CN101203616A - 玉米黄质的生物生产和类胡萝卜素的生物合成控制 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从属于Algibacter属的海洋细菌中分离类胡萝卜素及具体的叶黄素玉米黄质(玉米黄质－β，β－胡萝卜素－3，3’－二醇)和任选地其他类胡萝卜素，如番茄红素、β，β－胡萝卜素、3′－羟基海胆酮β－隐黄素和无色类胡萝卜素，八氢番茄红素和六氢番茄红素，其中所述Algibacter属能够生产上述化合物。本发明还提供一种Algibacter菌株，该菌株能够生产显著水平的类胡萝卜素，特别是高纯度的玉米黄质，以及使用所述Algibacter菌株的方法和生产的所述类胡萝卜素的用途。

Description

玉米黄质的生物生产和类胡萝卜素的生物合成控制

发明领域

本发明涉及从属于Algibacter属的海洋细菌中分离类胡萝卜素、和具体地叶黄素玉米黄质(玉米黄质-β，β-胡萝卜素-3，3’-二醇)、和任选地其他类胡萝卜素、如番茄红素、β，β-胡萝卜素、3’-羟基海胆酮β-隐黄素、和无色类胡萝卜素、八氢番茄红素和六氢番茄红素，该Algibacter属能够生产上述化合物。本发明还提供一种Algibacter菌株，该菌株能够生产显著水平的类胡萝卜素，特别是高纯度的玉米黄质，以及使用所述Algibacter菌株的方法和生产的所述类胡萝卜素的用途。

发明背景

类胡萝卜素是一类重要的在许多植物、藻类和光合细菌中普遍存在的天然脂溶性色素，它们在其中的光合作用中扮演重要角色。类胡萝卜素还能在许多非光合细菌、酵母、霉菌和真菌中发现，将它们在这其中的角色认为是保护生物体的DNA免受光氧化(太阳光)。

广泛认同类胡萝卜素赋予许多植物、水果、花和蔬菜的红色、橙色和黄色，且许多动物、如鲑鱼、鳟鱼和火烈鸟通过包含该类胡萝卜素的饮食获得它们的肉和羽毛的着色。在自然界中已经识别和表征了超过620种类胡萝卜素。

广泛认同动物中，包括人，类胡萝卜素具有重要的抗氧化活性，且有些担当维生素A的前体来源。不断有证据表明它们中的一些在有益于人类健康中扮演重要角色，且由于动物不能合成这些分子，它们因此必须从摄取的食物中对其进行吸收。

玉米黄质(β，β-胡萝卜素-3，3’-二醇)是一种在玉米中普遍存在的黄色类胡萝卜素(玉蜀黍属mays)，且是对眼睛健康很重要的类胡萝卜素。玉米黄质是人视网膜中天然存在的重要抗氧化剂。它担当UV过滤器，从而保护眼睛免受来自于太阳的UV光的光氧化损伤。最近科学证据发现该类胡萝卜素参与减少与衰老有关的黄斑退化(AMD)以及白内障的影响，AMD和白内障是世界上引起失明的两个主要原因。

玉米黄质还作为用于为烤鸡和蛋黄上色的试剂广泛用于农业食品工业，还被人类作为食品添加剂用于帮助对抗AMD的保护。它还能作为着色剂用于化妆品和食品工业中。

将这些饮食色素，如玉米黄质，加入饲料中，从而从美学角度改善了鸡产品的着色，例如蛋黄以及鸡本身，从而改善烤家禽的美学质量。这是必要的，因为在自然界中这些动物不能自身合成这些产物，且必须从饮食中获得这些色素。

玉米黄质是通过非常少的且大部分属于黄杆菌属(Flavobacterium)和副球菌属(Paracoccus)的细菌种天然合成的。

已将细菌种类多食黄杆菌属(Flavobacterium multivorum)描述为能够生产玉米黄质(专利号US5,308,759)。

也已将细菌种类副球菌属zeaxanthinifaciens sp.nov描述为生产玉米黄质(Berry et al.2003)。

除细菌生产玉米黄质外，商业天然玉米黄质主要由万寿菊和苜蓿提供。然而，当配制该生物来源用于家禽工业时，它与稳定性问题和生物可用性有关。现在正在进行改善万寿菊这些性质的工作(Bosma et al.2003)。大多数万寿菊产物必须首先经溶剂提取、皂化且需要在提取过程中添加抗氧化剂。由Gierhart et al.在1992年进行的早先工作显示由多食黄杆菌属生产的玉米黄质比从万寿菊中提取的玉米黄质的生物可用性高2-3倍。

番茄红素是开链不饱和类胡萝卜素，它将红色赋予番茄、番石榴、蔷薇果、西瓜和粉葡萄柚。番茄红素是经验证的抗氧化剂。抗氧化剂中和可损伤身体细胞的自由基。研究显示如果将番茄中的番茄红素加工成果汁、沙司、糊状和番茄酱、身体能更有效地对其进行吸收。番茄红素在番茄中存在的化学形式通过这些加工所涉及的温度改变发生转化、从而使身体更容易对其进行吸收。

在身体中、番茄红素堆积在肝脏、肺脏、前列腺、结肠和皮肤中。其在身体组织中的浓度倾向于高于所有其他类胡萝卜素。

正在进行的初步研究提出番茄红素与黄斑退化疾病，血清脂质氧化和肺、膀胱、子宫颈和皮肤癌降低的危险有关。

为了调查番茄红素的其他潜在优点、进行了研究、包括在多伦多大学和美国健康基金进行的由HJ.Heinz公司资助的研究。这些研究将集中在番茄红素在与消化道、乳腺和前列腺癌的对抗中的可能作用上。

天然番茄红素的主要商业来源是来自番茄和来自真菌Blaksleatrispora。然而，就发明人所知，不存在对从细菌，具体地从Algibacter属高产量分离的天然番茄红素的报道。

八氢番茄红素和六氢番茄红素是类胡萝卜素生物合成途径中的无色前体。除了作为抗氧化剂，它们还具有对抗羟基-自然界中最强大的原子团的能力。还指出它们具有消炎作用，从而保护皮肤对抗炎症和UV照射，且能通过防止LDL的氧化来帮助保护心脏血管系统。可以预料它们将会在饮食添加剂或需要附加的健康益处的食品中使用。还发现八氢番茄红素和六氢番茄与其他成分如CoQ10和着色的类胡萝卜素共同作用，从而提高其活性，稳定这些分子并防止退化。无色类胡萝卜素，由于它们的抗氧化和抗老化特性，适合用于化妆品。还判定它会使化妆品界中发展销售更为容易，因为颜色对于这个市场特别有关的。目前，无色类胡萝卜素来源于特殊培养的番茄和藻类。

本发明的目的是提供天然玉米黄质、番茄红素和无色类胡萝卜素的另外一种高纯度来源，其中无色类胡萝卜素理想地包括八氢番茄红素和六氢番茄，任选地包括来源于属于Algibacter属的海洋细菌的八氢番茄红素、六氢番茄红素、番茄红素、β，β-胡萝卜素、3’-羟基海胆酮和β-隐黄质。进一步的目的是提供一种属于Algibacter属的细菌、该细菌能够生产高纯度的玉米黄质，例如高于总类胡萝卜素的98％。

发明概述

在第一个方面，提供了一种生产至少一种前类胡萝卜素(pre-carotenoid)和/或类胡萝卜素橙色化合物的方法，包括如下步骤：

a)在适合的培养基中，在适合于生产所述前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素化合物的条件和时期内，培养来自Algibacter sp.属的细菌；和

b)从细菌中回收所述前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素化合物。

该前类胡萝卜素化合物可基本无色，但是类胡萝卜素化合物可显现黄/橙色，该颜色可帮助纯化。该方法可进一步包括任选的步骤：

c)最优化发酵和培养条件从而最大化细胞生物量和/或前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素的产量；

d)在细菌菌株AQP096上进行经典的菌株诱变，从而鉴定生产无色类胡萝卜素和/或橙色类胡萝卜素的突变菌株；

e)通过加入类胡萝卜素生物合成调节剂、控制碳氮原料(feed stock)比来改变所述条件，从而控制前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素的生物合成；和/或

f)利用甲基萘醌的添加改变所述条件，从而增强一种或多种类胡萝卜素生物合成途径化合物的表达。

已知该黄/橙色着色(pigmented)化合物的颜色可显著变化，但通常可从浅黄到橙/粉/红色变化。例如，可用一般的橙色表征包含类胡萝卜素的级分。

来源于Algibacter sp.属的细菌可为在生长中显现黄色，橙色或粉红色色素的任意Algibacter种。优选地，Algibacter种为海洋细菌，且可能在生长中需要NaCl。优选地，Algibacter种生产玉米黄质和/或番茄红素(依赖于培养条件)作为主要的类胡萝卜素。已知其他类胡萝卜素，如八氢番茄红素和六氢番茄红素，以较小的比例存在。也就是说，所用的Algibacter种应该理想地以比任何其他类胡萝卜素比例更大地生产玉米黄质和/或番茄红素。典型地，生产的玉米黄质和/或番茄红素的量将占总类胡萝卜素产量至少40％，50％，60％，70％，80％，90％或98％，且依赖于培养Algibacter菌株所使用的发酵条件。优选地，属于Algibacter种属的海洋细菌是菌株AQP096，该菌株按照布达佩斯条约的要求于2005年4月12日保藏于NCIMB，且其登记号为NCIMB 41268；或者，是具有分别生产黄色着色的和/或橙色着色的化合物的性质的AQP096菌株的突变体或变异体，例如具有生产至少一种类胡萝卜素，如玉米黄质和或番茄红素的性质。一种这样的突变体是AQP096 MU016，它按照布达佩斯条约的要求于2006年4月6日保藏于NCIMB，且其登记号为NCIMB 41383。

理想地，该黄色/橙色/粉红色着色的化合物是类胡萝卜素，如玉米黄质，3′-羟基海胆酮，β-隐黄素，番茄红素和β，β-胡萝卜素。这些类胡萝卜素可以基本分离的形式或类胡萝卜素混合物的形式回收。优选地，该类胡萝卜素是由基本分离形式回收的玉米黄质或番茄红素或它们的混合物。理想地，无色化合物是前类胡萝卜素，如八氢番茄红素和六氢番茄红素。

适合地，细菌可培养在包含如下成分的培养基中，该培养基包含：可同化(assimible)碳源，如碳水化合物，和至少一种可同化氮源，如氨基酸。理想地，该培养基包含另外的微量元素，如矿物盐，特别是NaCl，维生素等。一种适合的培养基是Difco 2216E海洋液体培养基或其变种。另一种适合的培养基是纯化海水(天然的)中含有0.3-3％的蛋白胨，例如0.5％的蛋白胨，和0.05-0.75％(例如0.1％)的酵母提取物来源。更优选地，对细胞量产量的增加更适合的培养基利用3％的蛋白胨加上4％的酵母提取物加上0.5％的硫胺素在过滤海水中培养48小时(参见表4)。熟练的收信人(addressee)将会理解，利用碳/氮源，如蛋白胨或葡萄糖，和酵母提取物在纯化海水中改变的浓度，可最优化该细菌的发酵和生长，从而提供所要求的生物量产量。典型地，可在20℃-27℃下振动，例如以120rpm的速度，培养细菌24-144小时。更典型地，在26℃，以120rpm的速度振动培养该细菌48小时。该培养物的pH值典型地为pH7.0-8.0，例如7.2-7.8。然而，根据本发明，优选的培养基含有下列成分：

组成	g/l&μg/ml
		氮源	30-50，例如45
碳源	25-40，例如33
		磷酸盐&硫酸盐	1-5，例如2.5
脂源	100μL/ml
		类胡萝卜素生物合成调节剂	20mMOL
海水	其余

可同化的氮来源包括但不仅限于众多动物、植物、微生物来源的物质以及无机氮化合物。优选的可同化氮源有：大豆粗粉、蛋白胨、酵母提取物、玉米浸出液、鱼粉、肉粉、氨基酸、铵盐(如磷酸铵和或硫酸铵)。

最优选的可同化氮源是玉米浸出液，因为其原材料的低成本。

可同化的碳来源包括，但不仅限于糖及其聚合体、如淀粉、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、脂肪酸和多元醇。优选的碳源包括玉米、玉米粉、淀粉、葡萄糖饲料、乳酸盐和乙酸盐。最优选的可同化碳源是玉米粉，因为其原材料的低成本。对于本领域的技术人员、玉米粉和淀粉要求酶的处理，如α-淀粉酶(可在Termamyl 120L商业获得)，该酶水解淀粉为糊精。

该营养培养基还可含有生长因子，如酵母提取物、来源于有机成分的微量元素。所述成分包括，但不仅限于，磷、硫、维生素。最优选的生长因子酵母提取物与低水平的硫酸亚铁和磷酸二钠结合。

脂源包括但不仅限于植物油、大豆油、肥皂原料和橄榄油。

该营养培养基还可含有某些类胡萝卜素生物合成控制因子，如咪唑和酪蛋白氨基酸。当将它们以高酵母提取物与葡萄糖营养比率加入到培养基中时，会导致对β-胡萝卜素环化酶的抑制，从而积累由Algibacter sp.AQP096培养生产的粉红色素番茄红素，而非玉米黄质。

本发明的黄色，橙色，粉红色着色的化合物通常可从该培养的细胞中分离和纯化。也就是，利用常规方法，如离心法或过滤法，从该培养中分离微生物细胞，该细胞溶解，且对着色的化合物进行利用一种溶剂的提取。少量的着色化合物/类胡萝卜素和无色化合物/前类胡萝卜素可溶于上清液或滤出液中，且该色素/类胡萝卜素也可从中回收。作为一种用于该提取的溶剂，能够使用能使该着色化合物溶于其中的任意物质。例如，使用有机溶剂，如丙酮、氯仿、二氯甲烷、己烷、环己烷、四氢呋喃、甲醇、乙醇、异丙醇、苯、二硫化碳、二乙醚等，并优选地使用四氢呋喃。纯化能通过常规程序进行，如单独或结合使用吸附，洗脱，在适合溶剂中溶解等。

根据本发明，在许多情形中，玉米黄质，、番茄红素、β，β-胡萝卜素、3′-羟基海胆酮、β-隐黄素、八氢番茄红素和六氢番茄红素同时生产并出现在培养产物中。因此，在本发明的一个实施方案中，上述类胡萝卜素中的任意一种都能够通过上述程序单独获得。或者，还能获得该类胡萝卜素的混合物。通过这种方法，本发明的类胡萝卜素生产过程包括生产单独类胡萝卜素的过程和生产类胡萝卜素混合物的过程。

根据类胡萝卜素相互分离的常规程序、如吸附/洗脱柱色谱法、微分萃取、逆流萃取、微分结晶等，能够将类胡萝卜素的混合物彼此分离。色谱技术可包括HPLC技术、例如正常或反相HPLC。

此外，为了个别类胡萝卜素的优先生产，或类胡萝卜素提高的含量，可通过控制培养基组成，培养条件等优先地生产所要求的类胡萝卜素。

例如，生产的类胡萝卜素的比率能够通过改变需氧条件而改变。例如，生产的类胡萝卜素的比率能够通过培养基的量和/或快速(flash)振动培养中振动速度而改变，和/或通过改变充气/搅拌培养中的空气供给速度或搅拌速度而改变。

或者，或另外，为了一种具体的类胡萝卜素优先的和/或提高的生产，能通过突变，如对例如本文所描述的AQP096的人工突变，来改善Algibacter细菌种，从而突变的Algibacter菌株优先地生产和/或生产出与其他类胡萝卜素相比提高了水平的所要求的类胡萝卜素。这种突变处理包括，例如，物理方法，如X-射线照射、UV照射等；化学方法，如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)的使用；以及生物方法，如本领域已知的基因重组技术或噬菌体暴露技术。利用这种改进了的突变进行类胡萝卜素生产的方法包含于本发明生产类胡萝卜素的方法中。

在进一步的方面，本发明还提供一种属于Algibacter sp属的海洋细菌，该细菌生产类胡萝卜素，如玉米黄质、番茄红素、3′-羟基海胆酮、β，β-胡萝卜素、β-隐黄素、八氢番茄红素和/或六氢番茄红素。如果要求，将所述细菌从其他细菌种中分离出，并保持为纯化的形式。有利地，玉米黄质是例如Algibacter AQP09菌株(登记号为NCIMB 41268，根据布达佩斯条约要求于2005年4月12日保藏于NCIMB，或AQP096 MU 016，根据布达佩斯条约要求于2006年4月6日保藏于NCIMB，登记号为NCIMB41383)生产的主要类胡萝卜素(例如，40％，50％，60％，70％，75％，85％，90％，98％)，其优势是它的纯化和制造。便利地，体外培养所述细菌，从而允许对所要求化合物的容易的收获。

可以以多种方法使用从细胞中分离出的海洋细菌生产的提取的玉米黄质、番茄红素和完整细胞产物，其中完整细胞产物含有混合的类胡萝卜素，即玉米黄质，番茄红素，隐黄素，3′-羟基海胆酮，β，β-胡萝卜素，八氢番茄红素和/或六氢番茄红素。可将以分离的形式或以含有混合类胡萝卜素的混合色素产物存在的玉米黄质或番茄红素加入到，例如，动物饲料中，在该饲料中，着色对于蛋黄和烤鸡皮的上色，作为抗氧化剂用于帮助保护人眼睛免受UV损伤和与衰老有关的黄斑退化(ADM)的卫生保健(药理学的)，和作为对环境友好的或比目前合成的和天然衍生物更具生物可用性的形式十分必要。分离形式的玉米黄质或作为含有玉米黄质、番茄红素、β，β-胡萝卜素、β-隐黄素、3′-羟基海胆酮、八氢番茄红素和/或六氢番茄红素的混合类胡萝卜素产物存在的玉米黄质，可从适合的海洋细菌中提取，特别是从Algibacter菌株，如Algibacter AQP096或AQP096 MU016，还可作为油基质来配制，如掺入涂层中的Ω3和Ω6脂肪酸的来源，如纤维素/凝胶胶囊。该包封产品能作为抗氧化剂用于食品添加剂工业中(功能食品)。

无色化合物/前类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素能用于皮肤护理中的化妆品工业，其中其无色特性十分理想。除了作为抗氧化剂，八氢番茄红素和六氢番茄红素具有对抗羟基自由基的能力，其中羟基自由基是自然界中最强大的原子团，比自由基更强。还指出它们具有消炎作用，从而保护皮肤以防炎症和UV照射，且能够通过防止LDL氧化来帮助保护心血脏血管系统。它们还能用于化妆品，饮食添加剂或需要附加的健康益处和颜色是被考虑问题的食品中。这些产物还能够用于延长食品的贮藏寿命。

除了它们自身的健康性质，还发现八氢番茄红素(Phytoen)和六氢番茄红素(Phytofluen)与其它成分，如CoQ10和着色的类胡萝卜素共同作用以提高它们的活性，稳定分子和防止退化。

如前所述的由海洋细菌Algibacter sp，如Algibacter sp nov AQP096或AQP096 MU 016生产的玉米黄质和混合类胡萝卜素色素可选择地作为对环境友好的替代物用于多种工业和消费者市场，包括油漆和涂料、塑料、旋转干燥的纤维、建筑材料、纸张、陶瓷、光电子设备、弹性体、墨水、纺织品、玻璃、包括糖果的食品、药物和化妆品。

或者，玉米黄质和混合类胡萝卜素产物还可用于在动物和人中促进药理学或生理学的作用，或作为抗氧化剂用于治疗和预防疾病，如与衰老有关的黄斑退化(AMD)和某些癌症。

本发明还允许分离编码负责生产本发明红色着色化合物的酶的基因，其中该化合物是由如本文所描述的Algibacter sp.菌株AQP096或AQP096 MU016所生产的。图1显示一个所设想的从Algibacter AQP096生产玉米黄质的途径。该途径可以与其它Algibacter种中的相似或相同。可利用本领域已知的一般分子生物学技术(参见，例如Sambrook J et al.2000.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Third Edition)Cold SpringHarbor Laboratory Press)容易地识别和分离类胡萝卜素生产所必需的基因。例如，可利用来自上述Algibacter AQP096基因组杂交研究识别基因。已经识别了许多类胡萝卜素生物合成基因/蛋白质，参加例如US60/434,618和US 60/435,612，且这些已知序列能够用于从Algibacter，特别是Algibacter AQP096或AQP096 MU016克隆相应的基因。典型地，针对先前已知类胡萝卜素序列设计的片断或寡核苷酸能够用于本领域技术人员所熟知的杂交或PCR反应中，从而识别和据此克隆相应的Algibacter基因/蛋白质。

现将通过参考下图对本发明进行进一步的描述，这些图显示：

图1显示所设想的从AQP096生产玉米黄质的遗传途径。

图2a是由AQP096生产的混合粗制类胡萝卜素的HPLC色谱图(450nm)(Thermoelectron)，该图显示了对玉米黄质的生产的优先选择；和

图2b是混合类胡萝卜素标准物的HPLC色谱图(450nm)。

图3显示利用受控制的氮和碳的原料比率，以及类胡萝卜素生物合成调节剂、咪唑和酪蛋白氨基酸的添加，进行的玉米黄质向番茄红素转化的HPLC色谱图(450nm)。

图4a和4b是AQP096中甲基萘醌诱导的类胡萝卜素表达的HPLC色谱图(450nm)。

图5是AQP096生产的八氢番茄红素和六氢番茄红素的HPLC色谱图(290nm)。

发明详述

实施例1

Algibacter sp.nov菌株AQP096 NCIMB 41268的分离

为定位细菌，在多个浅滩水域收集海水样品。将100μl的海水涂布于Difco海洋琼脂2216E上。在实验室环境条件下(约21℃)培养该琼脂培养板7天。

将呈现黄色、红色和橙色阴影的菌落进行继代培养和纯化，从而导致特殊菌株的分离。挑选了这些呈现黄-橙色阴影的菌株中的一种(命名为AQP096)，且保藏于NCIMB，登记号为NCIMB 41268。

菌株AQP096在琼脂培养基上展现了强黄-橙色素，且培养在海洋液体培养基中时生产黄-橙色素。该微生物是革兰氏阴性杆菌。从Algibacter sp.AQP096中提取的黄/橙色素与所报道的以玉米黄质作为其主要色素(98％)产生相似的吸收光谱和色谱保留时间。

在利用反相Gemini C-18 250×4.6mm柱的HPLC上，从10％v/v水中的丙酮∶100％丙酮(30∶70)到10％v/v水中的丙酮∶100％丙酮(5∶95)的范围内，以线性梯度洗脱10μl的色素样品10分钟，随后跟随着10％v/v水中的丙酮∶100％丙酮(5∶95)流过6分钟，之后以1分钟线性梯度和10％v/v水中的丙酮∶100％丙酮(30∶70)以1.3ml/min的流速流过2分钟恢复到起始条件10％v/v水中的丙酮∶100％丙酮(30∶70)。检测是在450nm处进行的。

将来自AQP096的混合粗制类胡萝卜素与混合类胡萝卜素标准物在HPLC上进行了比较(参见图1a和1b)，且显示出与这些标准物的相似性。

秘密地将该菌株提交给一个独立实验室进行16S rRNA分子分析和分类学整理。该实验室断定该培养物不相似于前述生产玉米黄质的微生物。将该培养菌株表征为Algibacter sp。这是利用该属进行玉米黄质生产的首次报道。

实施例2

Algibacter sp.nov的培养和玉米黄质生产的量化

液体培养基在每升中含有以下组成

组成	g/l
		酵母提取物	45
葡萄糖	33
		磷酸盐&硫酸盐	2.5
脂源	100μL/ml
		类胡萝卜素生物合成调节剂	20mMOL
海水	其余

利用1M的氢氧化钠(NaOH)溶液调节该营养培养基为pH7.5。接种培养的生长条件是25℃，pH7.5，在持续通气下进行2天。通气是通过利用25ml Erlenmeyer摇瓶培养在200rpm摇动实现的。

为了从Algibacter sp提取色素，将细胞沉淀冷冻干燥，再在微型离心管中重新悬浮于100μl溶菌酶细胞溶解缓冲液(50mmol/l Tris，200mmol/lNaCl和0.2g/l溶菌酶，利用1M的HCl调节其pH值为7.5)中，且在暗处放置45分钟。

配制了含有0.05％w/v BHT的四氢呋喃溶液，且将500μl该溶液加入到所述重新悬浮的生物量中。将该混合物置于暗处45分钟，以将任意类胡萝卜素提取到溶剂相中。

然后对该样品进行离心(在11000rpm进行3分钟)以分离溶剂相、水相和细胞碎片。去除并通过0.22μm PVDF滤纸过滤溶剂相。获得的过滤液备用通过HPLC进行的分析和分光光度计分析。

溶液中的类胡萝卜素服从Beer-Lambert规律，即其吸收与其浓度成正比。根据Delia et al的“Harvest-Plus handbook for Carotenoid Analysis”，能利用下面的公式估算总类胡萝卜素的含量：

总类胡萝卜素含量(μg/g)：

其中A＝吸光度

体积＝提取物总体积

ε＝玉米黄质的吸收系数

利用一种UV-VIS光谱仪(Cecil 3000系列，扫描分光光度计)测量来自菌株AQP096的类胡萝卜素在波长为450nm下的吸光度(利用THF+BHT样品作为空白对照)。

表1：来自AQP096的样品的总类胡萝卜素含量

样品	光密度	稀释度	浓度(mg/g)
				1	0.855	1/6	3.288
2	0.698	1/8	3.579
				3	0.356	1/16	3.651

需要将表1中的结果针对在类胡萝卜素粗提取物中产生的玉米黄质的纯度进行调节，所述纯度约占总类胡萝卜素含量的98％。

表2：玉米黄质的浓度，经调节用于反映由该菌株生产玉米黄质的纯度水平98％。

样品	总类胡萝卜素浓度(mg/g)	玉米黄质的估值(mg/g)
			1	3.288	3.13
2	3.579	3.40
			3	3.651	3.47

从这些结果，由Algibacter sp.AQP096的野生类型菌株生产的玉米黄质的浓度是3.47mg/g干生物量。

实施例3

培养条件的最优化

下列实验确定Algibacter sp.发酵的微生物中生物量最优化生产的最佳培养条件组合。配制、高压灭菌、冷却如表3所描述的培养基，并将Algibacter的菌株接种于其中。维持所有的pH值为7.5，且通过在4,500rpm离心20分钟，轻轻倒出液体并冷冻干燥细胞沉淀来计算细胞产量。

表3：

在Algibacter sp.AQP096生物量最优化中使用的培养基g/L组成的比较

培养基	a(g/L)	b(G/L)	c(G/L)	d(G/L)	e(G/L)	f(G/L)
							葡萄糖		1	1		33	1
蛋白胨	5
							酵母提取物	1	5	5		45	15
TSB				30
							植物油						100μL/ml
咪唑						20mMol
							Mendadione						100μg/ml
脂肪酶						0.05ml/l
							磷酸盐			2.5		2.5	2.5
醋酸钠						0.1ml/L
							天然海水	1L	1L	1L	1L	1L	1L

结果显示于表4：

表4：Algibacter sp.AQP096野生型和突变菌株在5L发酵的生物量最优化数据总结

培养基代号	生产的类胡萝卜素	类胡萝卜素的纯度	mg/g干重类胡萝卜素	cdw生物量g/L	制作的最大规模(l)	发酵时间(Hr)
							A低营养	玉米黄质	98％	3.47mg/g	1.5	5	48小时
B高营养	玉米黄质	95	1mg/g	6	5	48小时
							C高营养分批给料	玉米黄质	95	3.47mg/g	8	5	48小时
DTSB	番茄红素	95	3.47mg/g	12	5	48小时
							E超高营养	玉米黄质	95	3.47mg/g	12	5	48小时
F利用突变菌株的超高营养	番茄红素	95	10.41mg/g	12	5	48小时

利用海洋细菌Algibacter菌株NCIMB AQP096的初始实验生产产量为3.47mg/g干生物量的，具有总玉米黄质每升滴定度为5.61mg/L的玉米黄质(参见表4)。

早期培养基最优化研究已显示了利用培养基F，细胞干重(cdw)从1.05g/l到12g/l增强的生物量。AQP096的一种过量生产玉米黄质的菌株的分离已经改善了玉米黄质产物的滴定度，当用培养基F培养时，该滴定度超过125mg/L(参见表4)。

实施例4：

经典的菌株诱变用于分离过量生产玉米黄质的AQP096的突变体

该实验的目的是通过在导致高度着色菌株(过量生产玉米黄质的，从而其水平高于野生型菌株中相应水平的菌株)的AQP096中发生UV诱导的突变来增强每单位生物量的玉米黄质产量。

将AQP096过夜接种体培养物在新鲜海洋液体培养基中稀释100倍且生长为细胞密度为每ml含大约2×109到5×109个细胞。用无菌海水清洗这些细胞(通过离心)，然后再以每ml约2×109个细胞的浓度重新悬浮于无菌海水中。将10-5稀释度的0.1ml的等分试样一式两份地涂布于固体培养基上，以提供未经照射的对照。

将细胞悬浮液6ml的等分试样转移到20个无菌Petri培养皿中。所有细胞培养物的照射都是利用层流生物安全箱进行的。打开该生物安全箱的UV功能(UV管发射在254nm)，以下列时间来照射细胞悬浮液：15秒、30秒、60秒、90秒、2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、12分钟、15分钟、18分钟、20分钟、22分钟、25分钟、28分钟、30分钟、45分钟、60分钟和90分钟。

照射后，用无菌海水将1ml的照射细胞等分试样逐次稀释为10-5。将0.1ml的稀释液等分试样一式两份地涂布于两个海洋琼脂上。此外，将1.0ml的(未稀释的)照射细胞等分试样稀释于体积为20ml新鲜海洋液体培养基中，并过夜培养。然后将该培养物逐次稀释到10-5，并将0.1ml该稀释液的等分试样一式两份地涂布于两个海洋琼脂培养基上。

在对任何强着色菌落进行检测前，将所有的培养皿倒置并在室温下培养5天。

挑取出现了强着色橙色/黄色(或甚至在颜色上与未照射对照稍有不同的)菌落，并将其与对照并排地划线接种在新鲜的海洋琼脂培养皿上。然后利用标准HPLC分析进行类胡萝卜素分析，并根据上述公式测量玉米黄质的浓度。

经典的菌株诱变生产2种AQP096突变体，这2种突变体显现出改善的或不同的类胡萝卜素分布。将这些数据总结在表5中。

表5：为分离过量生产玉米黄质的突变体，由利用UV照射进行的AQP0096经典诱变分离而来的AQP096突变菌株。

菌株ID	生产的主要类胡萝卜素	占总类胡萝卜素的％	mg/g干重	制作的最大规模(l)	发酵时间(Hr)
						AQP096野生型	玉米黄质	98％	3.47mg/g	5	48小时
AQP096-16	玉米黄质	98％	11.41mg/g	5	48小时

已将突变菌株AQP096-16根据布达佩斯条约进行保藏(登记号NCIMB41383)。

实施例5

利用类胡萝卜素生物合成控制调节剂和在发酵中改变碳与氮的比例，从菌株AQP096进行番茄红素的生产

当在胰蛋白胨大豆液体培养基(TSB)中培养时，观察到AQP096培养物产生粉红色着色，而不是当利用标准海洋液体培养基培养时更为普遍的黄橙颜色。利用HPLC进行的色素分析(参见图3a和3b)显示当在TSB中培养时，由AQP096生产的主要类胡萝卜素是番茄红素。

进一步的研究表明能通过对培养基中碳和氮比例小心的调节来控制AQP096中番茄红素的生产。能够通过添加类胡萝卜素生物合成调节剂，咪唑(5mM)和酪蛋白氨基酸(12.5g.l)，对该番茄红素的控制机制进行进一步的调节。

表6：利用蛋白胨作为碳源来阻断番茄红素向玉米黄质转化来进行的对番茄红素生产的调节

碳源	1g/l的蛋白胨	1g/l的蛋白胨	1g/l的蛋白胨	1g/l的蛋白胨	1g/l的蛋白胨
						氮源	2g/l的酵母提取物	5g/l的酵母提取物	10g/l的酵母提取物	15g/l的酵母提取物	30g/l的酵母提取物
玉米黄质占总类胡萝卜素的％	98	98	90	70	40
						番茄红素占总类胡萝卜素的％	2	2	10	30	60

表7：利用葡萄糖作为碳源来阻断番茄红素向玉米黄质转化进行的对番茄红素生产的调节

碳源	1g/l的葡萄糖	1g/l的葡萄糖	1g/l的葡萄糖	1g/l的葡萄糖	1g/l的葡萄糖
						氮源	2g/l的酵母提取物	5g/l的酵母提取物	10g/l的酵母提取物	15g/l的酵母提取物	30g/l的酵母提取物
玉米黄质占总类胡萝卜素的％	98	80	50	45	10
						番茄红素占总类胡萝卜素的％	2	20	50	55	90

实施例6

利用甲基萘醌进行的对类胡萝卜素生物合成途径的诱导

将浓度为0.100mg/ml的甲基萘醌加入到经过24小时在海洋液体培养基中培养的AQP096培养物中。将该培养物在220rpm的轨道摇动器上摇动了24小时后，进一步培养4天。

5天培养后，将培养物进行离心(4,500rpm，20min)，并利用HPLC分析色素的类胡萝卜素含量(参见图4a和4b)。结果显示甲基萘醌诱导所有与菌株AQP096中标准类胡萝卜素生物合成途径有关类胡萝卜素的生产。

在标准的生长条件下，菌株AQP096生产98％的纯玉米黄质。甲基萘醌的使用将由AQP096生产的玉米黄质的量降低为约60％。然而，甲基萘醌诱导生产大约10％的β胡萝卜素，6％的番茄红素，8％的β-隐黄素，12％的角黄素，12％的虾青素和2％的其他类胡萝卜素，如adonirubin和3-羟基海胆酮。

实施例7

由AQP096培养物进行的八氢番茄红素和六氢番茄红素的生产

通常是从去饱和抑制剂存在下生长的植物和微生物中分离，本发明人实现了获得生产八氢番茄红素作为其主要类胡萝卜素的无色突变体(突变体026)。

对AQP096着色的野生型和无色突变菌株的八氢番茄红素进行的HPLC分析显示了总浓度为2mg/g的无色类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素的存在。八氢番茄红素是许多生物体内类胡萝卜素生物合成的前体(参见图5)。

八氢番茄红素和六氢番茄红素是通过利用一种溶剂系统的HPLC测量的，  该溶剂系统为：80％的乙腈，10％的甲醇和10％的水，运行时间为20分钟，恒溶剂，在波长为285nm和流速为1ml/min下进行测量。

Claims (29)

1.一种生产至少一种前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素化合物的方法，该方法包括如下步骤：

a)在适合的培养基中，在适合于生产所述前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素着色化合物的条件和时期内，培养来自Algibacter sp.属的细菌；和

b)从所述细菌中回收所述前类胡萝卜素和/或类胡萝卜素化合物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述化合物是黄/橙色着色或无色的类胡萝卜素。

3.权利要求1或2的方法，其中所述培养基包含用于类胡萝卜素生物合成调节的甲基萘醌、酪蛋白氨基酸和或咪唑。

4.根据权利要求的方法，其中所述Algibacter sp.是海洋种。

5.根据以上权利要求中任意一项的方法，其中所述Algibacter种生产比例高于任何其他类胡萝卜素或前类胡萝卜素的玉米黄质。

6.根据以上权利要求中任意一项的方法，其中所述Algibacter种保藏于NCIMB且通过登记号NCIMB41268识别，或是其具有生产黄色着色化合物和/或玉米黄质的性质的突变体(如NCIMB 41383)或变异体。

7.a.根据以上权利要求中任意一项的方法，其中所述黄色着色化合物包括：玉米黄质，番茄红素，3′-羟基海胆酮，β-隐黄质，和β-胡萝卜素。

7b.根据以上权利要求中任意一项的方法，其中所述无色化合物包括八氢番茄红素和六氢番茄红素。

8.一种优先生产具体的类胡萝卜素和/或增强其生产的方法，该方法包括如下步骤：

a)在适合的培养基中，在适合于生产所述类胡萝卜素的条件和时期内，培养来自Algibacter sp.属的细菌；

b)确定生产的所述类胡萝卜素的水平和/或所述类胡萝卜素与生产的其他类胡萝卜素相比的水平；和

c)在与上述a)中所采用的不相同的条件下培养所述细菌，并检测所述不同的条件是否导致对所述类胡萝卜素的优先和/或增强的生产。

9.根据权利要求7的方法，其中根据需要重复步骤c)以便确定所述类胡萝卜素优先和/或增强水平的生产的适合的培养条件。

10.根据权利要求8或9任意一项的方法，其中通过控制所述培养基中碳和氮的比例来改变所述条件。

11.根据权利要求8-10的方法，其中所述类胡萝卜素是玉米黄质。

12.根据权利要求8-11中任意一项的方法，其中所述Algibacter种保藏于NCIMB且通过登记号NCIMB 41268识别，或是其具有生产黄色着色化合物和/或玉米黄质的性质的突变体(如NCIMB 41383)或变异体。

13.一种优先生产具体的类胡萝卜素和/或增强其生产的方法，该方法包括如下步骤：

a)在适合的培养基中，在适合于生产所述类胡萝卜素的条件和时期内，培养来自Algibacter sp.属的细菌；

b)确定生产的所述类胡萝卜素的水平和/或所述类胡萝卜素与生产的其他类胡萝卜素相比的水平；和

c)对所述细菌进行诱变，并在与a)中所采用的相同的条件下培养所述突变的细菌；和

d)确定所述生产的类胡萝卜素的水平，从而确定所述诱变是否导致所述类胡萝卜素优先和/或增强的生产。

14.根据权利要求13的方法，其中根据需要重复步骤c)以便确定所述类胡萝卜素优先和/或增强水平的生产适合的培养条件。

15.a.根据权利要求13或14的方法，其中类胡萝卜素是玉米黄质。

15b.根据权利要求13或14的方法，其中类胡萝卜素是番茄红素。

15c.根据权利要求13或14的方法，其中前类胡萝卜素是八氢番茄红素和六氢番茄红素。

16.根据权利要求13-15中任意一项的方法，其中所述Algibacter sp.保藏于NCIMB且通过登记号NCIMB 41268识别，或是其具有生产无色化合物八氢番茄红素、六氢番茄红素和或黄色着色化合物和/或玉米黄质和或番茄红素的性质的突变体(如NCIMB 41383)或变异体。

17.一种属于Algibacter sp nov属的海洋细菌，所述细菌生产类胡萝卜素或前类胡萝卜素，如玉米黄质，番茄红素，3′-羟基海胆酮，β-隐黄质，β-胡萝卜素，八氢番茄红素和六氢番茄红素。

18.保藏于NCIMB、且通过登记号NCIMB 41268识别的细菌，或该细菌的具有生产无色化合物八氢番茄红素、六氢番茄红素和或黄色着色化合物和/或玉米黄质和或番茄红素的性质的突变体(如NCIMB 41383)或变异体。

19.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述黄色着色化合物、至少一种类胡萝卜素、或玉米黄质在制备动物饲料中的用途，其中所述制备可作为含有混和的类胡萝卜素和由所述海洋细菌提供的蛋白质源的完整细胞产物来配制。

20.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述黄色着色化合物、至少一种类胡萝卜素、或玉米黄质在制备油漆、涂料、塑料、旋转干燥的纤维、建筑材料、纸张、陶瓷、光电子设备、弹性体、墨水、纺织品、玻璃、食品和药物，例如作为食品添加着色剂和化妆品中的用途。

21.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述黄色着色化合物、至少一种类胡萝卜素、或玉米黄质在制备用于治疗和/或预防疾病或不良环境影响的抗氧化剂中的用途。

22.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述黄色着色化合物、至少一种类胡萝卜素、或玉米黄质在制备用于帮助人晒成褐色的化妆品添加剂中的用途。

23.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述无色化合物/前类胡萝卜素、至少一种类胡萝卜素、或八氢番茄红素/六氢番茄红素在制备用于帮助人类抗衰老的化妆品添加剂中的用途。

24.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述无色化合物/前类胡萝卜素、至少一种类胡萝卜素、或八氢番茄红素/六氢番茄红素在制备用于治疗和/或预防疾病或不良环境影响的抗氧化剂中的用途。

25.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述无色化合物/前类胡萝卜素、至少一种类胡萝卜素、或八氢番茄红素/六氢番茄红素在制备油漆、涂料、塑料、旋转干燥的纤维、建筑材料、纸张、陶瓷、光电子设备、弹性体、墨水、纺织品、玻璃、食品和药物，例如作为食品添加着色剂和化妆品中的用途。

26.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的所述无色化合物/前类胡萝卜素、至少一种类胡萝卜素、或八氢番茄红素/六氢番茄红素在制备动物饲料中的用途，其中所述制备可通过含有混和的类胡萝卜素和由所述海洋细菌提供的蛋白质源的完整细胞产物来配制。

27.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的黄色着色化合物、至少一种类胡萝卜素、或玉米黄质的纯来源的制备，其具有微量的根据权利要求19-26的番茄红素、β-隐黄质、β-胡萝卜素和无色前类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素的附加的健康益处。

28.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的黄色着色化合物、至少一种类胡萝卜素、或番茄红素的纯来源的制备，其具有微量的根据权利要求19-26的番茄红素、β-隐黄质、β-胡萝卜素和无色前类胡萝卜素八氢番茄红素和六氢番茄红素的附加的健康益处。

29.通过根据权利要求1-16中任意一项的方法或根据权利要求17或18的所述细菌生产的无色化合物、至少一种类胡萝卜素、或八氢番茄红素的纯来源的制备，其具有微量的根据权利要求19-26的六氢番茄红素的附加的健康益处。

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