KR20050046868A

KR20050046868A - 신규한 지아잔틴 생성 세균 플라보코커스 제주엔시스 및이를 사용한 지아잔틴 생산 방법

Info

Publication number: KR20050046868A
Application number: KR1020030080475A
Authority: KR
Inventors: 최의성; 손정훈; 배정훈; 성혜영; 오덕철; 이동헌
Original assignee: 한국생명공학연구원; 제주도
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2003-11-14
Publication date: 2005-05-19
Also published as: KR100706175B1

Abstract

본 발명은 제주 연안 해수로부터 분리된 신규한 지아잔틴 (zeaxanthin) 생성 세균 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis) 균주 및 이를 사용한 지아잔틴 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 지아잔틴 생성 세균 플라보코커스 제주엔시스 및 이를 사용한 지아잔틴 생산 방법 {New bacterium Flavococcus chejuensis producing zeaxanthin and production method of zeaxanthin using thereof}

본 발명은 제주 연안 해수로부터 분리된 신규한 지아잔틴 (zeaxanthin) 생합성 세균 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis) 균주 및 이를 사용한 지아잔틴 생산 방법에 관한 것이다.

지아잔틴은 8개의 C₅ 이소프렌 단위체(isoprene unit)가 연속적인 축합을 통하여 만들어진 C₄₀ 메틸-측쇄화(methyl-branched) 탄화수소 구조이고 분자량 568.88을 갖는 하기 화학식 1의 화합물이다. 지아잔틴은 자연계에 다양하게 분포하며 금잔화 꽃잎, 시금치, 옥수수 및 케일 등의 다양한 식물뿐만 아니라 광합성 세균, 시아노박테리아(cyanobacteria), 비광합성 세균 등의 박테리아와 조류 등에서도 생성되고 있다.

지아잔틴은 노란색을 띄는 잔토필 카로테노이드(xanthophyll carotenoid) 계열의 화합물로서, 베타 카로틴 외에 가장 많이 알려진 카로테노이드 화합물 중의 하나이다. 식물에서 생합성되는 카로테노이드는 엽록체 및 색소체 막에 내재되어 있는 주황색 및 붉은색 지용성 색소이다. 지아잔틴의 생합성에 대해서 아직 많이 알려져 있지는 않으나, 최근에는 식물내 카로테노이드 생합성 경로에 관여하는 효소들이 밝혀져 지아잔틴의 생합성에 대한 정보를 제공하고 있다.

식물의 경우 지아잔틴의 생합성은 다음과 같은 경로를 통해서 이루어진다[미국 특허 제6,627,795호 참조]. 식물에서 카로테노이드 생합성의 첫 번째 과정은 피토엔 신타제(phytoene synthase)에 의해 수행된다. 피토엔 신타제는 제라닐제라닐 디포스페이트(geranylgeranyl diphosphate)를 피토엔으로 전환시킨다. 이렇게 합성된 피토엔은 피토엔의 불포화 과정에 관여하는 카로테노이드 생합성의 두 번째 효소(phytoene desaturase)에 의해서 피토풀루엔으로 전환되고 추가의 불포화 과정을 거친 후, 제타-카로틴(zeta-carotene)이 생성된다. 이후, 제타-카로틴은 제타-카로틴을 불포화시키는 효소(zeta-carotene desaturase)에 의해 뉴로스포렌(neurosporene)으로 전환되고 이는 다시 추가로 불포화되어 리코펜(lycopene)을 형성하게 된다. 이러한 리코펜은 알파-카로틴이나 베타-카로틴으로 전환될 수 있으며, 이중 베타-카로틴은 베타-카로틴 데하이드록실라제(beta-carotene dehydroxylase)에 의해 지아잔틴(zeaxanthin)으로 생합성되게 된다.

지아잔틴은 항산화제 및 착색제로서 알려져 있으며, 항산화 기능과 관련하여 일부 항암 효능도 갖는 것으로 알려지고 있다. 지아잔틴은 프리라디칼(free-radical) 제거제, 즉 생체내 항산화 기능과 관련하여 저산소압 조건하에서 생체 조직내에서 자유단 산소 제거 능력이 상당히 강하다는 것이 확인되었다.

인체는 생명 현상을 유지하기 위해서 지속적인 산소공급을 필요로 하는데 정상적인 대사과정 중에 유해하면서 반응력이 큰 활성산소 화합물(ROS: Reactive Oxygen Species)이 생성된다. 이들 산소 화합물은 크게 자유기(free radical)와 비자유기(non-radical)로 나뉘는데 모두 불안정한 분자 구조로 인해서 세포의 손상을 초래할 수 있다. 이러한 산소화합물의 생성은 흡연, 자외선, 오존 등이 원인이 되어 가속화되기도 한다. 따라서, 생체 내에는 산소화합물에 의한 산화적 스트레스로부터 조직을 보호하기 위한 항산화 비타민, 무기질, 효소 등의 항산화 체계가 조직적으로 구성되어 있다. 이때 지아잔틴은 여러 상호작용을 통해서 항산화 기능을 상승시키며 산화로 인해 항산화 물질들이 파괴되는 것을 억제해 준다. 그리고 이 자유기(free-radical)에 의한 생체 손상에 대한 생체 방어로서 생체내 항산화 기능과 관련성이 있는 악성 종양의 위험을 경감시킨다는 보고도 있으며, 배양 암세포에 대한 변이원(mutagen) 억제 효과, 동물을 이용한 암 이식, 암 유발 시험에서 암 억제 효과가 있다는 유용한 결과가 보고되고 있다.

또한, 지아잔틴은 사람의 신체 중에는 망막에 주로 분포하며 시력저하의 원인이 될 수 있는 백내장, 황반변성 등 노화로 의한 퇴행성 안 질환에 대해서도 예방 및 지연 효과가 있으며 심장이나 피부 등에도 분포하는 것으로 알려져 있다[Moeller et al., J. Am. coll. Natr. 5: 522, (2000)].

또한, 지아잔틴은 사료첨가제로 사용되고 있고 화장품 및 식품 산업에서 착색제로도 쓰이는 등 다양한 용도를 가지고 있다. 지아잔틴은 육지방, 피부 및 난황을 암황색으로 착색시키기 위한 동물 사료용 착색제로 각광받고 있는 밝은 주황색 내지 노란색의 생성물이다. 가축 사료내 지아잔틴 및 이의 이성체인 잔토필이 부족해지는 겨울철에는, 가축 난황, 유지방 및 가금류 지방의 색상은 탈색 현상(bleaching)이 일어나는데, 이는 지아잔틴 및 잔토필 색소가 가축 사료내에 부족하기 때문이다. 이러한 색소 부족분은 가축 사료에 지아잔틴 및 잔토필 색소를 첨가해 줌으로써 해소될 수 있다.

지아잔틴은 착색 능력 및 침착 능력이 우수하고, 합성 색소들이 갖는 독성 보다 덜 유해한 천연 색소이다. 또한, 지아잔틴은 다른 카로테노이드 색소에 비해서도 착색 능력 및 침착 능력이 더 우수한 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 칸타잔틴(canthaxanthin), 알팔파(alfalfa) 및 카옌 고추(cayenne pepper) 같은 카로테노이드 또는 카로테노이드 함유 화합물들은 고농도로 사용시 육류 등에 비정상적인 붉은색이나 자주색을 착색시키거나 난황 등에 줄무늬를 야기하는 단점을 갖고 있는 반면, 루테인은 고농도로 사용시 육류 및 난황에 녹색을 띄게 하는 단점을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

이와는 다르게, 지아잔틴은 고농도에서도 육류 등에 고르게 황적색을 착색시키고 잘 침작되는 것으로 알려져 있어, 가축 사료, 식품 및 음료, 및 화장품 착색제로서 유용한 천연 색소이다.

지아잔틴을 산업상 이용하기 위해서 식물로부터 이를 추출하는 방법은 그 수율이 낮고, 생산 단가가 높으며, 계절의 영향을 받는 식물 생육을 고려하는 경우 지속적인 공급이 어렵다는 단점을 갖고 있다. 따라서, 지아잔틴을 생합하는 미생물을 분리해 내는 것은 지아잔틴을 대량으로 계속해서 공급하는데 매우 유용할 것이다.

지아잔틴을 생합성하는 미생물은 1960년대 중반, 호프만 라 로시사(Hoffmann-La Roche)가 해양에서 분리하였다(미국특허 제 3,891,504호). 이중 R-1512라고 명명되어진 하나의 미생물은 ATCC 기관에 기탁(수탁번호 ATCC 21588)되었으며, 지아잔틴을 생성하는 미생물로 플라보박테리움(Flavobacterium) 속 아래로 분류되었다. 그 후 추가적인 스크리닝 결과로 보다 높은 농도로 지아잔틴을 생산하는 균종으로 R1534와 R114 를 포함한 몇몇 종류의 균종이 확인되었다(Britton et al., Arch Microbiol. 113: 33 (1977); Goodwin, T. W. Biochem Soc Symp. 35: 233 (1972); McDermott et al., Biochem J. 144: 231 (1974); Mohanty et al., Helv Chim Acta. 83: 2036 (2000)). 그러나, 베타-카로틴(??-carotene)이나 아스타잔틴(astaxanthin) 등의 카로테노이드와는 달리 지아잔틴(zeaxanthin)을 주된 카로테노이드로 생산하는 균주는 현재에도 매우 드문 것으로 알려지고 있다(Johnson and Schroeder, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 53: 119 (1996)).

따라서, 주요 카테로노이드로서 지아잔틴을 생산하는 균주의 개발은 항산화제, 노인성 안 질환 치료제, 착색제 및 사료첨가제 등으로 유용한 용도를 갖는 천연 색소를 안정적으로 대량 공급할 수 있다는 측면에서 산업상 매우 유용할 것이다. 이에, 본 발명자들은 지아잔틴을 생합성하는 균주를 스크리닝하고자 노력하였다.

본 발명자들은 지아잔틴을 생합성하는 균주를 분리해 내기 위해서 지속적으로 노력한 결과, 제주 연안 해수로부터 지아잔틴을 생산하는 신규한 균주를 동정할 수 있었으며, 이로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 한 가지 양태에 있어서, 본 발명의 목적은 지아잔틴(zeaxanthin)을 생합성하는 신규 세균 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis) 균주를 제공하는 것이다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 목적은 지아잔틴을 생합성하는 신규 세균 플라보코커스 제주엔시스 균주를 사용하여 지아잔틴을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 주요 카로테노이드로서 지아잔틴(zeaxanthin)을 생합성하는 신규 균주 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis), 및 이를 사용한 지아잔틴의 생산 방법에 관한 것이다.

해수에 존재하는 세균들은 약 3% 정도의 염 농도를 갖는 해수에서 서식하기 때문에 호염성 또한 내염성 세균이 많고 서식 장소 및 환경 조건에 따라 형성된 세균상이나 세균수가 다양한 것으로 알려져 있다. 해수 세균으로는 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 아크로모박터(Achromobacter), 에어로모나스(Aeromonas), 포토박테리움(Photobacterium) 등이 대표적이나, 토양이나 민물 유래의 바실러스(Bacillus), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium) 등도 일부 검출되는 것으로 알려져 있다. 해수 세균의 세균 수는 육지에서 멀어질수록 감소되어 외양(外洋)에서는 그 수가 급격히 줄어들게 된다. 외양에서는 수심 4 내지 50m 정도에서 세균수가 가장 많으며, 비브리오, 슈도모나스, 플라보박테리움(Flavobacterium) 등이 주로 존재하는 것으로 알려져 있다.

그람 음성, 호기성 간균 또는 구균에는 슈도모나스 속, 할로박테리움(Halobacterium) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 브루셀라(Brucella) 속, 플라보박테리움 속 등이 알려져 있으며, 이중에 플라보박테리움 속은 황색 내지 적색의 색소를 생산하여 육류 표면에 착색되는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 지아잔틴 생합성 세균을 동정하기 위해서 제주도 연한 해수를 채취하여 스크리닝한 결과, 노란색의 콜로니를 형성하는 균주를 발견하여 D2로 명명하였다.

이후, 본 발명자들은 이러한 D2 균주에 대해 지아잔틴 생성능이 공지된 균주와의 비교와 함께 TLC, HPLC 실험을 통해, 지아잔틴 생성능을 확인하였으며, 형태적 특성을 조사한 결과 구균이며 그람 음성 세균임을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 D2 균주의 생리적 특성 및 탄소원 이용성을 분석하여 표 1에서 나타낸 바와 같은 결과를 얻었으며, 16S rRNA 염기 서열을 PHYDIT 프로그램(molecular sequence editor for phylogeny by Jongsik Chun)을 통해 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과(Saitou N. and Nei M., Mol Biol Evol. 4: 406 (1987)), 타종과는 94% 이하의 유사도를 갖는 신 균주임을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 본 발명자들은 그람 음성, 호기성 구균인 이러한 신 균주에 대해서 "제주 연안에서 분리된 노란색을 띄는 구균"이라는 의미를 갖는 "플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)"로 명명하였으며, 이를 2003년 11월 3일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 수탁번호 KCTC 10534BP로 기탁하였다.

본 발명에 따른 신규 균주 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis)의 특성은 다음과 같은 방법으로 검증되었으며 특성화되었다.

가. 균주의 분리, 배양

1) 균의 분리

제주도 대정읍 부근 연안 해수를 채취하여 마린 아가 플레이트 2216 (제조원: Difco Laboratories, MD USA )에 100㎕씩 도말한 후 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 노란색을 띄는 콜로니가 발견되었고 이 균주를 동일한 배지에서 계대 배양하여 단일 균주를 얻었으며, 이를 잠정적으로 D2로 명명하였다(도 1 참조).

2) D2 균주의 배양

분리된 균주 D2의 배양에는 마린 브로스 배지 2216(제조원: Difco Laboratories, MD USA)을 사용하였다. 액체배지의 경우 37.4g의 가루 배지를 증류수 1ℓ에 넣은 후 2분 동안 끓여 모든 화합물을 완전히 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하며, 고체배지의 경우 55.1g의 가루 배지를 증류수 1ℓ에 넣은 후 2분 동안 끓여 모든 화합물을 녹인 다음 121℃에서 15분간 살균하여 사용하여 사용하였다. 배양체의 준비는 500㎖ 배플드 플라스크 (baffled flask)에 50㎖씩 분주한 액체배지에 분리된 균주의 단일집락을 접종하고 25℃, 150rpm에서 2일간 진탕 배양하였다.

나. 분리 균주 D2의 동정

1) 균의 형태적, 배양적 특성

상기 언급된 마린 브로스 배지를 사용하여 25℃에서 48시간 배양한 액체 배양체의 일부를 현미경 하에서 형태적 특성을 조사한 결과, 구균으로 판명되었으며 그람 염색 결과, 그람음성 세균으로 조사되었다(도 2 참조). 또한, 본 균주의 최적 생장 온도를 확인하기 위하여 마린 브로스 배지를 사용하여 20℃, 25℃, 30℃, 37℃에서 12시간 간격으로 O.D600nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 25℃와 30℃에서 최적의 생장을 보였으며, 30℃에서 적응기간(lag phase)이 짧아 25℃보다 빨리 흡광도가 증가하는 볼 수 있었다. 그러나, 48시간 이후의 흡광도는 30℃와 25℃가 동일 한 것을 확인하였다(도 3 참조).

2) 균의 생리적 특성과 탄소원 이용성

본 발명에 따른 균주의 생리적 특성과 탄소원 이용성을 조사하기 위하여 API 20NE 키트(제조원:Bio-Merieux Korea Co., Ltd)를 사용하였다. 본 발명에 따른 분리 균주 D2를 마린 브로스 2261에서 25℃에서 48시간 동안 배양한 후 키트의 기질에 접종하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.

조사 항목	특 성
나이트레이트 환원력	음성
인돌 생성	음성
포도당 산성화	음성
에스큘린 가수분해	양성
젤라틴 가수분해	음성
베타-락테이즈 활성	양성
아라비노스 이용	음성
말토오즈 이용	음성
시토크롬 산화	양성

3) 균의 16S rRNA의 염기 서열 분석

분리 균주 D2의 동정을 위하여 16S rRNA 의 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA는 생물간의 진화 관계를 밝히는데 훌륭한 표지로 사용할 수 있다. rRNA는 옛 분자이고 기능적으로 일정하며, 널리 분포되어 있고, 넓은 범위의 계통학적 거리에 걸쳐 잘 보존되어 있기 때문이다. 또한, rRNA와 같은 커다란 분자에서 서로 상이할 수 있는 서열의 수는 매우 많기 때문에 두 서열간의 유사성은 약간의 계통적 유연 관계를 시사해 주기 때문이다.

본 발명에 따른 분리 균주 D2의 16S rRNA를 증폭하기 위하여 박테리아 통용의 16S rRNA 증폭 프라이머(서열 번호 1 및 서열 번호 2)를 제작하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 그 결과 1.4kb의 단편을 확보하였으며, 이 단편을 pST-Blue1 벡터(제조원:　Novagen, WI, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다(서열 번호 3).

4) 균의 지방산 분석

본 발명에 따른 분리 균주 D2의 동정을 위하여 균체 내 지방산 조성을 분석하였으며, 16S rRNA 염기 서열 분석 결과 가장 높은 유사도 (similarity)를 가지는 두개의 종과 지방산 조성을 비교하였다. 분석 기기는 미생물 동정 시스템(Microbial Identification System MIDI, 제조원: Microbial ID. Inc., DE, USA)을 사용하였으며, 분석된 데이터는 TSBA40 (Sherlock Version 4.0; 제조원: MIDI사, USA )에서 검색하였다. 그 결과가 표 2에 나타나 있다.

다. 분리 균주 D2의 지아잔틴(zeaxanthin) 생성능의 검정

1) TLC(thin layer chromatography)를 통한 지아잔틴 생성능 검정

분리 균주 D2 내에 포함된 색소화합물은 아세톤(acetone)을 통해 추출하였다. 색소 추출물을 건조시킨 후 메탄올:클로로포름(methanol:chloroform) 1:1 혼합용매에 용해시켰다. TLC의 매질은 실리카겔 (Silica gel 60F₂₅₄, 제조원: Merck, Germany)을 사용하였고, 추출된 색소 추출물을 클로로포름:아세톤(chloroform:aceton) 97:3 용매에서 전개시켰다. 그 결과가 도 5에 나타나 있다.

2) HPLC(high-pressure liquid chromatography)를 통한 지아잔틴 생성능 검정

분리 균주 D2 내에 포함된 색소 화합물은 아세톤을 통해 추출하였다. 추출된 색소 추출물을 건조시킨 후 메탄올:클로로포름(methanol:chloroform) 1:1 혼합용매에 용해시켰다. HPLC에 사용된 컬럼은 C18 역상 컬럼(Ultrasphere ODS 4.6㎜× 25㎝, 제조원: Beckman Coulter, CA, USA)을 사용하였고, 용매는 아세토나이트릴:메탄올:이소프로파놀(acetonitrile:methanol:isoprophanol) 90:6:4로 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 하였고, 흡광도는 UV 475nm에서 감지하였다. 그 결과가 도 6에 나타나 있다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 지아잔틴(zeaxanthin)의 생산능을 갖는 신규한 플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)(수탁번호 KCTC 10534BP)을 제공한다.

본 발명의 지아잔틴(zeaxanthin)의 생산능을 갖는 신규한 플라보코커스 제주엔시스는 지아잔틴의 생성을 촉진시킬 수 있는 다양한 배지에서 발효시킬 수 있으며, 이러한 발효 방법으로는 배치, 페드-배치(fed-batch) 및 연속 배양 등을 예시할 수 있다. 배지중에 포함될 수 있는 동화성 탄소원으로는 슈가 및 이들의 중합체, 폴리알콜 등을 사용될 수 있으며, 동화성 질소원으로는 무기 질소 화합물, 동물, 식물 및 미생물 기원의 물질 등이 사용될 수 있고, 기타 비타민, 성장 촉진제, 색소 형성 촉진제 등이 배지중에 포함될 수 있다.

본 발명의 신규한 플라보코커스 제주엔시스는 20 내지 40℃, 바람직하게는 23 내지 35℃, 보다 바람직하게는 25 내지 30℃에서 pH 5.5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7.8, 보다 바람직하게는 7 내지 7.8에서 배양하며, 이의 배양에 따른 지아잔틴의 생산능을 증대시키기 위해 산소, 이산화탄소 등의 배양 조건을 조절할 수 있다.

배양된 플라보코커스 제주엔시스로부터 생성된 지아잔틴은 균주내에 존재하며, 지아잔틴-함유(zeaxanthin-containing) 플라보코커스 제주엔시스는 원심분리, 여과 등 당 분야의 통상의 방법으로 회수할 수 있다. 회수된 지아진틴-함유 플라보코커스 제주엔시스는 이를 배양물로부터 회수하여 동물 사료 첨가제로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 양태로서, 플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)(수탁번호 KCTC 10534BP)를 배양하고 배양배지로부터 지아잔틴을 함유하는 플라보코커스 제주엔시스(zeazanthin-containing Favococcus chejuensis)를 회수하는 단계를 포함하여, 지아잔틴-함유 플라보코커스 제주엔시스를 생산하는 방법을 제공한다.

배양된 플라보코커스 제주엔시스의 균체내에 존재하는 지아잔틴은 당 분야의 통상의 정제 방법을 이용하여 지아잔틴을 정제할 수 있다. 균체내에 존재하는 지아잔틴은 당 분야의 표준 방법, 예를 들어 유기 용매를 사용하여 정제할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)(수탁번호 KCTC 10534BP)를 배양하고 배양배지로부터 지아잔틴을 함유하는 플라보코커스 제주엔시스를 회수하는 단계 및 회수된 균체로부터 축적된 지아잔틴을 추출하는 단계를 포함하여, 지아잔틴을 생산하는 방법을 제공한다.

상기한 바와 같이 정제된 지아잔틴은 당 분야에서 익히 공지된 바와 같이 항산화제, 착색제, 노인성 안 질환제 등으로 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1 : 신 분리 균주 D2의 16S rRNA 염기 서열을 통한 동정

분리 균주 D2를 마린 브로스 2216(제조원: Difco Laboratories, MD USA)에서 25℃에서 48시간 동안 배양한 후 이로부터 추출된 염색체를 PCR 반응의 주형으로 사용하였고, 아래의 프라이머를 사용하였다.

GF1 : 5'-TAA CAC ATG CAA GTC GAA CG-3' (서열 번호 1)

GR1 : 5'-GGT GTG ACG GGC GGT GTG TAC AAG-3'(서열 번호 2)

상기 중합효소 연쇄반응은 써멀 사이클러(Thermal Cycler; 제조원: Takara, Japan)를 사용하여 수행하였고, 94℃에서 5분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 45초간 반응을 35회 수행한 후, 72℃에서 15분간 반응시키는 조건으로 수행하여 1.4kb의 단편을 획득하였다. 얻어진 단편은 0.8% 아가로스 젤에서 추출한 다음 이를 pST-Blue1 (제조원:　Novagen, WI, USA)에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다(서열 번호 3). 분석된 염기서열을 NCBI의 BLAST-N를 통하여 타종간의 유연관계를 확인한 결과, 해양 살조 세균(Marine Algicidal bacterium) 시토파가 종(Cytophaga sp.) I-1858과 93.99%의 유사도(Similarity)를 보였다. 그러나, 시토파가 종(Cytophaga sp.) I-1858은 타입 균주가 아니므로 비교 대상이 될 수 없으므로, 타입 균주 중 가장 높은 유사도를 보이는 겔리디박터 알겐스(Gelidibacter algens) ACAM 536T 균주의 경우와 비교한 결과 92.13%의 유사도를 보였다. 타입 균주와 비교하여 통상 94% 이하의 유사도를 갖는 경우 그 균주는 새로운 속으로 분류되고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 분리 균주 D2는 16S rRNA의 염기 서열 분석 결과에 기초할 때 새로운 속임이 밝혀졌으며(도 4 참조), 본 발명자들은 본 발명에 따른 균주 D2에 대해서 속명을 "노란색을 띄는 구균"의 의미를 가지는 "Flavococcus"로 명명하고, 종명은 제주 연안을 의미하는 "chejuensis"로 명명하였으며, 이 균주를 2003년 11월 3일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구, 어은동 52번지 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁 번호 KCTC 10534BP로 기탁하였고, 16S rRNA 염기 서열(서열 번호 3)은 등록번호 AY455998로 진뱅크(GenBank)에 등록하였다.

실시예 2 : 신규 분리 균주 플라보코커스 제주엔시스의 지방산 분석을 통한 동정

본 발명에 따른 분리 균주 플라보코커스 제주엔시스내의 지방산 조성 분석을 위하여 이를 마린 아가 플레이트 2216 (Difco Laboratories, MD, USA )에서 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양체 40㎎을 루프로 캡튜브에 취한 후 메탄올:증류수 (methanol:D.W.) 1:1 혼합용액에 15% 수산화나트륨이 포함된 시약 1㎖을 가하여 100℃에서 25분간 반응시켜 세포내 지방산을 추출하였다. 추출된 지방산의 메틸화를 위하여 6N HCl 2㎖을 첨가하고 80℃에서 10분간 반응 시킨 후 재빨리 냉각시켰으며, 수용성의 상태인 지방산을 유기상으로 전환시키기 위하여 헥산:메틸-3급 부틸 에테르 (Hexane:Methyl-tert Buthyl Ether) 1:1 혼합용액 1.25㎖을 첨가 후 10분 동안 회전시켜주어 상층액만을 취했다. 마지막으로 포화된 수산화나트륨 용액 3ml으로 샘플을 씻어준 후 분석기기를 통하여 분석하였다. 분석된 결과를 TSBA40 데이터베이스에서 검색한 결과, 동일한 지방산 조성을 가지는 균종이 나타나지 않았고, 또한 16S rRNA 염기 서열 분석 결과 가장 높은 유사도(similarity)를 보이는 겔리디박터 알겐스(Gelidibacter algens)와 사이크로세르펜스 부르토넨시스(Psychroserpens burtonensis)의 지방산 조성과도 서로 다른 조성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이는 다음 표 2에 나타내었다. 따라서, 이러한 지방산 분석을 통하여 플라보코커스 제주엔시스가 새로운 속임을 입증할 수 있었다.

지방산	총 지방산 (%)
지방산	플라보코커스 제주엔시스	사이크로세르펜스 부르토넨시스	겔리디박터알겐스
14:0	0.5	0.2	0.3
15:0	2.6	10.1	8.8
16:0	2.6	0.4	1.4
18:0	-	-	0.2
i13:0	-	<0.1	-
i14:0	-	0.4	0.5
i15:0	11.6	10.0	7.9
a15:0	5.3	10.4	13.2
i15:1	14.5	-	-
a15:1	2.7	-	-
i15:1w10c	-	14.1	11.3
a15:1w10c	-	8.4	8.8
i16:0	1.0	0.6	8.0
i16:1	0.5	-	-
i16:1w11c	-	9.1	-
i16:1w6c	-	-	7.7
i17:0	0.5	-	-
a17:0	0.5	-	1.5
i17:1 w7c	-	1.5	4.9
i17:1 w9c	0.6	-	-
a17:1 w7c	-	<0.1	5.2
15:1 w11c	-	6.4	3.5
15:1 w6c	0.7	3.5	-
15:1 w4c	-	7.6	1.3
16:1 w9c	-	0.7	-
16:1 w7c	-	0.4	5.9
16:1 w5c	-	6.9	1.5
17:1 w8c	0.4	1.2	-
17:1 w6c	0.6	1.5	3.7
2-OH 15:0	1.7	-	-
2-OH 17:0	3.6	-	-
3-OH i14:0	0.4	-	-
3-OH i15:0	8.4	-	0.5
3-OH i16:0	4.7	-	0.8
3-OH 16:0	2.2	-	0.3
3-OH i17:0	13.3	-	0.4
3-OH a17:0	-	-	0.4
2-OH i15:0/16:1w7c	12.1	-	-
17:1 ISO I /ANTEI B	2.5	-	-
unknown 11.543	0.9	-	-
unknown 13.565	2.1	-	-
unknown 16.582	1.3	-	-

실시예 3 : TLC를 통한 지아잔틴 생성능 조사

본 발명에 따라 신규 명명된 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis)의 지아잔틴 생성능을 조사하기 위하여, TLC(thin layer chromatography)를 수행하였다. 이때, 지아잔틴을 생성하는 것으로 공지된 파라코코스 지아잔티니파시안스(Paracoccus zeaxantinifaciens) ATCC 21588 [Alan, Berry et al., Int. J. Syst. Evol. Micro., 53: 231, (2003)]을 대조 균주로 사용하였다. 대조 균주와 플라보코커스 제주엔시스의 Rf 값( Rf = 전개 용매의 전개 길이 / 균주 샘플의 전개 길이)을 산출한 결과, 두 균주 모두 Rf = 1.25/8.5 = 0.147으로 동일한 값을 가졌다[도 5 참조]. 따라서 본 발명에 따른 신규 균주 플라보코커스 제주엔시스가 지아잔틴을 생성한다는 것을 검증할 수 있었다.

실시예 4 : HPLC를 통한 지아잔틴 생성능 조사

HPLC를 통하여 플라보코커스 제주엔시스가 지아잔틴을 생성하는지 조사하였다. 이때, 지아잔틴을 생성하는 것으로 공지된 파라코코스 지아잔티니파시안스 ATCC 21588을 대조 균주로 사용하였다. 대조 균주에서 추출된 지아잔틴은 HPLC 분석 결과 7.9분대에 피크로 나타났으며, 본 발명에 따라 분리된 신규 균주 플라보코커스 제주엔시스가 또한 동일한 7.9분대의 피크를 보였다. 두 균주에서 추출된 색소 화합물을 혼합하여 함께 분석한 HPLC에서도 역시 단일의 7.9분대 피크(도 6 참조)를 보였으므로 본 발명에 따른 플라보코커스 제주엔시스가 대조 균주와 마찬가지로 지아잔틴을 생성한다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의해 제공되는 지아잔틴 생합성 세균 플라보코커스 제주엔시스(Flavococcus chejuensis) 균주는 항산화제, 착색제, 노인성 안 질환 치료제, 동물 사료 보조제 등으로 사용될 수 있는 유용한 천연 색소 지아잔틴을 안정적으로 공급할 수 있어 매우 유용하다.

도 1은 본 발명에 따른 신규한 분리 균주(이하, D2로 약칭됨)의 고체 배지 상의 사진이다. 배지 상에서 노란색은 지아잔틴이 생합성을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 D2의 현미경 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 D2의 온도에 따른 생장 곡선을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 D2의 16S rRNA 염기 서열에 따른 분류학적 계통도이다.

도 5는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 D2 및 대조 균주로 사용된 파라코커스 지아잔티니파시안스 (Paracoccus zeaxantinifaciens) ATCC 21588의 TLC 결과를 나타낸 사진이다. 이때, 레인 1은 파라코커스 지아잔티니파시안스의 TLC 결과이고 레인 2는 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 D2의 TLC 결과를 나타낸다.

도 6은 본 발명에 따른 신규한 분리 균주 D2 및 파라코커스 지아잔티니파시안스 (Paracoccus zeaxantinifaciens) ATCC 21588의 HPLC 결과를 나타낸 사진이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> New bacterium Flavococcus chejuensis producing zeaxanthin and production method of zeaxanthin using thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer GF1 for amplifying 16S rRNA <400> 1 taacacatgc aagtcgaacg 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer GR1 for amplifying 16S rRNA <400> 2 ggtgtgacgg gcggtgtgta caag 24 <210> 3 <211> 1307 <212> DNA <213> Flavococcus chejuensis <220> <221> ZN_FING <222> (1)..(1307) <223> 16S rRNA <400> 3 gagcttgctc gaccggcgca cgggtgcgta acgcgtatac aatctgcctt gtactggggt 60 atagccttta gaaatgaaga ttaacacccc ataatataca gagcccgcat gggttctata 120 ttaaaggtta cggtacaaga tgagtatgcg tcctattagt tagttggtgc ggtaacggcg 180 caccaagaca gcgataggta ggggccctga gagggggatc ccccacactg gtactgagac 240 acggaccaga ctcctacggg aggcagcagt gaggaatatt ggacaatgga gggaactctg 300 atccagccat gccgcgtgca ggaagactgc cctatgggtt gtaaactgct tttatacggg 360 aagaaaccgt gctacgtgta gcaccttgac ggtaccgtaa gaataaggat cggctaactc 420 cgtgccagca gccgcggtaa tacggaggat ccaagcgtta tccggaatca ttgggtttaa 480 agggtccgta ggtggactgg tcagtcagag gtgaaatcct gcagcttaac tgtagaactg 540 cctttgatac tgctagtctt gaatcattgt gaagtggtta gaatatgtag tgtagcggtg 600 aaatgcatag atattacata gaataccaat tgcgaaggca gatcactaac aatgtattga 660 cactgatgga cgaaagcgta ggtagcgaac gggattagat accccggtag tctacgccgt 720 aaacgatgga tactagctgt ccggcttcgg ctgggtggct aagcgaaagt gataagtatc 780 ccacctgggg agtacgttcg caagaatgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 840 gcggtggagc atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttaccagg gcttaaatgt 900 agattgacag gtttagagat agacttttct tcggacaatt tacaaggtgc tgcatggttg 960 tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcaggtt aagtcctata acgagcgcaa cccctgttgt 1020 tagttgccag catgtaaaga tgggaactct agcaagactg ccggtgcaaa ccgtgaggaa 1080 ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc ttacgtcctg ggctacacac gtgctacaat 1140 ggtagggaca gagagcaacc actgggcgac caggagcgaa tctataaacc ctatcacagt 1200 tcggatcgga gtctgcaact cgactccgtg aagctggaat cgctagtaat cggatatcag 1260 ccatgatccg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtc 1307

Claims

지아잔틴(zeaxanthin)의 생산능을 갖는 플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)(수탁번호 KCTC 10534BP).
플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)(수탁번호 KCTC 10534BP)를 배양하고 배양배지로부터 지아잔틴을 함유하는 플라보코커스 제주엔시스(zeazanthin-containing Flavococcus chejuensis)를 회수하는 단계를 포함하여, 지아잔틴-함유 플라보코커스 제주엔시스를 생산하는 방법.
제2항에 있어서, 플라보코커스 제주엔시스(수탁번호 KCTC 10534BP)를 20 내지 40℃에서 호기성 조건하에서 배양하는 방법.
제2항 또는 제3항에 따른 방법으로 생산된 지아잔틴-함유 플라보코커스 제주엔시스.
제4항에 따른 지아잔틴-함유 플라보코커스 제주엔시스를 포함하는, 동물성 사료 첨가제.
플라보코커스 제주엔시스 (Flavococcus chejuensis)(수탁번호 KCTC 10534BP)를 배양하고 배양배지로부터 지아잔틴을 함유하는 플라보코커스 제주엔시스를 회수하는 단계 및 회수된 균체로부터 축적된 지아잔틴을 추출하는 단계를 포함하여, 지아잔틴을 생산하는 방법.
제6항에 있어서, 플라보코커스 제주엔시스(수탁번호 KCTC 10534BP)를 20 내지 40℃에서 호기성 조건하에서 배양하는 방법.
제6항 또는 제7항의 방법으로 생산된 지아잔틴.
제8항에 따른 지아잔틴을 포함하는 항산화제.
제8항에 따른 지아잔틴을 포함하는 착색제.
제8항에 따른 지아잔틴을 포함하는 노인성 안 질환제.