TW202114645A - 用於抑制膠原蛋白流失之組合物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明係針對一種包括八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素之組合物，以及其使用方法，諸如用於減少膠原蛋白流失。

Description

用於抑制膠原蛋白流失之組合物及方法 相關申請之交叉引用

本申請主張2019年10月10日申請之名稱為《用於抑制膠原蛋白流失之組合物及方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING COLLAGEN LOSS)》之美國臨時專利申請第62/913,220號的優先權益，該申請之內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明大體上係關於類胡蘿蔔素之領域以及其使用方法，諸如用於治療包含膠原蛋白流失之皮膚相關病狀。

由衰老引起的皮膚生物學結構及功能之衰退主要由於人口平均壽命的增加而引起了極大的關注。成纖維細胞為真皮之主要成分，且已知其用於產生膠原蛋白及彈性纖維。光老化皮膚之標誌為日光性彈性纖維變性，此可能係細胞外基質(ECM)降解之最終產物。支撐皮膚組織中之細胞的ECM包含膠原蛋白、彈性纖維及原纖維蛋白。

據報導，嗜中性白血球在暴露於引起紅斑劑量之紫外線B(UVB)、模擬太陽輻射(SSR)及天然日光之一部分後會滲入皮膚。人體皮膚暴露於某一臨限值之UV、紅外輻射或熱量會導致嗜中性白血球流入。此等嗜中性白血球充滿了能夠使膠原蛋白及彈性纖維降解的強力蛋白水解酶。嗜中性白 血球衍生之蛋白水解酶涉及在若干非皮膚學病狀中觀察到的ECM損傷。此外，有人提出，光老化之關鍵因素可能係嗜中性白血球而非角質細胞及成纖維細胞。據報導，白皮膚暴露於引起紅斑劑量之SSR後，滲入的嗜中性白血球為蛋白水解酶(尤其基質金屬蛋白酶(MMP)及彈性蛋白酶)之主要來源，而非角質細胞或成纖維細胞。氧衍生之代謝物誘導蛋白水解酶之活化及/或防止此等酶被抗蛋白酶滅活，因此誘導ECM損傷，其最終可能導致日光性彈性纖維變性。

仍然非常需要用於防止嗜中性白血球衍生之蛋白水解酶釋放且因此避免膠原蛋白破壞的組合物及方法。

以下實施例及其態樣結合於系統、工具及方法描述及說明，該等系統、工具及方法意謂例示性及說明性的，不意謂限制範疇。

根據第一態樣，提供一種組合物，其包括：含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的55-65%(w/w)的八氫番茄紅素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的10-20%(w/w)的六氫番茄紅素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的15-25%(w/w)的ζ胡蘿蔔素；以及可接受之載劑。

根據另一態樣，提供一種用於預防或治療有需要之個體之膠原蛋白流失的方法，其包括向該個體投予治療有效量的本文所揭示組合物，從而預防或治療該個體之膠原蛋白流失。

根據另一態樣，提供一種用於降低有需要個體之基質金屬蛋白酶(MMP)、髓過氧化酶(MPO)、超氧化物(SO)、彈性蛋白酶、一氧化氮(NO)及其任何組合中之任一者之量、活性或兩者的方法，其包括向該個體投予治療有效量的本文所揭示組合物。

在一些實施例中，組合的該八氫番茄紅素及該六氫番茄紅素與該 ζ胡蘿蔔素之重量比介於15：1(w/w)至2：1(w/w)範圍內。

在一些實施例中，該組合物進一步包括選自以下組成之組的額外類胡蘿蔔素：番茄紅素、β胡蘿蔔素、γ胡蘿蔔素及其任何組合。

在一些實施例中，該番茄紅素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於5%(w/w)，該β胡蘿蔔素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於5%(w/w)，該γ胡蘿蔔素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的0.2-1.5%(w/w)，或其組合。

在一些實施例中，該組合物包括的類胡蘿蔔素總量為該組合物的10-15%(w/w)。

在一些實施例中，該組合物進一步包括生育酚。

在一些實施例中，該生育酚之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的10-30%(w/w)。

在一些實施例中，該組合物進一步包括植物固醇。

在一些實施例中，該植物固醇之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的5-15%(w/w)。

在一些實施例中，該組合物用於減少膠原蛋白流失、增加膠原蛋白含量或兩者兼有。

在一些實施例中，預防或治療減少50-90%的膠原蛋白流失。

在一些實施例中，MMP係選自：MMP-9、MMP-8、MMP-1或其任何組合。

在一些實施例中，該個體罹患膠原蛋白流失相關疾病。

在一些實施例中，該膠原蛋白流失相關疾病係選自以下組成之組：年齡相關疾病、皮膚疾病及發炎性疾病。

在一些實施例中，該皮膚疾病包括由以下中之任一者誘導的皮膚 損傷：輻射、氧化應激、DNA損傷、端粒縮短、發炎、吸菸以及其任何組合。

在一些實施例中，該輻射包括UV輻射、可見光輻射、紅外輻射或其任何組合。

在一些實施例中，該UV輻射為UVA、UVB、UVC或其任何組合。

在一些實施例中，與對照相比，個體在皮膚、全身或兩者中具有MMP、MPO、SO、彈性蛋白酶、NO及其任何組合中之任一者的量增加、活性增加或兩者兼有。

在一些實施例中，投予包括經口投予、局部投予或兩者。

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及/或科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。儘管與本文中所描述之方法及材料類似或等效的材料及方法可用於本發明之實施例的實踐或測試中，但下文描述例示性方法及/或材料。在有衝突之情況下，將以專利說明書(包含定義)為準。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為必定限制性的。

本發明之其他實施例及完整適用範疇將由下文給出之[實施方式]而變得顯而易見。然而，應瞭解，[實施方式]及特定實例雖然指示本發明之較佳實施例，但僅為了說明而給出，因為熟習此項技術者根據此[實施方式]將顯而易知屬於本發明精神及範疇內的各種改變及修改。

除了上文所描述之例示性態樣及實施例之外，其他態樣及實施例藉由參考圖式及藉由研究以下[實施方式]而變得顯而易見。

圖1A至圖1C為垂直條形圖，其展示受腫瘤壞死因子α(TNFα， 1A)、介白素8(IL8，1B)及甲醯基-甲硫胺酸-白胺酸-苯丙胺酸(fMLP，1C)促效劑刺激的人嗜中性白血球之基質金屬蛋白酶9(MMP-9)分泌動力學。值表示5個獨立實驗的平均值±平均值之標準誤差(SEM)。

圖2A至圖2C為垂直條形圖，其展示受TNFα(2A)、IL8(2B)及fMLP(2C)促效劑刺激的人嗜中性白血球之髓過氧化酶(MPO)分泌動力學。值表示5個獨立實驗的平均值±SEM。

圖3A至圖3C為垂直條形圖，其展示Lumenato(金番茄超臨界提取物或GTE)對MMP-9分泌之抑制作用。人嗜中性白血球受TNFα(3A)、IL8(3B)及fMLP(3C)促效劑刺激，且在GTE存在下觀測到對MMP-9分泌之劑量依賴性抑制。值表示3個獨立實驗的平均值±SEM。

圖4A至圖4C為垂直條形圖，其展示GTE對MPO分泌之抑制作用。人嗜中性白血球受TNFα(4A)、IL8(4B)及fMLP(4C)促效劑刺激，且在GTE存在下觀測到對MPO分泌之劑量依賴性抑制。值表示3個獨立實驗的平均值±SEM。

圖5A至圖5C為垂直條形圖，其展示GTE對超氧化物分泌之抑制作用。人嗜中性白血球受TNFα(5A)、IL8(5B)及fMLP(5C)促效劑刺激，且在GTE存在下觀測到對超氧化物分泌之劑量依賴性抑制。值表示3個獨立實驗的平均值±SEM。

圖6A至圖6S為免疫螢光顯微照片及垂直條形圖，其展示GTE之添加以劑量依賴性方式防止正常人真皮成纖維細胞(NHDF)中由嗜中性白血球誘導之膠原蛋白-3破壞。將嗜中性白血球用100ng/ml TNFα加以刺激，且在逐漸增加之GTE濃度下進行培育：6.5μg/ml(6C、6J)、13μg/ml(6D、6K)、26μg/ml(6E、6L)、52μg/ml(6F、6M)及104μg/ml(6G、6N)。對照組：陰性(無TNFα；6A及6H)，陽性(無GTE；6B及6I)。(6A至6G)為膠 原蛋白-3的放大倍數×40的代表性免疫螢光染色。(6H至6N)為膠原蛋白-3的放大倍數×200的代表性免疫螢光染色。(6A至6N)在每個實驗中，掃描每種處理的10個視野。(6O)為垂直條形圖，其展示GTE防止膠原蛋白破壞，如藉由對膠原蛋白-3之免疫螢光染色進行密度測定所分析。值表示5個不同實驗之平均值。(6P)及(6Q)為垂直條形圖，其分別展示逐漸增加之LycoDerm及LycoMato濃度對防止膠原蛋白流失之影響。較高濃度之LycoDerm或LycoMato對細胞有毒性。相比之下，對於104μg/ml(使用的最高濃度)的GTE，未觀測到細胞毒性作用。(6R)為展示膠原蛋白-3之免疫螢光染色(6A至6N)之密度測定結果的圖。所展示為三個不同實驗的平均值±SEM。(6S)為展示分泌至共培養物之上清液中的前膠原蛋白-3之量的圖。所展示為三個不同實驗的平均值±SEM，每個實驗一式三份。水平虛線表示在沒有嗜中性白血球之作用的情況下Lumenato之作用。Lum-Lumenato(μg/ml)，Fib-成纖維細胞，Neu-嗜中性白血球。

圖7A至圖7C為垂直條形圖，其展示與NHDF共培養的嗜中性白血球之MMP-9釋放之GTE誘導抑制(如圖6中所描述)。在共培養物之上清液中定量MMP-9(7A)。值表示5個不同實驗之平均值。(7B)及(7C)為垂直條形圖，其分別展示逐漸增加之LycoDerm及LycoMato濃度對MMP-9含量之影響。較高濃度之LycoDerm或LycoMato對細胞有毒性。相比之下，對於104μg/ml(使用的最高濃度)的GTE，未觀測到細胞毒性作用。

圖8A至圖8C為垂直圖表，其展示與NHDF共培養的嗜中性白血球之MPO釋放之GTE誘導抑制(如圖6中所描述)。基於MPO在共培養物之上清液中的活性來判定其定量(8A)。值表示5個不同實驗之平均值。(8B)及(8C)為垂直條形圖，其分別展示逐漸增加之LycoDerm及LycoMato濃度對MPO活性之影響。較高濃度之LycoDerm或LycoMato對細胞有毒性。相比之下， 對於104μg/ml(使用的最高濃度)的GTE，未觀測到細胞毒性作用。

圖9為垂直條形圖，其展示與NHDF共培養的嗜中性白血球之超氧化物釋放之GTE誘導抑制(如圖6中所描述)。超氧化物含量係使用Amplex red來偵測。值表示5個不同實驗之平均值。

圖10為垂直條形圖，其展示與NHDF共培養的嗜中性白血球之MMP-8(膠原蛋白酶)釋放之GTE誘導抑制(如圖6中所描述)。在共培養物之上清液中定量MMP-8。值表示5個不同實驗之平均值。

圖11為垂直條形圖，其展示與NHDF共培養的嗜中性白血球之彈性蛋白酶釋放之GTE誘導抑制(如圖6中所描述)。基於彈性蛋白酶在共培養物之上清液中的活性來判定其定量。值表示5個不同實驗之平均值。

圖12A至圖12B為垂直條形圖，其展示果漿或GTE對受脂多醣(LPS)刺激的巨噬細胞之一氧化氮(NO)釋放的影響。將果漿溶解在介質中並過濾；將GTE溶解在DMSO中。在所有測試濃度下，細胞存活均不受影響，如藉由MTT還原所判定。(12A)展示過濾後果漿對NO產生之影響，且(12B)展示GTE對NO產生之影響。結果表示進行的2個實驗之平均值。

圖13A至圖13C為垂直條形圖，其展示以GTE中存在之比例將生育酚及植物固醇添加至受刺激的嗜中性白血球引起對於用TNFα活化的嗜中性白血球之MPO釋放及活性的顯著協同抑制。單獨添加生育酚(13A)或植物固醇(13B)對於用TNFα活化的嗜中性白血球之MPO釋放及活性沒有影響。相比而言，225μg/ml生育酚及62.5μg/ml植物固醇產生了大約20% MPO活性抑制之協同作用，而高10倍或低10倍的比例則沒有協同作用(13C)。

圖14為垂直條形圖，其展示以GTE中存在之比例將ζ胡蘿蔔素與八氫番茄紅素、生育酚或植物固醇一起添加至受刺激的嗜中性白血球引起對於MPO活性之顯著協同抑制。單獨添加ζ胡蘿蔔素、生育酚、八氫番茄紅素或 植物固醇對MPO活性至多具有5%抑制，或在大多數情況下沒有作用。以GTE中所存在之比例添加ζ胡蘿蔔素與生育酚、八氫番茄紅素或植物固醇中之任一者都會誘導對於經TNFα活化的嗜中性白血球之MPO活性或釋放之協同抑制。

圖15A至圖15B為展示GTE(例如，Lumenato)膠囊具有增加的類胡蘿蔔素生體可用率的圖。作為金番茄提取物中之主要類胡蘿蔔素的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素顯示出良好的吸收性。血漿濃度之急劇增加反映了ζ胡蘿蔔素之吸收極好(15A)。(15B)為僅展示八氫番茄紅素及六氫番茄紅素之生體可用率動力學的圖。

圖16A至圖16B為展示H₂O₂以劑量依賴性方式誘導細胞死亡且增加MMP1分泌的圖。在添加H₂O₂之前添加指定濃度之Lumenato可提高細胞活力(16A)，並減少MMP1分泌(16B)。

圖17為展示GTE(例如，Lumenato)以劑量依賴性方式增加ARE/Nrf2轉錄活性之活化的圖。Lycomato作為參照物展示。所展示濃度係針對：番茄紅素(在Lycomato的情況下)及八氫番茄紅素(在Lumenato的情況下)。

圖18包含垂直條形圖，其展示共培養物之上清液中的前膠原蛋白3之含量。所展示為四個不同實驗的平均值±SEM，每個實驗一式三份。將介於6.5μg/ml至104μg/ml範圍內的Lumenato添加至以兩種不同濃度接種的成纖維細胞中。

圖19包含展示Lumenato校正H₂O₂誘導之膠原蛋白1a1分泌減少的圖。

在一些實施例中，本發明係針對一種包括多種類胡蘿蔔素之組合物。本發明部分基於以下令人驚訝的發現：包括大量八氫番茄紅素、六氫番茄 紅素及ζ胡蘿蔔素之番茄提取物與其他番茄提取物相比更大程度地防止膠原蛋白流失並抑制基質金屬蛋白酶9(MMP-9)及髓過氧化酶(MPO)活性，並且與該等番茄提取物相比具有降低的細胞毒性。

在一些實施例中，該組合物包括八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素。在一個實施例中，該組合物包括八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿蔔素及額外類胡蘿蔔素。在一個實施例中，該組合物包括八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿蔔素、番茄紅素、β胡蘿蔔素、γ胡蘿蔔素、生育酚及植物固醇。

在一些實施例中，類胡蘿蔔素為自水果、蔬菜或植物(包含植物部分)提取、分離或純化之天然類胡蘿蔔素。在另一實施例中，類胡蘿蔔素為自番茄植物中提取之類胡蘿蔔素。在另一實施例中，類胡蘿蔔素為自番茄果實中提取之類胡蘿蔔素。在另一實施例中，番茄類胡蘿蔔素為富含類胡蘿蔔素之番茄提取物。在另一實施例中，番茄類胡蘿蔔素為全天然的富含類胡蘿蔔素之番茄提取物。在另一實施例中，番茄類胡蘿蔔素為番茄類胡蘿蔔素複合物。在另一實施例中，番茄類胡蘿蔔素複合物包括植物營養素之複合物，該等植物營養素包含多種類胡蘿蔔素(例如，八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ胡蘿蔔素、β胡蘿蔔素等)、生育酚及植物固醇。在一些實施例中，類胡蘿蔔素為合成類胡蘿蔔素。

在一些實施例中，本發明提供一種藉由新穎的提取方案獲得之番茄提取物。包括八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素(其量如下文所指定)的此特定提取物具有降低的細胞毒性。在一些實施例中，降低的細胞毒性係與其他番茄提取物相比而言。在一些實施例中，降低的毒性使得能夠以較高劑量向有需要之個體提供本發明之組合物，而不會降低該個體之存活、健康或兩者。在一些實施例中，向有需要之個體投予本發明之組合物使得能夠藉由以更高的 量提供諸如八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素之活性成分來增加治療功效，該等更高的量增加治療功效，但不會由於高細胞毒性而降低該個體之存活、健康或兩者。

在一些實施例中，與其他來源於值物、水果或蔬菜之提取物(諸如番茄)相比，本發明之組合物提供更大量的具有降低毒性的類胡蘿蔔素。在一些實施例中，與其他來源於植物、水果或蔬菜之提取物(諸如番茄)相比，本發明之組合物提供增加的治療功效及降低的毒性。

在一些實施例中，本發明之組合物包括天然類胡蘿蔔素、合成類胡蘿蔔素或其任何組合。

在一些實施例中，該組合物包括的八氫番茄紅素之量為該組合物之類胡蘿蔔素總量的10-40%(w/w)、15-35%(w/w)、20-45%(w/w)、25-35%(w/w)、20-30%(w/w)或30-50%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物包括的六氫番茄紅素之量為該組合物之類胡蘿蔔素總量的1-10%(w/w)、3-12%(w/w)、4-14%(w/w)、5-10%(w/w)、8-15%(w/w)或2-9%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物包括的ζ胡蘿蔔素之量為該組合物之類胡蘿蔔素總量的4-20%(w/w)、6-18%(w/w)、5-15%(w/w)、6-12%(w/w)、9-17%(w/w)或10-17%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，組合的八氫番茄紅素及六氫番茄紅素與ζ胡蘿蔔素之重量比介於20：1(w/w)至3：1(w/w)、15：1(w/w)至3：1(w/w)、20：1(w/w)至6：1(w/w)、15：1(w/w)至2：1(w/w)、17：1(w/w)至4：1(w/w)、16：1(w/w)至7：1(w/w)、13：1(w/w)至8：1(w/w)、10：1(w/w)至3：1(w/w)或15：1(w/w)至10：1(w/w)範圍內。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物進一步包括額外類胡蘿蔔素。如本文所使用，「額外類胡蘿蔔素」係指除八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素以外或與其不同的任何類胡蘿蔔素或其代謝物。

在一些實施例中，額外類胡蘿蔔素係選自番茄紅素、β胡蘿蔔素、γ胡蘿蔔素及其任何組合。

在一些實施例中，該組合物包括的番茄紅素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於10%(w/w)、少於7%(w/w)、少於5%(w/w)、少於3%(w/w)、少於2%(w/w)或少於1%(w/w)，或其間的任何值及範圍。每種可能性代表本發明之單獨實施例。在一些實施例中，該組合物包括的番茄紅素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的1-3%(w/w)、1-5%(w/w)、2-6%(w/w)、0.5-4.5%(w/w)、0.1-3%(w/w)、0.6-4.8%(w/w)或2.5-4%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物包括的β胡蘿蔔素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於10%(w/w)、少於7%(w/w)、少於5%(w/w)、少於3%(w/w)、少於2%(w/w)或少於1%(w/w)，或其間的任何值及範圍。每種可能性代表本發明之單獨實施例。在一些實施例中，該組合物包括的β胡蘿蔔素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的1-3%(w/w)、1-5%(w/w)、2-6%(w/w)、0.5-4.5%(w/w)、0.1-3%(w/w)、0.6-4.8%(w/w)或2.5-4%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物包括的γ胡蘿蔔素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的至少0.15%(w/w)、至少0.18%(w/w)、至少0.2%(w/w)、至少0.25%(w/w)、至少0.35%(w/w)、至少0.5%(w/w)、至少0.75%(w/w)、至少0.9%(w/w)、至少1%(w/w)、至少1.2%(w/w)、至少1.35%(w/w)或至少1.7%(w/w)，或其間的任何值及範圍。每種可能性代表本發明之單獨 實施例。在一些實施例中，該組合物包括的γ胡蘿蔔素之量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的0.15-3%(w/w)、0.2-2%(w/w)、0.2-1.5%(w/w)、0.5-3%(w/w)、0.7-1.6%(w/w)、0.4-2.8%(w/w)或1.2-3.2%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物包括：含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於5%(w/w)的番茄紅素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於5%(w/w)的β胡蘿蔔素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的0.2-1.5%(w/w)的γ胡蘿蔔素；或其任何組合。

在一些實施例中，該組合物包括的額外類胡蘿蔔素之量為0.1-3%(w/w)、0.2-3.5%(w/w)、0.5-2.5%(w/w)、0.15-1.75%(w/w)、0.35-2.75%(w/w)、0.8-4%(w/w)、1-5%(w/w)或1.5-4.75%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，番茄紅素之量少於該組合物中之類胡蘿蔔素總量的5%(w/w)。

在一些實施例中，該組合物包括的類胡蘿蔔素總量為該組合物的5-25%(w/w)、10-15%(w/w)、12-35%(w/w)、3-17%(w/w)、2-20%(w/w)或1-30%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物進一步包括生育酚(例如維生素E)。在一些實施例中，該組合物包括的生育酚之量為該組合物的1-30%(w/w)、3-35%(w/w)、5-25%(w/w)、2-20%(w/w)、4-41%(w/w)、8-32%(w/w)或13-39%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，組合的八氫番茄紅素及六氫番茄紅素與生育酚之重量比介於20：1(w/w)至3：1(w/w)、15：1(w/w)至3：1(w/w)、20：1(w/w)至6：1(w/w)、17：1(w/w)至4：1(w/w)、16：1(w/w)至7：1(w/w)、13：1 (w/w)至8：1(w/w)、10：1(w/w)至3：1(w/w)或15：1(w/w)至10：1(w/w)範圍內。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，ζ胡蘿蔔素與生育酚之重量比介於3：1(w/w)至1：3(w/w)、3：1(w/w)至1：2(w/w)、3：1(w/w)至1：1(w/w)、2：1(w/w)至1：1(w/w)、2：1(w/w)至1：2(w/w)、2：1(w/w)至1：3(w/w)、1：1(w/w)至1：2(w/w)或1：1(w/w)至1：3(w/w)範圍內。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，該組合物進一步包括植物固醇。

在一些實施例中，該植物固醇選自：膽固醇、菜子固醇、菜油固醇、豆固醇、β-穀固醇、△5-燕麥固醇、△7-燕麥固醇、△7-豆固醇及其任何組合。

在一些實施例中，該組合物包括的植物固醇之量為該組合物的1-20%(w/w)、2-19%(w/w)、10-25%(w/w)、5-25%(w/w)、8-16%(w/w)、6-18%(w/w)、3-20%(w/w)、4-17%(w/w)或5-15%(w/w)。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，組合的八氫番茄紅素與六氫番茄紅素與植物固醇之重量比介於20：1(w/w)至3：1(w/w)、15：1(w/w)至3：1(w/w)、20：1(w/w)至6：1(w/w)、17：1(w/w)至4：1(w/w)、16：1(w/w)至7：1(w/w)、13：1(w/w)至8：1(w/w)、10：1(w/w)至3：1(w/w)或15：1(w/w)至10：1(w/w)範圍內。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

在一些實施例中，ζ胡蘿蔔素與植物固醇之重量比介於6：1(w/w)至2：1(w/w)、5：1(w/w)至2：1(w/w)、4：1(w/w)至2：1(w/w)、3：1(w/w)至2：1(w/w)、6：1(w/w)至3：1(w/w)、5：1(w/w)至3：1(w/w)、4：1(w/w)至3：2(w/w)或6：1(w/w)至3：1(w/w)範圍內。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

判定植物營養素(諸如類胡蘿蔔素)之量的方法係常見的，並且對於一般熟習此項技術者而言將係顯而易見的。此類方法之非限制性實例包含(但不限於)氣相層析法、液相層析法及質譜法。

在一些實施例中，該組合物為口服組合物或局部用組合物。在一些實施例中，該組合物為藥物組合物或保健營養組合物。在一些實施例中，該組合物包括藥學或保健營養學可接受的載劑或賦形劑。在一些實施例中，該組合物為藥妝組合物。在一些實施例中，該組合物包括藥妝學可接受的賦形劑。在一些實施例中，如本文所描述之組合物為可吸收的皮膚用組合物。

在一些實施例中，口服組合物呈軟膠囊形式。在一些實施例中，口服組合物呈飲料、丸粒、軟糖或粉末形式。在一些實施例中，將口服組合物混合或吸收至食品中，諸如巧克力、冰淇淋或其他。

在一些實施例中，本發明之組合物用於減少膠原蛋白流失、增加膠原蛋白含量或兩者。

量測膠原蛋白含量之方法係常見的，並且對於一般熟習此項技術者而言將係顯而易見的。用於判定或量測膠原蛋白含量之方法的非限制性實例包含免疫螢光顯微法、電子顯微法、西方墨點法及qRT-PCR，下文例示了其中一些。舉例而言，藉由比較在存在及不存在本發明組合物的情況下所量測的膠原蛋白含量，可以判定膠原蛋白流失、膠原蛋白含量增加或兩者。

在一些實施例中，本發明之組合物具有增加膠原蛋白含量之活性。在一些實施例中，增加膠原蛋白含量之活性包括選自以下之任何活性：增加膠原蛋白合成；增加每組織重量之膠原蛋白重量；增加膠原蛋白原纖維之數目、長度或兩者；增加天然或適當摺疊的膠原蛋白之量；減少結構受損的膠原蛋白之量；及其任何組合。

在一些實施例中，膠原蛋白包括前膠原蛋白3、膠原蛋白3、膠 原蛋白1a1或其任何組合。

在一些實施例中，膠原蛋白為前膠原蛋白3。在一些實施例中，膠原蛋白為膠原蛋白3。在一些實施例中，膠原蛋白為膠原蛋白1a1。在一些實施例中，膠原蛋白為膠原蛋白3、前膠原蛋白3及膠原蛋白1a1之組合。

在一個實施例中，本發明之組合物可以本身提供給個體。在一個實施例中，本發明之組合物可以作為包括藥學上可接受之載劑的藥物組合物或保健營養組合物的一部分提供給個體。

在一個實施例中，「藥物組合物」、「藥妝組合物」或「保健營養組合物」係指如本文所描述之組合物與其他化學組分(諸如生理學上合適的載劑及賦形劑)之製劑。藥物組合物、藥妝組合物或保健營養組合物之目的係促進組合物向生物體之投予。

在一些實施例中，提供用於產生包括20-30%(w/w)之量的八氫番茄紅素、5-10%(w/w)之量的六氫番茄紅素、5-15%(w/w)之量的ζ胡蘿蔔素及可接受之載劑的組合物的方法。在一些實施例中，該方法包括提取如本文所揭示之金番茄。在一些實施例中，本發明之組合物包括藉由本文所揭示之方法產生的金番茄提取物。

在一個實施例中，「組合製劑」尤其定義「分裝部分之套組」，意義在於如上文所定義的組合搭配物可獨立地給藥或藉由使用與特別量之組合搭配物的不同固定組合來給藥，亦即，同時、並行、分開或依序給藥。在一些實施例中，分裝部分之套組之各部分可接著例如同時投予或按時間順序錯開，亦即對於分裝部分之套組之任一部分在不同時間點且時間間隔相等或不同。在一些實施例中，組合搭配物之總量的比率可以在組合製劑中投予。在一個實施例中，組合製劑可改變，例如以便應對待治療之患者亞群的需求或單個患者之需求，該等不同需求可歸因於特定疾病、疾病之嚴重程度、年齡、性別或體重， 如可由熟習此項技術者易於作出。

在一個實施例中，可互換使用的片語「生理學上可接受之載劑」及「藥學上可接受之載劑」係指不會對哺乳動物造成顯著刺激並且不會消除所投予的組合物之生物活性及性質的載劑或稀釋劑。佐劑包含在此等短語下。

在一個實施例中，「賦形劑」係指添加至組合物中以進一步促進活性成分之投予的惰性物質。在一個實施例中，賦形劑包含碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖及各類澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油及聚乙二醇。

用於調配及投予藥物之技術見於《雷明頓藥物科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，賓夕法尼亞州伊斯頓的馬克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)，最新版中，該出版物以全文引用之方式併入本文中。

在一個實施例中，合適的投予途徑例如包含經口、經直腸、經黏膜、經鼻、經腸或非經腸遞送，包含肌肉內、皮下及髓內注射以及鞘內、直接室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。

根據一些實施例，提供一種治療或預防有需要之個體之膠原蛋白流失的方法，其包括向該個體投予治療有效量的本發明組合物。

在一些實施例中，該個體罹患膠原蛋白流失相關疾病。

在一些實施例中，該個體為健康個體。在一些實施例中，該個體由於以下原因中之任一者而罹患膠原蛋白流失：衰老、暴露於環境因素(例如UV、污染及煙霧)、缺乏睡眠、壓力或其任何組合。

在一些實施例中，罹患膠原蛋白流失相關疾病之個體的特徵在於具有：皮膚彈性降低；表皮厚度減小；皮膚對損傷(諸如機械損傷)之易損性增加；皮膚皺紋、下垂或兩者增加；及其任何組合。

判定皮膚彈性或表皮厚度中之任一者的方法係常見的，並且對於一般熟習此項技術者而言將係顯而易見的，並且此類方法之非限制性實例包含 (但不限於)皮膚抽吸或壓痕且隨後藉由光學量測來偵測皮膚位移以及皮膚活檢體之組織學分析。

根據一些實施例，提供一種用於抑制或降低有需要個體之MMP、MPO、超氧化物(SO)、彈性蛋白酶、一氧化氮(NO)及其任何組合中之任一者之量、活性或兩者中任一者的方法，其包括向該個體投予治療有效量的本發明組合物。

在一個實施例中，MMP為MMP-9、MMP-8、MMP-1或其任何組合。

判定MMP、MPO、SO、彈性蛋白酶、NO中任一者之量、活性或兩者的方法係常見的，並且對於熟習此項技術者而言將係顯而易見的。此等方法之非限制性實例包含(但不限於)ELISA、免疫組織化學、氧化分析及酶促分析(諸如下文所例示)及/或其他。

在一些實施例中，與對照相比，抑制或降低為50-60%、50-75%、50-90%、50-99%、65-95%、70-90%或75-99%。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

如本文所使用，對照包括健康個體之皮膚。在一些實施例中，對照係自同一個體(例如，罹患膠原蛋白流失相關疾病之個體)衍生、分離或獲得的健康皮膚樣品。

在一些實施例中，投予包括經口投予。在一些實施例中，投予包括局部投予。在一些實施例中，投予包括經口投予及局部投予之組合。

在一些實施例中，膠原蛋白流失相關疾病選自：年齡相關疾病、皮膚疾病及發炎性疾病。

如本文所使用，「年齡相關疾病」係指與其相關的疾病或病狀之發病率隨著年齡增長而快速增加。如本文所使用，術語「快速」係成指數增加。

與年齡相關的病狀之非限制性實例可以統稱為『衰老小毛病(lesser ailments of aging)』(LAA)，包含(但不限於)一般性肌無力、不耐寒、年齡相關之認知減退(亦包含輕微記憶力下降)、皮膚皺紋及皮膚挫傷癒合緩慢、消瘦(總體重減輕)、肌肉體積減少以及骨密度降低。年齡相關疾病之非限制性實例包含心血管疾病、癌症、關節炎、癡呆、白內障、骨質疏鬆、代謝疾病(包含糖尿病、膽固醇升高及脂質分佈惡化)、高血壓及神經退化性疾病(包含但不限於阿茲海默氏病(Alzheimer's disease))。

如本文所使用，片語「皮膚疾病」係指任何皮膚病理性病狀或其症狀。在一個實施例中，膠原蛋白流失係導致出現皮膚疾病的致病因素。在一個實施例中，膠原蛋白流失係由皮膚疾病之發作、開始、發展或其任何組合引起的病理生理因素。在一個實施例中，膠原蛋白流失係正在發生或正在進行的皮膚疾病的特徵性病狀。

在一些實施例中，皮膚疾病為免疫相關皮膚疾病。在一個實施例中，免疫相關皮膚疾病為發炎性皮膚疾病、自體發炎性皮膚疾病或自體免疫皮膚疾病。

如本文所使用，片語「發炎性疾病」係指涉及生物體(例如免疫系統之細胞、分子信號介體(諸如細胞介素)等)對有害外源實體(例如細菌、真菌、病毒、原生動物、過敏原等)之多組分反應的任何疾病。

在一些實施例中，基於皮膚損傷來表徵或判定皮膚疾病。在一些實施例中，皮膚損傷係由以下中之任一者誘導：輻射、氧化應激、DNA損傷、端粒縮短、發炎、吸菸以及其任何組合。

在一些實施例中，輻射包括光譜內的任何輻射波長。如本文所使用，術語「光譜」涵蓋介於10^-9m至10^-3m範圍內的波長。在一些實施例中，光譜內之輻射波長包括UV輻射、可見光輻射、紅外輻射或其組合。在一些實施 例中，暴露於輻射包括暴露於陽光。

如本文所使用，術語「紫外(UV)」涵蓋UV範圍之任何波長。在一些實施例中，UV為UV輻射。在一些實施例中，UV輻射為UVA輻射、UVB輻射、UVC或其任何組合。

如本文所使用，術語「紅外」涵蓋自700nm橫跨至1,000nm(具有430THz至300GHz之頻率)的波長。

在一些實施例中，與對照相比，個體在皮膚、全身或兩者中具有MMP、MPO、SO、彈性蛋白酶、NO及其任何組合中之任一者的量增加、活性增加或兩者兼有。

在一些實施例中，與對照相比增加1-10%、5-30%、15-50%、25-75%、70-150%、100-350%、250-550%、500-750%或700-1,000%。每種可能性代表本發明之單獨實施例。

如本文所使用，術語疾病、病症或病狀之「治療(treatment/treating)」涵蓋其至少一種症狀之緩解、其嚴重程度之降低或其進展之抑制。治療不一定意謂疾病、病症或病狀已完全治癒。作為有效治療，本文中有用的組合物僅需要降低疾病、病症或病狀之嚴重程度，降低與之相關的症狀之嚴重程度，或改善患者或個體之生活品質。

如本文所使用，術語疾病、病症或病狀之「預防」涵蓋延遲、預防、遏制或抑制疾病、病症或病狀之發作。如根據本發明描述之主題所使用，術語「預防」係關於一種防治方法，其中在疾病/病症過程之誘導或發作之前使個體暴露於本發明描述之組合物或調配物。當個體之遺傳譜系指示有出現待預防之疾病/病症的易感性時，可以這樣做。舉例而言，此可能適用於其祖先對某些類型之病症(例如發炎性病症)表現出易感性的個體。術語「遏制」用於描述其中疾病/病症過程已經開始但尚未意識到該病狀之明顯症狀的病狀。因此， 個體之細胞可以患有疾病/病症，但是尚未在臨床上認識到疾病/病症的外部跡象。在任一情況下，術語防治都可以涵蓋預防及遏制。相反，術語「治療」係指活性劑用於對抗患者已經意識到其臨床表現之已存在病狀的臨床應用。

在一些實施例中，預防包括降低疾病嚴重程度、延遲疾病發作、降低疾病累積發病率或其任何組合。

如本文所使用，術語「個體(subject/individual)」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」係指需要治療的任何個體，尤其哺乳動物個體，例如人。

在論述中，除非另外說明，否則修飾本發明之實施例的一個或多個特徵之條件或關係特性的形容詞(諸如「實質上」及「約」)應理解為意謂條件或特性限定在其意欲之應用的實施例之操作可接受之公差內。除非另外指示，否則說明書及申請專利範圍中之詞語「或」被認為是包含性的「或」而不是排他性的或，並且指示其所結合的項中之至少一者或任何組合。

應理解，如上文及本文其他地方所使用的術語「一(a/an)」係指所列舉組分中之「一個或多個」。一般熟習此項技術者將清楚的係，除非另外具體說明，否則單數的使用包含複數。因此，術語「一(a/an)」及「至少一個(種)」在本申請案中可互換使用。

為了更好地理解本教示，並且決不限制該等教示之範疇，除非另外指示，否則在說明書及申請專利範圍中使用的表示數量、百分比或比例的所有數字以及其他數值應理解為在所有情況下均由術語「約」修飾。因此，除非有相反指示，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，每一數值參數應至少根據所報告之有效數位之數量且藉由應用一般捨入技術來理解。

在本申請之說明書及申請專利範圍中，動詞「包括」、「包含」及「具有」中之每一者及其同源詞都用於表示動詞之一個或多個賓語不一定為 動詞之一個或多個主語之組分、元素或部分的完全清單。

如本文所使用之其他術語旨在由其在此項技術中眾所周知的含義來定義。

除非明確陳述或自上下文顯而易見，否則如本文中所使用，術語「或」應理解為包含性的。

在整個本說明書及申請專利範圍中，詞語「包括(comprise)」或諸如「包括(comprises)」或「包括(comprising)」之變化形式指示包含任何所陳述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。

如本文所使用，如在整個說明書及申請專利範圍中使用的術語「基本上由......組成(consists essentially of)」或諸如「基本上由......組成(consist essentially of)」或「基本上由......組成(consisting essentially of)」之變化形式指示包含任何所述整數或整數群，且視情況包含不會實質上改變指定方法、結構或組合物之基礎或新穎特性的任何所述整數或整數群。

如本文所使用，術語「包括(comprises)」、「包括(comprising)」、「含有」、「具有」及其類似者可意謂「包含(includes)」、「包含(including)」及其類似者；「基本上由......組成(consisting essentially of)」或「基本上由......組成(consists essentially)」同樣具有美國專利法賦予的含義，並且該術語係開放式的，從而允許存在比所列舉的更多的內容，只要所陳述的內容之基礎或新穎特徵不由於存在比所列舉的更多的內容而改變，但不包含先前技術實施例。在一個實施例中，術語「包括(comprises)」、「包括(comprising)」、「具有」可與「組成」互換。

一般熟習此項技術者在研究以下實例之後將顯而易知本發明之其他目的、優點及新穎特徵，此等實例並不意欲為限制性的。另外，如上文所描繪並且如下文申請專利範圍部分中所主張的本發明之各種實施例及態樣中之 每一者均在以下實例中找到實驗支持。

實例

一般而言，本文所用之命名法及本發明中所用之實驗室程序包含化學、分子、生物化學及細胞生物學技術。此類技術在文獻中已充分解釋。舉例而言，參見：《分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A laboratory Manual)》，Sambrook等人，(1989)；《分子生物學之當前方案(Current Protocols in Molecular Biology)》，第I-III卷，Ausubel,R.M.編(1994)；《細胞生物學：實驗室手冊(Cell Biology：A Laboratory Handbook)》，第I-III卷，Cellis,J.E.編(1994)；《生物途徑之有機化學(The Organic Chemistry of Biological Pathways)》，John McMurry及Tadhg Begley(Roberts and Company，2005)；《酶催化反應之有機化學(Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions)》，Richard Silverman(學術出版社(Academic Press)，2002)；《有機化學(Organic Chemistry)》(第6版)，Leroy「Skip」G Wade；《有機化學(Organic Chemistry)》，T.W.Graham Solomons及Craig Fryhle。

材料與方法

GTE製備

在以下條件下提取乾土金番茄(番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)(茄科植物)或番茄(Solanum lycopersicum))果漿：提取類型：超臨界CO₂提取；壓力：360巴；及溫度：60℃。來自原材料的粗提物之量為2.7%(w/w)。

下文(表1)中列出在超臨界提取的金番茄中鑑定出的化合物之非限制性實例，包含其相對量。提取物的總重量為7.55克。

LycoDerm、LycoMato中之含量

標準化至10%類胡蘿蔔素總量的GTE提取物被稱為Lumenato。表2中列出了Lumenato、Lycoderm及Lyc-O-Mato 6%之活性成分的比較。

人嗜中性白血球之製備

自健康志願者抽取血液。抽血後1小時內，藉由Ficoll-Hypaque離心、聚葡萄糖沈澱及紅細胞之低滲溶解，獲得純度為95%的嗜中性白血球。對細胞進行計數並藉由錐蟲藍排除法(trypan blue exclusion)判定其活力。

細胞培養

正常人真皮成纖維細胞(NHFD)成年供體(PROMOCELL，德國海德堡(Heidelberg,Germany))在成纖維細胞生長培養基2(PROMOCELL)中進行培養，該生長培養基中補充有：成纖維細胞生長培養基2(培養基中的最終補充協調：胎牛血清0.002%(v/v)，基礎成纖維細胞重組人生長因子1mg/ml及重組人胰島素5μg/ml)；2mM L-麩醯胺酸；100U/ml青黴素；100μg/ml鏈黴素(以色列貝特海默克(Beit-Haemek,Israel))。將細胞保持在37℃下，在含有5% CO₂之潮濕氛圍中。當達到超過80%的融合時，將NHDF接種在24孔盤上。

免疫螢光分析

對於免疫螢光偵測，將NHFD用甲醇在20℃下固定3分鐘，然後在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌。將固定的NHFD與1：50溶於5%(w/v)BSA/PBS中之抗膠原蛋白-3抗體(Santa Cruz)在室溫下在培育90分鐘。將細胞在PBS中洗滌三次，並與Cy3抗小鼠(1：100溶於5%(w/v)BSA/PBS中；美國賓夕法尼亞州傑克遜免疫研究實驗室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc,PA,USA))在室溫下培育60分鐘。將細胞在PBS中洗滌三次，並且用DAPI將細胞核染色。然後進行最終洗滌，並使用螢光顯微法(Olympus，BX60，漢堡，德國)分析細胞。使用CellProfiler程式來測定膠原蛋白-3之螢光強度。使用CellProfiler程式來測定螢光面積%。

超氧化物產生

細胞色素C的還原-藉由微量滴定盤技術來量測嗜中性白血球產生之超氧陰離子，因為超氧化歧化酶可抑制高鐵細胞色素c之還原。將細胞(每孔2.5×10⁵個)懸浮於100μl含高鐵細胞色素c(150mM)的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks' Balanced Salts Solution；HBSS)中。還原乙醯基高鐵細胞色素c，然後 在Thermomax微盤讀取器(Molecular Devices，Melno Park，CA)上以2分鐘的時間間隔改變550nm下之吸光度。使用消光係數E₅₅₀=21mM^-1．cm^-1，測定超氧化物產生之最大速率，並表達為奈莫耳O₂ ^-/10⁶個細胞/分鐘。

Amplex red-利用高度敏感的螢光生物感測劑Amplex red之辣根過氧化酶(HRP)依賴性氧化。Amplex red之氧化藉由HRP在細胞外發生，只要O₂ ^-(NADPH氧化酶之第一產物)自發歧化生成H₂O₂，HRP便截獲該H₂O₂。將靜止及活化的嗜中性白血球(每孔2×10⁴個)懸浮於含有HRP(0.1單位/ml)及Amplex red(50μM)之KRPG緩衝液(磷酸鹽緩衝液，145mM NaCl，4.86mM KCl，1.22mM MgSO₄，5.5mM D-葡萄糖，0.54mM CaCl_2，pH 7.35)中。在微盤讀取器中以535nm激發及595nm發射波長來記錄螢光。在沒有微膠質細胞的情況下量測背景螢光。

髓過氧化酶(MPO)活性

將100μl 37℃的O-二甲氧苯胺鹽酸鹽溶液(1mg O-二甲氧苯胺，10ml磷酸鹽緩衝液pH 6.0+0.0015% H₂O₂)添加至96孔盤中之100μl上清液中，然後立即進行光密度測定，然後在Thermomax微盤(Molecular Devices，Merno Park，CA)上以2分鐘的時間間隔改變450nm下之吸光度。

在添加100ng/ml TNFα之前20分鐘將生育酚及植物固醇添加至5×10⁵個人嗜中性白血球中，並在37℃下在含5% CO₂的潮濕氛圍中保持隔夜。在培養的嗜中性白血球之上清液中量測MPO活性。

在添加100ng/ml TNFα之前20分鐘將ζ胡蘿蔔素、八氫番茄紅素、生育酚、植物固醇或其組合添加至5×10⁵個人嗜中性白血球中，並在37℃下在含5% CO₂的潮濕氛圍中保持隔夜。如上所述量測MPO活性。

MMP-9

細胞培養上清液中之人MMP-9濃度藉由ELISA套組(美國明尼 蘇達州明尼阿波利斯市的R&D系統)進行定量。

MMP-8(膠原蛋白酶)

細胞培養上清液中之人MMP-8濃度藉由ELISA套組(美國馬里蘭州羅克維爾的OriGene，Technologies公司)進行定量。

彈性蛋白酶活性

將N-甲氧基琥珀醯-丙胺酸-丙胺酸-丙戊酸-纈胺酸-P-硝基苯胺添加至100μl上清液中，使最終濃度達到0.5mM，然後在37℃下培育隔夜。在Thermomax微盤讀取器(Molecular Devices，Melno Park，CA)上量測405nm下之吸光度。

巨噬細胞之分離及培養

在收穫前4天腹膜內注射1.5ml巰基乙酸鹽肉湯(4%)後，自6-8週大的雄性ICR小鼠(Harlan，以色列)的腹膜腔收集腹膜巨噬細胞。腹膜巨噬細胞用PBS洗滌三次，然後低滲溶解紅細胞，產生高度富集的(90-95%)巨噬細胞群。使用FIACS共軛的大鼠抗小鼠F4/80(MCA497F)(英國牛津Serotec)，藉由流式微螢光法在FACS(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上藉由FACS分析鑑定巨噬細胞。對於每個樣品，分析了10,000個光散射閘控活細胞。將腹膜巨噬細胞(1×10⁶個細胞/孔)在含有10% FCS、2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素的RPMI 1640培養基(以色列貝特海默克)中，在37℃下在5% CO₂氛圍中，在96孔盤中培養。在成分不存在或存在下，用來自腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)血清型鼠傷寒沙門氏菌的100ng/ml LPS刺激細胞。LPS購自以色列Sigma。

將所有化合物溶解在DMSO中，在測試盤上DMSO的體積不超過0.1-0.2%。向對照盤中添加適當體積的DMSO(0.1-0.2%)。計算相對於其對照的每個試管中的抑制%。

一氧化氮(NO)產生分析

藉由使用Griess試劑及亞硝酸鈉作為標準物分析亞硝酸鹽濃度來測定細胞培養物上清液中之NO含量。

細胞存活

藉由使用錐蟲藍排除法的細胞計數或藉由比色MTT([3-4，5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-四唑鎓)代謝活性分析來評估細胞活力。對於MTT量測，將細胞在96孔盤中培養。將MTT溶解在培養基(5mg/ml)中，並以等於培養基體積的10%的量添加至每個樣品中。培育4小時後，將甲月替晶體溶於含100mM HCl、10% Triton X-100的異丙醇中，其體積與培養基相等，該培養基僅作為背景。用Thermomax微盤讀取器(Molecular Devices，Melno Patk，CA，USA)在570nm下用參考波長690nm來量測吸收強度。

原膠原蛋白-3

細胞培養上清液中之人原膠原蛋白-3濃度藉由人PⅢNP(N端原膠原蛋白Ⅲ前肽)ELISA套組(美國德克薩斯州休斯頓的Elabscience Biotechnology公司)進行定量。由於成纖維細胞上清液中之原膠原蛋白-3濃度非常低，因此藉由蒸發濃縮上清液。

膠原蛋白-3

細胞培養溶解物及上清液中之人膠原蛋白-3濃度藉由III型α1人膠原蛋白(COL3A1)ELISA套組(美國德克薩斯州休斯頓的Cusabio Technology公司)定量。

膠原蛋白1a1

將細胞與Lumenato一起培育24小時，然後添加過氧化氫(H₂O₂)，並將細胞再培育24小時以誘導氧化應激。收集培育培養基，並使用特異性ELISA偵測套組來分析分泌至該培養基中的膠原蛋白1a1之含量。

統計分析

使用GraphPad Prism 5(美國加利福尼亞州聖地亞哥的GraphPad Software公司)藉由ANOVA判定評估參數之間的顯著差異，然後進行多次比較Bonferroni事後校正。小於0.05的P值被認為具有統計學意義。顯著性：*-p<0.05，**-p<0.001，***-p<0.0001。

實例1

GTE減少受刺激嗜中性白血球之降解酶分泌

為了研究GTE對可能破壞膠原蛋白的酶的釋放之影響，本發明人首先測定活化後嗜中性白血球之此等酶釋放的動力學。嗜中性白血球由100ng/ml TNFα或100ng/ml IL8活化，該等嗜中性白血球在暴露於UV期間自皮膚細胞釋放並活化。另外，將嗜中性白血球用5×10^-7fMLP活化以供比較。如圖1中所示，向人嗜中性白血球中添加TNFα在活化2小時時引起顯著(p<0.001)的MMP-9釋放(16.52±0.5ng/ml)，其在4小時時保持在相同水準。添加IL8在4小時活化期間以劑量依賴性方式引起MMP-9釋放。在用IL8活化2小時時偵測到顯著(p<0.001)的MMP-9釋放(9.12±0.2ng/ml)，其在4小時時進一步顯著(p<0.0001)增加至17.86±0.4ng/ml。fMLP在活化30分鐘時誘導快速及顯著(p<0.001)的MMP-9釋放(10.41+0.4ng/ml)，其在4小時活化期間逐漸增加至13.45+0.3ng/ml。如圖2中所示，添加TNFα或IL8均在活化2小時時誘導顯著(p<0.0001)的MPO釋放，其在4小時時分別進一步增加至0.28±0.001ng/ml及0.4±0.08ng/ml。fMLP在30分鐘時誘導快速及顯著(p<0.0001)的MPO釋放(0.54±0.004ng/ml)，其在4小時時保持在該水準。與4小時相比，嗜中性白血球活化24小時並未增加MMP-9或MPO的釋放(資料未顯示)。

為了研究GTE對MMP-9或MPO釋放的影響，嗜中性白血球藉由TNFα或IL8活化4小時且藉由fMLP活化30分鐘。在活化之前，在37℃下 將GTE添加至嗜中性白血球中並保持10分鐘。如圖3中所示，添加26-210μg/ml濃度範圍之GTE以劑量依賴性方式抑制受TNFα、IL8或fMLP刺激的嗜中性白血球之MMP-9釋放。受TNFα、IL8或fMLP刺激的嗜中性白血球之MMP-9分泌之最大抑制分別為95.4±4.6%、83.19±12.0%或76.6±12.0%。類似地，GTE誘導劑量依賴性MPO抑制，其中受TNFα、IL8或fMLP刺激的嗜中性白血球之最大抑制分別為46.0±6.7%、33.86±0.7%或38.5±4.5%(圖4)。

接下來，藉由細胞色素C還原來分析GTE對嗜中性白血球之超氧化物釋放的影響。由於超氧化物不穩定，因此在添加前述促效劑(例如TNFα、IL8等)中之每一者後立即進行分析。如圖5中所示，在刺激之前添加GTE並保持10分鐘誘導超氧化物產生之劑量依賴性抑制，達到最大抑制63.27±13%、67.55±3.4%及56.81±2.4%，嗜中性白血球分別由TNFα、IL8及fMLP刺激。

實例2

GTE減少成纖維細胞-嗜中性白血球共培養物之膠原蛋白流失

為了研究GTE對活化後嗜中性白血球誘導之膠原蛋白-3破壞的影響，本發明人使用培養的成纖維細胞及嗜中性白血球的最佳條件。將1×10⁵個成纖維細胞接種24小時以獲得融合培養物。如膠原蛋白-3之免疫螢光染色所示，添加2×10⁵個活化的嗜中性白血球誘導約30%的顯著膠原蛋白-3破壞，但並未破壞培養物(圖6A至圖6N)。在每種處理中都量測了細胞活力，且發現在不存在或存在GTE的情況下，細胞活力均不受活化後嗜中性白血球之添加影響。在共培養實驗中使用的嗜中性白血球濃度低於用於研究嗜中性白血球的濃度(圖1至圖5)。將嗜中性白血球與GTE在37℃下培育10分鐘，然後添加至培養物中並保持24小時。如膠原蛋白3之免疫螢光染色所示(圖6A之圖6N)，將在添加前與6.5-104μg/ml範圍內的GTE一起預培育的嗜中性白血球添加至成纖維細胞培養物中引起對膠原蛋白3破壞之劑量依賴性抑制。在52μg/ml GTE下 最大程度地防止膠原蛋白破壞(約80%保護作用)。藉由密度測定法測定並且在圖6O中呈現的培養物中膠原蛋白-3含量之定量大於其他番茄來源的組合物(圖6P至圖6Q)。共培養物中Lumenato之存在使得在104μg/ml Lumenato的存在下，分泌的前膠原蛋白-3劑量依賴性增加至68.21±7.1pg/ml(圖6S)，減去由嗜中性白血球誘導的原膠原蛋白-3之含量(用虛線橫線表示)，指示在104μg/ml Lumenato存在下增加了約10pg/ml。此外，將Lumenato添加至成纖維細胞中並保持隔夜並不影響如藉由MTT或藉由DAPI染色量測的成纖維細胞數目(資料未顯示)。儘管如此，但Lumenato之添加以劑量依賴性方式在上清液中誘導了原膠原蛋白-3含量之顯著增加(圖18)。

用50μM H₂O₂處理NHDF細胞導致膠原蛋白1a1分泌減少約10倍(圖19)。Lumenato已經以最低濃度使用，完全消除了膠原蛋白分泌的減少。考慮到Lumenato亦具有減少MMP1分泌的能力，此結果表明Lumenato係體內增加皮膚膠原蛋白含量並減少皮膚老化的有前途的藥劑。

在培養24小時後，在上清液中量測在前述共培養系統下釋放的降解酶之量/含量(如圖6中所描述)。共培養實驗中使用的GTE濃度低於用於研究其對嗜中性白血球影響的濃度(圖1至圖5)，因為在共培養實驗中使用的嗜中性白血球濃度較低(2.5×10⁵/ml相比於5×10⁶/ml)。如圖7A中所示，針對GTE觀測到MMP-9之劑量依賴性抑制，但在其他番茄來源的組合物中沒有觀測到(圖7B至圖7C)。GTE之抑制約為12.5±3.9%抑制。基於MPO在上清液中之活性所測定的MPO釋放在低至13μg/ml的GTE濃度下被顯著抑制，並逐漸增加，在測試的最大濃度下達到45.8±5.6%抑制(圖8A)。與其他番茄來源的組合物相比，GTEMPO抑制作用約為2倍(圖8B至圖8C)。藉由Amplex red研究GTE對超氧化物產生的影響，此研究在刺激嗜中性白血球後立即進行(超氧化物不穩定)。如圖9中所示，GTE誘導顯著的劑量依賴性抑制，達到78.5± 0.9%抑制。如圖10所呈現，藉由抑制MMP-8(膠原蛋白酶)，進一步例示了GTE在共培養物中的有益作用。GTE誘導了MMP-8釋放之逐漸抑制，在26μg/ml GTE時達到43.0±7.1%的最大抑制，其在更高GTE濃度下仍保持。在受刺激的嗜中性白血球及成纖維細胞的共培養物中，在存在GTE的情況下，彈性蛋白酶活性沒有顯著提高(圖11)。

實例3

GTE減少受刺激巨噬細胞中之一氧化氮產生

用LPS刺激巨噬細胞，然後與增加濃度的過濾後果漿或GTE一起培育。如圖12中所示，與過濾後果漿相比，GTE在抑制一氧化氮(NO)產生方面的效力提高了2倍。發現GTE以劑量依賴性方式抑制NO產生，起始濃度低至5μg/ml，顯示出約20%抑制。在GTE濃度為100μg/ml的情況下，NO產生的抑制水準持續增加至大約55%。

實例4

具有多種植物營養素之組合物協同抑制MPO活性

本發明人研究了多種植物營養素對受刺激嗜中性白血球中之MPO活性的影響。單獨添加生育酚或植物固醇對於用TNFα活化的嗜中性白血球之MPO釋放及活性沒有影響(圖13A至圖13B)。然而，補充225μg/ml生育酚及62.5μg/ml植物固醇產生協同作用，與對照相比，MPO活性被抑制約20%(圖13C)。

本發明人亦研究了將ζ胡蘿蔔素與八氫番茄紅素、生育酚或植物固醇一起添加對MPO活性的影響。單獨添加ζ胡蘿蔔素、生育酚、八氫番茄紅素或植物固醇對MPO活性沒有抑制作用到至多具有5%抑制(圖14)。然而，以GTE中所存在之比例添加ζ胡蘿蔔素與生育酚、八氫番茄紅素或植物固醇中之任一者都會誘導對於經TNFα活化的嗜中性白血球之MPO活性或釋放之協同 抑制(圖14)。

實例5

具有增加的類胡蘿蔔素生體可用率之Lumenato膠囊

本發明人已經檢測了Lumenato膠囊內遞送的類胡蘿蔔素的生體可用率。在給藥後1週、2週、3週及4週時，定量血漿中之以下類胡蘿蔔素。作為Lumenato(金番茄提取物)中之主要類胡蘿蔔素的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素及ζ胡蘿蔔素吸收很好(圖15)。發現ζ胡蘿蔔素之吸收極好，如藉由血漿濃度之急劇增加所反映(圖15A)。

實例6

平衡氧化應激誘導之皮膚細胞損傷

本發明人然後檢測了Lumenato(金番茄提取物)是否增強皮膚彈性，並防止氧化應激誘導的人角質細胞之皮膚損傷。已知諸如H₂O₂之活性氧物質(ROS)會引起皮膚炎症過程，增加皮膚細胞中基質金屬蛋白酶(MMP)的產生，從而導致膠原蛋白降解。

本發明人使用過氧化氫H₂O₂來誘導KERTr人角質細胞中之氧化應激，並分析了其對細胞數目(細胞死亡)及MMP1分泌的影響。使用XTT細胞增殖套組測定細胞活力，並藉由ELISA量測MMP1含量。用H₂O₂處理細胞導致劑量依賴性細胞死亡(圖16A)及MMP1分泌增加(圖16B)。在添加H₂O₂之前以指定的濃度添加Lumenato提高細胞活力並減少MMP1的分泌。

上述保護作用的一種可能解釋係抗氧化劑反應元件轉錄系統(ARE/Nrf2)之活化。因此，本發明人使用報導基因分析來量測了此轉錄系統之活化。觀測到Lumenato對ARE/Nrf2轉錄活性的劑量依賴性活化(圖17)。

實例7

皮膚狀況及外觀

本發明人收集了基線皮膚問卷調查，其中包含14個問題，詢問參與者在服用研究產品Lumenato前後的皮膚狀況及外觀(例如，在基線時及12週後)。結果顯示(表3)，在14個問題中的11個(不包括第3、10及11個問題)中，滿意度得到了顯著提高。

此外，發明人收集了皮膚更新調查表，其中包含14個問題，詢問參與者在服用研究產品Lumenato時的皮膚狀況及外觀(第4、8及12週)。結果顯示(表4)，在14個問題中的10個(不包括第3、8、11及12個問題)中，滿意度得到了顯著提高。

雖然已特定描述本發明，但熟習此項技術者將瞭解可進行許多變化及修改。因此，本發明不應理解為限於特定描述的實施例，而是藉由參考隨附申請專利範圍將更容易理解本發明之範疇及概念。

Claims (21)

1. 一種組合物，其包括：含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的55-65%(w/w)的八氫番茄紅素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的10-20%(w/w)的六氫番茄紅素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的15-25%(w/w)的ζ胡蘿蔔素；以及可接受之載劑。
2. 如請求項1所述之組合物，其中組合的該八氫番茄紅素及該六氫番茄紅素與該ζ胡蘿蔔素之重量比介於15：1(w/w)至2：1(w/w)範圍內。
3. 如請求項1或2所述之組合物，其進一步包括選自以下組成之組的額外類胡蘿蔔素：番茄紅素、β胡蘿蔔素、γ胡蘿蔔素及其任何組合。
4. 如請求項3所述之組合物，其包括：含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於5%(w/w)的該番茄紅素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的少於5%(w/w)的該β胡蘿蔔素；含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的0.2-1.5%(w/w)的該γ胡蘿蔔素；或其組合。
5. 如請求項1至4中任一項所述之組合物，其包括的類胡蘿蔔素總量為該組合物的10-15%(w/w)。
6. 如請求項1至5中任一項所述之組合物，其進一步包括生育酚。
7. 如請求項6所述之組合物，其包括含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的10-30%(w/w)的該生育酚。
8. 如請求項1至7中任一項所述之組合物，其進一步包括植物固醇。
9. 如請求項8所述之組合物，其包括含量為該組合物中之類胡蘿蔔素總量的5-15%(w/w)的該植物固醇。
10. 如請求項1至9中任一項所述之組合物，其用於減少膠原蛋 白流失、增加膠原蛋白含量或兩者兼有。
11. 一種用於預防或治療有需要之個體之膠原蛋白流失的方法，其包括向該個體投予治療有效量的如請求項1至10中任一項之組合物，從而預防或治療該個體之膠原蛋白流失。
12. 如請求項11所述之方法，其中該預防或治療減少50-90%的膠原蛋白流失。
13. 一種用於降低有需要個體之基質金屬蛋白酶(MMP)、髓過氧化酶(MPO)、超氧化物(SO)、彈性蛋白酶、一氧化氮(NO)及其任何組合中之任一者之量、活性或兩者的方法，其包括向該個體投予治療有效量的如請求項1至10中任一項之組合物。
14. 如請求項13所述之方法，其中該MMP係選自：MMP-9、MMP-8、MMP-1或其任何組合。
15. 如請求項11至14中任一項所述之方法，其中該個體罹患膠原蛋白流失相關疾病。
16. 如請求項15所述之方法，其中該膠原蛋白流失相關疾病係選自以下組成之組：年齡相關疾病、皮膚疾病及發炎性疾病。
17. 如請求項16所述之方法，其中該皮膚疾病包括由以下中之任一者誘導的皮膚損傷：輻射、氧化應激、DNA損傷、端粒縮短、發炎、吸菸以及其任何組合。
18. 如請求項17所述之方法，其中該輻射包括UV輻射、可見光輻射、紅外輻射或其任何組合。
19. 如請求項18所述之方法，其中該UV輻射為UVA、UVB、UVC或其任何組合。
20. 如請求項11至19中任一項所述之方法，其中與對照相比， 該個體在皮膚、全身或兩者中具有MMP、MPO、SO、彈性蛋白酶、NO及其任何組合中之任一者的量增加、活性增加或兩者兼有。
21. 如請求項11至20中任一項所述之方法，其中該投予包括經口投予、局部投予或兩者。

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