TWI397425B - 用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性及／或生成、及／或促進膠原蛋白生成之白仙丹葉萃取物及其用途 - Google Patents

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Description

用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成、及/或促進膠原蛋白生成之白仙丹葉萃取物及其用途
本發明係關於一種白仙丹(Ixora parviflora )葉萃取物，其可用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成，尤其是於改善、調理及/或修補皮膚之應用。
一般人隨著年紀的增長，老化的表徵會漸漸出現，例如皮膚鬆弛、皺紋生成及膚色暗沉等。皮膚的構造由上而下，依次為表皮層(epidermis)、真皮層(dermis)及皮下組織(hypodermis)，其老化原因可分為內因性及外因性。內因性之老化係指身體自然的老化過程，包含細胞自然死亡、荷爾蒙減少及免疫力降低。其中，荷爾蒙的分泌減少會減緩整體皮膚的新陳代謝，且因真皮層之纖維母細胞(fibroblast)的機能衰退，而逐漸停止製造膠原蛋白(collagen)及彈力纖維，使得真皮層之結締組織進入退化階段，造成皮膚鬆弛，甚至產生皺紋。此外，真皮層結締組織之退化亦會影響皮膚的儲水功能，導致皮膚乾燥及缺水等問題。
外因性之老化則係因外在因素(例如日曬、污染、自由基傷害及抽菸)所造成的老化。其中，損害皮膚最嚴重且加速皮膚老化的首要因素即為日光中之紫外線。紫外線依據波長可分為長波紫外線(UVA)、短波紫外線(UVB)及超短波紫外線(UVC)。一般日常生活中所接觸之紫外線，主要係長波紫外線及短波紫外線。長波紫外線及短波紫外線會使皮膚產生紅斑及曬傷、傷害皮膚細胞之去氧核醣核酸、以及造成皮膚免疫系統異常及皮膚癌等。紫外線所造成的老化現象稱為光老化，其會經由有絲分裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK pathway)之磷酸化作用而增加真皮層之基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)含量。基質金屬蛋白酶會分解膠原蛋白，減少皮膚中的膠原蛋白含量。此外，紫外線會促進活性氧物質(reactive oxygen species(ROS)，例如氧離子、過氧化物和自由基之有機物和無機物等)之產生，另會造成膠原蛋白之變性(denature)與功能喪失。若皮膚缺少膠原蛋白的支撐，其外觀會變得鬆弛，並造成角質層過度增生，進而使皮膚變得黯沉。
目前已發現的動物膠原蛋白大致可分成二十一種型式，依不同組織而有不同的膠原蛋白，其中以第一型(Type I)膠原蛋白的含量最多，也是用途最廣的膠原蛋白。於皮膚組織中，第一型膠原蛋白約占80%，而第三型(Type III)膠原蛋白約占20%。真皮層中的纖維母細胞主要係製造第一型膠原蛋白及第三型膠原蛋白供皮膚使用。
如上所述，由於基質金屬蛋白酶會分解膠原蛋白，減少皮膚中的膠原蛋白含量，而活性氧物質會使膠原蛋白喪失功能，因此，若能抑制活性氧物質之氧化反應或抑制基質金屬蛋白酶之活性及/或生成，即可達到改善/增進膚質之功效。
過去研究發現，以70%乙醇萃取薔薇科植物地楡(Sanguisorba officinalis )之根部所得之地榆糖(ziyuglycoside-I)可抑制基質金屬蛋白酶-1之表現；以甲醇萃取卷柏科植物萬年松(Selaginella tamariscina )所得之蘇馬黃酮(sumaflavone)及穗花杉雙黃酮(amentoflavone)，亦可抑制基質金屬蛋白酶-1之表現。然而，市面上對於抑制基質金屬蛋白酶活性具更佳效果之成分，仍存在極大的需求。
本案發明人研究後發現，白仙丹葉之萃取物具有優異之抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成的功效，可用於改善、調理及/或修補皮膚。
本發明之一目的在於提供一種白仙丹葉萃取物，其吸收光譜係包含以下波長範圍之吸收峰：210至250奈米、260至290奈米、及300至350奈米。
本發明之另一目的在於提供一種用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成之組合物，其包含上述白仙丹葉萃取物。
本發明之又一目的在於提供一種使用上述白仙丹葉萃取物於製造藥劑之用途，該藥劑係用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
本發明係關於一種白仙丹葉萃取物，其吸收光譜係包含以下波長範圍之吸收峰：210至250奈米、260至290奈米、及300至350奈米。於一實施態樣中，該白仙丹葉萃取物之吸收光譜係包含以下波長範圍之吸收峰：220至250奈米、270至290奈米、310至340奈米、390至420奈米、及650至670奈米。
本發明白仙丹葉萃取物具有抑制基質金屬蛋白酶活性及抑制基質金屬蛋白酶生成之功效，可防止或減緩膠原蛋白被破壞。基質金屬蛋白酶主要可分為膠原蛋白酶(collagenase)、基質酶(stromelysin)、膠質酶(gelatinase)、基酶(matrilysin)、及膜型基質金屬蛋白酶(transmembrane type-MMP)等類型。本發明白仙丹葉萃取物，尤其可有效抑制基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)之生成(或表現)。其中，基質金屬蛋白酶-1屬於膠原蛋白酶，亦稱作膠原蛋白酶-1(collagenase-1)，且另具別名為組織型膠原蛋白酶(tissue collagenase)或纖維母細胞型膠原蛋白酶(fibroblast-type collagenase)。基質金屬蛋白酶-3屬於基質酶，亦稱作基質酶-1且其受質為纖維網質(fibronectin)、板質(laminin)及非纖維膠原蛋白(non-fibrillar collagen)。基質金屬蛋白酶-9則屬於膠質酶，其主要受質為第四型膠原蛋白。於不受理論限制之情形下，本發明人相信，本發明之白仙丹葉萃取物可經由抑制有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化，達成抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成之功效，進而間接地增加膠原蛋白之生成。
除具有抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成之功效以外，本發明白仙丹葉萃取物亦具有抗氧化之功效。如上所述，活性氧物質之氧化作用會造成膠原蛋白之變性及喪失功能，使膠原蛋白無法支撐皮膚，進而導致皮膚鬆弛及黯沉。
如第1圖所示，由於本發明白仙丹葉萃取物同時兼具(1)抑制基質金屬蛋白酶之活性及/或生成，及(2)抑制活性氧物質之氧化作用，故可大幅減少皮膚中膠原蛋白被分解或變性的機會，進而有效地改善、調理及/或修補皮膚，例如可達到抗老化、抗光老化、減少皮膚皺紋、改善膚質及皮膚鬆弛現象、及促進傷口癒合等功效。
本發明白仙丹葉萃取物可以包含如下步驟之方法製得：a)使用一極性溶劑萃取白仙丹葉，以獲得一萃取液；以及b)視需要乾燥該萃取液。其中，可採用選自以下群組之極性溶劑：水、C1 -C4 醇類、及前述之組合。較佳地，該極性溶劑係選自以下群組：水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、及前述之組合。最佳地，係使用甲醇作為萃取溶劑。萃取溶劑與白仙丹葉之重量比率並非本發明之關鍵所在，通常為約10：1至約50：1，較佳係約20：1至40：1。
於步驟a)中，係進行一段時間以達到所欲的萃取程度，以採用甲醇為例，通常為至少30分鐘，較佳為至少60分鐘，更佳為至少90分鐘，且可視需要輔以其它合適的萃取手段，例如超音波震盪或加熱烹煮等方式，以提高萃取效果。另外，可視需要於步驟b)之前重複進行多次萃取步驟a)，並合併該多次步驟a)所得之萃取液以進行步驟b)，儘可能使白仙丹葉中之有效成分與無效成分分離，以及儘可能將全部有效成分萃取而出，以減低資源浪費及提升經濟效益。
一般而言，依據白仙丹葉萃取物之應用形式，可視需要進一步乾燥步驟a)所獲得之白仙丹葉萃取液。舉例言之，若選用之萃取溶劑為不具皮膚刺激性之甲醇或乙醇，且欲將所獲得之白仙丹葉萃取液直接施用於如皮膚上時，則不須額外乾燥該萃取液。然而，若欲以口服之方式施用本發明之白仙丹葉萃取物時，則可利用一乾燥步驟(例如凍晶乾燥、減壓濃縮及/或通入氣體)以移除白仙丹葉萃取物中之有機溶劑，避免有機溶劑傷害身體。
於本發明之一實施態樣中，係使用甲醇萃取白仙丹葉，並加以浸泡，其中，甲醇與白仙丹葉之重量比率為約30：1，以得到一萃取液，接著對該萃取液進行減壓濃縮，從而製得經乾燥之白仙丹葉萃取物。該萃取物具有可溶於極性溶劑中(例如：可溶於選自以下群組之溶劑：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、二甲基亞碸、水、及前述之組合)之溶解特性，且當將2毫克之該萃取物溶於1毫升之甲醇中時，可得到一橘黃色之溶液，且其pH值為約4.5至約5.0。
本發明亦關於一種用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成之組合物，其包含有效量之本發明白仙丹葉萃取物。特定言之，由於該組合物所含白仙丹葉萃取物具有抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成、及/或促進膠原蛋白生成之功效，故其特別可用於改善、調理及/或修補皮膚。
本發明組合物可呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，可呈供直接外用之乳液、乳霜或凝膠形式，例如保養品、化妝品等；或者，可將其製備成可供吞食或飲用的食品形式，例如健康食品、美容飲品等。此外，亦可呈一般常見之藥劑形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、酊劑、靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑及乾粉懸液注射劑等等。
本發明組合物中之白仙丹葉萃取物之含量，可依照所施用對象之年紀及施用目的(例如減少皮膚皺紋或促進傷口癒合)而加以調整，亦可視需要調整使用頻率。以用於減少皮膚皺紋為例，白仙丹葉萃取物之含量通常為約0.03重量%至約0.4重量%，較佳為約0.05重量%至約0.25重量%，以組合物總重量計。至於其它成分及其含量，端視組合物之最終形式而定；舉例言之，當製備皮膚用之保養品時，可添加任何合宜且適量的乳化劑、香料及其它可改善膚質之活性成分等；當製作成錠劑時，則可使用合宜的賦形劑。原則上，只要所添加的其它成分之種類及含量，不會對白仙丹葉萃取物之功效有不利的影響即可。
本發明另關於一種使用本發明之白仙丹葉萃取物於製造藥劑之用途，其中該藥劑係用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成，故可用於改善、調理及/或修補皮膚。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。
[白仙丹葉萃取物之製備]
本發明之白仙丹葉係來自台灣中部地區。第2圖所示為製備供以下實施例所用之白仙丹葉萃取物之製備流程圖。首先將乾燥之白仙丹葉磨碎，並加入至30倍重量之甲醇中，浸泡1小時後，以超音波震盪1小時，再以布氏漏斗抽氣過濾，以獲得一濾液。濾渣部分則再次加入至30倍重量之甲醇中，並以超音波震盪1小時候，以布氏漏斗抽氣過濾，以獲得另一濾液。接著，合併該二濾液，以30至40℃進行減壓濃縮乾燥，即可製得本發明之白仙丹葉萃取物(產率約為13重量%)。使用紫外-可見光光譜儀(型號為UV-160，購自Shimadzu公司)測定該萃取物之特徵吸收波長，紫外-可見光吸收光譜圖係如第3圖至第5圖所示。
[實施例1]
實驗A、抑制膠原蛋白酶活性試驗
於此試驗中，利用含明膠之洋菜培養基(瓊脂膠培養基)，測定白仙丹葉萃取物抑制膠原蛋白酶之抑制率，以評估白仙丹葉萃取物對膠原蛋白酶之抑制效果。
於一微量離心管中依序加入50微升之10倍稀釋緩衝溶液(以5毫升之1莫耳濃度Tris(pH 7.8)、1毫升之1莫耳濃度氯化鈣、3.75毫升之4莫耳濃度氯化鈉、及0.25毫升之水配製而成)、30微升蒸餾水、10微升之白仙丹葉萃取物(125至1000微克/毫升，溶於50體積%之丙二醇水溶液中)、以及10微升之細菌膠原蛋白酶(100微克/毫升，利用基因重組所獲得之廣效性膠原蛋白酶)，混合均勻後，於室溫下靜置1小時。接著，取40微升之混合溶液，滴於一瓊脂膠培養基上之濾紙片，並將該培養基置於37℃之培養箱中反應18小時後，移除該濾紙片，以染色劑染色培養基15分鐘，再以退染液退染。拍照紀錄培養基後，以TINA軟體(Prevx community，德國)分析影像，計算白仙丹葉萃取物之抑制率。於試驗中，分別以丙二醇及去氧羥四環素(doxycycline)取代白仙丹葉萃取物作為對照組及正對照組，另以蒸餾水取代膠原蛋白酶作為背景值，進行三次獨立試驗後，計算平均值及標準偏差(計算公式如下)，結果係如表1及第6圖所示。
A：溶液中不含有膠原蛋白酶，不含有萃取物
B：溶液中含有膠原蛋白酶，不含有萃取物
C：溶液中含有膠原蛋白酶，含有萃取物
如表1及第6圖所示，正對照組中之去氧羥四環素(doxycycline，100微克/毫升)的抑制率為100.4±0.3%；空白對照組中之丙二醇的抑制率為0.0±1.7%；白仙丹葉萃取物之抑制率為約80%至約100%。
此試驗說明本發明之白仙丹葉萃取物可有效抑制膠原蛋白酶的活性。
實驗B、抑制膠原蛋白酶活性之濃度依存性試驗
為進一步確認白仙丹葉萃取物抑制膠原蛋白酶活性之效果，稀釋白仙丹葉萃取物至不同濃度(10至500微克/毫升)，觀察其抑制效果。
於一微量離心管中依序加入132微升蒸餾水、22微升10倍稀釋緩衝溶液(以5毫升之1莫耳濃度Tris(pH 7.8)、1毫升之1莫耳濃度氯化鈣、3.75毫升之4莫耳濃度氯化鈉、及0.25毫升之水配製而成)、22微升白仙丹葉萃取物(10至500微克/毫升)、22微升細菌膠原蛋白酶(100微克/毫升)、及22微升螢光受質(膠原蛋白酶之螢光多胜肽受質I(fluorogenic peptide substrate I))溶液，混合均勻後，將該微量離心管置於37℃培養箱中反應20小時。接著，取200微升之反應溶液並置入一96微孔盤中，以一酵素免疫分析儀於320奈米激發光及450奈米放射光下，測量螢光強度。於試驗中，分別以蒸餾水及去氧羥四環素取代白仙丹葉萃取物作為對照組及正對照組，另以蒸餾水取代膠原蛋白酶及螢光受質作為背景值，進行三次獨立試驗後，計算平均值及標準偏差(計算公式如下)，結果係如表2及第7圖所示。
如表2及第7圖所示，白仙丹葉萃取物對於膠原蛋白酶之抑制效果呈現一濃度依存性，且有極佳之抑制效果。
[實施例2]
實驗C、抑制基質金屬蛋白酶表現試驗
計數5×105 個纖維母細胞Hs68(人類包皮纖維母細胞，生物資源保存及研究中心(BCRC)編號：60038，購自食品工業發展研究所)，並培養於直徑10公分之培養皿(培養皿成分為以4毫莫耳濃度之L-麩醯胺調整至含有1.5公克/公升碳酸氫鈉、4.5公克/公升葡萄糖及10%胎牛血清的90% Dulbecco's modified Eagle's medium)中，待纖維母細胞Hs68生長至八分滿之密度後，移除培養液，再以5毫升磷酸鹽緩衝溶液潤洗細胞一次。接著，添加3毫升含有不同濃度(0至50毫克/毫升)之白仙丹葉萃取物之無血清(phenol red-free)培養液至培養皿中，作用1小時後，將細胞置於紫外線燈源(80毫焦耳/平方公分之短波紫外線(UVB))下進行照射。之後，依序添加7毫升含有不同濃度(0至50毫克/毫升)之白仙丹葉萃取物之無血清培養液至培養皿中，再置於37℃、含有5體積%之二氧化碳的培養箱中培養48小時後收取細胞。
以破碎緩衝溶液(包含100毫莫耳濃度正釩酸鈉(Na3 VO4 )、100毫克/毫升苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSFL)、20毫克/毫升亮肽素(Leupeptin)、50毫莫耳濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH 7.4)、37.5毫莫耳濃度氯化鈉、250毫莫耳濃度DL-二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol)、3毫莫耳濃度去氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)、1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)及1% IgepalTM CA-630(Sigma-Aldrich))處理收取之細胞，並輔以物理性震盪，使細胞膜破裂，再以離心方式沉澱細胞胞器及碎片，並收集上清液部分，上清液含有位於細胞質之蛋白質。接著，以膠片電泳法(SDS-PAGE)分離獲得之蛋白質，並利用西方點墨法(western blotting)將其轉漬至一膜上，再利用抗原-抗體之原理，以抗體辨識標的蛋白，包括第一型膠原蛋白原(Type I procollagen)、基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及β-肌動蛋白(β-actin)，再以冷光顯影技術搭配分析軟體，利用LAS-4000(FUJIFILM)紀錄影像，並以multi Gauge V2.2(Steware Technology Inc.)進行定量分析，以測量標的蛋白之表現量變化。
結果係如第8圖所示，於紫外線照射後，纖維母細胞之MMP-1、MMP-3、及MMP-9之表現量皆增加，分別增加1.3、1.5及1.3倍。於紫外線照射後，再以白仙丹葉萃取物處理纖維母細胞，可發現在25毫克/毫升之萃取物濃度下，MMP-1蛋白質表現量有顯著降低，從1.3倍降至0.7倍；MMP-3從1.5倍降至0.6倍；MMP-9從1.3倍降至0.8倍。此外，第一型膠原蛋白原經紫外線照射後減少為0.4倍，以50毫克/毫升白仙丹葉萃取物處理纖維母細胞後，可使第一型膠原蛋白原之表現量增為0.7倍。
[實施例3]
實驗D、抗氧化試驗-自由基清除試驗
以DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)作為自由基來源，檢測白仙丹葉萃取物清除自由基的能力。於一96微孔盤中分別加入100微升不同濃度(50至1000微克/毫升)之白仙丹葉萃取物與100微升200微莫耳濃度DPPH溶液(溶於甲醇中)，均勻混和後，於室溫下避光靜置30分鐘，再以一酵素免疫分析儀於波長517奈米下，測定吸光值。此試驗以50體積%丙二醇取代萃取物作為對照組，以抗壞血酸作為正對照組，並以甲醇取代DPPH作為背景值。利用以下公式計算白仙丹葉萃取物清除自由基的能力，結果係顯示於表3及第9圖。
結果如表3及第9圖所示，白仙丹葉萃取物之半數清除DPPH自由基的濃度IC50 為23.8微克/毫升，其可有效清除自由基，故具有抗氧化能力。
實驗E、抗氧化試驗-抑制自由基試驗
以AAPH(2,2’-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydro-chloride)作為自由基來源，並以大鼠紅血球模擬生物膜，檢測白仙丹葉萃取物保護生物膜免於自由基破壞的能力。首先，取100微升之20%紅血球懸浮液、100微升之300毫莫耳濃度AAPH溶液，分別加入100微升不同濃度(0至500微克/毫升)之白仙丹葉萃取物，以震盪器輕搖混合後，置於37℃下反應，於反應時間1、2、3及4小時分別收取樣品(樣品數=3)，再添加300微升磷酸鹽緩衝溶液以終止反應。接著，以3000g 離心樣品2分鐘，取200微升上清液並置於一96微孔盤中，再以一酵素免疫分析儀於波長540奈米下測定吸光值。此試驗以磷酸鹽緩衝溶液取代萃取物作為對照組，另以磷酸鹽緩衝溶液取代20%紅血球懸浮液作為背景值。利用以下公式計算白仙丹葉萃取物抑制自由基的能力，結果顯示於表4、第10A圖及第10B圖。
結果係如表4、第10A圖及第10B圖所示。第10A圖顯示，未添加AAPH之樣品，於反應期間(1、2、3及4小時)，紅血球皆無溶血現象，而加入AAPH之樣品於37℃之培養箱中反應2小時後，產生溶血現象，且隨著反應時間增長而加劇，顯示AAPH誘導紅血球溶血具時間依存性。於樣品中加入不同濃度之白仙丹葉萃取物，於10微克/毫升之濃度下，在2小時後即有顯著之抑制溶血現象，其抑制AAPH自由基誘導紅血球溶血抑制效率為75.9±3.3%。此外，如第10B圖所示，隨著白仙丹葉萃取物濃度之增加，抑制效率亦遞增，顯示白仙丹葉萃取物之抗自由基活性具濃度依存性。此實驗結果說明白仙丹葉萃取物可有效抑制自由基之活性，故具有抗氧化能力。
[實施例4]
實 驗F、細胞毒性試驗
此試驗係以MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)測定法觀察白仙丹葉萃取物之細胞毒性。首先，分別將50微升不同濃度(0至500微克/毫升，溶於50體積%之丙二醇水溶液中)之白仙丹葉萃取物加入至一含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種104 個細胞)。於37℃、含有5體積%之二氧化碳的培養箱中培養24小時後，添加15微升之MTT溶液(5毫克/毫升，溶於磷酸鹽緩衝溶液中)，再將纖維母細胞Hs68培養3小時。接著，添加75微升之十二基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液(10%之SDS溶於0.01當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中，並於24小時後，以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值。最後，利用以下公式計算細胞存活率，以觀察萃取物之細胞毒性。結果係顯示於表5及第11圖。
細胞存活率(%)=實驗組之吸光值/控制組之吸光值×100
如表5及第11圖所示，以5至500微克/毫升之白仙丹葉萃取物處理纖維母細胞Hs68後，於500微克/毫升之高濃度下，仍不具有細胞毒性，此實驗說明，本發明之白仙丹葉萃取物對細胞，甚至對身體皆不具毒性。
實驗G、皮膚一次性刺激性試驗
首先，分別將0.1公克(低劑量)及0.5公克(高劑量)之白仙丹葉萃取物復溶於1毫升之生理食鹽水中。接著，將紐西蘭大白兔固定於兔架上，剃除其背毛，以色筆畫出每格2.5公分x 2.5公分之塗抹範圍，共6格。以無菌針頭在大白兔皮膚上之格子內輕劃四條平行線，破壞其角質層(或不破壞其角質層以作為對照)，但不可見血。分別將低劑量及高劑量之白仙丹葉萃取物均勻塗抹於格內。24小時後，以生理食鹽水輕拭大白兔皮膚以移除白仙丹葉萃取物，並於24小時及72小時兩個時間點分別觀察刺激程度，並根據Draize之方法(此可參見Kirket al .,Therapeutic Reviews,Survey of Ophthalmology ,vol 45,No.6,2001，該文獻全文併於此處以供參考)求出皮膚刺激指數(Primary Irritation Index，PII)，若有產生刺激性則延長觀察時間。刺激程度及皮膚刺激指數之評分標準係如以下表6所示。此試驗之統計方法係以ANOVA(變異數分析)及Student’s t-test進行數據分析，若p＜0.05則表示於統計上有顯著差異。各實驗係進行三次以上，實驗結果係以平均±標準誤差表示。實驗結果係顯示於表7A、表7B及第12圖。
*intact：評估對完整皮膚之刺激性；abraded：評估對受損皮膚之刺激性。
如第12圖、表7A及表7B所示，無論於低劑量(0.1公克)或高劑量(0.5公克)下，24小時及72小時後，白仙丹葉萃取物對完整或受損之皮膚並無產生任何刺激，其皮膚刺激指數皆為0.0，屬於「無刺激(non-irritation)」之刺激範圍。
此試驗顯示，本發明之白仙丹葉萃取物不會對皮膚產生刺激性。
實驗H、眼球刺激性試驗
將600微克之白仙丹葉萃取物復溶於1毫升之生理食鹽水後，以6,000轉/分鐘之轉速離心5分鐘，取上清液作為試驗樣品。取100微升(600微克/毫升)之樣品滴入紐西蘭大白兔一側眼睛之結膜囊，另一側則不給藥以作為對照組，並將大白兔眼睛輕輕闔上。於第1、5、15及30分鐘，以及第1、2、24、及48小時等時間點觀察白仙丹葉萃取物對大白兔眼睛的影響，並根據Draize之方法判別其刺激程度，若產生刺激性則延長觀察時間。刺激程度之評分標準係依據Lalithakumari之眼睛刺激分級量表(此可參見Lalithakumariet al .,Safety and Toxicological Evaluation of a Novel,Standardized 3-O-Acetyl-11-keto-β-Boswellic Acid(AKBA)-EnrichedBoswellia serrata Extract(5-),Toxicology Mechanisms and Methods ,16: 199-226,2006，該文獻全文併於此處以供參考)，如以下表8A及表8B所示。此試驗之統計方法係以ANOVA及Student’s t-test進行數據分析，若p＜0.05則表示於統計上有顯著差異。各實驗係進行三次以上，實驗結果係以平均±標準誤差表示。結果係顯示於表9及第13圖。
如第13圖所示，相較於無給藥之對照組，於實驗過程中，給予白仙丹葉萃取物的兩隻白兔於1分鐘時結膜輕微充血，且其中一隻有排出淚液的現象，分別評為2分及4分；於5分鐘時有兩隻白兔結膜輕微腫脹，各評為2分；於15及30分鐘兩個時間點觀察到有三隻白兔結膜輕微腫脹，評為2分；於1及2小時觀察到四隻白兔有結膜輕微腫脹的現象，評為2分；而在24及48小時觀察白兔右眼，已與無給藥之對照組相同，評為0分。將各時間點之評分加總平均之後，可得總評分為1.2(如表9所示)，屬實際無刺激(practically no irritation)之等級。
此試驗說明，本發明之白仙丹葉萃取物對眼睛不具刺激性。
經由以上細胞模式及動物安全性試驗可知，本發明之白仙丹葉萃取物具有優異之抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成的功效，且不具毒性及刺激性，因而可達到有效改善、調理及/或修補皮膚之效果，而不傷害人體或動物。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。
第1圖係本發明之白仙丹葉萃取物之作用機轉的示意圖；
第2圖係本發明之白仙丹葉萃取物之製備方法的流程圖；
第3圖至第5圖係本發明之白仙丹葉萃取物的紫外-可見光光譜圖；
第6圖係本發明之白仙丹葉萃取物對膠原蛋白酶之抑制率的統計直條圖；
第7圖係本發明之白仙丹葉萃取物對膠原蛋白酶之抑制率的統計直條圖；
第8圖係纖維母細胞Hs68之基質金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-3及MMP-9)及第一型膠原蛋白原的蛋白質電泳圖；
第9圖係本發明之白仙丹葉萃取物對DPPH自由基之清除效率的統計直條圖；
第10A圖及第第10B圖係本發明之白仙丹葉萃取物對AAPH自由基之抑制率的曲線圖；
第11圖纖維母細胞Hs68之細胞存活率的統計直條圖；
第12圖係皮膚一次性刺激性試驗之大白兔皮膚變化的示意圖；以及
第13圖係眼球刺激性試驗之大白兔眼球變化的示意圖。

Claims (13)

  1. 一種白仙丹(Ixora parviflora )葉萃取物，其紫外-可見光吸收光譜係包含以下波長範圍之吸收峰：210至250奈米、260至290奈米、及300至350奈米。
  2. 如請求項1之萃取物，其紫外-可見光吸收光譜係包含以下波長範圍之吸收峰：220至250奈米、270至290奈米、310至340奈米、390至420奈米、及650至670奈米。
  3. 如請求項1之萃取物，其係以包含如下步驟之方法製得：a)使用一極性溶劑萃取白仙丹葉，以獲得一萃取液；以及b)視需要乾燥該萃取液，其中該極性溶劑係選自以下群組：水、C1 -C4 醇類、及前述之組合。
  4. 如請求項3之萃取物，其中該極性溶劑係選自以下群組：水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、及前述之組合。
  5. 如請求項3之萃取物，其中該極性溶劑係甲醇。
  6. 如請求項3之萃取物，其中係於步驟b)之前，重複進行多次步驟a)，且合併該多次步驟a)所得之萃取液以進行步驟b)。
  7. 如請求項1至6中任一項之萃取物，其係用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成。
  8. 如請求項7之萃取物，其中該基質金屬蛋白酶係選自以下群組：基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、及前述之組合。
  9. 如請求項7之萃取物，其係用於改善、調理及/或修補皮膚。
  10. 一種用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成之組合物，其係包含有效量之如請求項1至6中任一項之萃取物。
  11. 如請求項10之組合物，其係用於改善、調理及/或修補皮膚。
  12. 一種使用如請求項1至6中任一項之萃取物於製造藥劑之用途，其中該藥劑係用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶活性、抑制基質金屬蛋白酶生成、及/或促進膠原蛋白生成。
  13. 如請求項12之用途，其中該藥劑係用於改善、調理及/或修補皮膚。
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JP2001163749A (ja) * 1999-12-13 2001-06-19 Pola Chem Ind Inc 皮膚外用剤
KR20100043717A (ko) * 2008-10-21 2010-04-29 인하대학교 산학협력단 익소라 콕시니아 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물

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