line) in a culture solution obtained by culturing zeaxanthin-producing microorganisms under different pressure conditions.
  • the zeaxanthin concentration in the culture solution is shown as a relative value with the zeaxanthin concentration in the culture solution obtained under a pressure condition of 0.0030.00MPa as 100%.
  • FIG. 3 shows the measurement results of zeaxanthin concentration (solid line) and microbial concentration (dotted line) in the culture solution obtained by culturing zeaxanthin-producing microorganisms in a medium with a different amount of sodium citrate added under a pressure of 0.05 MPa. Show.
  • the zeaxanthin concentration in the culture broth is shown as a relative value with the zeaxanthin concentration in the culture broth obtained under the condition that the amount of sodium citrate added is 0 g / L.
  • FIG. 4 shows the measurement of zeaxanthin concentration (solid line) and microbial concentration (dotted line) in a culture solution obtained by culturing zeaxanthin-producing microorganisms in a medium supplemented with 2.8 g / L sodium citrate under different pressure conditions. Results are shown. The zeaxanthin concentration in the culture solution is shown as a relative value with the zeaxanthin concentration in the culture solution obtained under a pressure condition of 0.003 MPa in a medium without addition of sodium citrate as 100%.
  • FIG. 5 shows the measurement results of various ion concentrations in the supernatants of media with different amounts of sodium citrate added.
  • Triangle Potassium ion;
  • Batsu Magnesium ion;
  • Zeaxanthin-producing microorganism is a microorganism belonging to the genus Paracoccus, and has a high ratio of zeaxanthin to the total amount of carotenoid produced.
  • Zeaxanthin-producing microorganisms can be obtained based on a known method (for example, see JP-A-2005-87097). That is, astaxanthin-producing microorganisms belonging to the genus Paracoccus (hereinafter referred to as “astaxanthin-producing microorganisms”) are mutagenized to induce mutation, and the ratio of zeaxanthin produced to the total carotenoid production (mass%) ) Can be obtained by selecting and obtaining a mutant strain higher than that of the parent strain astaxanthin-producing microorganism.
  • astaxanthin-producing microorganisms include astaxanthin-producing bacteria in which the base sequence of DNA corresponding to 16S ribosomal RNA is substantially homologous to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • examples of such astaxanthin-producing microorganisms include the E-396 strain (FERM BP-4283) and A-581-1 strain (FERM BP-4671), and these mutant strains and related species thereof.
  • the E-396 strain (FERM BP-4283) and A-581-1 strain (FERM BP-4671) are the National Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center) ( It is deposited on April 27, 1993 and May 20, 1994, respectively, at the current National Center for Product Evaluation Technology (PAT).
  • Mutation treatments for astaxanthin-producing microorganisms include chemical methods such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and ethylmethanesulfonate (EMS), ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, etc. Physical methods, biological methods such as genetic recombination, transposon, and the like can be used.
  • This mutation treatment may be performed once, or, for example, a mutation of an astaxanthin-producing microorganism may be obtained by this mutation treatment, and the mutation treatment may be further performed twice or more.
  • mutant mutants of astaxanthin-producing microorganisms that have been mutated select mutants in which the ratio (mass%) of zeaxanthin produced to the total carotenoid production is higher than that of the parent strain, and select zeaxanthin-producing microorganisms. Obtainable. When colonies are formed on a solid medium, colonies of zeaxanthin-producing microorganisms exhibit a yellow-orange color, and can be easily distinguished from the red-red-orange colonies of astaxanthin-producing microorganisms. A zeaxanthin-producing microorganism (mutant strain) can be selected.
  • the mutant colonies selected in this manner are cultured by a conventional method, and after completion of the culture, carotenoid compounds contained in the culture solution of each mutant strain can be obtained by, for example, high performance liquid chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography. Analyze using etc. Thereby, a mutant strain with a high ratio of zeaxanthin to the total carotenoid amount can be selected and obtained.
  • the total amount of carotenoid referred to here is the total amount of carotenoid compounds such as astaxanthin, canthaxanthin, adonixanthin, ⁇ -carotene, echinone, zeaxanthin, ⁇ -cryptoxanthin, 3-hydroxyechinone, astereudenone, and adonilbin.
  • astaxanthin biosynthesis in astaxanthin-producing microorganisms is considered to be carried out with ⁇ -carotene as the upstream and 6-membered rings at both ends modified by ketozyme and hydroxylase (see FIG. 1). If the ketozyme is completely or incompletely lost here, the reaction indicated by the arrow “keto” in FIG.
  • Echinenone, canthaxanthin, 3-hydroxyechinenone, asteroidenone, adonilvin, adonixanthin and astaxanthin which are products of the above, are not produced or the production is reduced. Therefore, another effective means for selecting zeaxanthin-producing microorganisms from mutant strains is the total carotenoids of echinenone, canthaxanthin, 3-hydroxyechinenone, asteroidenone, adonilbin, adonixanthin and astaxanthin
  • a method of selecting on the basis of the low ratio of each to the amount can be used. Selection can be made on the basis that the ratio of each of the aforementioned compounds to the total carotenoid is less than 10% by mass, more preferably less than 5% by mass, and even more preferably less than 1% by mass.
  • the medium used in the present invention contains a chelating agent.
  • the “chelating agent” is not particularly limited as long as it has a function of chelating iron elements and solubilizing them in the medium.
  • Known chelating agents can be used, for example, citric acid, malic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, acetic acid, gluconic acid, phytic acid, polyaminophosphoric acid, lactic acid, alkyl diphosphones.
  • Acid ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid, 1,2-diaminocyclohexanetetraacetic acid, hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid, iminodiacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, dihydroxyethylglycine, diaminopropanetetraacetic acid , Nitrilotris (methylenephosphonic acid), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid), and salts thereof.
  • the salt include water-soluble salts, such as alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, ammonium salts, and the like.
  • the chelating agent is preferably citric acid or citrate.
  • the zeaxanthin producing ability and the proliferating ability of the zeaxanthin producing microorganism can be improved even under pressure conditions that inhibit zeaxanthin production by the zeaxanthin producing microorganism and the growth of the microorganism.
  • the addition amount of these chelating agents added to the medium varies depending on the type of chelating agent used and the ability to chelate iron elements, but even under pressure conditions that inhibit zeaxanthin production by the zeaxanthin-producing microorganism and the growth of the microorganism, It can adjust suitably in the range which improves the zeaxanthin production ability and growth ability of a zeaxanthin production microorganism.
  • the chelating agent used is citric acid or a salt thereof, the amount is less than 14 g, preferably 10.0 g or less, more preferably 8.4 g or less per liter of medium.
  • the lower limit of the addition amount of citric acid or a salt thereof is not particularly limited, but if it is too small, a sufficient chelating effect cannot be obtained, so 0.5 g or more, preferably 1.0 g or more, more preferably 1.5 g or more, More preferably, it is 2.8 g or more. Therefore, the amount of citric acid or a salt thereof added is preferably 0.5 g or more and 10.0 g or less, more preferably 2.8 g or more and 8.4 g or less per liter of medium.
  • the medium further contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and special required substances (for example, vitamins, amino acids, nucleic acids, etc.) necessary for the growth of the zeaxanthin-producing microorganism.
  • Carbon sources include sugars such as glucose, sucrose, fructose, trehalose, mannose, mannitol, maltose, organic acids such as acetic acid, fumaric acid, citric acid, propionic acid, malic acid, malonic acid, ethanol, propanol, butanol, pen Examples include alcohols such as butanol, hexanol, and isobutanol.
  • the addition ratio varies depending on the type of carbon source, but is usually 1 to 100 g, preferably 2 to 50 g, per liter of the medium.
  • the nitrogen source for example, one or more of potassium nitrate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonia, urea and the like are used.
  • the addition ratio varies depending on the type of nitrogen source, but is usually 0.1 to 20 g, preferably 1 to 10 g, per 1 L of the medium.
  • Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, iron sulfate, iron chloride, manganese sulfate, manganese chloride, zinc sulfate, zinc chloride, copper sulfate, and chloride.
  • One or more of calcium, calcium carbonate, sodium carbonate and the like are used.
  • the addition ratio varies depending on the type of inorganic salt, but is usually 0.1 mg to 10 mg per 1 L of medium.
  • Special requirements include vitamins, nucleic acids, yeast extract, peptone, meat extract, malt extract, corn steep liquor, dry yeast, soybean meal, soybean oil, olive oil, corn oil, linseed oil, etc. The above is used.
  • the addition ratio varies depending on the type of special requirement substance, but is usually 0.01 mg to 100 mg per 1 L of medium.
  • the pH of the medium is adjusted to 2 to 12, preferably 6 to 9.
  • the present invention is a culture of a zeaxanthin-producing microorganism, 0.008 MPa or more and 0.08 MPa or less, or 0.008 MPa or more and less than 0.08 MPa, preferably 0.02 MPa or more and 0.08 MPa or less, or 0.02 MPa or more with respect to the zeaxanthin producing microorganism. And it can be applied to a culture method having a situation where a pressure of less than 0.08 MPa, more preferably 0.05 MPa is applied.
  • the pressure in the liquid phase portion water pressure
  • a difference occurs between the pressure condition at the upper part of the medium and the pressure condition at the lower part of the medium.
  • the pressure value when a large culture tank is used can be an average pressure value applied to the culture system (liquid phase part).
  • the average pressure value applied to the culture system can be determined as 0.02 MPa (gas phase part) +0.03 MPa (medium water depth median water pressure of 3 M).
  • the zeaxanthin producing ability and the growth ability of the microorganism are significantly reduced.
  • the zeaxanthin-producing ability of the zeaxanthin-producing microorganism is not significantly reduced even under the above pressure conditions, and the production ability can be maintained.
  • zeaxanthin-producing microorganism by culturing a zeaxanthin-producing microorganism using the medium, it is possible to promote the growth of the zeaxanthin-producing microorganism, and the ability of the microorganism to grow does not significantly decrease even under the pressure condition. That is, by culturing a zeaxanthin-producing microorganism using the above medium, zeaxanthin can be produced and produced with high efficiency even under the above pressure conditions.
  • Cultivation can be carried out at a temperature of 10 to 70 ° C., preferably 20 to 35 ° C., usually by shaking culture or aeration and agitation culture for 1 to 20 days, preferably 2 to 9 days.
  • the zeaxanthin produced in the present invention can be recovered based on a known technique. That is, after completion of the culture, a culture precipitate containing zeaxanthin can be obtained by removing medium components and water from the culture solution by filtration, centrifugation, or the like. If necessary, the culture precipitate can be further dried by spray drying, drum drying, freeze drying, or the like to obtain a dried precipitate containing zeaxanthin.
  • zeaxanthin is extracted from the culture precipitate or the precipitate dried using a water-soluble organic solvent.
  • the water-soluble organic solvent is not particularly limited, and for example, tetrahydrofuran, pyridine, dioxane, cyclohexanone, cyclohexanol, methanol, ethanol, isopropanol, acetone, ethyl methyl ketone, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and the like can be used. These may be used alone, in combination of two or more, or in combination with water.
  • An extract containing zeaxanthin can be obtained by removing the solvent from the obtained water-soluble organic solvent extract by concentration under reduced pressure or the like. The obtained extract may be subjected to a deodorizing treatment if necessary, or may be suspended in a vegetable oil.
  • zeaxanthin can be further purified by adding a nonpolar organic solvent and water to the water-soluble organic solvent extract and performing liquid-liquid extraction.
  • a nonpolar organic solvent for example, hexane, heptane, cyclohexane, benzene, toluene, xylene, petroleum ether, naphtha, kerosene and the like can be used.
  • high-purity zeaxanthin can be precipitated by concentration, addition of water, addition of nonpolar solvent or cooling.
  • concentration, addition of water, addition of a nonpolar solvent and cooling may be carried out independently, but they can also be carried out in combination as necessary. Since the obtained precipitate is easily recovered by filtration, it can be washed with a solvent or the like, if necessary, and dried to obtain a highly purified zeaxanthin extract and purified product.
  • Base medium A basic medium having the following composition was used.
  • the basic medium 2.0L was put into a 5 L fermenter, a predetermined amount of sodium citrate was added as necessary, and autoclaved at 121 ° C. for 30 minutes, and used in the following examples.
  • zeaxanthin-producing microorganism As the zeaxanthin-producing microorganism, a mutant obtained by the above method from an astaxanthin-producing microorganism belonging to the genus Paracoccus was used.
  • the value of the pressure condition described in the following examples indicates an average pressure value applied to the culture system (liquid phase part).
  • the analytical column used was two Inertsil® SIL-100A, 5 ⁇ m ( ⁇ 4.6 ⁇ 250 mm) (manufactured by GL Sciences) connected together. Elution was carried out by flowing 1.0 mL / min of a mobile phase n-hexane / tetrahydrofuran / methanol mixture (40: 20: 1) at a constant temperature near room temperature. In the measurement, the sample was dissolved in tetrahydrofuran and 20 ⁇ L of a 100-fold diluted solution in the mobile phase was used as the injection amount, and the column eluent was detected at a wavelength of 470 nm. Further, ZEAXANTHIN (Cat. No.
  • the zeaxanthin concentration of the standard solution was set using the following formula after measuring the absorbance at 453 nm (A) of the standard solution and the area percentage% (B) of the zeaxanthin peak when HPLC analysis was performed under the above conditions. It was.
  • Zeaxanthin concentration (mg / L) A ⁇ 2327 ⁇ B ⁇ 100 [Measurement of bacterial cell concentration]
  • the absorbance (OD 610 ) of the culture solution after completion of the culture was measured using a spectrophotometer, and this value was taken as the cell concentration of the culture solution.
  • Example 1 Effect of pressure on zeaxanthin-producing microorganism
  • a basal medium not added with sodium citrate under pressure conditions of 0.003 MPa, 0.025 MPa, 0.05 MPa, 0.075 MPa, or 0.1 MPa. Incubated at 0.003 MPa, 0.025 MPa, 0.05 MPa, 0.075 MPa, or 0.1 MPa. Incubated at 0.003 MPa, 0.025 MPa, 0.05 MPa, 0.075 MPa, or 0.1 MPa.
  • the culture solution was collected and the zeaxanthin concentration and microbial concentration in the culture solution were measured.
  • the results are shown in FIG.
  • the zeaxanthin concentration in the culture solution is shown as a relative value with the zeaxanthin concentration in the culture solution obtained under a pressure condition of 0.0030.00MPa as 100%.
  • the zeaxanthin concentration in the culture decreased by applying pressure, and the lowest value was obtained when a pressure of 0.05 MPa was applied.
  • the microbial concentration in the culture showed the same tendency.
  • Example 2 Effect of citrate on zeaxanthin-producing microorganisms under pressure conditions Sodium citrate was added at 0 g / L, 2.8 g / L, 8.4 g / L, 14 g / Culture was carried out by the above culture method using a basic medium prepared by adding L or a concentration of 21 g / L.
  • the culture solution was collected and the zeaxanthin concentration and microbial concentration in the culture solution were measured.
  • the results are shown in FIG.
  • the zeaxanthin concentration in the culture broth is shown as a relative value with the zeaxanthin concentration in the culture broth obtained under the condition that the amount of sodium citrate added is 0 g / L. It was shown that the zeaxanthin concentration in the culture broth was improved by adding sodium citrate to the medium even in the culture under a pressure condition of 0.05 MPa. The microbial concentration in the culture showed the same tendency. In particular, when sodium citrate was added to a concentration of 2.8 to 8.4 g / L in the medium, both the zeaxanthin concentration and the microorganism concentration showed high values.
  • Example 3 Effect of pressure on zeaxanthin-producing microorganisms in the presence of citrate zeaxanthin-producing microorganisms were added at a pressure of 0.003 MPa, 0.02 MPa, 0.04 MPa, 0.06 MPa, 0.08 MPa, or 0.1 MPa. Using a basic medium prepared by adding to a concentration of g / L, culturing was performed by the above culture method.
  • the culture solution was collected and the zeaxanthin concentration and microbial concentration in the culture solution were measured.
  • the zeaxanthin concentration in the culture broth is shown as a relative value in which the zeaxanthin concentration in the culture broth obtained under the pressure condition of 0.003 MPa in the medium without addition of sodium citrate in Example 1 is 100%.
  • the concentration of zeaxanthin in the culture solution is greatly reduced not only under the pressure condition of 0.05 MPa but also under the pressure condition of 0.02 MPa ⁇ 0.08 MPa required on a commercial scale. There was no.
  • the pressure condition is smaller than 0.008 MPa and larger than 0.08 MPa, the culture solution can be obtained by adding sodium citrate to the medium. Zeaxanthin concentration was shown to decrease.
  • the microorganism concentration in the culture solution was not limited to a pressure of 0.05 MPa but was not significantly reduced under other pressure conditions. Moreover, it was shown that by adding sodium citrate to the medium, the microorganism concentration in the culture solution can be improved regardless of the pressure condition (see FIG. 2).
  • Example 4 Change in ion concentration in culture supernatant by addition of citrate Sodium citrate was added to a concentration of 0 g / L, 2.8 g / L, 8.4 g / L, or 14 g / L, respectively.
  • the basal medium prepared in this manner was centrifuged to recover the supernatant.
  • the concentration of calcium ions, iron ions, potassium ions, magnesium ions, and phosphate ions in each of the obtained supernatants was measured.
  • Each cation concentration was measured by ICP emission spectrometry, and phosphate ions were measured by molybdenum blue absorbance method.
  • the present invention it is possible to maintain high zeaxanthin-producing ability and proliferative ability of zeaxanthin-producing microorganisms even in culture in a large-scale culture tank on a commercial scale, and efficiently produce a large-scale zeaxanthin on a commercial scale. be able to.

Abstract

　所定の圧力条件下においても、ゼアキサンチン生産微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を維持することが可能な培養方法及びそれを用いたゼアキサンチンの製造方法を提供する。　キレート剤を含有する培地中にて、ゼアキサンチン生産微生物を培養することを含む、所定の圧力条件下における該微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を向上させる方法。

Description

ゼアキサンチンの製造方法及び細菌の培養方法
　本発明は、圧力条件下におけるゼアキサンチン生産微生物の効率的な培養方法及びそれを用いたゼアキサンチンの効率的な製造方法に関する。
　ゼアキサンチンはトウモロコシなど種々の植物に含まれ天然の黄色色素として飼料に添加され、ニワトリなどの家禽類の卵黄、肉、表皮の色調を改善する用途および食品の着色料としての用途が知られる。また強力な抗酸化作用を有し（非特許文献１）、抗腫瘍効果が報告されている（非特許文献２）。ゼアキサンチンはルテインとともに網膜及び水晶体に存在し眼の健康維持に関与していることが知られている（非特許文献３）。これらの生理的効果からゼアキサンチンは健康食品素材、化粧品素材及び医薬品素材として有用である。
　従来、ゼアキサンチンの製造法としてはオキソイソホロンの不斉還元により得た光学活性なヒドロキシケトンを原料として用いる化学合成法（非特許文献４）、トウモロコシの種子やマリーゴールドなどの植物原料から抽出する方法（非特許文献５、特許文献１）、さらに、スピルリナ藻類（特許文献２）、ナンノクロリス属微細藻類（特許文献３）、フレキシバクター属細菌（特許文献４）、アルテロモナス属細菌（特許文献５）、フラボバクテリウム属細菌（非特許文献６）、細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（非特許文献７）、パラコッカス属細菌（特許文献６－９）等の微生物による生産方法が知られていた。
　しかしながら、化学合成法においては有機溶剤を使用するため安全性及び近年の天然物指向の面で問題がある。また、植物に含まれるゼアキサンチン含量は非常に低く、また、従来の微生物によるゼアキサンチン生産量は十分に高いものではなかったことから、植物及び微生物を用いた方法では効率的にゼアキサンチンを得ることができず実用的でなかった。
　これらの課題を解決するために、本発明者らはこれまでにゼアキサンチン生産能の高いパラコッカス属微生物（以下、「ゼアキサンチン生産微生物」と記載する。）を開発し、当該微生物を利用することによって効率的にゼアキサンチンを製造することが可能であることを報告している（特許文献１０）。
特開平8-092205号公報 特開平10-155430号公報 特開平7-59558号公報 特開平5-328978号公報 特開平5-49497号公報 特開平7-79796号公報 特開平8-9964号公報 米国特許第5,607,839号公報 米国特許第5,858,761号公報 特開2005-87097号公報
Fisheries Science, 62 (1), 134-137, 1996 Biol. Pharm. Bull., 18 (2), 227-233, 1995 FOOD Style 21, 3 (3), 50-53, 1999 Pure Appl. Chem., 63 (1), 45, 1991 生体色素，朝倉書店，１９７４年出版 Carotenoids, in Microbial Technology, 2nd edn, Vol.1, 529-544,New York:Academic Press FEMS Microbiology Letters, 128, 139-144, 1995
　本発明者らは、商業規模のゼアキサンチン製造を目的として、大型の培養槽（例えば、高さ10m）にて上記ゼアキサンチン生産微生物の培養を行う際、もしくは、酸素供給能力の不足する培養槽において酸素供給量を高めるために、張り込む液量を少なくして（例えば、高さ5m）更に空気相を加圧する場合などに、培養槽の下部に位置する微生物は液深分の水圧、あるいは水圧と気相の圧力を併せた圧力を受けており、これによって当該微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能が顕著に低下することを見出した。
　従って本発明は、商業規模の大型の培養槽における培養においてゼアキサンチン生産微生物が受け得る圧力条件下においても、当該微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を顕著に低下させることなく、ゼアキサンチン生産能及び増殖能を維持することを可能とする、ゼアキサンチン生産微生物の培養方法、及び該培養方法を用いたゼアキサンチンの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、鉄元素をキレート化し、培地中に可溶化させる作用を有するキレート剤、例えばクエン酸又はその塩、を含む培地を用いて、ゼアキサンチン生産微生物を培養することによって、所定の圧力条件下においても、当該微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を顕著に低下させることなく、ゼアキサンチン生産能及び増殖能を維持できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］　パラコッカス（Paracoccus）属に属するゼアキサンチン生産微生物を用いたゼアキサンチンの製造方法であって、
(i) キレート剤を含有する培地中にて、0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の平均圧力条件下にて該微生物を培養する工程、及び
(ii) 培養物より、生成されたゼアキサンチンを回収する工程、
を含む、上記方法。
［２］　工程(ii)が、培養物より培地成分及び水分を除去して乾燥させることによりゼアキサンチンを含む組成物を得る工程を含む、［１］の方法。
［３］　さらに、ゼアキサンチンを含む組成物よりゼアキサンチンを精製する工程を含む、［２］の方法。
［４］　キレート剤がクエン酸又はその塩である、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］　培地がクエン酸又はその塩を14 g/L未満の濃度で含有する、［４］の方法。
［６］　培地がクエン酸又はその塩を0.5 g/L以上かつ10 g/L以下の濃度で含有する、［５］の方法。
［７］　0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下の平均圧力条件下にて前記微生物を培養する、［１］～［６］のいずれかの方法。
［８］　キレート剤を含有する培地中にて、パラコッカス（Paracoccus）属に属するゼアキサンチン生産微生物を培養することを含む、0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の圧力条件下における該微生物のゼアキサンチン生産能を向上させる方法。
［９］　キレート剤がクエン酸又はその塩である、［８］の方法。
［１０］　培地がクエン酸又はその塩を14 g/L未満の濃度で含有する、［９］の方法。
［１１］　圧力条件が0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下である、［８］～［１０］のいずれかの方法。
［１２］　キレート剤を含有する培地中にて、パラコッカス（Paracoccus）属に属するゼアキサンチン生産微生物を培養することを含む、0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の圧力条件下における該微生物を培養する方法。
［１３］　キレート剤がクエン酸又はその塩である、［１２］の方法。
［１４］　培地がクエン酸又はその塩を14 g/L未満の濃度で含有する、［１３］の方法。
［１５］　圧力条件が0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下である、［１２］～［１４］のいずれかの方法。
［１６］　［２］の方法により製造された、ゼアキサンチンを含む組成物。
［１７］　［３］の方法により製造された、ゼアキサンチン。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-073833号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、商業規模の大型の培養槽における培養においてゼアキサンチン生産微生物が受け得る圧力条件下においても、当該微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を顕著に低下させることなく、ゼアキサンチン生産能及び増殖能を維持することを可能とする、ゼアキサンチン生産微生物の培養方法、及び該培養方法を用いたゼアキサンチンの製造方法を提供することができる。
図１はパラコッカス属微生物のカロテノイド類の生合成経路を示す模式図である。 図２はゼアキサンチン生産微生物を異なる圧力条件下にて培養して得られた培養液中のゼアキサンチン濃度（実線）及び微生物濃度（点線）の測定結果を示す。培養液中のゼアキサンチン濃度は、0.003 MPaの圧力条件下にて得られた培養液中のゼアキサンチン濃度を100%とする相対値にて示す。 図３はゼアキサンチン生産微生物を0.05 MPaの圧力条件下、クエン酸ナトリウムの添加量の異なる培地中で培養して得られた培養液中のゼアキサンチン濃度（実線）及び微生物濃度（点線）の測定結果を示す。培養液中のゼアキサンチン濃度は、クエン酸ナトリウムの添加量0 g/Lの条件下にて得られた培養液中のゼアキサンチン濃度を100%とする相対値にて示す。 図４はゼアキサンチン生産微生物を異なる圧力条件下にて、クエン酸ナトリウムを2.8 g/L添加した培地中で培養して得られた培養液中のゼアキサンチン濃度（実線）及び微生物濃度（点線）の測定結果を示す。培養液中のゼアキサンチン濃度は、クエン酸ナトリウム無添加の培地中、0.003 MPaの圧力条件下にて得られた培養液中のゼアキサンチン濃度を100%とする相対値にて示す。 図５はクエン酸ナトリウム添加量の異なる培地の上清中における各種イオン濃度の測定結果を示す。（丸）リン酸イオン；（三角）カリウムイオン；（ばつ）マグネシウムイオン；（ひし形）カルシウムイオン；（四角）鉄イオン。
１．ゼアキサンチン生産微生物
　本発明におけるゼアキサンチン生産微生物は、パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物であり、生産される総カロテノイド量に対するゼアキサンチンの比率が高い微生物である。
　ゼアキサンチン生産微生物は公知の手法（例えば、特開2005-87097号公報参照）に基づいて得ることができる。すなわち、パラコッカス（Paracoccus）属に属するアスタキサンチン生産微生物（以下、「アスタキサンチン生産微生物」と記載する。）を変異処理して突然変異を誘発し、生産されるゼアキサンチンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量%）が親株であるアスタキサンチン生産微生物のそれよりも高い変異株を選抜・取得することにより得ることができる。
　アスタキサンチン生産微生物としては、16SリボソームRNAに対応するDNAの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と実質的に相同であるアスタキサンチン生産細菌が挙げられる。このようなアスタキサンチン生産微生物として、例えばE-396株(FERM BP-4283)及びA-581-1株(FERM BP-4671)、ならびに、これら変異株及びこれらの近縁種が挙げられる。なお、E-396株(FERM BP-4283)及びA-581-1株(FERM BP-4671)は、工業技術院生命工学工業技術研究所（独立行政法人産業技術研究所 特許生物寄託センター）（現在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター）に平成5年(1993年)4月27日及び平成6年(1994年)5月20日にそれぞれ寄託されている。
　アスタキサンチン生産微生物に対する変異処理は、例えば、N－メチル－N’－ニトロ－N－ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホネート（EMS）等の変異剤による化学的方法、紫外線照射、Ｘ線照射等の物理的方法、遺伝子組換え、トランスポゾン等による生物学的方法などを用いることができる。この変異処理は１回でもよいし、また、例えばこの突然変異処理によりアスタキサンチン生産微生物の変異体を得て、これをさらに突然変異処理するというように2回以上の変異処理を行ってもよい。
　変異処理されたアスタキサンチン生産微生物の突然変異体の中から、生産されるゼアキサンチンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量%）が親株のそれよりも高くなっている変異株を選抜してゼアキサンチン生産微生物を得ることができる。固体培地上にコロニーを形成させた場合、ゼアキサンチン生産微生物のコロニーは黄色～橙色を呈し、アスタキサンチン生産微生物の赤色～赤橙色のコロニーと比較して容易に区別することが可能であり、効率的にゼアキサンチン生産微生物（変異株）を選抜することができる。このようにして選抜された変異株コロニーを慣用の方法により培養し、培養終了後に各変異株の培溶液中に含まれるカロテノイド化合物を、例えば、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等を利用して分析する。これにより、ゼアキサンチンの総カロテノイド量に対する比率の高い変異株を選抜・取得することができる。ここで言う総カロテノイド量とは、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β－カロテン、エキネノン、ゼアキサンチン、β－クリプトキサンチン、3－ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、アドニルビンなどのカロテノイド化合物の総量をいう。また、アスタキサンチン生産微生物におけるアスタキサンチンの生合成はβ－カロテンを上流とし、ケト化酵素および水酸化酵素によりそれぞれ両端の6員環が修飾されて行われるとされる（図１参照）。ここでケト化酵素が完全に欠損するか、又は不完全に欠損すれば、図１中「ケト化」にて表示される矢印の反応は生じないか、又は低下し、それによって「ケト化」による生成物であるところの、エキネノン、カンタキサンチン、3－ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンは生産されないか、又は生産量が低下する。したがって、変異株の中からゼアキサンチン生産微生物を選抜するためのもう一つの有効な手段としては、エキネノン、カンタキサンチン、3－ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、アドニルビン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンの総カロテノイド量に対するそれぞれの比率が低いことを基準に選抜する方法を用いることができる。前述化合物それぞれの総カロテノイドに対する比率がいずれも、10質量％未満、より好ましくは5質量％未満、さらに好ましくは1質量％未満であることを基準に選抜することができる。
２．培地
　本発明にて用いられる培地は、キレート剤を含有する。「キレート剤」としては、鉄元素をキレート化し、培地中に可溶化させる作用を有する物質であれば特に限定されない。このようなキレート剤としては公知のものを利用することができ、例えば、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、酢酸、グルコン酸、フィチン酸、ポリアミノリン酸、乳酸、アルキルジホスホン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ニトリロ三酢酸、1,2－ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）及びそれらの塩が挙げられる。塩としては水溶性塩が挙げられ、例えばナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩やアンモニウム塩等が挙げられる。キレート剤として好ましくはクエン酸又はクエン酸塩である。このようなキレート剤を培地に含めることによって、ゼアキサンチン生産微生物によるゼアキサンチン生産及び当該微生物の増殖を阻害する圧力条件下においても、ゼアキサンチン生産微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を向上させることができる。これらキレート剤の培地に加える添加量は、用いるキレート剤の種類や鉄元素をキレート化する能力によって変更されるが、ゼアキサンチン生産微生物によるゼアキサンチン生産及び当該微生物の増殖を阻害する圧力条件下においても、ゼアキサンチン生産微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を向上させる範囲にて適宜調節することができる。用いるキレート剤がクエン酸又はその塩であれば、培地1Ｌ当たり14 g未満、好ましくは10.0g以下、より好ましくは8.4 g以下である。クエン酸又はその塩の添加量の下限は特に限定されないが、少なすぎれば十分なキレート効果が得られないことから、培地1Ｌ当たり0.5 g以上、好ましくは1.0 g以上、より好ましくは1.5 g以上、さらに好ましくは2.8 g以上である。したがって、クエン酸又はその塩の添加量として、培地1Ｌ当たり好ましくは0.5 g以上かつ10.0g以下、より好ましくは2.8 g以上かつ8.4 g以下、の範囲から選択される量を用いることができる。
　培地はさらに、ゼアキサンチン生産微生物が生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩および必要であれば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核酸等）を含む。炭素源としてはグルコース、シュークロース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール等のアルコール類等が挙げられる。添加割合は炭素源の種類により異なるが、通常培地1Ｌ当たり1 g～100 g、好ましくは2 g～50 gである。窒素源としては、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類により異なるが、通常培地1 Lに対し0.1 g～20 g、好ましくは1 g～10 gである。無機塩としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の１種または2種以上が用いられる。添加割合は無機塩の種類により異なるが、通常、培地1 Lに対し0.1 mg～10 gである。特殊な要求物質としてはビタミン類、核酸類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、乾燥酵母、大豆粕、大豆油、オリーブ油、トウモロコシ油、アマニ油等の1種または2種以上が用いられる。添加割合は特殊な要求物質の種類により異なるが、通常、培地1 Lに対し0.01 mg～100 gである。培地のpHは2～12、好ましくは6～9に調整する。
３．培養方法
　本発明はゼアキサンチン生産微生物の培養において、当該ゼアキサンチン生産微生物に対して0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下、または0.008 MPa以上かつ0.08 MPa未満、好ましくは0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下、または0.02 MPa以上かつ0.08 MPa未満、さらに好ましくは0.05 MPaの圧力が付加される状況を有する培養方法に適用することができる。ただし、大型の培養槽を用いた場合、液相部分の圧力（水圧）は深度によって異なり、培地上部の圧力条件と培地下部の圧力条件に差が生じる。したがって、大型の培養槽を用いた場合の上記圧力値は培養系（液相部分）にかかる平均圧力値とすることができる。例えば、大型培養槽（高さ10 M）を用いた一般的な培養方法について例示すると、当該培養槽に対して深さ6 Mまで培地を満たし、気相に0.02 MPaの圧力を付加した場合、当該培養系にかかる平均圧力値は、0.02 MPa（気相部）＋0.03 MPa（培地水深中央値3 Mの水圧）として求めることができる。
　ゼアキサンチン生産微生物に対して0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の圧力が付加される条件下において、当該微生物を通常の培地を用いて培養すると当該微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能は顕著に低下する。一方、上記培地を使用して培養を行うことにより、ゼアキサンチン生産微生物のゼアキサンチン生産能は、上記圧力条件下においても顕著に低下することがなく、その生産能を維持することができる。また、上記培地を使用してゼアキサンチン生産微生物の培養を行うことにより、ゼアキサンチン生産微生物の増殖を促すことができ、上記圧力条件下においても当該微生物の増殖能が顕著に低下することはない。すなわち、上記培地を使用してゼアキサンチン生産微生物の培養を行うことにより、上記圧力条件下においてもゼアキサンチンを高効率に生産・製造することができる。
　培養は10～70℃、好ましくは20～35℃の温度にて、通常1日～20日間、好ましくは2～9日間振とう培養あるいは通気撹拌培養により行うことができる。
４．ゼアキサンチンの回収
　本発明にて生産されたゼアキサンチンは、公知の手法に基づいて回収することができる。すなわち、培養終了後、培養液からろ過法、遠心分離法などにより培地成分や水分を除去することによって、ゼアキサンチンを含む培養沈殿物を得ることができる。必要であればさらに、当該培養沈殿物を噴霧乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥等により乾燥し、ゼアキサンチンを含む沈殿乾燥物を得ることができる。
　次いで、上記培養沈殿物又は沈殿乾燥物より、水溶性有機溶媒を用いてゼアキサンチンを抽出する。水溶性有機溶媒は特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ピリジン、ジオキサン、シクロヘキサノン、シクロヘキサノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、エチルメチルケトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどを用いることができる。これらは単独で用いても２種以上を混合して用いてもあるいはこれらと水とを混合して用いてもよい。得られた水溶性有機溶媒抽出液を減圧濃縮などにより溶媒を除去することにより、ゼアキサンチンを含む抽出物を得ることができる。得られた抽出物は必要により脱臭処理に供してもよいし、植物油に懸濁してもよい。
　さらに、上記水溶性有機溶媒抽出液に非極性有機溶媒及び水を加え、液液抽出を行うことにより、ゼアキサンチンをさらに精製することができる。非極性溶媒としては例えばヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、石油エーテル、ナフサ、ケロシン等を用いることができる。液液抽出後に得られた非極性溶媒相は分離回収したのち、濃縮又は加水又は非極性溶媒の追加又は冷却を行うことにより高純度のゼアキサンチンを析出させることができる。濃縮、加水、非極性溶媒の追加及び冷却の工程はそれぞれ単独に実施してもよいが、必要に応じいくつかを組み合わせて実施することも可能である。得られた析出物はろ過により容易に回収されるので、必要に応じ溶媒等で洗浄を行い、乾燥して高純度のゼアキサンチン抽出精製物を得ることができる。
　以上の方法で得られるゼアキサンチンを含む培養沈殿物、沈殿乾燥物、抽出物、抽出精製物等の中から、飼料配合剤、食品素材、化粧品素材及び医薬品素材としてそれぞれ必要な製品形態を選択し利用することができる。
　次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[シード用フラスコ培地]
　シード用フラスコ培地は以下の組成を有するものを使用した。
　シュークロース30g/L；コーンスティープリカー30g/L；リン酸二水素カリウム1.5g/L；リン酸水素二カリウム無水和物3g/L；塩化カルシウム2水和物5.0g/L；硫酸マグネシウム7水和物12g/L；硫酸鉄7水和物0.3g/L、pH7.2、100mlを、500ml容量の綿栓付き三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ殺菌し、以下の実施例に用いた。
[基本培地]
　基本培地は以下の組成を有するものを使用した。
　グルコース30g/L；コーンスティープリカー30g/L；硫酸アンモニウム5g/L；リン酸二水素カリウム2.25g/L；リン酸水素二ナトリウム12水和物5.7g/L；塩化カルシウム2水和物1g/L；硫酸マグネシウム7水和物5g/L；硫酸鉄7水和物5g/L；L-グルタミン酸ナトリウム1水和物6g/L；アルコール系消泡剤0.5g/L。
　当該基本培地2.0Lを5L容量の発酵槽に入れ、必要に応じて所定量のクエン酸ナトリウムを添加して、121℃で30分間オートクレーブ殺菌し、以下の実施例に用いた。
[ゼアキサンチン生産微生物]
　ゼアキサンチン生産微生物は、パラコッカス（Paracoccus）属に属するアスタキサンチン生産微生物より上記手法により得られた変異株を使用した。
[培養方法]
　微生物を、上記シード用フラスコ培地に一白金耳植菌し、28℃で2日間、100rpmで回転振とう培養を行った後、その培養液80mLを基本培地を入れた発酵槽に植菌した。
　所定の圧力条件下、及び所定のクエン酸ナトリウム添加条件下において、28℃、通気量1vvmの好気培養を140時間行った。培養中のpHが7.2を維持するように15％アンモニア水で連続的にpHを制御した。グルコースは枯渇しないように培養1日目、2日目、3日目及び4日目にそれぞれ50gずつ添加した。また、最低攪拌回転数を500rpmとし、培養中期における培養液中の溶存酸素濃度を2.4 ppmに維持した。気泡センサーで発泡を感知することによりアルコール系消泡剤を自動添加、もしくは必要に応じて消泡剤を連続添加して発泡を抑えた。
[圧力条件の制御]
　圧力の制御は手動で背圧弁を調整して制御した。
　なお、以下の実施例中に記載される圧力条件の値は、培養系（液相部分）にかかる平均圧力値を示す。
[ゼアキサンチン濃度の測定]
　ゼアキサンチンの定量は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて以下のとおり行った。
　分析カラムはInertsil SIL-100A, 5μm(φ4.6×250mm)(GLサイエンス製)を2本連結して使用した。溶出は、移動相であるn-ヘキサン/テトラヒドロフラン/メタノール混合液(40:20:1)を室温付近一定の温度にて毎分1.0mL流通させることで行った。測定においては、サンプルをテトラヒドロフランで溶解し、移動相にて100倍希釈した液20μLを注入量とし、カラム溶離液の検出は波長470nmで行った。また、定量のための標準品としては、EXTRASYNTHESE社製ゼアキサンチン(Cat.No.0307 S)を用いた。標準液のゼアキサンチン濃度の設定は、標準液の453nmの吸光度(A)及び上記条件でHPLC分析を行ったときのゼアキサンチンピークの面積百分率％(B)を測定した後に、以下の式を用いて行った。
　ゼアキサンチンの濃度(mg/L)＝A÷2327×B×100
[菌体濃度の測定]
　波長610 nmにて、培養終了後の培養液の吸光度（OD610）を、分光光度計を用いて計測しこの値を培養液の菌体濃度とした。
（実施例１）ゼアキサンチン生産微生物に対する圧力の影響
　ゼアキサンチン生産微生物を0.003MPa、0.025MPa、0.05 MPa、0.075MPa、又は0.1 MPaの圧力条件下、クエン酸ナトリウム未添加の基本培地を用いて上記培養方法にて培養を行った。
　培養終了後、培養液を回収し培養液中のゼアキサンチン濃度及び微生物濃度を測定した。
　結果を図２に示す。培養液中のゼアキサンチン濃度は、0.003 MPaの圧力条件下にて得られた培養液中のゼアキサンチン濃度を100%とする相対値にて示す。培養中、圧力を付加することによって培養液のゼアキサンチン濃度は低下し、0.05 MPaの圧力を付加した場合に最も低い値を示した。培養液の微生物濃度も同様の傾向を示した。
（実施例２）圧力条件下におけるゼアキサンチン生産微生物に対するクエン酸塩の効果
　ゼアキサンチン生産微生物を0.05 MPaの圧力条件下、クエン酸ナトリウムを0 g/L、2.8 g/L、8.4 g/L、14g/L、又は21g/Lの濃度となるように添加して調製した基本培地を用いて、上記培養方法にて培養を行った。
　培養終了後、培養液を回収し培養液中のゼアキサンチン濃度及び微生物濃度を測定した。
　結果を図３に示す。培養液中のゼアキサンチン濃度は、クエン酸ナトリウムの添加量0 g/Lの条件下にて得られた培養液中のゼアキサンチン濃度を100%とする相対値にて示す。0.05 MPaの圧力条件下の培養においても、培地にクエン酸ナトリウムを添加することによって、培養液のゼアキサンチン濃度が向上することが示された。培養液の微生物濃度も同様の傾向を示した。特に、培地中2.8 g/L～8.4 g/Lの濃度となるようにクエン酸ナトリウムを添加することによって、ゼアキサンチン濃度及び微生物濃度が共に高い値を示した。
（実施例３）クエン酸塩存在下におけるゼアキサンチン生産微生物に対する圧力の影響
　ゼアキサンチン生産微生物を0.003 MPa、0.02 MPa、0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa、又は0.1 MPaの圧力条件下、クエン酸ナトリウムを2.8 g/Lの濃度となるように添加して調製した基本培地を用いて、上記培養方法にて培養を行った。
　培養終了後、培養液を回収し培養液中のゼアキサンチン濃度及び微生物濃度を測定した。
　結果を図４及び表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　培養液中のゼアキサンチン濃度は、上記実施例１のクエン酸ナトリウム無添加の培地中、0.003 MPaの圧力条件下にて得られた培養液中のゼアキサンチン濃度を100%とする相対値にて示す。培地にクエン酸ナトリウムを添加することによって、0.05 MPaの圧力条件下に限らず、商業規模で必要とされる0.02 MPa～0.08 MPaの圧力条件下においても、培養液のゼアキサンチン濃度は大きく低下することはなかった。ただし、実施例１及び図２の結果と比較して明らかなとおり、圧力条件が0.008 MPaよりも小さい場合、及び0.08 MPaよりも大きい場合においてはクエン酸ナトリウムを培地に添加することによって、培養液のゼアキサンチン濃度が減少することが示された。一方、培養液中の微生物濃度は、培地にクエン酸ナトリウムを添加することによって、0.05 MPaの圧力条件下に限らず、他の圧力条件下においても大きな低下はみられなかった。また、培地にクエン酸ナトリウムを添加することによって、圧力条件に関わらず、培養液中の微生物濃度を向上できることが示された（図２参照）。
（実施例４）クエン酸塩添加による培養上清中のイオン濃度変化
　クエン酸ナトリウムを0 g/L、2.8 g/L、8.4 g/L、又は14 g/Lの濃度となるようにそれぞれ添加して調製した基本培地を遠心分離して上清を回収した。次いで、得られた各上清中のカルシウムイオン、鉄イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、及びリン酸イオンの濃度をそれぞれ測定した。各陽イオン濃度はICP発光分析法により測定し、リン酸イオンについてはモリブデンブルー吸光度法で測定した。
　結果を図５に示す。培養上清中のリン酸イオン、カルシウムイオン及び鉄イオンの量がそれぞれ、クエン酸ナトリウムの添加量依存的に増大することが示された。特に鉄イオンは、クエン酸ナトリウム未添加の培地上清においては検出限界以下であったものが、クエン酸ナトリウムを14 g/Lの濃度となるように添加した培地上清においては約80 ppmにまで増大した。
　図１に示すパラコッカス属微生物のカロテノイド生合成経路において、ゼアキサンチンの合成に関与する水酸化反応には鉄イオンが必要であることが明らかとなっている（Fraser, P.D.ら、 In Vitro Characterization of Astaxanthin Biosynthetic Enzymes, J. Biol. Chem., 1997, 272, 6128-6135）。上記実施例にて示されるクエン酸ナトリウム添加による、ゼアキサンチン生産量増大の一つの要因として、添加されたクエン酸ナトリウムのキレート作用により鉄元素が培地中に鉄イオンとして溶出され、これをゼアキサンチン生産微生物が利用できるようになったためと示唆される。
　本発明によれば、商業規模の大型の培養槽における培養においても、ゼアキサンチン生産微生物のゼアキサンチン生産能及び増殖能を高く維持することが可能であり、商業規模の大型のゼアキサンチン製造を効率的に行うことができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (17)

  1. 　パラコッカス（Paracoccus）属に属するゼアキサンチン生産微生物を用いたゼアキサンチンの製造方法であって、
    (i) キレート剤を含有する培地中にて、0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の平均圧力条件下にて該微生物を培養し、ゼアキサンチンを生成する工程、及び
    (ii) 培養物より、生成されたゼアキサンチンを回収する工程、
    を含む、上記方法。
  2. 　工程(ii)が、培養物より培地成分及び水分を除去して乾燥させることによりゼアキサンチンを含む組成物を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　さらに、ゼアキサンチンを含む組成物よりゼアキサンチンを精製する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　キレート剤がクエン酸又はその塩である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　培地がクエン酸又はその塩を14 g/L未満の濃度で含有する、請求項４に記載の方法。
  6. 　培地がクエン酸又はその塩を0.5 g/L以上かつ10 g/L以下の濃度で含有する、請求項５に記載の方法。
  7. 　0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下の平均圧力条件下にて前記微生物を培養する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　キレート剤を含有する培地中にて、パラコッカス（Paracoccus）属に属するゼアキサンチン生産微生物を培養することを含む、0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の圧力条件下における該微生物のゼアキサンチン生産能を向上させる方法。
  9. 　キレート剤がクエン酸又はその塩である、請求項８に記載の方法。
  10. 　培地がクエン酸又はその塩を14 g/L未満の濃度で含有する、請求項９に記載の方法。
  11. 　圧力条件が0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　キレート剤を含有する培地中にて、パラコッカス（Paracoccus）属に属するゼアキサンチン生産微生物を培養することを含む、0.008 MPa以上かつ0.08 MPa以下の圧力条件下における該微生物を培養する方法。
  13. 　キレート剤がクエン酸又はその塩である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　培地がクエン酸又はその塩を14 g/L未満の濃度で含有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 　圧力条件が0.02 MPa以上かつ0.08 MPa以下である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　請求項２に記載の方法により製造された、ゼアキサンチンを含む組成物。
  17. 　請求項３に記載の方法により製造された、ゼアキサンチン。
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