JP2008541697A - ゼアキサンチンの生物学的産生およびカロテノイドの生合成コントロール - Google Patents

Abstract

本発明はカロテノイドおよび特にキサントフィルゼアキサンチン（ゼアキサンチン、β，β−カロテン−３，３’−ジオール）の単離および前述の化合物を産生することができるアルギバクター（Algibacter）属に属する海洋細菌からのリコペン、β，β−カロテン，３’−ヒドロキシエキネノンβ−クリプトキサンチンおよび無色のカロテノイド、フィトエンおよびフィトフルエンのような他のカロテノイドの随意な単離に関する。本発明は、また、アルギバクター（Algibacter）株を用いる方法および産生されたカロテノイドの利用と同様に、かなりの濃度のカロテノイド、特に高純度のゼアキサンチンを産生することができるアルギバクター（Algibacter）株を提供する。
【選択図】 図１

Description

本発明はカロテノイドおよび特にキサントフィルゼアキサンチン（ゼアキサンチン、β，β−カロテン−３，３’−ジオール）の単離および前記の化合物を産生することができるアルギバクター（Algibacter）属に属する海洋細菌からのリコペン、β，β−カロテン，３’−ヒドロキシエキネノン、β−クリプトキサンチンおよび無色のカロテノイド、フィトエンおよびフィトフルエンのような他のカロテノイドの随意な単離に関する。本発明は、また、アルギバクター（Algibacter）株を用いる方法および産生されたカロテノイドの利用と同様に、かなりの濃度のカロテノイド、特にゼアキサンチンを高純度で産生することができるアルギバクター（Algibacter）株を提供する。

カロテノイドは一般に多くの植物、藻類および光合成細菌に見られる天然の脂溶性色素の重要な部類で、光合成において重要な役割を果たす。カロテノイドは、また、多くの非光合成細菌、酵母、糸状菌および真菌に見られ、その役割は光酸化（日光）に対し生物のＤＮＡを保護すると考えられる。

カロテノイドは多くの植物、果実、草花および野菜に赤色、オレンジ色および黄色を与えるものとして広く認められ、サケ、マスおよびフラミンゴのような多くの動物の肉および羽の着色はこのようなカロテノイドを含む食餌による。天然には６２０種以上のカロテノイドが同定され、特徴が明らかにされている。

ヒトを含む動物のカロテノイドは重要な抗酸化活性を有するものとして広く認められそしてある物はビタミンＡの前駆体供給源としてふるまう。これらの幾つかはヒトの健康に利益をもたらす重要な役割を果たす証拠が増えており、そして動物はこれらの分子を合成できないので、動物は食物からこれらを吸収しなければならない。

ゼアキサンチン（β，β−カロテン−３，３’−ジオール）はトウモロコシ（Zea mays）に一般に見られる黄色のカロテノイドで、眼の健康にとって重要なカロテノイドである。ゼアキサンチンはヒトの網膜に自然に見られる重要な抗酸化剤である。それは太陽のＵＶ光による光酸化障害から眼を保護するＵＶフィルターとして働く。最近の科学的証拠はこのカロテノイドが世界における盲目の主な原因である、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）および白内障の影響の減少に関与していることを見出した。

ゼアキサンチンは、また、ブロイラーの鶏肉、卵の卵黄を着色する薬剤として農食品産業において広く用いられ、ＡＭＤに対する保護を促進するためにヒトにより食品サプリメントとしても用いられる。それは化粧品および食品産業における着色料としても用いられる。

ゼアキサンチンのようなこれら食物色素は卵黄のような鶏製品の着色を見た目に美しく改善するため飼料およびブロイラー鶏肉の美的品質を改善するため鶏自身に加えられる。本来これらの動物は自身でこれらの製品を合成できないので、これが必要であり、食餌からこれらの色素を摂らなければならない。

ゼアキサンチンは大多数がフラボバクテリウム（Flavobacterium）属およびパラコッカス（Paracoccus）属に属するごくわずかな細菌種によって自然界において合成される。

細菌種フラボバクテリウム・マルチボラム（Flavobacterium multivorum）はゼアキサンチンを産生することができるように述べられている（米国特許第5,308,759号）。

細菌種パラコッカス・ゼアキサンチニフェーシェンス・エスピー・ノブ（Paracoccus zeaxanthinifaciens sp. nov）もゼアキサンチンを産生するように述べられている（ベリー（Berry）ら、2003年）。

ゼアキサンチンの細菌による産生を除けば、市販の天然ゼアキサンチンは主にマリーゴールドおよびアルファルファから提供される。しかしながら、この生物供給源は鶏肉産業にとって処方書に従って作る時の安定性の問題および生物からの入手可能性と関連する。マリーゴールドのこれらの性質を改善するために行なわれている最新の研究がある（ボスマ（Bosma）ら、2003年）。ほとんどのマリーゴールド製品は最初溶剤抽出し、鹸化しなければならないそして抽出過程において抗酸化剤の添加を必要とする。１９９２年にギーアハート（Gierhart）らによって行なわれた以前の研究はフラボバクテリウム・マルチボラム（Flavobacterium multivorum）から産生されたゼアキサンチンはマリーゴールドから抽出されたものより２〜３倍高い生物学的利用能のあることを示した。

リコペンはトマト、グアヴァ、ローズヒップ、スイカおよびピンクのグレープフルーツに赤色を与える開鎖不飽和カロテノイドである。リコペンは証明済みの抗酸化剤である。抗酸化剤は身体の細胞を傷害するフリーラジカルを中和する。トマトのリコペンはジュース、ソース、ペーストおよびケッチャップに加工処理されれば身体によってより効率よく吸収され得ることを研究は示している。トマトに見られるリコペンの化学形態はより容易に吸収させる過程に関わる温度変化によって変換される。

身体において、リコペンは肝臓、肺、前立腺、結腸および皮膚に沈着する。身体組織におけるその濃度は他のいずれのカロテノイドよりも高い傾向にある。

進行中の予備研究はリコペンが黄斑変性疾患、血清脂質酸化および肺、膀胱、子宮頸および皮膚の癌のリスク軽減と関連することを示唆している。

リコペンの他の可能性のある利点を研究するために行なわれている研究はエイチ・ジェー・ハインズ（H. J. Heinz）社がスポンサーのトロント大学および米国健康財団での研究を含む。これらの研究は消化管、乳房および前立腺の癌との戦いにおけるリコペンの役割の可能性に焦点を当てている。

天然リコペンの主な市販供給源はトマト由来および真菌ブラクスリー・トリスポラ（Blakslea trispora）由来である。しかしながら、本発明者の知る限りでは細菌および特にアルギバクター（Algibacter）属から高収率で単離されている天然リコペンの報告はない。

フィトエンおよびフィトフルエンはカロテノイド生合成経路における無色の前駆体である。抗酸化剤であることを越えて、それらは自然界において最も強力なラジカルであるヒドロキシラジカルと戦う能力をも有する。それらは炎症およびＵＶ放射から皮膚を保護する抗炎症作用を有し、ＬＤＬの酸化を阻止することにより心血管系の保護を促進することができると言われてもいる。それらは栄養補助食品あるいは更に健康利益が望まれる食品において用いられるであろうと予想される。フィトエンおよびフィトフルエンはそれらの活性を増強させ、これらの分子を安定化させそして分解を防ぐためにＣｏＱ１０および着色カロテノイドのような他の成分と共に作用することも判明している。無色カロテノイドはそれらの抗酸化および抗加齢の性質のために化粧品に適している。化粧品市場にとって色彩が特に直接関係するので、化粧品界における販売を発展させることはより容易であるとも判断される。現在、無色カロテノイドは特別に栽培トマトおよび藻類産に由来している。

本発明の目的はアルギバクター（Algibacter）属に属する海洋細菌由来のフィトエン、フィトフルエン、リコペン、β，β−カロテン、３’−ヒドロキシエキネノンおよびβ−クリプトキサンチンを随意に含む、天然のゼアキサンチン、リコペンおよび無色カロテノイド、望ましくはフィトエンおよびフィトフルエンの代わりの高純度の供給源を提供することである。更なる目的は、例えば総カロテノイド中９８％以上の高純度でゼアキサンチンを産生することができるアルギバクター（Algibacter）属に属する細菌を提供することである。

第一に以下のステップからなる少なくとも１個のプレ−カロテノイドおよび／またはオレンジ色のカロテノイド化合物を産生する方法が提供される：

ａ）上記プレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド化合物の産生条件下適切な培地中および適切な時間アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）属由来の細菌を培養し；そして

ｂ）その細菌から上記プレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド化合物を回収する。

プレ−カロテノイド化合物は本質的に無色であるが、カロテノイド化合物は精製を促進する黄色／オレンジ色の色素を示す。方法は更に以下の任意のステップからなる：

ｃ）細胞のバイオマスおよび／またはプレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド産生を最大にするために発酵および培養条件を最適化し；

ｄ）無色のプレ−カロテノイドおよび／またはオレンジ色のカロテノイドを過剰産生するミュータント株を同定するために細菌株ＡＱＰ０９６に古典的な菌株突然変異誘発を実施し；

ｅ）プレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド生合成をコントロールするためにカロテノイド生合成調節剤の添加により供給原料の窒素対炭素比を制御することにより上記条件を変え；および／または

ｆ）カロテノイド生合成経路の化合物の１個以上の発現を増加させるようにメナジオンの添加により上記条件を変える。

黄色／オレンジ色の着色化合物の色彩はかなり変化するが一般に浅黄色からオレンジ色／ピンク色／赤色に変化することが理解される。例えば、カロテノイドを含む画分は一般にオレンジ色の特徴がある。

アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）属由来の細菌は生育中に黄色、オレンジ色またはピンクレッドの色素を示すアルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）の可能性がある。好ましくはアルギバクター（Algibacter）種は海洋細菌で、生育にＮａＣｌを必要とする。好ましくはアルギバクター（Algibacter）種は主なカロテノイドとしてゼアキサンチンおよび／またはリコペン（培養条件に依存）を産生する。フィトエンおよびフィトフルエンのようなその他のカロテノイドはわずかな割合で認められると理解される。すなわち、用いられたアルギバクター（Algibacter）種は望ましくはその他のいずれのカロテノイドよりも大きな割合でゼアキサンチンおよび／またはリコペンを産生する。典型的にゼアキサンチンおよび／またはリコペンは産生された総カロテノイドの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９８％の量を産生し、アルギバクター（Algibacter）株を培養するのに用いられた発酵条件に依存するであろう。好ましくは、アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）属に属する海洋細菌は受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８で２００５年４月１２日にＮＣＩＭＢにブタペスト協定下の要求に従って供託されたＡＯＰ０９６株またはそれぞれ黄色に着色したおよび／またはオレンジ色に着色した化合物を産生する性質を有する、例えば、ゼアキサンチンおよび／またはリコペンのようなカロテノイドを少なくとも１個産生する性質を有するそれらのミュータントまたは変異体である。このようなミュータントの１つは受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１３８３で２００６年４月６日にＮＣＩＭＢにブタペスト協定下の要求に従って供託されたＡＯＰ０９６ＭＵ０１６である。

望ましくは、黄色／オレンジ色／ピンクレッド−着色化合物はゼアキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、β−クリプトキサンチン、リコペンおよびβ，β−カロテンのようなカロテノイドである。このような化合物は実質上単離型、またはカロテノイドの混合物として回収される。好ましくはカロテノイドはゼアキサンチンまたはリコペンまたはそれらの混合物であり、実質上単離型で回収される。望ましくは無色化合物はフィトエンおよびフィトフルエンのようなプレ−カロテノイドである。

適切には細菌は炭水化物のような同化できる炭素供給源、およびアミノ酸のような同化できる窒素供給源の少なくとも１つの供給源からなる培地中で培養できる。望ましくは培地は無機塩、特にＮａＣｌ、ビタミンなどのような微量元素の添加からなる。適切な培地の１つはＤｉｆｃｏ２２１６Ｅマリンブロスまたはその変形である。もう１つの適切な培地は０．３〜３％のペプトン、例えば精製海水（天然）中０．５％のペプトンおよび０．０５〜０．７５％（例、０．１％）の酵母抽出物供給源である。より好ましくは、細胞量の産生増加にとってより適切な培地は４８時間インキュベートしながらろ過海水中で３％のペプトン＋４％の酵母抽出物＋０．５％のチアミンを用いる（表４参照）。熟練者は細菌の発酵および生育は精製海水中ペプトンまたはグルコースおよび酵母抽出物のような炭素／窒素供給源の濃度を変えることにより望ましいバイオマスを産生するように最適化され得ることを認めるであろう。典型的には細菌を、例えば２０℃〜２７℃、１２０ｒｐｍで２４〜１４４時間振とう培養する。より典型的には細菌を１２０ｒｐｍで振とうしながら、２６℃で４８時間培養する。培養液のｐＨは典型的にはｐＨ７．０〜８．０、例えば７．２〜７．８である。しかしながら本発明によれば、好ましい培地は以下の組成を有する：

同化可能な窒素供給源を含むが無機窒素化合物と同様に動物、野菜、微生物源の多数の物質に限定されない。好ましい同化可能な窒素供給源は大豆粉、ペプトン、酵母抽出物、コーンスティープリカー、魚粉、肉粉、アミノ酸、アンモニウム塩（リン酸アンモニウムおよび／または硫酸アンモニウムのような）である。最も好ましい同化可能な窒素供給源は原料の低価格の故にコーンスティープリカーである。

同化可能な炭素供給源を含むが、砂糖および澱粉、マルトース、ラクトース、グルコースのようなそれらのポリマー、脂肪酸およびポリアルコールに限定されない。好ましい炭素供給源はトウモロコシ、トウモロコシ粉、澱粉、グルコース飼料、乳酸塩および酢酸塩を含む。最も好ましい同化可能な炭素供給源は原料の低価格故にトウモロコシ粉である。当該技術における熟練者にとって、トウモロコシ粉および澱粉は澱粉をデキストリンに加水分解するα−アミラーゼ（ターマミル（Termamyl）１２０Ｌの商品名で市販品が入手できる。）のような酵素による処理を必要とする。

栄養培地は酵母抽出物、有機成分由来の微量元素のような成長因子をも含有する。このような成分を含むが、リン、イオウ、ビタミンに限定されない。最も好ましい成長因子の酵母抽出物を低濃度の硫酸第一鉄およびリン酸二ナトリウムと混合する。

脂肪供給源を含むが野菜油、大豆油、ソープストックおよびオリーブ油に限定されない。

栄養培地はイミダゾールおよびカザミノ酸のようなカロテノイド生合成調節剤をも含む。培地に酵母抽出物対グルコースを高栄養比で添加したとき、β−カロテンサイクラーゼの阻害をもたらしアルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）ＡＱＰ０９６の培養からゼアキサンチンの代わりにピンクレッド色素のリコペンの産生を蓄積させる。

本発明の黄色、オレンジ色、ピンクレッド−着色化合物は一般に培養細胞から単離および精製される。すなわち、微生物細胞を遠心分離またはろ過のような通常の方法によって培養液から分離し、そして細胞を溶解しそして着色化合物を溶剤で抽出する。少量の着色化合物／カロテノイドおよび無色化合物／プレ−カロテノイドを上澄み液またはろ液に溶解し、そして色素／カロテノイドもこれから回収される。抽出溶剤として、着色化合物が溶解する物質を用いることができる。例えば、アセトン、クロロフォルム、ジクロロメタン、ヘキサン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ベンゼン、二硫化炭素、ジエチルエーテルなどのような有機溶剤が用いられる、好ましくはテトラヒドロフランが用いられる。精製は適切な溶剤などで、単独または組み合わせて吸着、溶出、溶解のような通常の方法によって行なわれる。

本発明に従って、多くの場合、ゼアキサンチン、リコペン、β，β−カロテン、３’−ヒドロキシエキネノン、β−クリプトキサンチン、フィトエンおよびフィトフルエンは同時に産生され、培養産物中に存在する。従って、本発明の具体化において、上述カロテノイドのいずれか１つを上述した方法によって別々に得ることができる。二者択一的に、カロテノイドの混合物も得ることができる。このようにして、本発明のカロテノイド産生の過程は個々のカロテノイドの産生過程およびカロテノイド混合物の産生過程を含む。

カロテノイドの混合物を吸着／溶出カラムクロマトグラフィー、示差分別抽出、向流抽出、示差結晶化などのようなカロテノイドの相互分離に対する通常の方法に従って相互に分離することができる。クロマトグラフィー技術はＨＰＬＣ技術、例えば順相または逆相ＨＰＬＣを含む。

加えて、個々のカロテノイドの選択的産生またはカロテノイドの増量のために望ましいカロテノイドを培地組成、培養条件などを制御することによって選択的に産生することができる。

例えば、産生カロテノイドの割合は好気性条件を変えることによって変えることができる。例えば、産生カロテノイドの割合を培地の量および／またはフラッシュ−振とう培養における振とう速度によって、および／または通気／撹拌培養における空気供給の速度または撹拌速度を変えることによって変えることができる。

二者択一的に、または追加的に特定のカロテノイドの選択的産生および／または産生増加のために、アルギバクター（Algibacter）細菌種をミュータント アルギバクター（Algibacter）株が他のカロテノイド中、望ましいカロテノイドを選択的に産生しおよび／または高濃度に産生するようにここに述べたように，例えばＡＱＰ０９６の人工突然変異のような突然変異によって改善することができる。このような突然変異処理は、例えば、Ｘ線放射、ＵＶ放射などのような物理的方法；Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）の使用のような化学的方法；および当該技術領域において知られた遺伝子組み換え技術、またはファージ曝露技術のような生物学的方法を含む。このような改良ミュータントを用いるカロテノイドの産生過程はカロテノイド産生の本過程に含まれる。

さらに本発明はゼアキサンチン、リコペン、３’−ヒドロキシエキネノン、β，β−カロテン、β−クリプトキサンチン、フィトエンおよび／またはフィトフルエンのようなカロテノイドを産生するアルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）属に属する海洋細菌をも提供する。望ましくは、上記細菌は他の細菌種から分離され、そして精製型で分離される。都合の良いことに、ゼアキサンチンは例えば、その精製および製造に関して有益なアルギバクター（Algibacter）株ＡＱＰ０９６（２００５年４月１２日にＮＣＩＭＢにブタペスト協定の要求下供託された受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８または２００６年４月６日にＮＣＩＭＢにブタペスト協定の要求に従って受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１３８３として供託されたＡＱＰ０９６ＭＵ０１６）によって産生された主要なカロテノイドである（例えば、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８５％、９０％、９８％）。都合の良いことに上記細菌は必要な化合物を容易に集めるためにイン・ビトロ（in vitro）で培養される。

抽出したゼアキサンチン、リコペンおよび海洋細菌により産生され細胞から単離された混合カロテノイド、すなわち、ゼアキサンチン、リコペン、クリプトキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、β，β−カロテン、フィトエンおよび／またはフィトフルエンを含むホールセル産生物は様々なやり方で用いられる。単離型または混合カロテノイドを含む混合色素産生物のいずれかでゼアキサンチンまたはリコペンは、例えば、ブロイラー鶏の卵黄および皮膚の色素形成に着色が必要な動物飼料に添加され、ＵＶ障害および加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）（薬理学）に対しヒトの眼の保護を促進する抗酸化剤としておよび環境に優しいまたは現在の合成および天然誘導体に比べてより生物に利用されやすい型としてヘルスケアに加えられる。単離型でまたはゼアキサンチン、リコペン、β，β−カロテン、β−クリプトキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、フィトエンおよび／またはフィトフルエンを含む混合カロテノイド産生物として適切な海洋細菌アルギバクター（Algibacter）ＡＱＰ０９６またはＡＱＰ０９６ＭＵ０１６のような特にアルギバクター（Algibacter）株から抽出されるゼアキサンチンはセルロース／ゼラチンカプセルのような被覆剤に混合されるオメガ３およびオメガ６脂肪酸の供給源のようなオイルマトリックスとして調合される。このカプセルに封じ込められた産生物は抗酸化剤として栄養補助食品産業において（機能性食品）として用いられる。

無色化合物／プレ−カロテノイドのフィトエンおよびフィトフルエンを無色特性が望まれるスキンケアの化粧品産業に用いることができる。抗酸化剤であることを越えて、フィトエンおよびフィトフルエンはフリーラジカルより強力で、天然において最も強力なラジカル−ヒドロキシラジカルと戦う能力がある。それらは炎症およびＵＶ放射に対し皮膚を保護する抗炎症作用を有するとも言われており、ＬＤＬの酸化を阻止することにより心血管系の保護を促進することができる。それらを化粧品、栄養補助食品または追加の健康利益が望まれそして色彩が論点である食物に用いることができる。これらの産生物を食物の貯蔵寿命を高めるためにも用いることができる。

それら自身の健康性質に加えて、フィトエンおよびフィトフルエンはそれらの活性を増強し、分子を安定化させそして分解を防ぐためにＣｏＱ１０のようなその他の成分および着色カロテノイドと共に作用することが判明している。

これまでに述べられたようにアルギバクター・エスピー・ノブ（Algibacter sp. nov）ＡＱＰ０９６またはＡＱＰ０９６ＭＵ０１６のような海洋細菌アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）により産生されたゼアキサンチンおよび混合カロテノイド色素は塗料および被覆剤、プラスチック、スピン乾燥繊維、建築材、紙、セラミックス、光学電子装置、エラストマー、インク、織物、ガラス、菓子を含む食品製品、医薬品および化粧品を含む様々な産業および消費者市場に用いる環境に優しい代用品として二者択一的に用いられる。

二者択一的に、ゼアキサンチンおよび混合カロテノイド産生物は動物およびヒトにおいて薬理作用または生理作用を促進するためにまたは加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）およびある種の癌のような疾患の治療および予防に用いる抗酸化剤として用いられる。

本発明はまたここで述べたようにアルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）株ＡＱＰ０９６またはＡＱＰ０９６ＭＵ０１６によって産生される本発明の赤色−着色化合物の産生に責任のある酵素をコードする遺伝子の単離をも可能にする。図１はアルギバクター（Algibacter）ＡＱＰ０９６からゼアキサンチン産生の提案経路を示す。この経路は他のアルギバクター（Algibacter）種に類似しているかまたは同一である可能性がある。カロテノイド産生に必要な遺伝子は当該技術において知られた一般的な分子生物学技術を用いて容易に同定および単離される（例えば、サンブルック・ジェー（Sambrook J）ら2000年 分子クローニング：実験マニュアル（第３版），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照）。例えば、遺伝子は前述したアルギバクター（Algibacter）ＡＱＰ０９６由来ゲノムのハイブリダイゼーション研究によって同定される。多くのカロテノイド生合成遺伝子／蛋白質はこれまでに同定されてきた、例えば、ＵＳ６０／４３４，６１８およびＵＳ６０／４３５，６１２を参照し、そしてアルギバクター（Algibacter）、特にアルギバクター（Algibacter）ＡＱＰ０９６またはＡＱＰ０９６ＭＵ０１６から相当する遺伝子をクローニングするのに既知の塩基配列を用いることができる。典型的にこれまでに知られたカロテノイド塩基配列に対しデザインされたフラグメントまたはオリゴヌクレオチドは同定しそしてその後相当するアルギバクター（Algibacter）遺伝子／蛋白質をクローニングするために当該技術に熟練した人々によく知られたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ反応に用いられる。

本発明を以下に示す図面を参照して更に述べる：

図１はＡＱＰ０９６からのゼアキサンチン産生の提案された遺伝的経路を示す；

図２ａはゼアキサンチン産生の選択性を示すＡＱＰ０９６により産生された混合粗カロテノイドのＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）（熱電子）；および

図２ｂは混合カロテノイド標準品のＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）である。

図３はカロテノイド生合成調節剤のイミダゾールおよびカザミノ酸の添加により制御された窒素および炭素の供給原料比を用いるゼアキサンチンのリコペンへの変換のＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）を示す。

図４ａおよび４ｂはＡＱＰ０９６においてメナジオンにより誘導されたカロテノイド発現のＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）である。

図５はＡＱＰ０９６により産生されたフィトエンおよびフィトフルエンのＨＰＬＣクロマトグラム（２９０ｎｍ）である。

実施例１：アルギバクター・エスピー・ノブ（Algibacter sp. nov）株ＡＱＰ０９６ＮＣＩＭＢ４１２８６の単離
細菌の場所を探し当てるために海水サンプルを数箇所の浅瀬の水ロケーションから集めた。１００μｌの海水をディフコ・マリーン・アガー（Difco Marine Agar）２２１６Ｅ上で培養した。寒天平板を実験室温条件（約２１℃）で７日間インキュベートした。

黄色、赤色およびオレンジ色の色調を示すコロニーを継代培養しそして精製の結果特定株の分離をもたらした。黄色−オレンジ色の色調を示したこれらの株の一つを選択し（ＡＱＰ０９６を指定した）そして受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８でＮＣＩＭＢに供託した。

ＡＱＰ０９６株は寒天培地上強い黄色−オレンジ色の色素を示したそしてマリンブロス中で培養した時黄色−オレンジ色の色素を産生した。その微生物はグラム陰性桿菌である。アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）ＡＱＰ０９６から抽出した黄色／オレンジ色の色素はその主要色素（９８％）としてゼアキサンチンに対して報告されたものと類似の吸収スペクトルおよびクロマトグラフィー保持時間を生じた。

逆相ジェミニック（Gemini）Ｃ−１８ ２５０Ｘ４．６ｍｍカラムを用いるＨＰＬＣにおいて、１０μｌの色素サンプルを１０％v/vアセトン水：１００％アセトン（３０：７０）から１０％v/vアセトン水：１００％アセトン（５：９５）へ直線勾配で１０分間溶出し、引き続き１０％v/vアセトン水：１００％アセトン（３０：７０）の開始条件に戻る前に１分の直線勾配で１０％v/vアセトン水：１００％アセトン（５：９５）で６分間溶出し、そして１．３ｍｌ／分の流速で１０％v/vアセトン水：１００％アセトン（３０：７０）で２分間溶出した。４５０ｎｍで検出した。

ＡＱＰ０９６からの混合粗カロテノイドをＨＰＬＣ上混合カロテノイド標準品と比較した（図１ａおよび１ｂを参照）そしてこれらの標準品と類似性を示す。

その株を１６ＳｒＲＮＡ分子解析および分類学的精密検査のため独立した試験所へ内密に提出した。試験所は、培養はこれまでに述べられたゼアキサンチン産生微生物に類似していないと結論した。培養株はアルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）としての特徴を示した。これがこの属によるゼアキサンチン産生の最初の報告である。

実施例２：アルギバクター・エスピー・ノブ（Algibacter sp. nov）の培養およびゼアキサンチン産生の定量化
液体培地は培養液のＬ当たり以下の組成を有する

この栄養培地を１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液を用いてｐＨ７．５に調整した。接種された培養の生育条件は２５℃、ｐＨ７．５で、２日間連続通気した。通気は２５ｍｌの振とう型エルレンマイヤーフラスコ培養を用い２００ｒｐｍで振とうして行った。

アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）から色素を抽出するために、細胞ペレットを凍結乾燥しその後ミクロ遠心分離管中１００μｌのリソチーム溶解緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、２００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌおよび０．２ｇ／ｌリソチームを１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整した。）に再懸濁し、そして暗所に４５分間放置した。

０．０５％w/vＢＨＴを含むテトラヒドロフラン溶液を作成し、そして５００μｌを再懸濁バイオマスに加えた。溶剤相にカロテノイドを抽出するために暗所にこの混合物を４５分間放置した。

それから溶剤相、水相および細胞残骸を分離するためにサンプルを遠心分離した（１１０００ｒｐｍで３分間）。溶剤相を除きそして０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターを通してろ過した。得られたろ液をその後のＨＰＬＣによる分析および分光光度計分析用に用意した。

ビア−ランベルト（Beer-Lambert）則に従う溶液中のカロテノイド、すなわち、それらの吸光度は濃度に直接比例する。“カロテノイド分析のハーベスト−プラス・ハンドブック（Harvest-Plus handbook）”（ディーリア（Dielia）ら）にしたがって総カロテロイド含有量を以下の式を用いて見積もることができる：

総カロテノイド含有量（μｇ／ｇ）：
式中、Ａ＝吸光度、容積＝抽出液の総容積、ε＝ゼアキサンチンの吸収係数。

４５０ｎｍの波長でＡＱＰ０９６株からのカロテノイドサンプルの吸光度を測定するためにＵＶ−ＶＩＳ分光計（セシル（Cecil）３０００シリーズ、走査型分光光度計）を用いた（ＴＨＦ＋ＢＨＴのサンプルをブランクコントロールとして用いた）。

表１の結果はカロテノイド粗抽出において産生されたゼアキサンチンの純度を約９８％の総カロテノイド含有量で調整する必要がある。

これらの結果から、アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）ＡＱＰ０９６の野生型株により産生されたゼアキサンチンの濃度は乾燥バイオマスの３．４７ｍｇ／ｇであった。

実施例３：培養条件の最適化
以下の実験がアルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）の発酵由来微生物バイオマスの最適化産生の最良の培養条件を限定する。表３に述べたように培地を調整し、オートクレーブにかけ、冷却しそしてアルギバクター（Algibacter）株を接種した。いずれのｐＨも７．５に維持しそして細胞産物（cell yields）を４，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、液をデカントして除きそして細胞ペレットを乾燥することによって計算した。

その結果を表４に示す：

海洋細菌アルギバクター（Algibacter）株ＮＣＩＭＢＡＱＰ０９６を用いる最初の実験はＬ当たり総ゼアキサンチン力価５．６１ｍｇ／Ｌの３．４７ｍｇ／ｇの乾燥バイオマスを産生した（表４を参照）。

最適化研究の初期の培地は培地Ｆを用い細胞乾燥重量（ｃｄｗ）１．０５ｇ／ｌから１２ｇ／ｌへのバイオマス増加を立証した。過剰産生ゼアキサンチンの単離はＡＱＰ０９６株が培地Ｆを用いて培養した時ゼアキサンチン力価の収率を１２５ｍｇ／Ｌ以上に改善した。

実施例４：ＡＱＰ０９６のゼアキサンチン過剰産生ミュータントを単離するための古典的細菌株突然変異誘発
この実験の目的は高度に着色した株（レベルが野生型株のそれより高いようにゼアキサンチンを過剰産生する株）を生じるＡＱＰ０９６においてＵＶ−誘発突然変異を生じさせることによりバイオマス単位当りのゼアキサンチン収率を増大させることにあった。

ＡＱＰ０９６の終夜接種培養液を新鮮なマリンブロスへ１００倍に希釈しそして約２×１０⁹〜５×１０⁹細胞／ｍｌの細胞密度に生育した。細胞を滅菌海水中で洗浄し（遠心分離により）その後滅菌海水中に〜２×１０⁹細胞／ｍｌで再懸濁した。１０^-5希釈液の０．１ｍｌを非照射コントロールを提供するために個体培地上で２倍に培養した。

細胞懸濁液の６ｍｌを２０の滅菌ペトリ皿に移した。細胞培養の全照射を層流バイオセーフティキャビネットを用いて行なった。バイオセーフティキャビネット内のＵＶ機能（２５４ｎｍで放射するＵＶ管）を以下の期間細胞懸濁液を照射するために交換した：１５秒、３０秒、６０秒、９０秒、２分、４分、６分、８分、１０分、１２分、１５分、１８分、２０分、２２分、２５分、２８分、３０分、４５分、６０分および９０分。

照射後、照射細胞の１ｍｌを滅菌海水中連続して１０^-5に希釈した。希釈液の０．１ｍｌをマリン寒天上で２倍に培養した。加えて、（無希釈）照射細胞の１．０ｍｌを２０ｍｌの新鮮なマリンブロスに希釈しそして終夜培養した。培養液を連続して１０^-5に希釈しそして希釈液の０．１ｍｌをマリン寒天培地上で２倍に培養した。

すべての培養皿を転倒させそして強く着色したコロニーを調べる前に室温で５日間インキュベートした。

明らかに強くオレンジ色／黄色（または非照射コントロールの色とわずかに異なっていても）に着色したコロニーを取り上げそしてコントロールと並べて新鮮なマリン寒天培地上にストリーキングした。それから標準ＨＰＬＣ分析を用いてカロテノイド分析を行いそして上記式に従ってゼアキサンチンの濃度を測定した。

古典的細菌株突然変異誘発は改善した、または異なるカロテノイド像を示したＡＱＰ０９６の２種のミュータントを生じた。このデータを表５に要約する。

ミュータント株ＡＱＰ０９６−１６はブタペスト協定下に供託された（受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１３８３）。

実施例５：カロテノイド生合成制御調節剤を用いそして発酵の間炭素対窒素比を変えるＡＱＰ０９６株からのリコペンの産生
トリプトン大豆培養液（ＴＢＳ）中で培養した時、ＡＱＰ０９６の培養液は標準のマリンブロスを用いて培養した時より通常の黄色オレンジ色の代わりにピンクレッド着色を生じることが観察された。ＨＰＬＣによる色素分析は（図３ａおよび３ｂを参照）ＴＳＢで培養した時ＡＱＰ０９６により産生された主なカロテノイドはリコペンであることを示した。

培地中炭素対窒素比の注意深い制御によりＡＱＰ０９６でのリコペンの産生を制御できることを更なる研究が立証した。このリコペン制御メカニズムはカロテノイド生合成調節剤、イミダゾール（５ｍＭ）およびカザミノ酸（１２．５ｇ／ｌ）の添加によってさらに制御することができる。

実施例６：メナジオンを用いるカロテノイド生合成経路の誘導
０．１００ｍｇ／ｍｌの濃度でメナジオンをマリンブロス中で培養したＡＱＰ０９６の２４時間培養液に添加した。この培養液を２２０ｒｐｍで２４時間回転式シェーカー上さらに４日間インキュベートした。

インキュベーションの５日後、培養液を遠心分離し（４，５００ｒｐｍ，２０分）そして色素のカロテノイド含有量をＨＰＬＣにより分析した（図４ａおよび４ｂ参照）。結果はＡＱＰ０９６株における標準カロテノイドの生合成経路に関連したいずれのカロテノイド産生をもメナジオンが誘導することを立証した。

標準の生育条件下、ＡＱＰ０９６株は純度９８％のゼアキサンチンを産生する。メナジオンの使用はＡＱＰ０９６により産生されたゼアキサンチンの量をおよそゼアキサンチンの６０％に減少させる。しかしながら、メナジオンは約１０％のβカロテン、６％のリコペン、８％のβ‐クリプトキサンチン、１２％のカンタキサンチン、１２％のアスタキサンチンおよびアドニルビンおよび２％の３−ヒドロキシエキネノンのようなその他のカロテノイドの産生を誘導した。

実施例７：ＡＱＰ０９６の培養液からのフィトエンおよびフィトフルエンの産生
脱飽和阻害剤の存在下に生育した植物および微生物から通常単離されるが、主要カロテノイドとしてフィトエンを産生する無色のミュータント（ミュータント０２６）を得ることに本発明者らは成功した。

フィトエンに対するＡＱＰ０９６の着色野生型株および無色ミュータント株両者のＨＰＬＣ分析は総濃度２ｍｇ／ｇの無色カロテノイドのフィトエンおよびフィトフルエンの存在を示した。多くの生物においてフィトエンはカロテノイド生合成の前駆体である（図５を参照）。

フィトエンおよびフィトフルエンを２８５ｎｍの波長で１ｍｌ／分の流速での測定時、無勾配で２０分の流出時間で８０％のアセトニトリル、１０％のメタノールおよび１０％水の溶媒系を用いるＨＰＬＣにより測定した。

ＡＱＰ０９６からのゼアキサンチン産生の提案された遺伝的経路を示す。 ゼアキサンチン産生の選択性を示すＡＱＰ０９６により産生された混合粗カロテノイドのＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）（熱電子）である。 混合カロテノイド標準品のＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）である。 カロテノイド生合成調節剤のイミダゾールおよびカザミノ酸の添加により制御された窒素および炭素の供給原料比を用いるゼアキサンチンのリコペンへの変換のＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）を示す。 ａおよびｂは、ＡＱＰ０９６においてメナジオンにより誘導されたカロテノイド発現のＨＰＬＣクロマトグラム（４５０ｎｍ）である。 ＡＱＰ０９６により産生されたフィトエンおよびフィトフルエンのＨＰＬＣクロマトグラム（２９０ｎｍ）である。

Claims (32)

1. 以下のステップからなる少なくとも１個のプレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド化合物の産生方法：
   ａ）上記プレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド着色化合物の産生条件下適切な培地中および適切な時間アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）属由来の細菌を培養し；そして
   ｂ）細菌から上記プレ−カロテノイドおよび／またはカロテノイド化合物を回収する。
2. 化合物が黄色／オレンジ色に着色したまたは無色のカロテノイドである請求項１に記載の方法。
3. 培地がカロテノイド生合成制御のためメナジオン、カザミノ酸および／またはイミダゾールからなる請求項１または２に記載の方法。
4. アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）が海洋種である先行する請求項のいずれかに記載の方法。
5. アルギバクター（Algibacter）種が他のいかなるカロテノイドまたはプレ−カロテノイドよりも大きな割合でゼアキサンチンを産生する先行する請求項のいずれかに記載の方法。
6. アルギバクター（Algibacter）種がＮＣＩＭＢに供託されたようなものおよび受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８またはミュータント（ＮＣＩＭＢ４１３８３のような）または黄色−着色化合物および／またはゼアキサンチンを産生する性質を有するそれらの変異体によって同定される先行する請求項のいずれかに記載の方法。
7. 黄色−着色化合物がゼアキサンチン、リコペン、３’−ヒドロキシエキネノン、β−クリプトキサンチン、およびβ‐カロテンからなる先行する請求項のいずれかに記載の方法。
8. 無色の化合物がフィトエンおよびフィトフルエンからなる先行する請求項のいずれかに記載の方法。
9. 以下のａ）〜ｃ）のステップからなる特定カロテノイドを選択的に産生するおよび／または産生を促進する方法：
   ａ）上記カロテノイドの産生条件下適切な培地中および適切な時間アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）属由来の細菌を培養する；
   ｂ）産生された上記カロテノイドの濃度および／または産生されたその他のカロテノイドと比較した上記カロテノイドの濃度を確かめる；そして
   ｃ）上のａ）において採用された培養条件と異なる条件で上記細菌を培養しそして上記の異なる条件が上記カロテノイドの選択的産生および／または産生促進をもたらすかどうかを検出する。
10. 上記カロテノイドの選択的産生および／または産生濃度の増大に対する適切な培養条件を明らかにするために必要ならステップｃ）を繰り返す請求項７または８に記載の方法。
11. 培地中の炭素対窒素比の制御により条件を変える請求項９または１０に記載の方法。
12. カロテノイドがゼアキサンチンである請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
13. アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.)がＮＣＩＭＢに供託されたようなものおよび受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８またはミュータント（ＮＣＩＭＢ４１３８３のような）または黄色−着色化合物および／またはゼアキサンチンを産生する性質を有するそれらの変異体によって同定される請求項９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
14. 以下のステップからなる特定のカロテノイドを選択的に産生するおよび／または産生を促進する方法：
    ａ）上記カロテノイドの産生条件下適切な培地中および適切な時間アルギバクター・エスピー（Algibcter sp.）属由来の細菌を培養する；
    ｂ）産生された上記カロテノイドの濃度および／または産生されたその他のカロテノイドと比較した上記カロテノイドの濃度を確かめる；そして
    ｃ）上記細菌を突然変異誘発させそして上記の突然変異誘発させた細菌をａ）で用いた同じ条件で培養する；そして
    ｄ）上記の突然変異誘発が上記カロテノイドの選択的産生および／または産生促進をもたらすかどうかを確かめるために、産生された上記カロテノイドの濃度を確認する。
15. 上記カロテノイドの選択的産生および／または産生濃度の増大に対する適切な培養条件を明らかにするために必要ならステップｃ）を繰り返す請求項１４に記載の方法。
16. カロテノイドがゼアキサンチンである請求項１４または１５に記載の方法。
17. カロテノイドがリコペンである請求項１４または１５に記載の方法。
18. プレ−カロテノイドがフィトエンおよびフィトフルエンである請求項１４または１５に記載の方法。
19. アルギバクター・エスピー（Algibacter sp.）がＮＣＩＭＢに供託されたようなものおよび受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８またはミュータント（ＮＣＩＭＢ４１３８３のような）または無色の化合物フィトエン、フィトフルエンおよび／または黄色‐着色化合物および／またはゼアキサンチンおよび／またはリコペンを産生する性質を有するそれらの変異体によって同定される請求項１４〜１８のいずれか１つに記載の方法。
20. ゼアキサンチン、リコペン、３’−ヒドロキシエキネノン、β−クリプトキサンチン、β−カロテン、フィトエンおよびフィトフルエンのようなカロテノイドまたはプレ−カロテノイドを産生するアルギバクター・エスピー・ノブ（Algibacter sp. nov）属に属する海洋細菌。
21. ＮＣＩＭＢに供託されたおよび受け入れ番号ＮＣＩＭＢ４１２６８またはミュータント（ＮＣＩＭＢ４１３８３のような）または無色の化合物フィトエン、フィトフルエンおよび／または黄色−着色化合物および／またはゼアキサンチンおよび／またはリコペンを産生する性質を有するそれらの変異体によって同定される細菌。
22. 製品が海洋細菌によって提供される混合カロテノイドおよび蛋白供給源を含むホールセル産生物として作られる動物飼料の製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような黄色−着色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはゼアキサンチンの利用。
23. 塗料、被覆剤、プラスチック、スピン乾燥繊維、建築材、紙、セラミックス、光学−電子装置、エラストマー、インク、織物、ガラス、食品および医薬品、例えば食品添加着色剤および化粧品の製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような黄色−着色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはゼアキサンチンの利用。
24. 病気または有害な環境影響の治療および／または予防に用いる抗酸化剤の製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような黄色−着色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはゼアキサンチンの利用。
25. ヒトの日焼けを促進させる美容サプリメントの製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような黄色−着色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはゼアキサンチンの利用。
26. ヒトの抗老化を促進させる美容サプリメントの製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような無色の化合物／プレ−カロテノイド、少なくとも１個のカロテノイド、またはフィトエン／フィトフルエンの利用。
27. 病気または有害な環境影響の治療および／または予防に用いる抗酸化剤の製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような無色の化合物／プレ−カロテノイド、少なくとも１個のカロテノイド、またはフィトエン／フィトフルエンの利用。
28. 塗料、被覆剤、プラスチック、スピン乾燥繊維、建築材、紙、セラミックス、光学−電子装置、エラストマー、インク、織物、ガラス、食品および医薬品、例えば食品添加着色剤および化粧品の製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または２１に記載の細菌によって産生されるような無色の化合物／プレ−カロテノイド、少なくとも１個のカロテノイド、またはフィトエン／フィトフルエンの利用。
29. 製品が海洋細菌によって提供される混合カロテノイドおよび蛋白供給源を含むホールセル産生物として作られる動物飼料の製造のため請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または請求項２１に記載の細菌によって産生されるような無色の化合物／プレ−カロテノイド、少なくとも１個のカロテノイド、またはフィトエン／フィトフルエンの利用。
30. 請求項１〜１９のいずれかに記載の方法または請求項２０または請求項２１に記載の細菌によって産生されるような請求項２２〜２９に記載の少量のリコペン、β−クリプトキサンチン、β−カロテンおよび無色のプレ−カロテノイドのフィトエンおよびフィトフルエンの追加の健康利益を有する黄色着色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはゼアキサンチンの純粋な供給源の産生。
31. 請求項１〜１８のいずれかに記載の方法または請求項１９または２０に記載の細菌によって産生されるような請求項２２〜２９に記載の少量のゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、β−カロテンおよび無色のプレ−カロテノイドのフィトエンおよびフィトフルエンの追加の健康利益を有する黄色着色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはリコペンの純粋な供給源の産生。
32. 請求項１〜１８のいずれかに記載の方法または請求項１９または２０に記載の細菌によって産生されるような請求項２２〜２９に記載の少量のフィトフルエンの追加の健康利益を有する無色化合物、少なくとも１個のカロテノイド、またはフィトエンの純粋な供給源の産生。