TWI789749B - 可抗氧化、抗發炎、促進黑色素生成之刺蔥萃取物 - Google Patents

Abstract

本發明有關一種刺蔥莖萃取物的用途，係用於製備抗氧化、抗發炎、預防光老化、DNA修復以及促進黑色素生成的組合物，所製成的組合物可作為醫藥品、化妝品、保養品、毛髮產品等產品的原料者；本發明另提出一種刺蔥葉萃取物的用途，係用於製備抗氧化、抗發炎、預防光老化、DNA修復以及促進黑色素生成的組合物，所製成的組合物可作為醫藥品、化妝品、保養品、毛髮產品等產品的原料者。

Description

可抗氧化、抗發炎、促進黑色素生成之刺蔥萃取物

本發明有關一種植物萃取物，特別是指一種刺蔥萃取物，所製成的組合物可作為醫藥品、化妝品、保養品、毛髮產品等產品的原料者。

刺蔥之學名為食茱萸（Zanthoxylum ailanthoides），通稱茱萸，別名紅刺楤、紅刺蔥、大葉刺蔥、仁刺蔥、刺江某、越椒、毛越椒、鳥不踏、樧、艾子等等，其具有特殊香味，是辛香氣味的重要調味品，自古以來與花椒、薑並列為「三香」。

刺蔥的營養價值高，富含鈣、鉀、鐵質與膳食纖維，自古以來刺蔥就是中醫藥用，其樹皮、果實、葉、根都有不同藥效。《本草綱目》記載，刺蔥性溫、味辛苦，主治心腹冷痛、冷痢、齒痛等。此外，刺蔥有預防痛風的保健功效，並且，其中含有的多酚類植化素，能抑制黃嘌呤氧化酶，降低尿酸，預防痛風。

先前技術提出一種以刺蔥提取物為有效成分的治療代謝疾病的藥物組合物和治療方法。該發明涉及肝脂肪變性，其包括刺蔥萃取物，其更具體地阻礙GPAT（甘油-3-磷酸酰基轉移酶）和DGAT（甘油二酰基酰基轉移酶）的活性，並且可以抑制局部合成和形成脂質。細胞內脂質（脂質液滴）中的脂質作為用於預防代謝疾病或治療並有效抑制中性脂質對脂肪變性的活性成分的吸收的藥物組合物，以及用於預防血脂異常或糖尿病的藥物組合物第二種形式的糖尿病或包含刺蔥提取物的治療和營養組合物。

先前技術中，刺蔥多作為中藥材的部分成分，用於製備外用消炎藥、闌尾炎、腸胃炎、關節炎等等，此外，其亦作為殺瞒劑與殺蟲劑之重要成分之一。

本發明之一目的在於提供一種刺蔥莖萃取物的用途，係用於製備抗氧化、抗發炎、預防光老化、DNA修復以及促進黑色素生成的組合物。

更佳者，該刺蔥莖萃取物之製備方法包含：將一刺蔥莖浸泡於水中，以取得一刺蔥莖水萃取物。

更佳者，該刺蔥莖萃取物之製備方法包含：將一刺蔥莖浸泡於乙醇溶液中，以取得一刺蔥莖乙醇萃取物。

本發明之另一目的在於提供一種刺蔥葉萃取物的用途，係用於製備抗氧化、抗發炎、預防光老化、DNA修復以及促進黑色素生成的組合物。

更佳者，該刺蔥葉萃取物之製備方法包含：將一刺蔥葉浸泡於水中，以取得一刺蔥葉水萃取物。

更佳者，該刺蔥葉萃取物之製備方法包含：將一刺蔥葉浸泡於乙醇溶液中，以取得一刺蔥葉乙醇萃取物。

更佳者，該刺蔥莖水萃取物的製備方法包含：秤取重量比為1：8至1：10之刺蔥莖以及去離子水，放入超音波萃取設備於低溫下連續式萃取， 經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第一澄清過濾液；該刺蔥葉水萃取物的製備方法包含：秤取重量比為1：8至1：10之刺蔥葉以及去離子水，放入超音波萃取設備於低溫下連續式萃取， 經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第二澄清過濾液。

更佳者，該刺蔥莖水萃取物的製備方法更包含：將該第一澄清過濾液進行濃縮；該刺蔥葉水萃取物的製備方法更包含：將該第二澄清過濾液進行濃縮。

更佳者，該刺蔥莖乙醇萃取物的製備方法包含：將該刺蔥莖秤取100公克，於低溫下浸泡於五倍體積之乙醇中，取出後放入超音波萃取設備，於低溫下連續式萃取，經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第三澄清過濾液；該刺蔥葉乙醇萃取物的製備方法包含：將該刺蔥葉秤取100公克，於低溫下浸泡於五倍體積之乙醇中，取出後放入超音波萃取設備，於低溫下連續式萃取， 經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第四澄清過濾液。

更佳者，該刺蔥莖乙醇萃取物的製備方法更包含：將該第三澄清過濾液進行濃縮；該刺蔥葉乙醇萃取物的製備方法更包含：將該第四澄清過濾液進行濃縮。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：

本發明之一目的在於提供一種刺蔥萃取物的用途，其用途包含：用於製備具抗氧化、抗發炎、預防光老化、DNA修復或促進黑色素生成之功效的組合物，且不以此為限。

本發明之另一目的在於提供一種刺蔥取物，其中該刺蔥萃取物包含刺蔥莖或刺蔥葉，但不以此為限。

更佳者，該刺蔥莖之萃取方法包含水萃或乙醇萃，但不以此為限；該刺蔥葉之萃取方法包含水萃或乙醇萃，但不以此為限。

為瞭解本發明之技術特徵、運用技術手段及所預期達成之功效，茲將本發明萃取物之萃取方法加以說明，其敘述如下：

以下為本發明之「刺蔥莖萃取物」之萃取方式

將刺蔥莖洗淨，陰乾約3至5天，再將刺蔥莖剪成小碎片約0.5 cm²大小以進行萃取，其中，本發明之萃取率公式為：(萃取物重量/樣品原總重)×100%。

萃取方法一：「超音波低溫水萃法」

將刺蔥莖秤取約100 g浸泡於4˚C/900 ml的去離子水中，並以超音波振盪萃取設備，於低溫下以總能量300~600 w的能量連續式萃取。於一較佳實施例中，該連續式萃取以震盪3分鐘，休息2分鐘之方式一共震盪60分鐘。於另一較佳實施例中，在4°C溫度下以15,000 rpm高速離心30分鐘，收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，獲得澄清過濾液，利用減壓濃縮機及冷凍乾燥機將澄清過濾液進行濃縮，製成刺蔥莖水萃取物。於又一較佳實施例中，該刺蔥莖水萃取物之凍乾物儲存於-80˚C。

萃取方法二：「超音波低溫乙醇萃法」

將刺蔥莖秤取約100 g浸泡於五倍體積的4˚C/95%乙醇中避光三天，取出後於低溫下以總能量300~600 w的能量連續式萃取。於一較佳實施例中，該連續式萃取以震盪3分鐘，休息2分鐘之方式一共震盪60分鐘。於另一較佳實施例中，在4°C溫度下以15,000 rpm高速離心30分鐘，收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，獲得澄清過濾液，利用減壓濃縮機及冷凍乾燥機將澄清過濾液進行去除溶劑作業，製成刺蔥莖乙醇萃取物。於又一較佳實施例中，該刺蔥莖乙醇萃取物之凍乾物儲存於-80˚C。

以下為本發明之「刺蔥葉萃取物」之萃取方式

將刺蔥葉洗淨，陰乾約3至5天，再將刺蔥葉剪成小碎片約0.5 cm²大小以進行萃取，其中，本發明之萃取率公式為：(萃取物重量/樣品原總重)×100%。

萃取方法一：「超音波低溫水萃法」

將刺蔥葉秤取約100 g浸泡於4˚C/900 ml的去離子水中，並以超音波振盪萃取設備，於低溫下以總能量300~600 w的能量連續式萃取。於一較佳實施例中，該連續式萃取以震盪3分鐘，休息2分鐘之方式一共震盪60分鐘。於另一較佳實施例中，在4°C溫度下以15,000 rpm高速離心30分鐘，收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，獲得澄清過濾液，利用減壓濃縮機及冷凍乾燥機將澄清過濾液進行濃縮，製成刺蔥葉水萃取物。於又一較佳實施例中，刺蔥葉水萃取物之凍乾物儲存於-80˚C。

萃取方法二：「超音波低溫乙醇萃法」

將刺蔥葉秤取約100 g浸泡於五倍體積的4˚C/95%乙醇中避光三天，取出後於低溫下以總能量300~600 w的能量連續式萃取。於一較佳實施例中，該連續式萃取以震盪3分鐘，休息2分鐘之方式一共震盪60分鐘。於另一較佳實施例中，在4°C溫度下以15,000 rpm高速離心30分鐘，收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，獲得澄清過濾液，利用減壓濃縮機及冷凍乾燥機將澄清過濾液進行去除溶劑作業，製成刺蔥葉乙醇萃取物。於又一較佳實施例中，該刺蔥葉乙醇萃取物之凍乾物儲存於-80˚C。

為更進一步瞭解本發明之技術特徵、運用技術手段及所預期達成之功效，茲將本發明相關實施例加以說明敘述如下：

將刺蔥的莖和葉以清水清洗後，置於陰涼處陰乾，各部位乾燥物分別取100 g進行去離子水萃取以及乙醇萃取。將萃取所得刺蔥莖和葉之水萃及乙醇萃溶液以減壓濃縮之方式去除多餘溶劑，之後進行冷凍乾燥48小時。將所得之乾燥萃取物秤重，並除以原始乾燥重以得到該次萃取之萃取率。其萃取結果為： 刺蔥莖以乙醇萃取之萃取率為3.2%；刺蔥莖以去離子水萃取之萃取率為6.6%；刺蔥葉以乙醇萃取之萃取率為6.7%；刺蔥葉以去離子水萃取之萃取率為9.7%，綜上述結果，以去離子水所得的萃取率皆高於乙醇萃取，顯示刺蔥以去離子水進行萃取可得較多產物，顯示刺蔥所含之化合物對水的溶解度較佳。

自由基的傷害常常伴隨著許多疾病的發生，為防止這樣的氧化傷害，於日常中活中適當的補充抗氧化物是有必要的，目前除了合成物外也逐漸以天然物為篩選對象。評斷抗氧化能力之指標包含：多酚含量、黃酮含量、花青素含量或多醣含量，當萃取物含有上述所提及成分的量越高，表示抗氧化的活性越高。在總酚含量中，每克重的樣品裡面ZLLW擁有18.4±0.4 mg的歿食子酸；ZLLE擁有19.4±0.2 mg的歿食子酸；ZLSW擁有32.7±0.5 mg的歿食子酸；ZLSE擁有14.0±1.0 mg的歿食子酸。在總黃酮含量當中，每克重的樣品裡面ZLLW擁有218.9±0.1 mg的芸香素；ZLLE擁有145.5±0.5 mg的芸香素；ZLSW擁有115.5±3.9 mg的芸香素；ZLSE擁有1.6±3.6 mg的芸香素。總花青素含量中，每克重的樣品裡面ZLLW擁有118.9±5.6 mg的花青素；ZLLE擁有807.9±34.1 mg的花青素；ZLSW擁有245.8±14.5 mg的花青素；ZLSE擁有394.7±45.3 mg的花青素。總多醣含量中，每克重的樣品裡面ZLLW擁有728.0±66.7 mg的多醣；ZLLE擁有1229.1±52.8 mg的多醣；ZLSW擁有902.0±51.7 mg的多醣；ZLSE擁有1212.7±48.0 mg的多醣。

實施例1：「刺蔥水萃取物及刺蔥乙醇萃取物之DPPH·與ABTS· ⁺清除自由基試驗」。

探討刺蔥水萃及乙醇萃取物之體外抗氧化能力，試驗利用DPPH·和ABTS· ⁺兩種自由基來作測定， 設定一控制組，其對於DPPH·自由基與ABTS· ⁺自由基之抑制率皆為0%。當添加Ascorbic acid (AA)於50 μg/ml 時，即能達到最高抑制率，而添加ZLSE、ZLSW、ZLLE或ZLLW亦具有良好的自由基清除能力，其中於添加ZLLE及添加ZLLW之兩個試驗中，皆於ZLLE或ZLLW之濃度250 μg/ml時就能達到顯著抑制率，表示其具有較佳之抗氧化能力。

實施例2：「刺蔥水萃取物及刺蔥乙醇萃取物還原力及螯合亞鐵離子能力之測定」。

還原劑可以阻止自由基進行一連串的氧化反應，藉由試劑中的還原物質將赤血鹽[K3Fe(CN)6]還原成黃血鹽[K4Fe(CN)6]，形成普魯士藍(Prussian blue；[Fe4(CN)6]3)之深藍色複合物，並於700 nm測定吸光值，當吸光值愈高表示還原力越強。設定一控制組，其吸光度為0，一添加AA之對照組具有最高的還原能力，而相較於添加其他萃取物的組別，於添加ZLLE及ZLLW時具有較好的還原能力。金屬離子是造成脂質過氧化的原因之一，藉由redox cycling反應，只要少量的金屬離子便可產生大量自由基，促進脂質過氧化進行。金屬離子中又以Fe ²⁺是最具影響力的助氧化劑，利用Fe ²⁺和Ferrozine的複合物在562 nm具特定吸光值，當吸光值越低表示螯合能力越強。設定一控制組，其螯合亞鐵離子能力為0%，一添加EDTA之對照組，其具有最好的螯合亞鐵離子能力，而相較於添加其他萃取物的組別，添加ZLLW具有較好的螯合能力。為評估各組別間的效能差異，計算出分別添加ZLSE、ZLSW、ZLLE及ZLLW之濃度分別在269.3 μg/ml、136.2 μg/ml、32.5 μg/ml以及31.4 μg/ml時達到清除50% DPPH自由基之功效；在濃度223.5 μg/ml、121.9 μg/ml、57.7 μg/ml以及66.3 μg/ml時達到清除50%ABTS自由基之功效；以及在濃度848.1 μg/ml、973.8 μg/ml、1350.3 μg/ml和450.8 μg/ml時達到螯合50% 亞鐵離子之功效。

利用DPPH、ABTS、Chelating power試驗結果計算出EC50，在清除DPPH·自由基之試驗中，ZLLW之EC50為31.4 μg/ml、ZLLE之EC50為32.5 μg/ml、ZLSW之EC50為136.2 μg/ml、ZLSE之EC50為269.3 μg/ml；在清除ABTS· ⁺自由基之試驗中，ZLLW之EC50為66.3 μg/ml、ZLLE之EC50為57.7 μg/ml、ZLSW之EC50為121.9 μg/ml、ZLSE之EC50為223.5 μg/ml；在螯合亞鐵離子能力之試驗中ZLLW之EC50為450.8 μg/ml、ZLLE之EC50為1350.3 μg/ml、ZLSW之EC50為973.8 μg/ml、ZLSE之EC50為848.1 μg/ml。依上述結果可得知：刺蔥之水萃物抗氧化效能普遍較優於乙醇萃取物。

實施例3：「刺蔥水萃取物及刺蔥乙醇萃取物抑制脂質過氧化能力之測定」。

自由基會攻擊細胞膜上的多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid)使其失去一個氫原子，進而產生不成對的電子，而此不成對的電子會再去與其他的不飽和脂肪酸作用而產生新的自由基，於是反應一直延續並產生脂質過氧化的連鎖反應(chain reaction)。TBARS (thiobarituric acid reactive substances)作為脂質過氧化反應的指標，其反應的產物丙二醛(MDA)會與TBA結合形成淡粉紅色物質，於523 nm測定吸光值。實驗分別以老鼠之腎臟、胰臟、肝臟、心臟、腦及皮膚各部位之組織均質液進行測試，如圖1所示，提供一控制組，其抑制脂質過氧化能力為0%，結果顯示，添加250 μg/ml 之ZLSW在脾臟、肝臟中達到40%以上的抑制率；添加250 μg/ml 之ZLLW在脾臟、肝臟、腦組織液中達到40%以上的抑制率，該ZLSW與ZLLW之效能與對照組trolox相似，能有效地降低MDA的生成量，進而終止脂質過氧化的連鎖反應發生。

實施例4：「刺蔥水萃取物及刺蔥乙醇萃取物對人類皮膚角質株化細胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)和小鼠胚胎纖維母細胞(3T3L1)之細胞存活度試驗」。

評估ZL莖和葉之水萃及乙醇萃取物的安全性，實驗利用人類角質株化細胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)和小鼠胚胎纖維母細胞(3T3L1)進行細胞存活度試驗。將以下不同濃度之藥物：20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml和1000 μg/ml，在經過24小時及72小時作用後，利用MTT試驗測定其存活度。結果如圖2A至2C所示，提供一控制組，其HaCaT 細胞活性、B16F10細胞活性與3T3L1細胞活性皆為100%，當添加ZLLE在 100 μg/ml及以上的濃度作用下，HaCaT及B16F10細胞存活度低於80%；當添加ZLSE在 250 μg/ml及以上的濃度作用下，HaCaT及B16F10細胞存活度低於80%，顯示其具有毒性。添加刺蔥之水萃取物在HaCaT及B16F10兩株細胞中存活度皆在80%以上。而當添加ZLSW及ZLLW分別在100 μg/ml及250 μg/ml的濃度下，對小鼠胚胎纖維母細胞具有促進細胞增生的能力。綜合以上結果，後續細胞實驗以250 μg/ml之刺蔥水萃取物作為最高之濃度點進行評估。

實施例5：「經刺蔥水萃取物處理的HaCaT細胞內超氧陰離子( ^.O2-)、活性氧(ROS)及榖胱甘肽(GSH)含量變化測定」。

活性氧主要來源是經由細胞內涉及氧分子氧化還原的生化反應，屬於人體正常的代謝過程。超氧陰離子( ^.O ₂ ^-)被認為是體內最早出現的自由基，且經過自由基鏈鎖反應後，會產生一系列的活性氧自由基(ROS)。細胞中存在許多抗氧化分子，能保護細胞免於自由基的傷害，像是榖胱甘肽(GSH)就能透過降低過量ROS的累積，來防止氧化壓力對細胞造成傷害，是一種相當重要的細胞內抗氧化分子。HaCaT細胞經ZL水萃取物(100和250 μg/ml)作用24小時後，再加入H ₂O ₂作用1小時，DCFH ₂DA (10 μM)測定細胞內ROS的變化；OPT (10 μM)測定細胞內GSH含量的變化；DHE (10 μM)測定細胞內 ^.O ₂ ^-的變化。設定一控制組，其細胞內ROS活性為100%，當細胞受到H ₂O ₂誘導後其ROS誘發率為124.7%，再經濃度250  μg/ml的ZLSW作用後則使誘發率下降至97.6%；再經濃度250 μg/ml ZLLW作用後則使誘發率下降至88.1%。設定一控制組，其細胞內 ^.O ₂ ^-活性為100%，當細胞受到H ₂O ₂誘導後 ^.O ₂ ^-誘發率為111.9%，再經濃度250 μg/ml的ZLSW作用後則使誘發率下降至74.0%；再經濃度250 μg/ml ZLLW作用後則使誘發率下降至61.6%。設定一控制組，其細胞內GSH活性為100%，在細胞受到H ₂O ₂作用後GSH含量下降至85.0%，經濃度250 μg/ml的ZLSW作用後則提升GSH含量至99.7%；經濃度250 μg/ml的ZLLW作用後則提升GSH含量至及94.1%。試驗結果證明經藥物作用的組別能降低經H ₂O ₂誘發的氧化傷害，並藉由提升GSH含量來保護細胞免於受到氧化壓力所造成的傷害。

實施例6：「經刺蔥水萃取物處理的HaCaT細胞內超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase)及榖胱甘肽過氧化酶(GPx)之活性測定及以西方墨點法測定三種抗氧化酵素之蛋白質表現」。

經過刺蔥水萃取物作用後，HaCaT細胞中SOD、catalase和GPx的含量變化結果如下，設定一控制組，其細胞內SOD含量為100%，經250 μg/ml之ZLSW作用後，相較於負控制組H ₂O ₂，細胞內抗氧化酵素SOD、catalase和GPx分別提升13.6%、12.9%和10.8%；而經250  μg/ml之ZLLW作用後，細胞內的SOD、catalase和GPx也分別提升109.8%、31.5%和71.0%。以西方墨點法來測定經刺蔥水萃取物作用後，HaCaT細胞中SOD、catalase及GPx之蛋白質表現。結果如表1所示，將一控制組之數值設定為1.0，僅受H ₂O ₂作用之組別，其抗氧化酵素SOD、catalase和GPx的蛋白質表現量明顯降低，而經過ZLSW和ZLLW作用後之組別，能明顯地看到細胞內抗氧化酵素之蛋白質表現量有所提升。此結果再次證實ZLSW和ZLLW能藉由提高細胞內SOD、catalase和GPx的活性，來保護細胞免於受到氧化壓力所造成的傷害。 表1

	控制組	加入0.1mM H 2O 2反應1小時
H 2O 2	加入ZLLW (250  μg/ml)	加入ZLSW (250  μg/ml)
SOD-1	1.0	0.5	1.1	0.9
catalase	1.0	0.1	0.9	0.8
GPx1/2	1.0	0.3	0.9	0.6
Β-actin	1.0	1.0	1.0	1.0

實施例7：「刺蔥水萃取物及刺蔥乙醇萃取物抑制一氧化氮(NO)能力試驗」。

NO自由基在發炎反應中扮演重要的角色，可以自由地進出細胞作為細胞的訊息傳遞物質，是一種常見引起發炎反應的介質。適量的NO具有保護心血管疾病的作用，但在產量過多時會對組織產生傷害。設定一控制組，其NO活性抑制率為0%，其中ZLSE、ZLSW、ZLLE及ZLLW皆具有良好的NO自由基清除能力，其中ZLSW、ZLLE和ZLLW於濃度250 μg/ml時達到約35%抑制率，與對照組rutin的NO自由基清除活性相近，證明刺蔥水萃及乙醇萃取物確實具有清除NO自由基之能力。

實施例8：「刺蔥水萃取物作用於經LPS誘發後之HaCaT細胞內TNF-α、IL-1β及IL-6含量變化及發炎相關因子蛋白質表現」。

在LPS誘導的環境下，iNOS及COX-2會受到轉錄因子NF-κB的調控，促發炎細胞激素像是TNF-α、IL-1β和 IL-6等，都能活化NF-κB並誘導發炎反應的發生。而當體內處於過量活性氧物質環境時，細胞會釋放促發炎因子，促使MAPKs家族(ERK1/2、JNK和p38)活化，使轉錄因子NF-κB從細胞質到細胞核內進行轉錄造成發炎反應。設定一控制組，其促炎性細胞分子之分泌為100%， 經LPS誘導之組別會提升該促炎性細胞分子之分泌，而ZLSW及ZLLW皆有抑制TNF-α、IL-1β和 IL-6生成的能力，其中以ZLLW表現較佳，在250 μg/ml的作用濃度下，相較於僅受LPS誘導之組別，分別降低了TNF-α含量32.1%、IL-1β含量37.3%及IL-6含量10.1%。西方墨點法結果如表2與表3所示，將一控制組之數值設定為1.0以便於做對照，可看出僅受1 μg/ml LPS作用之組別，其發炎相關因子蛋白質表現量明顯地提升，而經250 μg/ml之ZLSW和ZLLW作用24小時後之組別，細胞內iNOS、COX-2、ERK、JNK和p38等發炎相關之蛋白質表現量明顯降低。結果證實ZLSW和ZLLW能有效地抑制細胞內發炎因子之活性，藉此降低發炎反應的發生。 表2

	控制組	以LPS(1 μg/ml)誘發
LPS	加入ZLLW (250 μg/ml)	加入ZLSW (250 μg/ml)
JNK	1.0	1.8	0.4	0.6
p-JNK	1.0	2.9	1.3	1.9
ERK	1.0	3.4	0.6	0.5
P-ERK	1.0	3.0	0.7	0.7
P38	1.0	1.8	0.3	0.4
p-p38	1.0	1.5	0.4	1.2
β-actin	1.0	1.0	1.0	1.0

表3

	控制組	以LPS(1 μg/ml)誘發
LPS	加入ZLLW (250 μg/ml)	加入ZLSW (250 μg/ml)
NF-κB	1.0	3.2	0.9	1.5
Lamin A	0.0	0.0	0.0	0.0
iNOS	1.0	1.8	0.5	1.0
COX-2	1.0	3.0	0.8	0.4
TNF-α	1.0	1.9	0.6	0.8
1L-1β	1.0	2.0	0.9	0.6
1L-6	1.0	5.2	0.6	1.3
Β-actin	1.0	1.0	1.0	1.0

實施例9：「小鼠胚胎纖維母細胞(3T3L1)經ZLSW和ZLLW作用後細胞內膠原蛋白含量變化」。

膠原蛋白擁有良好的伸展特性，是支撐真皮層整體結構的主要成分，膠原蛋白之缺乏與細胞外基質被破壞為皮膚老化的主因，過量曝曬於UVB會導致皮膚組織改變，使皮膚中大量的彈性纖維異常表現，並使膠原蛋白降解及變形。彈性纖維和膠原蛋白相結合是賦予肌膚拉伸強度和彈性的主因，因此通過抑制異常彈性纖維的生成和膠原蛋白的降解來增強皮膚彈性。設定一控制組，其細胞內膠原蛋白含量為100%，經ZLLW或ZLSW作用後皆會提高細胞內膠原蛋白含量，並且其細胞內膠原蛋白含量隨著ZLLW或ZLSW之濃度增加而提升；設定一控制組，其細胞外膠原蛋白含量為100%，經ZLLW或ZLSW作用後皆會提高細胞外膠原蛋白含量，並且其細胞外膠原蛋白含量隨著ZLLW或ZLSW之濃度增加而提升。經不同濃度(50 μg/ml、100 μg/ml及250 μg/ml)之ZLSW和ZLLW作用之組別，纖維母細胞內或纖維母細胞外與其分泌之膠原蛋白含量有隨萃取物濃度提高而提高的趨勢，表示刺蔥水萃取物具有提高膠原蛋白含量之能力。

實施例10：「小鼠胚胎纖維母細胞(3T3L1)經ZLSW和ZLLW作用後其抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)活性之能力」。

紫外線的刺激會引發細胞膜產生脂質過氧化反應，並促進基質金屬蛋白酶(MMPs)的生成，透過此種膠原蛋白分解酵素的作用，人體皮膚中的膠原蛋白會降解，進而影響到皮膚的緊緻與彈性，並誘發皮膚發生提前老化的現象。將不同濃度之ZLSW和ZLLW (100和250 μg/ml)作用於3T3L1細胞72小時，結果如圖3所示，利用含有gelatin的凝膠作為呈現抑制MMP-9和MMP-2能力的指標，當MMP-2及MMP-9不被抑制時，凝膠上屬於兩者分子量位置的凝膠內之明膠會被分解，使得膠體上出現透明條帶(band)。而萃取物若具備抑制金屬基質蛋白酶之能力，則band表現量降低，並利用Image J定量分析band的縮減趨勢。如圖3所示，設定一控制組，其基質金屬蛋白酶活性之抑制率為0%，添加ZLSW或ZLLW後會增加其基質金屬蛋白酶活性之抑制率，並且其抑制效果隨著ZLSW或ZLLW濃度之增加而提升，其中濃度250 μg/ml之ZLLW有較好的抑制MMP-9及MMP-2之活性，抑制率分別為37.0%和20.8%。結果證實相較於未受藥的控制組，經ZLLW作用之組別確實能有效地抑制MMP-9和MMP2的表現。

實施例11：「ZLSW和ZLLW抑制透明質酸酶活性之能力試驗」。

玻尿酸是皮膚的天然保濕因子，存在於人體的結締組織內，在體內具有多種生理功能，如潤滑關節、調節血管壁通透性或是促進傷口癒合等，另外玻尿酸具有良好的保水能力，是目前保濕性最好的物質之一。試驗在凝膠中添加玻尿酸，而玻尿酸會被透明質酸酶(hyaluronidase, HAase)分解，導致膠片無法被亮藍染劑染色，利用此特性來測定抑制透明質酸酶的活性。ZLSW和ZLLW (100及250 μg/ml)及標準品兒茶素(50 μg/ml) (epigallocatechin gallate, EGCG)分別與透明質酸酶(3000 unit/ml)作用18小時後，未添加之控制組為透明無色狀態，而正向控制組EGCG有明顯的抑制透明質酸酶活性之能力，使膠片被染成較深的色澤。如圖4所示，設定一控制組，其透明質酸酶活性之抑制率為0%，添加ZLSW或ZLLW後會增加其透明質酸酶活性之抑制率，並且其抑制效果隨著ZLSW或ZLLW濃度之增加而提升，經ZLSW和ZLLW作用之組別，其顏色也較深，利用Image J定量分析出濃度250 μg/ml之ZLSW和ZLLW對透明質酸酶活性之抑制率分別為29.7%和30.9%。證明ZLSW和ZLLW皆具有抑制透明質酸酶活性之能力。

實施例12：「ZLSW和ZLLW作用於小鼠胚胎纖維母細胞(3T3L1)後細胞內光老化因子之蛋白質表現」。

基質金屬蛋白酶(MMPs)及Elastase-3A為膠原蛋白分解酵素，當受UVB曝曬時會大量表現，進而降解細胞外基質(ECM)使真皮組織的膠原蛋白降解，其中COL1A與COL3A1分別作為第一型(type I collagen)膠原蛋白與第三型(type III collagen)膠原蛋白的重要指標。在細胞外基質被破壞的同時，生物體內的細胞黏附分子濃度也會下降，造成細胞間的鏈結能力下降，使角質的排列變得較為鬆散。E-cadherin與β-catenin存在於表皮細胞中，當細胞上的E-cadherin與β-catenin的表現異常時，細胞的生長便會失去黏附的特性，進而造成細胞的異常增生與分化不良。結果如表4所示，將一控制組之數值設定為1.0，經ZLSW(250 μg/ml) 或ZLLW(250 μg/ml)作用後顯示具有抑制膠原蛋白分解酵素之活性，並提升膠原蛋白指標的相關因子表現量。結果證實ZLSW和ZLLW具有抑制膠原蛋白分解酵素之活性，並可以有效的增加膠原蛋白生長之能力。 表4

	控制組	加入ZLLW (250 μg/ml)	加入ZLSW (250 μg/ml)
MMP1	1.0	1.0	0.7
MMP2	1.0	0.8	0.4
MMP7	1.0	0.2	0.5
MMP9	1.0	0.8	0.5
MMP13	1.0	0.6	0.7
Elastase	1.0	0.9	0.9
COL1A	1.0	1.2	0.7
COL3A1	1.0	1.2	1.7
β-catenin	1.0	1.8	1.2
E-cadherin	1.0	2.4	2.1
β-actin	1.0	1.0	1.0

實施例13：「ZLSW及ZLLW對經UVB照射後細胞之修復作用」。

試驗將含有不同濃度(20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、250 μg/ml)之ZLSW及ZLLW的無血清培養液加入HaCaT細胞中培養4小時，抽乾培養液後經UVB (50 mJ/cm ²)照射，再以ZLSW及ZLLW作用培養4小時，利用MTT試劑測試細胞存活度，並以顯微鏡觀察細胞移動之變化，藉此評估細胞修復之能力。結果如圖5所示，單受UVB照射組之細胞存活率僅剩75.6%，而經過ZLSW和ZLLW作用後之細胞存活率隨濃度提高有上升的趨勢，在250 μg/ml濃度時分別提升至98.6%及119.3%，結果表明ZLSW及ZLLW具有明顯地修復效果，且修復能力ZLLW大於ZLSW。

實施例14：「ZLSW及ZLLW對經UVB照射後細胞之傷口癒合能力(wound healing)試驗」。

試驗將濃度250 μg/ml之ZLSW及ZLLW的無血清培養液加入HaCaT細胞中培養4小時，抽乾培養液後經UVB (50 mJ/cm ²)照射，再以ZLSW及ZLLW作用培養4小時，以顯微鏡觀察細胞移動之變化，藉此評估細胞修復之能力。wound healing試驗結果，單受UVB照射之組別，其細胞間距幾乎沒有改變，且細胞呈現碎片狀，表示細胞嚴重受損。經ZLSW及ZLLW作用後之細胞在48小時觀察到較明顯的改變，且為向中間生長的趨勢，而透過量化結果，如圖6所示，設定一控制組，其細胞間隙距離改變為100%，受到UVB照射後，其細胞間隙距離增加，再經ZLSW或ZLLW作用後，可以使細胞間隙距離下降，可發現ZLSW及ZLLW確實具有促進細胞修復並使傷口癒合的能力。

實施例15：「ZLSW和ZLLW作用於受UVB照射後之SKH-1小鼠皮膚組織型態變化」。

蘇木紫-伊紅染色(hematoxylin eosin stain, H&E stain)為一種組織化學染色之自然染料，廣泛應用於組織細胞核和細胞質的鑑別染色劑。蘇木紫(hematoxylin)經氧化作用將細胞核著色成藍色，伊紅(eosin)則將組織纖維和細胞質染成不等程度的粉紅色。試驗以UVB (180 mJ/cm ²)照射SKH-1小鼠，照射前後塗抹含ZLSW及ZLLW (250 μg/ml)的2% HEC膠體，於第72小時取下小鼠皮膚，以蘇木紫-伊紅染色皮膚組織，並以光學顯微鏡進行觀察皮膚組織細胞型態變化。結果如圖7所示，經UVB誘發後的皮膚組織明顯呈現被破壞的狀態，其上之表皮已經幾乎不可見，而有塗抹未含藥之2% HEC組則出現明顯發表皮層不正常增厚的現象。經ZLSW及ZLLW(250 μg/ml)作用的組別則皆有明顯優於單受UVB或是處以HEC組別的皮膚狀態，無論是表皮層的厚度或是其下真皮層的排列都與未受處理之副控制組相似，顯示ZLSW及ZLLW有保護皮膚不受UVB傷害的能力。

實施例16：「ZLSW及ZLLW作用於經UVB照射後HaCaT細胞之UV光化產物(CPD及6-4PPs)含量試驗」。

過度曝曬紫外線除了造成光老化之外也可能導致基因突變，當細胞受到UVB照射後會引起光化產物的形成，主要有環丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4二聚體(6-4PPs)，這兩者都是UVB所引起的DNA損傷指標產物。結果如圖8A至8B所示，利用可以辨識CPD或6-4PP的抗體進行免疫螢光染色，設定一控制組，其細胞CPD含量或細胞之6-4PPs含量為100%，僅受UVB作用組別之CPD和6-4PP有較強的螢光訊號，與未處理組相比分別達到164%及330%，表示細胞核受到較嚴重的損傷。而經250 μg/ml之ZLSW及ZLLW作用後CPD之螢光訊號降低至45%及60%，6-4 PP則降至170%及195%。結果證明受傷之DNA在經過藥物作用後會修復細胞的CPD和6-4PPs傷害。

實施例17：「刺蔥水萃取物及刺蔥乙醇萃取物之DNA保護能力試驗」。

完整的DNA型態呈現環形纏繞結構(Supercoiled-form, S-form)，但經紫外線曝曬或受到氧化壓力影響後，其環形纏繞結構會被破壞，形成直線型的結構(Linear-form, L-form)，故利用不同分子量的核酸在膠體孔徑中移動的速度會有差異的特性，將pUC119 DNA以1 mM H ₂O ₂、0.5 mM FeSO ₄誘導及UVB (20 mJ/cm ²)照射，引發DNA損傷。而DNA/HindIII Marker是一群含有已知大小DNA的混合片段，試驗以10 mM H ₂O ₂、3.5 mM FeSO ₄誘導及以UVB (50 mJ/cm ²)照射，使得DNA構造由緻密變為鬆散，藉此來造成DNA的損傷。試驗結果如圖9A與9B所示，僅受H ₂O ₂、FeSO ₄及UVB傷害的組別，DNA結構受到損傷，呈現大量的直線型的結構，而經刺蔥水萃取物及乙醇萃取物(50-250 μg/ml)作用之組別，能保持DNA的完整型態呈現環形纏繞結構。另外圖10也顯示，相較於僅受H ₂O ₂及UVB傷害的組別，經刺蔥水萃取物及乙醇萃取物(50-250 μg/ml)作用後能使DNA維持較完整的片段。結果證明刺蔥水萃取物及乙醇萃取物確實具有保護DNA避免因氧化壓力及UVB照射所引發之DNA損傷。

實施例18：「ZLSW、ZLLW作用於經UVB照射之HaCaT細胞內NER路徑相關蛋白質表現」。

哺乳類動物以NER為其主要的修復系統，故利用西方墨點法分析XPE、XPC、RPA、XPA、XPF、ERCC、XPG及PCNA之蛋白質表現量，評估ZLSW及ZLLW是否能藉由調控NER路徑，達到修復經UVB照射所造成的DNA損傷。其結果如表5所示，將一控制組之數值設為1.0以方便比對，經ZLLW作用之HaCaT細胞，與經UVB照射後之蛋白質表現量相比，其修復系統因子在XPE、XPC、XPF、ERCC和XPG表現增加。故推測ZLLW是利用辨識DNA損傷的位置，並協助DNA將受損片段移除，藉此提升DNA修復能力。 表5

	控制組	經UVB(50 mJ/cm 2)照射
UVB	加ZLLW (250 μg/ml)	加入ZLSW (250 μg/ml)
XPE	1.0	0.8	1.8	0.4
XPC	1.0	0.4	1.5	0.2
RPA	1.0	0.8	2.1	1.8
XPA	1.0	0.9	2.4	3.6
XPF	1.0	0.7	1.4	1.7
ERCC	1.0	0.8	0.9	0.4
XPG	1.0	0.9	1.2	0.6
PCNA	1.0	0.9	1.7	1.3
β-actin	1.0	1.0	1.0	1.0

實施例19：「刺蔥水萃取物及乙醇萃取物抑制細胞外蘑菇酪胺酸酶活性試驗」。

酪胺酸酶是催化黑色素生成反應途徑中的重要酵素，將刺蔥水萃取物及乙醇萃取物以下列各濃度(100 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml、1000 μg/ml)進行細胞外的酪胺酸酶試驗。結果如圖11所示，ZLSE、ZLLE及ZLLW明顯促進酪胺酸酶能力，導致黑色素生成量增加，且其增加比率有隨濃度增高而增強的趨勢，故推測ZLSE、ZLLE及ZLLW可能具備促進黑色素生成之能力。

實施例20：「刺蔥水萃取物於小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)細胞內黑色素含量試驗」。

α-MSH是一種促黑激素荷爾蒙，當細胞受到α-MSH激素刺激時會增加細胞內cAMP含量，接著會活化黑色素生合成途徑中最主要的參與酵素酪胺酸酶(tyrosinase)，酪胺酸酶會催化酪胺酸(tyrosine)氧化形成多巴(DOPA)，再使多巴轉變成多巴醌(dopaquinone)，再經一系列反應形成黑色素。將小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)以α-MSH (100 nM)作用24小時後，分別加入(50 μg/ml、100 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml)之刺蔥水萃取物，作用72小時後進行細胞內的黑色素含量測試。結果如圖12所示，ZLLW具有明顯提高黑色素含量的能力，在250 μg/ml的作用濃度下相較於僅受α-MSH作用之組別，提高黑色素含量126.8%，與細胞外試驗結果相符。由結果得知，ZLLW具促進黑色素生成的功效。

實施例21：「ZLSW及ZLLW對於黑色素生成相關蛋白質MC1R、MITF、Tyrosinase、TRP-2和TRP-1之基因調控」。

進一步以即時聚合酶鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction, qPCR)評估與黑色素生合成相關因子MC1R、MITF、Tyrosinase、TRP-2和TRP-1之基因表現。將小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)以α-MSH (100 nM)作用24小時後，分別加入濃度250 μg/ml之ZLSW及ZLLW，作用72小時後萃取細胞內之RNA。之後再將RNA反轉錄為cDNA，透過即時自動溫度循環儀分析MC1R、MITF、Tyrosinase、TRP-2和TRP-1之基因表現。與僅受α-MSH作用組別之黑色素相關蛋白質MC1R、MITF、trosinase、TRP-2和TRP-1相比，再經ZLLW作用的組別，黑色素生合成相關因子MC1R、MITF、tyrosinase和TRP-1之基因表現明顯提高。結果再次證實ZLLW對於受α-MSH刺激的B16F10細胞有明顯的促進黑色素合成作用。

無

以下「刺蔥」簡稱為「ZL」；以下「刺蔥莖水萃取物」簡稱為「ZLSW」；「刺蔥莖乙醇萃取物」簡稱為「ZLSE」；「刺蔥葉水萃取物」簡稱為「ZLLW」；「刺蔥葉乙醇萃取物」簡稱為「ZLLE」； 圖1為一長條圖，說明「ZLLW、ZLLE、ZLSW與ZLSE於250 μg/ml時抑制脂質過氧化能力(與對照組Trolox比較)」； 圖2A為一長條圖，說明「不同濃度之ZLLW、ZLLE、ZLSW與ZLSE (20~1000 μg/ml)作用反映於人類皮膚角質株化細胞(HaCaT)24小時後，利用MTT試劑測試其存活度」； 圖2B為一長條圖，說明「不同濃度之ZLLW、ZLLE、ZLSW與ZLSE (20~1000 μg/ml)作用反映於小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)72小時後，利用MTT試劑測試其存活度」； 圖2C為一長條圖，說明「不同濃度之ZLLW、ZLLE、ZLSW與ZLSE (20~1000 μg/ml)作用反映於小鼠胚胎纖維母細胞(3T3L1) 72小時後，利用MTT試劑測試其存活度」； 圖3為一長條圖，說明「3T3L1細胞經濃度(100和250 μg/ml)之ZLLW和ZLSW作用後以Image J分析定量之結果」； 圖4為一長條圖，說明「不同濃度(100和250 μg/ml)之ZLSW和ZLLW抑制透明質酸酶活性之能力，以Image J分析定量之結果」； 圖5為一長條圖，說明「HaCaT細胞經UVB (50 mJ/cm²)照射，前後加入ZLLW和 ZLSW作用4小時後，進行細胞之存活度試驗之結果」； 圖6為一曲線圖，說明「HaCaT細胞經UVB (50 mJ/cm²)照射，前後加入ZLLW和ZLSW作用4小時後，進行Image J分析定量之結果」； 圖7為一照片圖，說明「將ZLSW和ZLLW (250 μg/ml)作用於經UVB (180 mJ/cm²)照射後之SKH-1小鼠皮膚組織以H&E stain後，利用光學顯微鏡觀測」； 圖8A為一長條圖，說明「ZLSW及ZLLW作用於經UVB照射後HaCaT細胞之UV光化產物(CPD)之含量變化」； 圖8B為一長條圖，說明「ZLSW及ZLLW作用於經UVB照射後HaCaT細胞之UV光化產物(6-4PPs)之含量變化」； 圖9A為一長條圖，說明「經H ₂O ₂ (1 mM)、FeSO ₄ (0.5 mM)誘導及以UVB (20 mJ/cm²)照A射之pUC119DNA處以不同濃度 (50~250 μg/ml)之Image J對超螺旋形態(supercoiled form)分析定量之結果」； 圖9B為一長條圖，說明「經H ₂O ₂ (1mM)、FeSO ₄ (0.5 mM)誘導及以UVB (20 mJ/cm²)照射之pUC119DNA處以不同濃度(50~250 μg/ml)之Image J對直線形態(linear form)分析定量之結果」； 圖10為一長條圖，說明「經H ₂O ₂ (10 mM)、FeSO ₄ (3.5 mM)誘導及以UVB (50 mJ/cm²)照射之DNA/HindIII Maker，以Image J分析定量之結果」； 圖11為一長條圖，說明「ZLLW、ZLLE、ZLSW與ZLSE (100~1000 μg/ml)抑制細胞外蘑菇酪胺酸酶活性實驗」； 圖12為一長條圖，說明「ZLLW、ZLLE、ZLSW與ZLSE (50~500 μg/ml)作用於經α-MSH(100 nM)刺激後之B16F10細胞，於72小時後測定黑色素含量變化」。

Claims (9)

1. 一種刺蔥萃取物的用途，係用於製備促進黑色素細胞內黑色素生成、抑制皮膚角質細胞氧化、抑制皮膚角質細胞發炎、預防皮膚角質細胞光老化以及皮膚角質細胞DNA修復的組合物，該刺蔥萃取物同時具有抗氧化及促進黑色素生成的有效成分，其中抗氧化的有效成分係用於皮膚角質細胞以抑制皮膚角質細胞氧化，促進黑色素生成的有效成分係用於黑色素細胞以促進黑色素細胞內黑色素生成。
2. 如請求項1所述之用途，其中該刺蔥萃取物為一刺蔥莖水萃取物，其製備方法包含：將一刺蔥莖浸泡於水中。
3. 如請求項1所述之用途，其中該刺蔥萃取物為一刺蔥莖乙醇萃取物，其製備方法包含：將一刺蔥莖浸泡於乙醇溶液中。
4. 如請求項1所述之用途，其中該刺蔥萃取物為一刺蔥葉水萃取物，其製備方法包含：將一刺蔥葉浸泡於水中。
5. 如請求項1所述之用途，其中該刺蔥萃取物為一刺蔥葉乙醇萃取物，其製備方法包含：將一刺蔥葉浸泡於乙醇溶液中。
6. 如請求項1所述之用途，其中該刺蔥萃取物為一刺蔥莖水萃取物，其製備方法包含：秤取重量比為1：8至1：10之刺蔥莖以及去離子水，放入超音波萃取設備於低溫下連續式萃取，經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第一澄清過濾液；或該刺蔥萃取物為一刺蔥葉水萃取物，其製備方法包含：秤取重量比為1：8至1：10之刺蔥葉以及去離子水，放入超音波萃取設備於低溫下連續式萃取，經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第二澄清過濾液。
7. 如請求項6所述之用途，其中，該刺蔥莖水萃取物的製備方法更包含：將該第一澄清過濾液進行濃縮；該刺蔥葉水萃取物的製備方法更包含：將該第二澄清過濾液進行濃縮。
8. 如請求項1所述之用途，其中該刺蔥萃取物為一刺蔥莖乙醇萃取物，其製備方法包含：將該刺蔥莖秤取100公克，於低溫下浸泡於五倍體積之乙醇中，取出後放入超音波萃取設備，於低溫下連續式萃取，經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第三澄清過濾液；或該刺蔥萃取物為一刺蔥葉乙醇萃取物，其製備方法包含：將該刺蔥葉秤取100公克，於低溫下浸泡於五倍體積之乙醇中，取出後放入超音波萃取設備，於低溫下連續式萃取，經高速離心收集上清液，再經抽真空篩檢程式過濾，以獲得第四澄清過濾液。
9. 如請求項8所述之用途，其中，該刺蔥莖乙醇萃取物的製備方法更包含：將該第三澄清過濾液進行濃縮；該刺蔥葉乙醇萃取物的製備方法更包含：將該第四澄清過濾液進行濃縮。

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