JP2005087099A

JP2005087099A - β−カロテンの製造方法

Info

Publication number: JP2005087099A
Application number: JP2003325130A
Authority: JP
Inventors: Akira Tsubokura; 章坪倉; Hisashi Yoneda; 久米田; Kazuaki Hirasawa; 和明平澤
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2003-09-17
Publication date: 2005-04-07

Abstract

【課題】β-カロテンの安価で、安定供給可能な、安全性の高い製造方法を提供する。
【解決手段】１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が特定の塩基配列と実質的に相同であり、かつエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンから選ばれる少なくとも一つのカロテノイド化合物を生産するカロテノイド生産微生物を変異のための親株としてこれに突然変異を誘発し、生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量％）が親株のそれよりも高い変異株を選抜してβ−カロテン生産微生物を取得し、当該微生物を培養することにより得た培養物からβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物を採取することを含むβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、天然黄色色素及び抗酸化作用物質として飼料用、食品用、化粧品用、医薬品用等の素材に有用なβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物の微生物的製造法に関する。

β−カロテンはニンジン等の緑黄色野菜に含まれる天然の黄色カロテノイドでありバターやマーガリンといった食品の着色料として広く使用されている。また、プロビタミンA活性を有し、人間にとって重要な栄養素である。抗酸化作用を有することが知られ（ＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ，６２（１），１３４−１３７，１９９６）、抗腫瘍・抗癌作用が報告されている（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１８（２），２２７−２３３，１９９５）。これら生理的効果からβ−カロテンは着色料としてのみならず、飼料用、食品用、化粧品用及び医薬品用の機能性素材として有用である。

β−カロテンの製造法としてはβ−ヨノンからの化学合成（ＰｕｒｅＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１），４５，１９７９）、ニンジン、サツマイモ、カボチャ等緑黄色野菜からの抽出（天然着色料ハンドブック，光琳，１９７９，天然着色料ハンドブック編集委員会編）が知られている。また微生物がβ−カロテンを生産する例としては、ドナリエラ藻類（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ，２３，１７６，１９８７）、糸状菌ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６，６３９−６４２，１９７９）、酵母ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（特開平５−１６８４６５）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属酵母（特開平６−２２７４８）、細菌アグロバクテリウム・オウランティアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，１２８，１３９−１４４，１９９５）、新属の細菌Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）（特開平７−７９７９６，特開平８−９９６４，米国特許第５，６０７，８３９号，米国特許第５，８５８，７６１号）が知られている。
特開平７−７９７９６号公報特開平８−９９６４号公報米国特許第５，６０７，８３９号明細書米国特許第５，８５８，７６１号明細書

しかしながら、前述のβ−カロテン化学合成法は安全性および近年の天然物指向の面で問題がある。ニンジン等野菜からの抽出では含有量が低いためにコストがかかりすぎるうえに天候に左右されるので安定供給が困難であるという欠点を有する。また従来の微生物による培養では生産濃度が低いので実用的でない。カロテノイド化合物生産菌として知られるＥ−３９６株は各種試験により既にその安全性が確認されアスタキサンチンを含有するカロテノイド化合物を工業的規模で高濃度に生産する方法が確立されているものの、β−カロテンの生成量は少ない。
このためβ−カロテンの安価で、安定供給可能な、安全性の高い製造方法が求められていた。

上記課題を解決するため本発明者らは鋭意検討した結果、カロテノイドを生産する微生物を変異処理することにより、生産される総カロテノイド量に対するβ−カロテンの比率が高い微生物が容易に得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の手段を提供する。
（１）１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と実質的に相同であり、かつエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンから選ばれる少なくとも一つのカロテノイド化合物を生産するカロテノイド生産微生物を変異のための親株としてこれに突然変異を誘発し、生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量％）が親株のそれよりも高い変異株を選抜してβ−カロテン生産微生物を取得し、前記β−カロテン生産微生物を培養することにより得た培養物からβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物を採取することを含むβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物の製造方法。
（２）生産するカンタキサンチン及びエキネノンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であるカロテノイド生産微生物を変異の親株として用いる前記（１）に記載の方法。
（３）生産するゼアキサンチン及びβ−クリプトキサンチンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であるカロテノイド生産微生物を変異の親株として用いる前記（１）に記載の方法。
（４）生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量％）が親株のそれより高い変異株の選抜が、固体培地上で黄色〜橙色を呈するコロニーを選択することを含む工程により行われる前記（１）に記載の方法。
（５）β−カロテン生産微生物により生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であることを特徴とする前記（１）に記載の方法。
（６）β−カロテン生産微生物により生産されるエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンのそれぞれの総カロテノイド生産量に対する比率がいずれも２０質量％未満であることを特徴とする前記（１）に記載の方法。
（７）カロテノイド生産微生物がＥ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）およびその変異株、並びにＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭＢＰ−４６７１）およびその変異株から選ばれる（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。

本発明により、安価で、安定供給可能な、安全性の高いβ-カロテンの製造方法が提供される。
また、本発明の方法によれば、β-カロテン生産変異株の中には、主生成物としてβ-カロテンとともに、副生成物として他のカロテノイド化合物を同時に生産する場合もあり、本発明はβ-カロテンを主成分とするカロテノイド混合物を効率的に製造する方法としても有用である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法においては変異の親株としてカロテノイドを生産する微生物が用いられるが、このような微生物としては、その１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と実質的に相同であるカロテノイド生産細菌が挙げられる。ここで言う実質的に相同であるとはＤＮＡの塩基配列決定の際のエラー頻度等を考慮し９８％以上の相同性であることを意味する。

上記配列と実質的に相同な配列を有するカロテノイド生産微生物としては、具体的には、Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）およびＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭＢＰ−４６７１）、ならびにＥ−３９６株あるいはＡ−５８１−１株を変異改良することで得られる各種変異株およびこれら２種の近縁種を挙げることができる。配列番号１のＤＮＡ塩基配列は、Ｅ−３９６株のリボソームＲＮＡに対応するものであり、また配列番号２のＤＮＡ塩基配列は、Ａ−５８１−１株のリボソームＲＮＡに対応するものである。Ｅ−３９６株とＡ−５８１−１株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列の相同性は９９．４％であり、極めて近縁な株であることが判明した。よって、これらの菌株はカロテノイドを生産する細菌として一つのグループを形成している。本発明の方法において用いられる変異の親株は、Ｅ−３９６株およびＡ−５８１−１株ならびにＥ−３９６株あるいはＡ−５８１−１株の変異株およびこれらの菌株の近縁種として、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９８％以上の相同性を有するカロテノイド生産微生物として定義される。

本発明に使用するカロテノイド生産微生物として挙げられるＥ−３９６株について説明する。この株は、本発明者らが新しく単離したものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター）に平成5年4月２７日にＦＥＲＭＢＰ−４２８３として寄託された。さらに具体的な他の微生物としてはＡ−５８１−１株を挙げることができる。この株は、発明者らが新しく単離したものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センター）に平成６年５月２０日にＦＥＲＭＢＰ−４６７１として寄託された。

本発明に使用される変異のための親株は、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９８％以上の相同性を有し、かつエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンから選ばれる少なくとも一つのカロテノイド化合物を生産するカロテノイド生産微生物として定義されるが、好ましくは生産するカンタキサンチン及びエキネノンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であるカロテノイド生産微生物、あるいは生産するゼアキサンチン及びβ−クリプトキサンチンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であるカロテノイド生産微生物が用いられる。より好ましくは生産するカンタキサンチン及びエキネノンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が７０質量％以上であるカロテノイド生産微生物、あるいは生産するゼアキサンチン及びβ−クリプトキサンチンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が７０質量％以上であるカロテノイド生産微生物が用いられる。ここで言う総カロテノイド量とは、β−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチンなどのカロテノイド化合物の総量を示す。

カロテノイドの生合成は、リコペンの両末端が環化しβ−カロテンを生成し、β−カロテンがさらにケト化酵素および水酸化酵素によりそれぞれ両端の６員環が修飾されることによりカンタキサンチン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンなどが生成して行われると推定されている（図１参照）。

本発明者らは、アスタキサンチンを高比率で生産する微生物を変異の親株に用いるのに比較して、カンタキサンチン及びエキネノンを高比率で生産する微生物、又はゼアキサンチン及びβ−クリプトキサンチンを高比率で生産する微生物を変異の親株として用いることによりβ−カロテン生産微生物の取得確率は飛躍的に向上することを見出した。この現象は以下のように説明することができる。すなわちアスタキサンチンを高比率で生産するカロテノイド生産微生物は、β−カロテンを水酸化する酵素とケト化する酵素の両方を合わせ持つので、β−カロテンを蓄積させるためには両酵素をともに欠損させる必要があるが、カンタキサンチン及びエキネノンの合計量の比率が高い微生物は水酸化酵素が欠損している微生物であるので、ケト化酵素のみを変異で欠損させればよく、ゼアキサンチン及びβ−クリプトキサンチンの合計量の比率が高い微生物はケト化酵素が欠損している微生物であるので水酸化酵素のみを欠損させればよいことになる。カンタキサンチンとエキネノンとの合計量の比率が高い微生物、及びゼアキサンチンとβ−クリプトキサンチンとの合計量の比率が高い微生物はもともと野生株としてその性質をもつものでもよいが、アスタキサンチン生産微生物等から突然変異により取得されたものでもよい。

本発明においてカロテノイド生産微生物を変異処理する方法は、突然変異を誘発するものであれば特に限定されない。たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、などの変異剤による化学的方法、紫外線照射、Ｘ線照射などの物理的方法、遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。この変異処理は１回でもよいし、また、例えばこの突然変異処理によりカロテノイド生産微生物の変異体を得て、これをさらに突然変異処理するというように２回以上の変異処理を行ってもよい。

次に、上記のようにして得られるカロテノイド生産微生物の突然変異体の中から、生産されるβ-カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量％）が親株のそれよりも高くなっている変異株を選抜してβ-カロテン生産微生物を取得する。この目的のために、変異処理後に固体培地上にコロニーを形成させ、ランダムにコロニーを取得してもよいが、β-カロテン生産微生物のコロニーは黄色〜橙色を呈する場合が多いので、このような色を呈するコロニーを選択することにより、効率的にβ-カロテン生産微生物（変異株）を選抜することができる。この工程を含むことによりβ−カロテンの総カロテノイド量に対する比率の高い変異株を取得できる確率は飛躍的に向上する。

次いで、上述のようにして選択された変異株コロニーを慣用の方法により培養し、培養終了後に各変異株の培溶液中に含まれるカロテノイド化合物を分析することにより、β-カロテンの生産比率が高い変異株を選抜することができる。

変異株の培養は、例えば、生産菌の生育に必要で、カロテノイド化合物を生成する成分を含む培地で培養することにより行うことができる。培養方法は試験管、フラスコなどの振とう培養、通気撹拌培養などいずれの方法でもよい。カロテノイド化合物の分析方法は、カロテノイド化合物を分離検出できる方法なら何でも良いが、たとえば、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィーなどを用いることができる。

本発明においてβ−カロテン生産微生物の取得は、β−カロテンの総カロテノイド量に対する比率の高い変異株を選抜することにより行われる。Ｅ−３９６株のごときカロテノイド生産微生物は、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン、エキネノン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、アドニルビンなど多種のカロテノイド化合物を同時に生成するので、β−カロテンの総カロテノイド量に対する比率は低く、通常は０〜２０質量％程度である。

本発明においては、カロテノイド生産微生物に突然変異を誘発し、生産するβ−カロテンの総カロテノイド量に対する比率が特に高い変異株を選抜する。その選抜の基準となるβ−カロテンの比率は、変異前の親株のβ−カロテン生産比率より高いことが最低限の条件であるが、生産される総カロテノイド量に対してβ−カロテンを好ましくは５０質量％以上、より好ましくは７０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上を示す変異株を選抜する。

カロテノイドの生合成は、前述のようにβ−カロテンがケト化酵素および水酸化酵素によりそれぞれ両端の６員環が修飾されることによりカンタキサンチン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンなどが生成して行われると推定されている（図１参照）。このケト化酵素及び水酸化酵素の両方が完全に欠損すれば、β−カロテンまでの化合物だけが生産され、β−カロテン以降のエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンは生産されないことが推定される。またこのケト化酵素及び水酸化酵素が不完全に欠損すれば、β−カロテンの生産比率が高くなり、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンの総カロテノイド生産量に対する比率が低くなることが推定される。したがって、変異株の中からβ−カロテン生産微生物を選抜するためのもう一つの有効な手段としては、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンの総カロテノイド量に対するそれぞれの比率が低いことを基準に選抜する方法を用いることができる。前述化合物それぞれの総カロテノイドに対する比率がいずれも、２０質量％未満、より好ましくは１０質量％未満、さらに好ましくは５質量％未満であることを基準に選抜することができる。

本発明においてβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物を採取するために、β−カロテン生産微生物を培養する方法は、β−カロテンを生成する条件であればいずれの方法でもよいが、例えば、以下のような方法を採用できる。すなわち、培地としては生産菌が生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩および必要であれば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核酸等）を含むものを使用する。炭素源としてはグルコース、シュークロース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール等のアルコール類等が挙げられる。添加割合は炭素源の種類により異なるが、通常培地１Ｌ当たり１〜１００ｇ、好ましくは２〜５０ｇである。窒素源としては、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、グルタミン酸ソーダ等の１種または2種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類により異なるが、通常培地１Ｌに対し０．１〜２０ｇ、好ましくは１〜１０ｇである。無機塩としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の１種または2種以上が用いられる。添加割合は無機塩の種類により異なるが、通常、培地１Ｌに対し０．１ｍｇ〜１０ｇである。特殊な要求物質としてはビタミン類、核酸類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、乾燥酵母、大豆粕、大豆油、オリーブ油、トウモロコシ油、アマニ油等の１種または２種以上が用いられる。添加割合は特殊な要求物質の種類により異なるが、通常、培地１Ｌに対し０．０１ｍｇ〜１００ｇである。培地のｐＨは２〜１２、好ましくは６〜９に調整する。培養条件は１０〜７０℃、好ましくは２０〜３５℃の温度であり、通常１日〜２０日間、好ましくは２〜９日間振とう培養あるいは通気撹拌培養を行う。

次に、以上の方法により得られた培養液から水分を除去する作業を行う。β−カロテン含有物を得るために、培養液からどの程度の水分除去が必要かは培養液の色素含有量等の状態により異なるが、一般にまずろ過の作業を行いさらに水分の除去が必要であれば沈殿物の乾燥を行う。ろ過の方法は、通常のろ過法、遠心分離法などにより行うことができる。さらに水分を除去する必要がある場合には、沈殿物を乾燥する方法をとることが可能である。乾燥の方法としては、通常の噴霧乾燥、ドラム乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。

必要に応じ抽出によりβ−カロテンの含量を高くすることもできる。抽出原料としては培養液そのものを用いても、ろ過後の沈殿物またはそれを乾燥したものを用いてもよい。抽出の方法は溶媒抽出でも超臨界二酸化炭素抽出でもよい。溶媒抽出に用いる有機化合物はβ−カロテンを抽出する能力のあるものならば水溶性有機溶媒でも非水溶性有機溶媒でも特に限定されない。得られた抽出液は減圧濃縮などにより溶媒を除去し製品とすることができる。必要により脱臭処理を行うことや植物油に懸濁することが可能である。

また、β−カロテンの含量をさらに高くする必要がある場合には、２種以上の溶媒の組み合わせによる液液抽出、カラムを用いる吸着分離又はクロマトグラフィーなどの分離工程をそれぞれ単独でもしくは組み合わせて使用することができる。得られた高純度の抽出液から、濃縮又は加水又はβ−カロテンの溶けにくい溶媒の追加又は冷却を行うことにより高純度のβ−カロテンを析出させることができる。濃縮、加水、溶媒の追加及び冷却の工程はそれぞれ単独に実施してもよいが、必要に応じいくつかを組み合わせて実施することができる。

以上の方法で得られるβ−カロテンを含む培養沈殿物、沈殿乾燥物、抽出物、抽出精製物等の中から、飼料配合剤、食品素材、化粧品素材及び医薬品素材としてそれぞれ好適な製品形態を選択することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
〔実施例１〕
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）を濃度１００ｍｇ／ＬのＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で、温度２８℃、３０分間静置して変異処理を行った。表１の組成からなる培地６ｍｌを内径１８ｍｍの試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌し、試験管培地を作製した。黄色〜橙色を呈する変異株コロニー４，０００株を選抜し、それぞれ試験管培地に１白金耳植菌、２８℃で４日間、３３０ｒｐｍの往復振とう培養を行った。次にこの培養物を遠心分離し、得られた菌体のカロテノイド化合物の分析を高速液体クロマトグラフィーにより行ったところ、総カロテノイド生産量に対するβ−カロテンの比率が５０質量％以上を示す菌株を１株得た。この菌株のカロテノイド化合物の分析結果を表２に示した。比較のために上記と同条件で培養したＥ−３９６株培養液のカロテノイド化合物の分析結果を表３に示した。

〔実施例２〕
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）をＮＴＧで変異処理し、橙色のコロニーを選抜してカンタキサンチンの生産性が向上した変異株ＣＡ−２２株を取得した。このＣＡ−２２株をさらに２００ｍｇ／ＬのＮＴＧで変異処理した。表１の組成からなる培地６ｍｌを内径１８ｍｍの試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌し、試験管培地を作製した。黄色〜橙色を呈する変異株コロニー８０株を選抜し、それぞれ試験管培地に１白金耳植菌、２８℃で５日間、３３０ｒｐｍの往復振とう培養を行った。次にこの培養物を遠心分離し、得られた菌体のカロテノイド化合物の分析を高速液体クロマトグラフィーにより行ったところ、総カロテノイド生産量に対するβ−カロテンの比率が５０質量％以上を示す菌株を１株得た。この菌株のカロテノイド化合物の分析結果を表４に、比較のために上記と同じ条件で培養したＣＡ−２２株のカロテノイド化合物の分析結果を表５に示した。

〔実施例３〕
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）をＮＴＧで変異処理し、黄色のコロニーを選抜してゼアキサンチンの生産性が向上した変異株ＺＥ−７株を取得した。このＺＥ−７株をさらに１５０ｍｇ／ＬのＮＴＧで変異処理した。表１の組成からなる培地６ｍｌを内径１８ｍｍの試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌し、試験管培地を作製した。黄色〜橙色を呈する変異株コロニー６０株を選抜し、それぞれ試験管培地に１白金耳植菌、２８℃で５日間、３３０ｒｐｍの往復振とう培養を行った。次にこの培養物を遠心分離し、得られた菌体のカロテノイド化合物の分析を高速液体クロマトグラフィーにより行ったところ、総カロテノイド生産量に対するβ−カロテンの比率が５０質量％以上を示す菌株を１株得た。この菌株のカロテノイド化合物の分析結果を表６に、比較のために上記と同じ条件で培養したＺＥ−７株のカロテノイド化合物分析結果を表７に示した。

〔実施例４〕
Ａ−５８１−１株（ＦＥＲＭＢＰ−４６７１）にＵＶランプで紫外線を照射し変異処理を行った。表１の組成からなる培地６ｍｌを内径１８ｍｍの試験管に入れ１２１℃、１５分間蒸気殺菌し、試験管培地を作製した。黄色を呈する変異コロニー３，０００株を選抜し、それぞれ試験管培地に１白金耳植菌し、２８℃で４日間、３３０ｒｐｍの往復振とう培養を行った。次にこの培養物を遠心分離し、得られた菌体のカロテノイド化合物の分析を高速液体クロマトグラフィーにより行ったところ、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンのそれぞれの総カロテノイド生産量に対する比率がいずれも２０質量％未満を示す菌株を１株得た。この菌株のカロテノイド化合物の分析結果を表８に示した。比較のために上記と同じ条件で培養したＡ−５８１−１株培養液のカロテノイド化合物の分析結果を表９に示した。

本発明の方法は、天然黄色色素及び抗酸化剤等に有用なβ−カロテン又はβ−カロテンを高濃度に含有するカロテノイド混合物の製造に有用である。

カロテノイドの生合成経路を示す図である。

Claims

１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と実質的に相同であり、かつエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンから選ばれる少なくとも一つのカロテノイド化合物を生産するカロテノイド生産微生物を変異のための親株としてこれに突然変異を誘発し、生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量％）が親株のそれよりも高い変異株を選抜してβ−カロテン生産微生物を取得し、前記β−カロテン生産微生物を培養することにより得た培養物からβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物を採取することを含むβ−カロテン又はβ−カロテンを含有するカロテノイド混合物の製造方法。
生産するカンタキサンチン及びエキネノンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であるカロテノイド生産微生物を変異の親株として用いる請求項１に記載の方法。
生産するゼアキサンチン及びβ−クリプトキサンチンの合計量の総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であるカロテノイド生産微生物を変異の親株として用いる請求項１に記載の方法。
生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率（質量％）が親株のそれより高い変異株の選抜が、固体培地上で黄色〜橙色を呈するコロニーを選択することを含む工程により行われる請求項１に記載の方法。
β−カロテン生産微生物により生産されるβ−カロテンの総カロテノイド生産量に対する比率が５０質量％以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
β−カロテン生産微生物により生産されるエキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン及びアスタキサンチンのそれぞれの総カロテノイド生産量に対する比率がいずれも２０質量％未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
カロテノイド生産微生物がＥ−３９６株（ＦＥＲＭＢＰ−４２８３）およびその変異株、並びにＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭＢＰ−４６７１）およびその変異株から選ばれる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。