CN114786655A

CN114786655A - 用于抑制胶原蛋白流失的组合物和方法

Info

Publication number: CN114786655A
Application number: CN202080084563.7A
Authority: CN
Inventors: T·欧菲尔; T·塞德洛夫; Y·夏罗尼; J·利维; R·利维; K·林内维尔赫莫尼
Original assignee: Lycored Ltd
Current assignee: Lycored Ltd
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2020-10-08
Publication date: 2022-07-22
Also published as: EP4041207A4; IL292057A; CA3153568A1; AU2020363042B2; AU2020363042A1; KR20220123506A; US20220387344A1; BR112022006820A2; TW202114645A; WO2021070184A1; EP4041207A1; JP2023502312A

Abstract

本发明涉及包含八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ‑胡萝卜素的组合物，以及使用它们的方法，例如用于减少胶原蛋白流失。

Description

用于抑制胶原蛋白流失的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年10月10日提交的名称为“用于抑制胶原蛋白流失的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING COLLAGEN LOSS)”的美国临时专利申请号62/913,220的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

一般而言，本发明涉及类胡萝卜素领域，以及使用类胡萝卜素的方法，诸如用于治疗皮肤相关的病症，其包括胶原蛋白流失。

背景技术

衰老引起的皮肤生物结构和功能的衰退主要由于人口平均寿命的延长而引起了极大的关注。成纤维细胞是真皮的主要成分，并且以产生胶原蛋白和弹性纤维而闻名。光老化皮肤的标志是日光性弹性组织变性，这可能是细胞外基质(ECM)降解的最终产物。支持皮肤组织中的细胞的ECM包括胶原蛋白、弹性纤维和原纤维蛋白。

据报道，在暴露于致红斑剂量的紫外线B(UVB)后中性粒细胞会浸润皮肤，紫外线B(UVB)是一种模拟太阳辐射(SSR)，并且是自然阳光的一部分。人体皮肤暴露在一定阈值的紫外线、红外线辐射或热量下，会导致中性粒细胞内流。这些中性粒细胞充满了能够降解胶原蛋白的有效蛋白水解酶和弹性纤维。中性粒细胞衍生的蛋白水解酶参与了在几种非皮肤病学条件下观察到的ECM损伤。此外，有人认为，中性粒细胞，而不是角质形成细胞和成纤维细胞，可能是光老化的关键参与者。据报道，在白皮肤暴露于致红斑剂量的SSR后，浸润的中性粒细胞而非角质形成细胞或成纤维细胞是蛋白水解酶(尤其是基质金属蛋白酶(MMP)和弹性蛋白酶)的主要来源。氧衍生的代谢物诱导蛋白水解酶的活化，和/或防止这些酶被抗蛋白酶失活，因此诱导ECM损伤，其最终可能导致日光性弹性组织变性。

仍然非常需要用于防止中性粒细胞衍生的蛋白水解酶的释放并因此保护免受胶原损伤的组合物和方法。

发明内容

结合系统、工具和方法来描述和说明以下实施方式及其各方面，其旨在是示例性和说明性的，而不是在范围上限制性的。

根据第一方面，提供了一种组合物，其包含：为组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的量的八氢番茄红素、为组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的量的六氢番茄红素、为组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的量的ζ-胡萝卜素和可接受的载体。

根据另一个方面，提供了一种用于预防或治疗需要其的受试者中的胶原蛋白流失的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物，从而预防或治疗该受试者中的胶原蛋白流失。

根据另一方面，提供了一种用于降低在需要其的受试者中以下任何一种的量、活性或两者的方法：基质金属蛋白酶(MMP)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物(SO)、弹性蛋白酶、一氧化氮(NO)及其任意组合，包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与ζ-胡萝卜素的重量比范围为15:1(w/w)至2:1(w/w)。

在一些实施方式中，组合物进一步包含选自以下的另外的类胡萝卜素：番茄红素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素及其任意组合。

在一些实施方式中，番茄红素的量为小于组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)，β-胡萝卜素的量为小于组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)，γ-胡萝卜素的量为组合物中总类胡萝卜素的0.2-1.5％(w/w)，或其组合。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物的10-15％(w/w)的总类胡萝卜素量。

在一些实施方式中，组合物进一步包含生育酚。

在一些实施方式中，生育酚的量为组合物中总类胡萝卜素的10-30％(w/w)。

在一些实施方式中，组合物进一步包含植物甾醇。

在一些实施方式中，植物甾醇的量为组合物中总类胡萝卜素的5-15％(w/w)。

在一些实施方式中，该组合物用于减少胶原蛋白流失、增加胶原蛋白水平或两者。

在一些实施方式中，预防或治疗是将胶原蛋白流失减少50-90％。

在一些实施方式中，MMP选自：MMP-9、MMP-8、MMP-1或其任意组合。

在一些实施方式中，受试者患有胶原蛋白流失相关疾病。

在一些实施方式中，胶原蛋白流失相关疾病选自：年龄相关疾病、皮肤病和炎性疾病。

在一些实施方式中，皮肤病包括由以下任何一种诱导的皮肤损伤：辐射、氧化应激、DNA损伤、端粒缩短、炎症、烟草使用及其任意组合。

在一些实施方式中，辐射包括UV辐射、可见光辐射、红外辐射或其任意组合。

在一些实施方式中，UV辐射是UVA、UVB、UVC或其任意组合。

在一些实施方式中，与对照相比，受试者在皮肤中、全身地或两者具有MMP、MPO、SO、弹性蛋白酶、NO及其任意组合的任一种的增加的量、增加的活性或两者。

在一些实施方式中，施用包括口服施用、局部施用或两者。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试，但示例性方法和/或材料在下文描述。如有冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不意味着必然是限制性的。

从下文给出的详细描述中，本发明的进一步的实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解的是，虽然指示了本发明的优选实施方式，但详细描述和具体实例但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将从该详细描述中变得显而易见。

除了上述示例性方面和实施方式之外，通过参考附图并通过研究以下详细描述，进一步的方面和实施方式将变得显而易见。

附图说明

图1A-1C是显示由肿瘤坏死因子α(TNFα，1A)、白细胞介素8(IL8，1B)和甲酰基-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP，1C)激动剂刺激的人中性粒细胞分泌基质金属蛋白酶9(MMP-9)的动力学的垂直条形图。数值表示5次独立实验的平均值±平均值的标准误差(SEM)。

图2A-2C是显示由TNFα(2A)、IL8(2B)和fMLP(2C)激动剂刺激的人中性粒细胞分泌髓过氧化物酶(MPO)的动力学的垂直条形图。数值表示5次独立实验的平均值±SEM。

图3A-3C是显示Lumenato(金番茄超临界萃取物或GTE)对MMP-9分泌的抑制作用的垂直条形图。人中性粒细胞被TNFα(3A)、IL8(3B)和fMLP(3C)激动剂刺激，并且在GTE存在下观察到MMP-9分泌的剂量依赖性抑制。数值表示3次独立实验的平均值±SEM。

图4A-4C是显示GTE对MPO分泌的抑制作用的垂直条形图。人中性粒细胞被TNFα(4A)、IL8(4B)和fMLP(4C)激动剂刺激，并且在GTE存在下观察到MPO分泌的剂量依赖性抑制。数值表示3次独立实验的平均值±SEM。

图5A-5C是显示GTE对超氧化物分泌的抑制作用的垂直条形图。人中性粒细胞被TNFα(5A)、IL8(5B)和fMLP(5C)激动剂刺激，并且在GTE存在下观察到对超氧化物分泌的剂量依赖性抑制。数值表示3次独立实验的平均值±SEM。

图6A-6S是显示添加GTE以剂量依赖性方式防止由中性粒细胞诱导的正常人真皮成纤维细胞(NHDF)中的胶原-3损伤的免疫荧光显微照片和垂直条形图。用100ng/ml TNFα刺激中性粒细胞，并在逐渐增加的GTE浓度的情况下温育：6.5μg/ml(6C，6J)、13μg/ml(6D，6K)、26μg/ml(6E，6L)、52μg/ml(6F，6M)和104μg/ml(6G，6N)。对照：阴性(无TNFα；6A和6H)，阳性(无GTE；6B和6I)。(6A-6G)是胶原蛋白-3放大×40的代表性免疫荧光染色。(6H-6N)是胶原蛋白-3放大×200的代表性免疫荧光染色。(6A-6N)在每个实验中，每个处理的10个区域被扫描。(6O)是显示通过胶原蛋白-3的免疫荧光染色的光密度测定法分析的GTE对胶原蛋白损伤的预防的垂直条形图。数值表示5次不同实验的平均值。(6P)和(6Q)是分别显示逐渐增加LycoDerm和LycoMato浓度对预防胶原蛋白流失的影响的垂直条形图。较高浓度的LycoDerm或LycoMato对细胞有毒。相反，在104μg/ml(使用的最高浓度)下，没有观察到GTE的细胞毒性作用。(6R)显示胶原蛋白-3的免疫荧光染色的光密度测定的图(6A-6N)。显示的是三个不同实验的平均值±SEM。(6S)是显示分泌到共培养物的上清液中的前胶原蛋白-3的量的图。显示的是三个不同实验的平均值±SEM，每个实验一式三份。水平虚线表示没有中性粒细胞影响的Lumenato的效果。Lum–Lumenato(μg/ml)，Fib–成纤维细胞，Neu–中性粒细胞。

图7A-7C是显示GTE诱导抑制MMP-9从与NHDF(如图6所述)共培养的中性粒细胞中释放的垂直条形图。在共培养物的上清液中定量MMP-9(7A)。数值表示5次不同实验的平均值。(7B)和(7C)是分别显示逐渐增加的LycoDerm和LycoMato浓度对MMP-9水平的影响的垂直条形图。较高浓度的LycoDerm或LycoMato对细胞有毒。相反，在104μg/ml(使用的最高浓度)下，没有观察到GTE的细胞毒性作用。

图8A-8C是显示GTE诱导抑制MPO从与NHDF(如图6中所述)共培养的中性粒细胞释放的垂直图。MPO量化是基于其在共培养物上清液中的活性来确定的(8A)。数值表示5次不同实验的平均值。(8B)和(8C)是分别显示逐渐增加的LycoDerm和LycoMato浓度对MPO活性的影响的垂直条形图。较高浓度的LycoDerm或LycoMato对细胞有毒。相反，在104μg/ml(使用的最高浓度)下，没有观察到GTE的细胞毒性作用。

图9是显示GTE诱导抑制与NHDF(如图6所述)共培养的中性粒细胞的超氧化物释放的垂直条形图。使用Amplex red检测超氧化物水平。数值表示5次不同实验的平均值。

图10是显示GTE诱导抑制MMP-8(胶原酶)从与NHDF(如图6中所述)共培养的中性粒细胞中释放的垂直条形图。定量在共培养物的上清液中的MMP-8。数值表示5次不同实验的平均值。

图11是显示GTE诱导抑制与NHDF(如图6中所述)共培养的中性粒细胞的弹性蛋白酶释放的垂直条形图。基于其在共培养物的上清液中的活性确定弹性蛋白酶的定量。数值表示5次不同实验的平均值。

图12A-12B是显示浆料或GTE对脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞释放一氧化氮(NO)的影响的垂直条形图。将浆料溶解在介质中并过滤；GTE溶解在DMSO中。如通过MTT还原所确定的，在所有测试的浓度中，对细胞存活没有影响。(12A)显示了过滤的浆料的影响，(12B)显示了GTE对NO产生的影响。结果表示进行的2次实验的平均值。

图13A-13C是显示以GTE中存在的比例将生育酚和植物甾醇添加到刺激的中性粒细胞导致来自用TNFα活化的中性粒细胞的MPO释放和活性的显著协同抑制的垂直条形图。单独添加生育酚(13A)或植物甾醇(13B)对用TNFα活化的中性粒细胞的MPO释放和活性没有影响。相比之下，225μg/ml的生育酚和62.5μg/ml的植物甾醇产生大约20％的MPO活性抑制的协同效应，而10倍更高或更低的比率没有提供协同效应(13C)。

图14是显示以存在于GTE中的比例将ζ-胡萝卜素与八氢番茄红素、生育酚或植物甾醇中的任何一种添加到刺激的中性粒细胞导致MPO活性的显著协同抑制的垂直条形图。仅添加ζ-胡萝卜素、生育酚、八氢番茄红素或植物甾醇对MPO活性的抑制作用最多为5％，或者在大多数情况下没有作用。以GTE中存在的比例将ζ-胡萝卜素与生育酚、八氢番茄红素或植物甾醇中的任何一种添加诱导协同抑制MPO活性或从TNFα激活的中性粒细胞释放。

图15A-15B是显示GTE(例如，Lumenato)胶囊具有增加的类胡萝卜素生物利用度的图。八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素，其是黄金番茄萃取物中的主要类胡萝卜素，显示吸收良好。ζ-胡萝卜素被吸收得非常好，如通过血浆浓度的急剧增加所反映的(15A)。(15B)是仅显示八氢番茄红素和六氢番茄红素的生物利用度动力学的图。

图16A-16B是显示H₂O₂以剂量依赖性方式诱导细胞死亡和增加MMP1分泌的图。在添加H₂O₂之前以指定浓度添加Lumenato增加细胞活力(16A)并减少MMP1的分泌(16B)。

图17是显示GTE(例如，Lumenato)以剂量依赖性方式增加ARE/Nrf2转录活性的激活的图。Lycomato显示为参考。所示浓度适用于：番茄红素(在Lycomato的情况下)和八氢番茄红素(在Lumenato的情况下)。

图18包括垂直条形图，显示共培养物的上清液中前胶原蛋白-3的水平。显示的是四个不同实验的平均值+SEM，每个实验一式三份。将6.5–104μg/ml范围内的Lumenato添加到以两种不同浓度铺板的成纤维细胞中。

图19包括显示Lumenato校正H₂O₂诱导的胶原蛋白1a1分泌减少的图。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明涉及包含多种类胡萝卜素的组合物。本发明部分地基于令人惊讶的发现，即，与其他番茄萃取物相比，包含大量八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素的番茄萃取物在更高水平上防止胶原蛋白流失，并抑制基质金属蛋白酶9(MMP-9)和髓过氧化物酶(MPO)活性，并且与相同番茄萃取物相比，细胞毒性降低。

在一些实施方式中，组合物包含八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素。在一个实施方式中，该组合物包含八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素和另外的类胡萝卜素。在一个实施方式中，该组合物包含八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、番茄红素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、生育酚和植物甾醇。

在一些实施方式中，类胡萝卜素是从水果、蔬菜或植物(包括植物部分)中萃取、分离或纯化的天然类胡萝卜素。在另一个实施方式中，类胡萝卜素是从番茄植物中萃取的类胡萝卜素。在另一个实施方式中，类胡萝卜素是从番茄果实中萃取的类胡萝卜素。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素是富含类胡萝卜素的番茄萃取物。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素是全天然的富含类胡萝卜素的番茄萃取物。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素是番茄类胡萝卜素复合物。在另一个实施方式中，番茄类胡萝卜素复合物包含植物营养素复合物，其包括多种类胡萝卜素(诸如，八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、β-胡萝卜素等)、生育酚和植物甾醇。在一些实施方式中，类胡萝卜素是合成类胡萝卜素。

在一些实施方式中，本发明提供了通过创新萃取方案获得的番茄萃取物。这种包含八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素(其量如下文所述)的特定萃取物具有降低的细胞毒性。在一些实施方式中，将降低的细胞毒性与其他番茄萃取物进行比较。在一些实施方式中，降低的毒性能够以更高的剂量向需要其的受试者提供本发明的组合物，而不会降低受试者的存活率、健康或两者。在一些实施方式中，向需要其的受试者施用本发明的组合物能够通过以提高治疗效果的更高量提供活性成分(诸如八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素)来提高治疗效果，但不会由于高细胞毒性而降低受试者的存活率、健康或两者。

在一些实施方式中，本发明的组合物提供了与其他植物、水果或蔬菜来源的萃取物诸如番茄相比毒性降低的更大量的类胡萝卜素。在一些实施方式中，与其他植物、水果或蔬菜来源的萃取物，诸如番茄相比，本发明的组合物提供了增加的治疗功效和降低的毒性。

在一些实施方式中，本发明的组合物包含天然类胡萝卜素、合成类胡萝卜素或其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物的总类胡萝卜素的10-40％(w/w)、15-35％(w/w)、20-45％(w/w)、25-35％(w/w)、20-30％(w/w)或30-50(w/w)的量的八氢番茄红素。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物的总类胡萝卜素的1-10％(w/w)、3-12％(w/w)、4-14％(w/w)、5-10％(w/w)、8-15％(w/w)或2-9％(w/w)的量的六氢番茄红素。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物的总类胡萝卜素的4-20％(w/w)、6-18％(w/w)、5-15％(w/w)、6-12％(w/w)、9-17％(w/w)或10-17％(w/w)的量的ζ-胡萝卜素。每种可能性代表本发明的单独实施例。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与ζ-胡萝卜素的重量比范围为20:1(w/w)至3:1(w/w)、15:1(w/w)至3:1(w/w)、20:1(w/w)到6:1(w/w)、15:1(w/w)至2:1(w/w)、17:1(w/w)至4:1(w/w)、16:1(w/w)至7:1(w/w)、13:1(w/w)至8:1(w/w)、10:1(w/w)至3:1(w/w)或15:1(w/w)至10:1(w/w)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物进一步包含另外的类胡萝卜素。如本文所用，“另外的类胡萝卜素”是指除了或不同于八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素的任何类胡萝卜素或其代谢物。

在一些实施方式中，另外的类胡萝卜素选自番茄红素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素及其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的小于10％(w/w)、小于7％(w/w)、小于5％(w/w)、小于3％(w/w)、小于2％(w/w)或小于1％(w/w)的量的番茄红素，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的1-3％(w/w)、1-5％(w/w)、2-6％(w/w)、0.5-4.5％(w/w)、0.1-3％(w/w)、0.6-4.8％(w/w)或2.5-4％(w/w)的量的番茄红素。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的小于10％(w/w)、小于7％(w/w)、小于5％(w/w)、小于3％(w/w)、小于2％(w/w)或小于1％(w/w)的量的β-胡萝卜素，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，该组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的1-3％(w/w)、1-5％(w/w)、2-6％(w/w)、0.5-4.5％(w/w)、0.1-3％(w/w)、0.6-4.8％(w/w)或2.5-4％(w/w)的量的β-胡萝卜素。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的至少0.15％(w/w)、至少0.18％(w/w)、至少0.2％(w/w)、至少0.25％(w/w)、至少0.35％(w/w)、至少0.5％(w/w)、至少0.75％(w/w)、至少0.9％(w/w)、至少1％(w/w)、至少1.2％(w/w)、至少1.35％(w/w)或至少1.7％(w/w)的量的γ-胡萝卜素，或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的0.15-3％(w/w)、0.2-2％(w/w)、0.2-1.5％(w/w)、0.5-3％(w/w)、0.7-1.6％(w/w)、0.4-2.8％(w/w)或1.2-3.2％(w/w)的量的γ-胡萝卜素。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物中总类胡萝卜素的小于5％(w/w)的量的番茄红素、为组合物中总类胡萝卜素的小于5％(w/w)的量的β-胡萝卜素、为组合物中总类胡萝卜素的0.2-1.5％(w/w)的量的γ-胡萝卜素或其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含为0.1-3％(w/w)、0.2-3.5％(w/w)、0.5-2.5％(w/w)、0.15-1.75％(w/w)、0.35-2.75％(w/w)、0.8-4％(w/w)、1-5％(w/w)或1.5-4.75％(w/w)的量的另外的类胡萝卜素。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，番茄红素为组合物中总类胡萝卜素的小于5％(w/w)的量。

在一些实施方式中，组合物包含组合物的5-25％(w/w)、10-15％(w/w)、12-35％(w/w)、3-17％(w/w)、2-20％(w/w)或1-30％(w/w)的总类胡萝卜素量。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物进一步包含生育酚(例如，维生素E)。在一些实施方式中，组合物包含为组合物的1-30％(w/w)、3-35％(w/w)、5-25％(w/w)、2-20％(w/w)、4-41％(w/w)、8-32％(w/w)或13-39％(w/w)的量的生育酚。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与生育酚的重量比范围为20:1(w/w)至3:1(w/w)、15:1(w/w)至3:1(w/w)、20:1(w/w)至6:1(w/w)、17:1(w/w)至4:1(w/w)、16:1(w/w)至7:1(w/w)、13:1(w/w)至8:1(w/w)、10:1(w/w)至3:1(w/w)或15:1(w/w)至10:1(w/w)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，ζ-胡萝卜素与生育酚的重量比范围为3:1(w/w)至1:3(w/w)、3:1(w/w)至1:2(w/w)、3:1(w/w)至1:1(w/w)、2:1(w/w)至1:1(w/w)、2:1(w/w)至1:2(w/w)、2:1(w/w)至1:3(w/w)、1:1(w/w)至1:2(w/w)或1:1(w/w)至1:3(w/w)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，组合物进一步包含植物甾醇。

在一些实施方式中，植物甾醇选自：胆固醇菜子甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ5-燕麦甾醇、Δ7-燕麦甾醇、Δ7-豆甾醇及其任意组合。

在一些实施方式中，组合物包含为组合物的1-20％(w/w)、2-19％(w/w)、10-25％(w/w)、5-25％(w/w)、8-16％(w/w)、6-18％(w/w)、3-20％(w/w)、4-17％(w/w)或5-15％(w/w)的植物甾醇。每种可能性代表本发明的单独实施方式。每种可能性代表本发明的单独实施例方式。

在一些实施方式中，组合的八氢番茄红素和六氢番茄红素与植物甾醇的重量比范围为20:1(w/w)至3:1(w/w)、15:1(w/w)至3:1(w/w)、20:1(w/w)到6:1(w/w)、17:1(w/w)至4:1(w/w)、16:1(w/w)至7:1(w/w)、13:1(w/w)至8:1(w/w)、10:1(w/w)至3:1(w/w)或15:1(w/w)至10:1(w/w)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，ζ-胡萝卜素与植物甾醇的重量比范围为6:1(w/w)至2:1(w/w)、5:1(w/w)至2:1(w/w)、4:1(w/w)至2:1(w/w)、3:1(w/w)至2:1(w/w)、6:1(w/w)至3:1(w/w)、5:1(w/w)至3:1(w/w)、4:1(w/w)至3:2(w/w)或6:1(w/w)至3:1(w/w)。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

确定植物营养素诸如类胡萝卜素的量的方法是常见的并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。这种方法的非限制性实例包括但不限于气相色谱法、液相色谱法和质谱法。

在一些实施方式中，组合物是口服组合物或局部组合物。在一些实施方式中，组合物是药物或营养组合物。在一些实施方式中，组合物包含药学上或营养学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方式中，组合物是药妆组合物。在一些实施方式中，组合物包含药妆上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，本文所述的组合物是可摄取的皮肤组合物。

在一些实施方式中，口服组合物是软凝胶胶囊的形式。在一些实施方式中，口腔组合物是饮料、丸剂、软糖或粉末的形式。在一些实施方式中，将口腔组合物混合或同化到食物中，诸如巧克力、冰淇淋等。

在一些实施方式中，本发明的组合物用于减少胶原蛋白流失、增加胶原蛋白水平或两者。

测量胶原蛋白水平的方法是常见的并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。用于确定或测量胶原蛋白水平的方法的非限制性实例包括免疫荧光显微术、电子显微术、蛋白质印迹和qRT-PCR，其中一些在下文中举例说明。例如，通过比较在存在和不存在本发明组合物的情况下测量的胶原蛋白水平，可以确定胶原蛋白流失、增加的胶原蛋白水平或两者。

在一些实施方式中，本发明的组合物具有增加胶原蛋白水平的活性。在一些实施方式中，增加胶原蛋白水平的活性包括选自以下的任何活性：增加胶原蛋白合成，增加每组织重量的胶原蛋白重量，增加胶原蛋白原纤维数量、长度或两者，增加天然或适当折叠的胶原蛋白的量，减少结构受损的胶原蛋白的量及其任意组合。

在一些实施方式中，胶原包括前胶原蛋白-3、胶原蛋白-3、胶原蛋白-1a1或其任意组合。

在一些实施例中，胶原蛋白是前胶原蛋白-3。在一些实施方式中，胶原蛋白是胶原蛋白-3。在一些实施方式中，胶原蛋白是胶原蛋白-1a1。在一些实施方式中，胶原蛋白是胶原蛋白-3、前胶原蛋白-3和胶原蛋白-1a1的组合。

在一个实施方式中，本发明的组合物可以提供给个体本身。在一个实施方式中，本发明的组合物可以作为包含药学上可接受的载体的药物组合物或营养组合物的一部分提供给个体。

在一个实施方式中，“药物组合物”、“药妆组合物”或“营养组合物”是指如本文所述的具有其他化学组分诸如生理上合适的载体和赋形剂的组合物的制剂。药物组合物、药妆组合物或营养组合物的目的是促进将组合物施用于生物体。

在一些实施方式中，提供了用于生产组合物的方法，该组合物包含为20-30％(w/w)的量的八氢番茄红素、为5-10％(w/w)的量的六氢番茄红素、为5-15％(w/w)的量的ζ-胡萝卜素和可接受的载体。在一些实施方式中，该方法包括萃取如本文所公开的黄金番茄。在一些实施方式中，本发明的组合物包含通过本文公开的方法生产的黄金番茄萃取物。

在一个实施方式中，“组合制剂”特别限定了“各部分的套组”，即如上定义的组合伴侣可以独立给药或通过使用具有不同量的组合伴侣的不同固定组合即，同时地(simultaneously)、并发地(concurrently)、分别地或依次地给药。在一些实施方式中，然后可以例如同时或按时间交错地施用各部分的套组中的各部分，即在不同的时间点并且对于各部分的套组中的任何部分具有相等或不同的时间间隔。在一些实施方式中，总量的一定比例的组合伴侣可以在组合制剂中施用。在一个实施方式中，可以改变组合制剂，例如，为了满足待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，其中不同的需要可能是由于具体疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或体重，如本领域技术人员可以容易地确定的。

在一个实施方式中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对哺乳动物造成显著刺激并且不会消除所施用的组合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语下。

在一个实施方式中，“赋形剂”是指添加到组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。在一个实施方式中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.,Easton,PA，最新版中发现了药物的配制和施用技术，其通过引用以其整体并入本文。

在一个实施方式中，合适的施用途径，例如，包括口服、直肠、经粘膜、经鼻、肠或肠胃外递送，其包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

根据一些实施方式，提供了在其需要的受试者中治疗或预防胶原蛋白流失的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。

在一些实施方式中，受试者患有胶原蛋白流失相关疾病。

在一些实施方式中，受试者是健康受试者。在一些实施方式中，受试者因以下任何一项而遭受胶原蛋白流失：老化，暴露于诸如UV、污染和烟雾等的环境因素，睡眠不足，压力或其任意组合。

在一些实施方式中，患有胶原蛋白流失相关疾病的受试者的特征在于具有：皮肤弹性降低，表皮厚度降低，皮肤易受损伤(诸如机械损伤)增加，皮肤皱纹、下垂或两者增加，以及其任意组合。

用于确定皮肤弹性或表皮厚度中任一种的方法是常见的并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，并且这种方法的非限制性实例包括但不限于皮肤抽吸或压痕以及随后的通过光学测量的皮肤位移检测，以及皮肤活检的组织学分析。

根据一些实施方式，提供用于抑制或降低需要求其的受试者中以下任何一种的量、活性或两者的任何一种的方法：MMP、MPO、超氧化物(SO)、弹性蛋白酶、一氧化氮(NO)及其任意组合，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。

在一个实施方式中，MMP是MMP-9、MMP-8、MMP-1或其任意组合。

确定MMP、MPO、SO、弹性蛋白酶、NO中的任一种的量、活性或两者的方法是常见的并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些方法的非限制性实例包括但不限于ELISA、免疫组织化学、氧化测定和酶测定，诸如下文举例说明的和/或其他。

在一些实施方式中，与对照相比，抑制或降低50-60％、50-75％、50-90％、50-99％、65-95％、70-90％或75-99％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，对照包括健康受试者的皮肤。在一些实施方式中，对照是从相同受试者(例如，患有胶原蛋白流失相关疾病的受试者)来源、分离或获得的健康皮肤样品。

在一些实施方式中，施用包括口服施用。在一些实施方式中，施用包括局部施用。在一些实施方式中，施用包括组合的口服施用和局部施用。

如本文所用，“年龄相关疾病”是指发病率随年龄迅速增加的疾病或与其相关的病症。如本文所用，术语“迅速”是指数形式的。

与年龄相关的病症——其可以统称为‘较轻的衰老疾病’(LAA)——的非限制性实例，包括但不限于一般性肌肉无力、低温不耐受、年龄相关的认知衰退——其还包括轻微的记忆力丧失、皮肤皱纹和皮肤中瘀伤的缓慢愈合、消瘦(总体重减轻)、肌肉体积减少和骨密度降低。年龄相关疾病的非限制性实例包括心血管疾病、癌症、关节炎、痴呆症、白内障、骨质疏松症、代谢疾病(包括糖尿病、胆固醇升高和脂质分布恶化)、高血压和神经退行性疾病(其包括但不限于阿尔茨海默病)。

如本文所用，短语“皮肤病”是指任何皮肤病理病症或其症状。在一个实施方式中，胶原蛋白流失是导致皮肤病发展的致病因素。在一个实施方式中，胶原蛋白流失是由皮肤病的发作、起始、进展或其任意组合引起的病理生理因素。在一个实施方式中，胶原蛋白流失是发展中或进行中的皮肤病的病症特征。

在一些实施方式中，皮肤病是免疫相关皮肤病。在一个实施方式中，免疫相关皮肤病是炎性皮肤病、自身炎性皮肤病或自身免疫性皮肤病。

如本文所用，短语“炎性疾病”是指涉及生物体(例如，免疫系统的细胞、分子信号介体诸如细胞因子等)对有害外源实体(例如，细菌、真菌、病毒、原生动物、过敏原等)的多组分反应的任何疾病。

在一些实施方式中，皮肤病的特征在于皮肤损伤或基于皮肤损伤确定。在一些实施方式中，皮肤损伤由以下任何一种诱导：辐射、氧化应激、DNA损伤、端粒缩短、炎症、烟草使用及其任意组合。

在一些实施方式中，辐射包括光谱内的任何辐射波长。如本文所用，术语“光谱”涵盖在10^-9m至10^-3m范围内的波长。在一些实施方式中，光谱内的辐射波长包括UV辐射、可见光辐射、红外辐射或其组合。在一些实施方式中，暴露于辐射包括暴露于阳光。

如本文所用，术语“紫外线(UV)”涵盖UV范围的任何波长。在一些实施方式中，UV是UV辐射。在一些实施方式中，UV辐射是UVA辐射、UVB辐射、UVC或其任意组合。

如本文所用，术语“红外”涵盖在700nm至1,000nm范围内的波长(具有430THz至300GHz的频率)。

在一些实施方式中，与对照相比，受试者在皮肤中、全身性地或两者中具有MMP、MPO、SO、弹性蛋白酶、NO及其任意组合的增加的量、增加的活性或两者。

在一些实施方式中，与对照相比，增加了1-10％、5-30％、15-50％、25-75％、70-150％、100-350％、250-550％、500-750％或700-1,000％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，术语“治疗”或“处理”疾病、紊乱或病症包括减轻其至少一种症状、降低其严重性或抑制其进展。治疗不一定意味着疾病、紊乱或病症被完全治愈。为了成为有效的治疗，本文有用的组合物仅需要降低疾病、紊乱或病症的严重程度，降低与其相关的症状的严重程度，或提供对患者或受试者的生活质量的改善。

如本文所用，术语“预防”疾病、紊乱或病症包括延迟、预防、遏抑或抑制疾病、紊乱或病症的发作。如根据当前描述的主题所使用的，术语“预防”涉及受试者在疾病/紊乱过程的诱导或发作之前暴露于当前描述的组合物或制剂的预防过程。这可以在个体具有表明倾向于发生要预防的疾病/紊乱的遗传谱系时进行。例如，这可能适用于其祖先表现出对某些类型例如炎性紊乱的倾向的个体。术语“遏抑”用于描述其中疾病/紊乱过程已经开始但尚未实现该病症的明显症状的情况。因此，个体的细胞可能患有疾病/紊乱，但临床上尚未辨识出疾病/紊乱的外部迹象。在任一情况下，术语预防可适用于包括预防和遏抑。相反，术语“治疗”是指临床应用活性剂来对抗已经存在的病症，其临床表现已经在患者身上实现。

在一些实施方式中，预防包括降低疾病严重程度、延迟疾病发作、降低疾病累积发病率或其任意组合。

如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人。

在讨论中，除非另有说明，形容词诸如“基本上”和“约”修饰本发明实施方式的一个或多个特征的条件或关系特性，应理解为表示条件或特性被定义为在对于预期应用的实施方式的操作的可接受的公差内。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中的“或”一词被认为是包含性的“或”而不是排他性的“或”，并且表示它所结合的项目中的至少一个或任意组合。

应当理解，如上文和本文其他地方使用的术语“一(a、an)”是指所列举的组分中的“一个或多个”。除非另有明确说明，否则本领域普通技术人员将清楚单数的使用包括复数。因此，术语“一”和至少一个在本申请中可互换使用。

为了更好地理解本教导并且绝不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示数量、百分比或比例的数字以及其他数值，都是应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可以根据寻求获得的期望特性而变化的近似值。至少，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并应用普通的舍入技术来解释。

在本申请的说明书和权利要求书中，动词“包含”、“包括”和“具有”及其变位词中的每个用于表示动词的一个或多个宾语不一定是动词的一个或多个主语的成分、要素或部分的完整列表。

如本文所用的其他术语旨在由它们在本领域中众所周知的含义来定义。

除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“或”被理解为包括性的。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等的变体表示包括任何列举的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

如本文所用，在整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成(consists essentially of)”或诸如“基本上由……组成(consist essentially of)”或“基本上由……组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何列举的整数或整数组，以及任选地包括不实质性改变指定方法、结构或组合物的基本或新颖性质的任何列举的整数或整数组。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等可以表示“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of)”或“基本上由……组成(consistsessentially)”等同样具有美国专利法中所赋予的含义，并且该术语是开放式的，只要所阐述内容的基本或新颖特性不会因所阐述内容以外的内容的存在而改变，则允许存在所阐述内容以外的内容，但不包括现有技术的实施方式。在一个实施方式中，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(having)”可与“由……组成(consisting)”互换。

本发明的其他目的、优点和新颖特征对于本领域的普通技术人员来说，在检查以下实施例后将变得显而易见，这些实施例并非旨在是限制性的。此外，如上所述和在权利要求部分中所述的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中找到了实验支持。

实施例

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括化学、分子、生物化学和细胞生物学技术。这些技术在文献中得到了详尽的解释。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；"Cell Biology:ALaboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；The OrganicChemistry of Biological Pathways by John McMurry and Tadhg Begley(Roberts andCompany,2005)；Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions by RichardSilverman(Academic Press,2002)；Organic Chemistry(6th Edition)by Leroy"Skip"GWade；Organic Chemistry by T.W.Graham Solomons and,Craig Fryhle。

材料和方法

GTE制备

在以下条件下萃取干磨黄金番茄(Lycopersicon esculentum Mill.(Fam.Solanaceae)或Solanum lycopersicum)浆料：萃取型-超临界CO₂萃取，压力360bar，温度60℃。来自原料的粗提物的量为2.7％(w/w)。

在下文中详述了在超临界萃取的黄金番茄中鉴定的化合物的非限制性实例，包括其相对量(表1)。总萃取物重量为7.55克。

表1.在通过超临界萃取获得的粗GTE中鉴定的化合物

化合物	重量％
		番茄红素	0.55％
生育酚	11.27％
		15-顺式-八氢番茄红素	24.06％
六氢番茄红素	6.75％
		β-胡萝卜素	0.61％
ζ-胡萝卜素	7.48％
		γ-胡萝卜素	0.16％
植物甾醇	3.15％
		总类胡萝卜素	39.61％
八氢番茄红素和六氢番茄红素(PP)	30.81％

LycoDerm、LycoMato中的含量

标准化为总类胡萝卜素10％的GTE萃取物称为Lumenato。Lumenato、Lycoderm和Lyc-O-Mato 6％之间的活性成分比较见表2。

表2植物营养素含量比较

人中性粒细胞的制备

从健康志愿者中抽取血液。在抽血后1小时内通过Ficoll-Hypaque离心、葡聚糖沉降和红细胞低渗裂解获得纯度为95％的中性粒细胞。对细胞进行计数并通过台盼蓝排除法确定它们的活力。

细胞培养

在补充有成纤维细胞生长培养基-2(培养基中的最终补充浓度：胎牛血清0.002％(v/v)、碱性成纤维细胞重组人生长因子1mg/ml和重组人胰岛素5μg/ml)、2mM L-谷氨酰胺；100U/ml青霉素；100μg/ml链霉素(Beit-Haemek，Israel)的成纤维细胞生长培养基-2(PROMOCELL)中培养正常人真皮成纤维细胞(NHFD)成人供体(PROMOCELL，Heidelberg，Germany)。细胞在含有5％CO₂的潮湿气氛中在37℃下保持。当达到80％以上的汇合度时，将NHDF接种在24孔板上。

免疫荧光分析

对于免疫荧光检测，将NHFD用甲醇在20℃下固定3分钟，接着在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。固定的NHFD与抗胶原蛋白-3抗体(Santa Cruz)在5％(w/v)的BSA/PBS中以1:50在室温下温育90min。将细胞在PBS中洗涤3次，并与Cy3抗小鼠(1:100，5％(w/v)BSA/PBS中；Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc,PA,USA)在室温下温育60min。细胞在PBS中洗涤3次，并且将细胞核用DAPI染色。然后进行最后洗涤，并使用荧光显微镜(Olympus，BX60，Hamburg，Germany)分析细胞。使用CellProfiler程序确定胶原蛋白-3的荧光强度。使用CellProfiler程序确定荧光面积的百分比。

超氧化物的产生

细胞色素C还原——通过微量滴定板技术根据铁细胞色素c的超氧化物歧化酶可抑制的还原测量中性粒细胞产生超氧阴离子。将细胞(2.5×10⁵/孔)悬浮在含有铁细胞色素c(150mM)的100μl的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中。乙酰铁细胞色素c还原，然后是在Thermomax微孔板读数器(Molecular Devices，Melno Park，CA)上以2分钟间隔在550nm处的吸光度变化。使用消光系数E₅₅₀＝21mM^-1·cm^-1，确定最大超氧化物生成速率并表示为纳摩尔O₂-/10⁶个细胞/min。

Amplex red——使用高度灵敏的荧光生物传感器Amplex red的辣根过氧化物酶(HRP)依赖性氧化。Amplex red的氧化通过HRP在细胞外发生，一旦H₂O₂由NADPH氧化酶的第一个产物O₂ ^-自发歧化产生，HRP就会将其捕获。将静止和活化的中性粒细胞(2×10⁴/孔)悬浮在含有HRP(0.1单位/ml)和Amplex red(50μM)的KRPG缓冲液(磷酸盐缓冲液，145mMNaCl、4.86mM KCl、1.22mM MgSO₄、5.5mM D-葡萄糖、0.54mM CaCl₂、pH 7.35)中。在微孔板阅读器中记录荧光，其中激发波长为535nm并且发射波长为595nm。在没有小胶质细胞的情况下测量背景荧光。

髓过氧化物酶(MPO)活性

将100μl的37℃下邻联茴香胺盐酸盐溶液(1mg邻联茴香胺，10ml磷酸盐缓冲液pH6.0+0.0015％H₂O₂)添加到96孔板中的100μl上清液中，然后立即观察光密度，之后是在Thermomax微孔板阅读器(Molecular Devices,Melno Park,CA)上以2分钟的间隔在450nm处的吸光度变化。

在添加100ng/ml TNFα之前20分钟，将生育酚和植物甾醇添加到5×10⁵人中性粒细胞中，并在37℃下在含有5％CO₂的湿润气氛中保持过夜。在培养的中性粒细胞的上清液中测量MPO活性。

在添加100ng/ml TNFa前20分钟，将ζ-胡萝卜素、八氢番茄红素、生育酚、植物甾醇或其组合添加到5×10⁵人中性粒细胞中，并在含有5％CO₂的湿润气氛中在37℃下保持过夜。如上所述测量MPO活性。

MMP-9

细胞培养上清液中的人MMP-9浓度通过ELISA试剂盒(R&D systems Minneapolis,MN,USA)进行定量。

MMP-8(胶原酶)

细胞培养上清液中的人MMP-8浓度通过ELISA试剂盒(OriGene,Technologies,Inc.Rockville,MD,USA)进行定量。

弹性蛋白酶活性

将N-甲氧基琥珀酰-ala-ala-pro-Val-P-硝基苯胺添加到100μl上清液中以达到0.5mM的最终浓度，然后在37℃下温育过夜。在Thermomax微孔板阅读器(MolecularDevices,Melno Park,CA)上测量405nm处的吸光度。

巨噬细胞的分离和培养

在收获前4天腹膜内注射1.5ml硫乙醇酸盐肉汤(4％)后，从6-8周龄雄性ICR小鼠(Harlan,Israel)的腹腔收集腹膜巨噬细胞。用PBS洗涤腹膜巨噬细胞3次，然后进行红细胞的低渗裂解，产生高度富集(90-95％)的巨噬细胞群。使用FITC缀合的大鼠抗小鼠F4/80(MCA497F)(Serotec,Oxford,England)通过FACS(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上的流式微荧光法通过FACS分析鉴定巨噬细胞。对于每个样品，分析了10,000个光散射门控活细胞。在含有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺；100U/ml青霉素；100μg/ml链霉素(Beit-Haemek，Israel)的RPMI 1640培养基中，将腹膜巨噬细胞(1×10⁶个细胞/孔)在37℃和5％CO₂氛围下于96孔板中培养。在不存在或存在这些成分的情况下，用来自肠沙门菌血清型鼠伤寒的100ng/ml LPS刺激细胞。LPS购自Sigma，Israel。

所有化合物均溶解在DMSO中，测试板中DMSO的体积不超过0.1-0.2％。向对照板中添加适当体积的DMSO(0.1-0.2％)。相对于其对照计算每个试管试验中的抑制百分比。

一氧化氮(NO)产生测定

细胞培养物上清液中的NO水平通过使用Griess试剂和亚硝酸钠作为标准品测定亚硝酸盐浓度来确定。

细胞存活

使用台盼蓝排除法通过细胞计数或通过比色MTT([3-4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-四唑

)代谢活性测定来评估细胞活力。对于MTT测量，细胞在96孔板中培养。将MTT溶解在培养基(5mg/ml)中，并以等于培养基体积的10％的量添加到每个样品中。温育4小时后，将甲臜晶体溶解在均溶于与培养基等体积的异丙醇中的100mM HCl、10％TritonX-100中，培养基仅作为背景。通过Thermomax酶标仪(Molecular Devices，Melno Park，CA，USA)在570nm处测量吸光度强度，参考波长690nm。

前胶原蛋白-3

细胞培养上清液中的人前胶原蛋白-3浓度通过人PⅢNP(III型前胶原蛋白N端肽)ELISA试剂盒(Elabscience Biotechnology Inc.Houston,Texas,USA)进行定量。由于成纤维细胞上清液中前胶原蛋白-3的浓度非常低，因此通过蒸发浓缩上清液。

胶原蛋白-3

细胞培养裂解物和上清液中的人胶原蛋白-3浓度通过人胶原蛋白，III型，α1(COL3A1)ELISA试剂盒(Cusabio Technology Inc.，Houston，Texas，USA)进行定量。

胶原蛋白-1a1

将细胞与Lumenato一起温育24h，然后添加过氧化氢(H₂O₂)，并将细胞温育另外的24h以诱导氧化应激。收集培养液，并使用特定的ELISA检测试剂盒分析向培养基分泌的胶原蛋白-1a1蛋白水平。

统计分析

使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)通过ANOVA确定评估参数之间的显著差异，然后进行多重比较Bonferroni事后校正。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。显著性：*-p<0.05，**-p<0.001，***-p<0.0001。

实施例1

GTE减少受刺激的中性粒细胞降解酶的分泌

为了研究GTE对可能对胶原蛋白造成损伤的酶的释放的影响，发明人首先确定了这些酶从活化的中性粒细胞中释放的动力学。中性粒细胞被100ng/ml TNFα或100ng/mlIL8激活，它们在暴露于紫外线期间从皮肤细胞释放并被激活。此外，用5×10^-7fMLP激活中性粒细胞进行比较。如图1所示，在人中性粒细胞中添加TNFα会导致MMP-9在激活2hr时显著(p<0.001)释放(16.52±0.5ng/ml)，并在4hr时保持相同水平。在激活的4h期间，添加IL8导致MMP-9以剂量依赖性方式释放。在用IL8(9.12±0.2ng/ml)激活2hr时检测到MMP-9的显著释放(p<0.001)，在4hr时，其进一步显著增加(p<0.0001)至17.86±0.4ng/ml。fMLP在激活30分钟(10.41+0.4ng/ml)时诱导MMP-9快速且显著(p<0.001)释放，在4小时激活期间逐渐增加至13.45+0.3ng/ml。如图2所示，添加TNFα或IL8在激活2hr时诱导MPO的显著(p<0.0001)释放，其在4hr时分别进一步增加至0.28±0.001ng/ml和0.4±0.08ng/ml。在30min时f，MLP诱导MPO快速且显著(p<0.0001)释放至0.54±0.004ng/ml，并在4hr时保持在该水平。与4hr相比，中性粒细胞激活24hr并没有增加MMP-9或MPO的释放(数据未显示)。

中性粒细胞被TNFa或IL8激活4小时并被fMLP激活30分钟，以便研究GTE对MMP-9或MPO释放的影响。在激活前，将GTE在37℃下添加到中性粒细胞中10min。如图3所示，添加浓度范围为26-210μg/ml的GTE以剂量依赖性方式抑制由TNFα、IL8或fMLP刺激的中性粒细胞释放MMP-9。TNFα、IL8或fMLP刺激的中性粒细胞的MMP-9分泌的最大抑制分别为95.4±4.6％、83.19±12.0％或76.6±12.0％。类似地，GTE诱导MPO的剂量依赖性抑制，其中对TNFα、IL8或fMLP刺激的中性粒细胞的最大抑制分别为46.0±6.7％、33.86±0.7％或38.5±4.5％(图4)。

接下来，通过细胞色素C还原分析GTE对中性粒细胞超氧化物释放的影响。由于超氧化物不稳定，因此在添加上述每种激动剂(例如，TNFα、IL8等)后立即进行分析。如图5所示，在刺激前添加GTE 10分钟诱导了对超氧化物产生的剂量依赖性抑制，达到63.27±13％、67.55±3.4％和56.81±2.4％的最大抑制，中性粒细胞分别受到TNFα、IL8和fMLP的刺激。

实施例2

GTE减少成纤维细胞-中性粒细胞共培养物中的胶原蛋白流失

为了研究GTE对由活化的中性粒细胞诱导的胶原蛋白-3损伤的影响，本发明人使用了培养的成纤维细胞和中性粒细胞的最佳条件。将1×10⁵个成纤维细胞铺板24hr以获得汇合培养物。如胶原蛋白-3的免疫荧光染色所示(图6A-6N)，添加2×10⁵活化的中性粒细胞诱导了约30％的显著胶原蛋白-3损伤，但并未破坏培养物。在每次处理中测量细胞活力，发现在不存在或存在GTE的情况下添加受刺激的神经毡不会影响细胞活力。用于共培养实验的中性粒细胞浓度低于用于研究中性粒细胞的浓度(图1-5)。中性粒细胞与GTE在37℃下温育10分钟，然后添加到培养物中24hr。如胶原蛋白-3的免疫荧光染色所示(图6A-6N)，在添加到成纤维细胞培养物之前，添加在6.5-10⁴μg/ml范围内GTE预温育的中性粒细胞导致剂量依赖性抑制胶原蛋白-3损伤。在52μg/ml的GTE(约80％的保护)下，达到对胶原蛋白损伤的最大预防。培养物中胶原蛋白-3水平的定量——其通过光密度测定法确定并呈现在图6O中，高于其他番茄衍生组合物(图6P-6Q)。共培养物中Lumenato的存在导致分泌的前胶原蛋白-3剂量依赖性增加至68.21+7.1pg/ml(图6S)，减去中性粒细胞诱导的前胶原蛋白-3水平(用水平虚线标记)表明在104ug/ml Lumenato存在下增加了约10pg/ml。进一步地，如通过MTT或DAPI染色所测量的(数据未显示)，向成纤维细胞添加Lumenato过夜不影响成纤维细胞数量。尽管如此，添加Lumenato以剂量依赖性方式诱导上清液中前胶原蛋白-3水平的显著增加(图18)。

用50μM H₂O₂处理NHDF细胞导致胶原蛋白-1a1分泌减少约10倍(图19)。Lumenato已经在使用的最低浓度下，完全消除了胶原蛋白分泌的减少。鉴于Lumenato还减少MMP1分泌的能力，该结果表明Lumenato在体内是一种有希望增加皮肤胶原蛋白水平和减少皮肤老化的药物。

在上述共培养系统下释放的降解酶的量/水平(如图6中所述)在培养24小时后在上清液中测量。共培养实验中使用的GTE浓度低于用于研究其对中性粒细胞影响的浓度(图1-5)，因为在共培养实验中使用了较低浓度的中性粒细胞(相比于5×10⁶/ml为2.5×10⁵/ml)。如图7A所示，对于GTE，观察到MMP-9的剂量依赖性抑制，但在其他番茄衍生组合物中没有观察到(图7B-7C)。GTE的抑制为约12.5±3.9％抑制。基于其在上清液中的活性确定的MPO释放在GTE浓度低至13μg/ml时受到显著抑制，其逐渐增加，在测试的最大浓度下达到45.8±5.6％的抑制(图8A)。与其他番茄衍生组合物相比，GTE MPO抑制效果为约2倍(图8B-8C)。Amplex red研究了GTE对超氧化物产生的影响，该研究在刺激中性粒细胞后立即进行(超氧化物不稳定)。如图9所示，GTE诱导显著的剂量依赖性抑制，达到78.5±0.9％抑制。GTE在共培养中的有益效果通过抑制MMP-8(胶原酶)被进一步例证，如图10所呈现。GTE诱导MMP-8释放的逐渐抑制，在26μg/ml的GTE下，实现43.0±7.1％的最大抑制，其在更高的GTE浓度下持续。在受刺激的中性粒细胞和成纤维细胞的共培养物中，在存在GTE的情况下，弹性蛋白酶活性没有显著升高(图11)。

实施例3

GTE减少受刺激的巨噬细胞中一氧化氮的产生

用LPS刺激巨噬细胞，然后用增加浓度的过滤的浆料或GTE温育。如图12所示，GTE在抑制一氧化氮(NO)产生方面的效果是过滤后的浆料的2倍。发现GTE从低至5μg/ml的浓度开始以剂量依赖性方式抑制NO的产生，显示出约20％的抑制。在GTE浓度为100μg/ml的情况下，NO产生抑制水平连续增加到约55％。

实施例4

多种植物营养素的组合物协同地抑制MPO活性

发明人检查了多种植物营养素对受刺激的中性粒细胞中的MPO活性的影响。生育酚或植物甾醇的单独添加对用TNFα活化的中性粒细胞的MPO释放和活性没有影响(图13A-13B)。然而，补充225μg/ml的生育酚和62.5μg/ml的植物甾醇导致协同效应，与对照相比，具有约20％的MPO活性抑制(图13C)。

发明人还检查了添加ζ-胡萝卜素与八氢番茄红素、生育酚或植物甾醇对MPO活性的影响。仅添加ζ-胡萝卜素、生育酚、八氢番茄红素或植物甾醇对MPO活性没有抑制作用到至多5％的MPO活性抑制(图14)。然而，以存在于GTE中的比例添加ζ-胡萝卜素与以下任何一种：生育酚、八氢番茄红素或植物甾醇诱导TNFα-激活的中性粒细胞的MPO活性或释放的协同抑制(图14)。

实施例5

具有增加的类胡萝卜素生物利用度的Lumenato胶囊

发明人已经检查了在Lumenato胶囊内递送的类胡萝卜素的生物利用度。在施用后1周、2周、3周和4周对血浆中的以下类胡萝卜素进行定量。作为Lumenato(黄金番茄萃取物)中的主要类胡萝卜素的八氢番茄红素、六氢番茄红素和ζ-胡萝卜素被很好地吸收(图15)。发现ζ-胡萝卜素被吸收得非常好，如血浆浓度的急剧增加所反映的(图15A)。

实施例6

平衡皮肤细胞中氧化应激诱导的损伤

然后，发明人研究了Lumenato——金番茄萃取物是否增强皮肤弹性并防止人角质形成细胞中的氧化应激诱导的皮肤损伤。已知活性氧种类(ROS)诸如H₂O₂会在皮肤中诱导炎症过程，增加皮肤细胞中基质金属蛋白酶(MMP)的产生，从而导致胶原蛋白降解。

发明人使用过氧化氢H₂O₂在KERTr人角质形成细胞中诱导氧化应激，并分析了对细胞数量(细胞死亡)和MMP1分泌的影响。使用XTT细胞增殖试剂盒测定细胞活力，并通过ELISA测量MMP1水平。用H₂O₂处理细胞导致剂量依赖性细胞死亡(图16A)和MMP1分泌增加(图16B)。在添加H₂O₂之前，以指定浓度添加Lumenato会增加细胞活力并减少MMP1的分泌。

对上述保护作用的一种可能解释是抗氧化反应元件转录系统(ARE/Nrf2)的激活。因此，发明人使用报告基因测定法测量了该转录系统的激活。观察到Lumenato对ARE/Nrf2转录活性的剂量依赖性激活(图17)。

实施例7

皮肤状况和外观

发明人编制了基线皮肤问卷，其包括14个问题，询问参与者在服用研究产品Lumenato之前和之后(例如，在基线时和12周后)他们的皮肤状况和外观。结果显示(表3)14个问题中的11个(不包括第3、10和11个问题)的满意度显著提高。

表3.基线皮肤问卷的结果

进一步地，发明人编制了皮肤更新问卷，其包括14个问题，询问参与者在服用研究产品Lumenato(第4、8和12周)时他们的皮肤状况和外观。结果显示(表4)14个问题中有10个(不包括第3、8、11和12个问题)的满意度显著提高。

表4皮肤更新问卷结果

虽然已经具体描述了本发明，但是本领域技术人员将理解可以做出许多变化和修改。因此，本发明不应被解释为限于具体描述的实施方式，并且本发明的范围和概念将通过参考所附权利要求而更容易理解。

Claims

1.一种组合物，其包含：为所述组合物中总类胡萝卜素的55-65％(w/w)的量的八氢番茄红素、为所述组合物中总类胡萝卜素的10-20％(w/w)的量的六氢番茄红素、为所述组合物中总类胡萝卜素的15-25％(w/w)的量的ζ-胡萝卜素和可接受的载体。

2.根据权利要求1的组合物，其中组合的所述八氢番茄红素和所述六氢番茄红素与所述ζ-胡萝卜素的重量比范围为15:1(w/w)至2:1(w/w)。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含选自以下的另外的类胡萝卜素：番茄红素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素及其任意组合。

4.根据权利要求3所述的组合物，其包含小于所述组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)的量的所述番茄红素、小于所述组合物中总类胡萝卜素的5％(w/w)的量的所述β-胡萝卜素、小于所述组合物中总类胡萝卜素的0.2-1.5％(w/w)的量的所述γ-胡萝卜素或其组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其包含为所述组合物的10-15％(w/w)的总类胡萝卜素量。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包含生育酚。

7.根据权利要求6所述的组合物，其包含为所述组合物中总类胡萝卜素的10-30％(w/w)的量的所述生育酚。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其进一步包含植物甾醇。

9.根据权利要求8所述的组合物，其包含为所述组合物中总类胡萝卜素的5-15％(w/w)的量的所述植物甾醇。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，用于减少胶原蛋白流失、增加胶原蛋白水平或两者。

11.一种用于预防或治疗有需要的受试者的胶原蛋白流失的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至10中任一项所述的组合物，从而预防或治疗所述受试者的胶原蛋白流失。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述预防或治疗是将胶原蛋白流失减少50-90％。

13.一种降低以下任何一种的量、活性或两者的方法：基质金属蛋白酶(MMP)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物(SO)、弹性蛋白酶、一氧化氮(NO)及其任意组合，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至10中任一项所述的组合物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述MMP选自：MMP-9、MMP-8、MMP-1或其任何组合。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与胶原蛋白流失相关疾病。

16.根据权利要求15的方法，其中所述胶原蛋白流失相关疾病选自：年龄相关疾病、皮肤病和炎性疾病。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述皮肤病包括由以下任何一种诱导的皮肤损伤：辐射、氧化应激、DNA损伤、端粒缩短、炎症、烟草使用及其任意组合。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述辐射包括UV辐射、可见光辐射、红外辐射或其任何组合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述UV辐射是UVA、UVB、UVC或其任何组合。

20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法，其中与对照相比，所述受试者在皮肤中、全身地或两者具有下述任一种的增加的量、增加的活性或两者：MMP、MPO、SO、弹性蛋白酶、NO及其任意组合。

21.根据权利要求11至20中任一项所述的方法，其中所述施用包括口服施用、局部施用或两者。