KR20160125784A

KR20160125784A - 자운고 발효 오일 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20160125784A
Application number: KR1020150056726A
Authority: KR
Inventors: 김광년; 박찬선; 윤종석; 신민희; 손주현
Original assignee: 주식회사 라비오
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2015-04-22
Publication date: 2016-11-01
Also published as: KR101716680B1

Abstract

본 발명은 자초 및 당귀를 포함하는 자운고 재료를 미생물에 의해 발효 시켜 얻은 자운고 발효 오일 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 자운고 발효 오일로 항산화, 항염, 항노화, 미백의 효능이 뛰어나므로, 이를 활용하여 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등의 피부 외용제 등 다양한 분야에 적용할 수 있다.

Description

자운고 발효 오일 및 이의 제조방법{SHIUNKO FERMENTED OIL AND PRODUCING METHOD THEREOF}

본 발명은 항산화, 항염, 미백, 항노화 효과를 가지는 자운고 성분을 함유하는 자운고 발효 오일 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 우리 몸의 가장 큰 기관으로서 전체 우리 몸 부피의 약 16%를 차지하고 있으며, 외부환경과 직접 접해 있으면서, 몸 안으로 침입하려는 치명적인 많은 유해인자들 온도, 습도 및 자외선 등과 같은 외부 자극과 인체 유해 미생물 등으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당한다.

피부 노화의 한가지 형상인 주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는데, 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다. 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형, 진피의 기질인 히아루론산의 감소에 의한 피부 탄력 감소이다. 특히 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하 에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹인 상처 치유 시)의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 근래에 들어 피부 노화에 대한 광범위한 연구 결과가 보고되면서 피부에서의 콜라겐의 중요한 기능이 밝혀지고 있다.

신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 기질 금속단백질 분해효소(Matrix Metalloprotease; MMP)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현량 및 활성을 조절하고자 하였다.

자운고에 함유된 유효성분을 효과적으로 추출하는 방법에 대하여 연구하여, 항산화, 항염, 항노화, 미백의 효능을 가진 자운고 성분을 유효성분을 함유한 자운고 발효 오일 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 자초 및 당귀를 포함하는 자운고 재료를 미생물에 의해 발효 시켜 얻은 자운고 발효 오일을 제공한다.

일 구현예에 따르면, 상기 발효 오일은 감초, 황금, 진피, 고삼, 작약, 금은화, 황기, 연교, 감국, 유근피 및 지실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 자운고 재료를 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명은 미생물을 적정 배지와 식물성 오일 및 자운고 성분이 포함된 1차 배양 배지에서 배양하는 1차 발효 단계;

상기 1차 배양된 배양액을 적정 배지와 식물성 오일 및 자운고 성분이 포함된 2차 배양 배지에 접종하여 배양하는 2차 발효 단계;

상기 2차 발효된 배양액을 정치하여 배지와 오일층을 분리하는 단계;

상기 분리된 오일층을 수거하여 수분을 제거하는 단계; 및

상기 수분이 제거된 오일을 여과하는 단계;를 포함하는 자운고 발효 오일의 제조방법을 제공한다.

일 구현예에 따르면, 상기 미생물은 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물인 것이 바람직하다.

일 구현예에 따르면, 상기 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물은 슈도지마 속(Pseudozyma sp.)인 것이 바람직하다.

일 구현예에 따르면, 상기 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물은 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)인 것이 바람직하다.

일 구현예에 따르면, 상기 적정 배지는 글루코스(glucose), 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 으깬 대두 분말(soya bean meal), (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, NaCl 및 정제수로 이루어지는 것이 바람직하다.

일 구현예에 따르면, 상기 식물성 오일은 올리브 오일, 야자 오일, 아르간 오일, 녹차씨 오일, 포도씨 오일, 메도우폼씨 오일, 대두 오일, 해바라기씨 오일, 포도씨 오일, 참깨 오일, 들깨 오일, 아마 오일, 홍화씨 오일, 옥수수 오일, 유채씨 오일, 카놀라 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기의 자운고 발효 오일을 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 피부 외용제 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하다.

본 발명은 자운고에 함유된 유효성분을 미생물을 이용한 식물성 오일의 발효 방법을 이용하여 효과적으로 추출할 수 있고 및 그 방법으로 발효된 자운고 발효 오일로 항산화, 항염, 항노화, 미백의 효능을 가진 자운고 발효 오일을 생산할 수 있어, 이를 활용하여 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등의 피부 외용제로서 활용하는 데에 유용하다.

도 1은 자운고 오일의 2차 발효 후의 시간대 별 자운고 발효 오일의 유리지방산 함량을 측정한 실험 결과 이다.
도 2는 DPPH Assay를 통한 자운고 발효오일(F.S.)의 라디컬 소거 효과 검증 실험의 결과이다.
도 3은 TBARS Assay를 통한 자운고 발효오일(F.S.)의 지질과산화 억제 능력 검증 실험 결과이다.
도 4는 NO Assay를 통한 자운고 발효오일의 항염 효능 실험 결과이다.
도 5는 B16F10 세포주를 이용한 자운고 발효오일의 미백 효능 실험 결과이다.
도 6은 HDF 세포주에 자운고 발효 오일 추출물을 처리한 후의 콜라겐 분해효소(MMP-1)의 발현양을 통해 확인한 자운고 발효 오일의 항노화 효능 실험 결과이다.
도 7은 HDF 세포주에 자운고 발효 오일 추출물을 처리한 후의 콜라겐 유전자(COL1A1)의 발현양을 통해 확인한 자운고 발효 오일의 항노화 효능 실험 결과이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 자초 및 당귀의 유효 성분을 함유하는 자운고 발효 오일을 제공한다.

자운고(慈雲膏)는 중국 명나라 진실공 <외과정종> 중 '백독창' 에 기록된 '윤기고' 에서 유래된 고약에 일본 에도시대의 외과의사 '하나오카 세이슈' 가 돼지 기름을 가하여 자운고라 명명한 것으로, '동의보감' 에서는 자초근외 당귀와 여러 재료를 넣어 끓이면 지혈, 통증완화, 피부재생 촉진, 무좀, 화상, 동상, 화농성 종기, 타박에 효과가 있다고 기록되어 있다. 또한, 일본 '새한방처방해설' 및 '한방진료의전' 에서는 화상 혹은 건조해서 생기는 만성 피부염에 원인에 관계 없이 사용 가능하다고 기록되어 있는 외상 및 타박상 특히 화상에 많은 효과를 보이며, 널리 사용되고 있는 아토피치료제에 포함된 소염제 및 부신 피질스테로이드 등이 전혀 포함하지 않고도 피부 진정효과와 가려움 진정효과를 나타낸다.

전통적인 자운고 제조 방법은 참기름 100 중량부에 밀랍 또는 황납 약 30-40 중량부, 돼지기름 약 1 내지 5 중량부를 용융시킨 후 당귀 약 5-20 중량부 및 자초 약 5-20 중량부를 투입하고 낮은 온도에서 붉은 빛이 될 때까지 가열하여 제조하는 것이다. 그러나 이러한 방법으로 제조된 자운고 오일을 베이스 오일로 화장료 조성물에 적용하여 상품화 하기에는 곤란한 측면이 많다.

이에 본 발명자들은 자운고의 주요 성분인 자초와 당귀를 식물성 오일과 함께 미생물 발효 시킴으로써 보다 효과가 우수한 자운고 발효 오일을 제공할 수 있게 되었다.

본 발명에서 자운고라 함은 전통적 방식으로 제조된 자운고 뿐만 아니라 기본적으로 자초와 당귀를 포함하는 재료도 함께 지칭하는 것으로 한다.

자초(생약명: Radix Lithospermi)는 한국, 중국, 일본의 산과 들의 풀밭에서 서식하는 지치(학명: Lithospermum erythrorhizon)과의 다년초로 줄기는 곧게 서고 가지가 갈라지며, 크기는 약 30~70cm 정도이며, 긴 타원 모양의 잎을 갖는다. 전체에 위로 향한 잔털이 많으며, 뿌리가 굵고 보라색을 띠어 자초라고 불리며, 한방에서는 뿌리를 약재로 사용한다. 토혈, 코피, 소변, 출혈, 홍역에 효과가 있고, 화상, 동상, 습진, 발진, 피부궤양 등에 소독약으로 외용한다. 뿌리는 항균이나 항염 작용에 쓰이며, 민간에서는 불로약으로 불리기도 하였다.

자초의 주요 성분은 디옥시시코닌(Deoxyshikonin), β,β-디메틸아크릴시코닌(dimethylacrylshikonin), 이소부틸시코닌(isobutylshikonin), 시코닌(shikonin), 5,8-디하이드록시-2-(1-메톡시-4-메틸-3-펜테닐)-1,4-나프탈렌디온, β-사이토스테롤 및 카페인산 에스테르의 혼합물 중 하나 이상을 포함한다.

당귀(Angelica sinensis)는 미나리과에 여러해살이 풀이다.　높이는 0.4~1m이다. 줄기는 곧게 자라고 자줏빛을 띠며 세로 홈이 있다. 줄기는 반들반들하며 털이 없다. 잎은 2~3회 홀수 깃꼴로 갈라졌으며 잎자루의 길이가 3~11cm이며 기부의 엽초가 팽대되었다. 잎몸은 달걀 모양이다. 작은 잎은 3쌍인데 잎자루에 가까운 한 쌍의 작은 잎은 자루의 길이가 0.5~1.5cm이며 끝에 가까운 1쌍은 잎자루가 없고 1~2회로 갈라졌으며 열편(裂片)의 가장자리에 결각(缺刻)이 있다.

당귀는 진정작용, 진통작용, 강압작용, 억균작용, 약한 이뇨작용, 이담작용, 관상동맥 혈류량 촉진작용, 적혈구 생성 작용, 비특이성 면역 촉진 작용, 항산화 작용, 항방사능 작용, 간기능 보호 작용, 혈허증, 월경부조, 무월경, 징가, 산후복통, 타박상, 근육 관절통 및 신경통, 만성기관지염, 만성 인후염, 돌발성 이통, 음경섬유성해면체염, 어깨관절염, 위 십이지장 궤양, 만성 간염, 월경병, 고혈압, 대상포진, 뇌동맥경화, 요퇴통, 혈전폐쇄성맥관염, 습진, 만성 비염, 옹종, 변비, 이질, 비증, 자궁발육부전, 신경쇠약, 자궁출혈을 다스리는 것으로 알려져 있다.

당귀는 70 가지가 넘는 성분을 함유하고 있으며, 특히 리수스트리드(ligustilide), 부틸프탈레이드(butylphthalide, 센큐노리드(senkyunolide) A, 프탈라이드 다이머, 페룰산(ferulic acid), 코니페릴 페룰레이트(coniferyl ferulate), 폴리아세틸렌, 비타민 및 아미노산 등을 함유한다.

또한, 상기 자운고 발효 오일은 감초, 황금, 진피, 고삼, 작약, 금은화, 황기, 연교, 감국, 유근피, 지실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 재료를 발효 시켜 얻은 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 미생물을 적정 배지와 식물성 오일 및 자운고 성분이 포함된 1차 배양 배지에서 배양하는 1차 발효 단계;

상기 2차 발효된 배양액을 정치하여 배지와 오일 층을 분리하는 단계; 상기 분리된 오일 층을 수거하여 수분을 제거하는 단계;

및 상기 수분이 제거된 오일을 여과하는 단계;를 포함하는 자운고 발효 오일의 제조방법을 제공한다.

상기 미생물은 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물일 수 있다.

상기 다당체는 미생물에 의해 발효된 다당인 것으로, 상기 미생물은 통상적으로 미생물 발효 공정에 사용되는 슈도지마(Pseudozyma), 토룰롭시스 봄비콜라(Torulopsisbombicola), 토룰롭시스 아피콜라(Torulopsisapicola), 토룰롭시스 페트로필룸(Torulopsis petrophilum), 칸디다 봄비콜라(CandidaBombicola), 칸디다 아피콜라(Candida apicola), 칸디다 페트로풀룸(Candidapetrophulum) 및 티오바실러스 티오옥시단스(Thiobacillus thiooxidans)로 이루어진 그룹으로부터 선택하여 발효에 사용할 수 있으며, 바람직하게는 슈도지마(Pseudozyma sp.) 속으로 구성된 군으로부터 1종 이상, 보다 바람직하게는 슈도지마(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)을 사용할 수 있다.

상기 슈도지마(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)는 원통 모양으로, 극성 발아 형식으로 증식하며, 균사 및 자낭포자와는 구별되는 내생포자를 형성한다.

상기 적정 배지는 글루코스(glucose), 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 으깬 대두 분말(soya bean meal), (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, NaCl 및 정제수로 이루어질 수 있다.

상기 식물성 오일은 올리브 오일, 야자 오일, 아르간 오일, 녹차씨 오일, 포도씨 오일, 메도우폼씨 오일, 대두 오일, 해바라기씨 오일, 포도씨 오일, 참깨 오일, 들깨 오일, 아마 오일, 홍화씨 오일, 옥수수 오일, 유채씨 오일, 카놀라 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 1차 배양 배지는 1차 배양 배지 총 중량 100 중량부를 기준으로 식물성 오일 1 내지 30 중량부, 자초 0.1 내지 3 중량부, 당귀 0.01 내지 0.3 중량부 및 나머지 적정 배지를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 1차 발효는 22 내지 28 ℃, 250 내지 350rpm, 호기 조건에서 발효시킬 수 있다.

상기 2차 배양 배지는 1차 배양 배지 총 중량 100 중량부를 기준으로 식물성 오일 30 내지 70 중량부, 자초 0.1 내지 3 중량부, 당귀 0.01 내지 0.3 중량부 및 나머지 적정 배지를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 2차 발효는 22 내지 28 ℃, 100 내지 200rpm, 호기 조건에서 발효시킬 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제조된 자운고 발효 오일은 항산화, 항염, 항노화, 미백의 효능을 가지기 때문에 이를 활용하여 피부 외용제로 사용하게 되면 탁월하다.

피부 외용제는 예를 들어 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등일 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<실시예 1> 미생물 발효를 통한 자운고 발효 오일의 제조

슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16[KCTC 8950P]를 표 1과 같은 조성의 올리브 오일, 자초, 당귀 및 적정배지를 포함하는 조성의 배양액 1L를 이용하여, 25℃, 300rpm, 호기조건에서 배양하여 1차 발효 하였다.

배양액 조성		함 량
올리브 오일		100 g/L
자초		10 g/L
당귀		1 g/L
적 정 배 지	Glucose	10 g/L
	Yeast extract	3 g/L
	Melt extract	3 g/L
	Peptione	3 g/L
	Soya bean meal	3 g/L
	(NH₄)₂SO₄	2 g/L
	KH₂PO₄	1 g/L
	MgSO₄	0.5 g/L
	CaCl₂	0.1 g/L
	NaCl	0.1 g/L
	증류수	Up to 1L

상기 1차 발효액을 표 2와 같은 조성의 올리브 오일, 자초, 당귀 및 적정배지를 포함하는 조성의 배양액 100L를 이용하여, 25℃, 150rpm, 호기조건에서 배양하여 2차 발효 하였다.

배양액 조성		함 량
올리브 오일		500 g/L
자초		10 g/L
당귀		0.1 g/L
적 정 배 지	Glucose	10 g/L
	Yeast extract	3 g/L
	Melt extract	3 g/L
	Peptione	3 g/L
	Soya bean meal	3 g/L
	(NH₄)₂SO₄	2 g/L
	KH₂PO₄	1 g/L
	MgSO₄	0.5 g/L
	CaCl₂	0.1 g/L
	NaCl	0.1 g/L
	증류수	Up to 1L

상기 2차 발효 후에 3h, 7h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h 각각의 시간대 별로 배양액을 20mL씩 채취하여, 오일 부분만을 회수하고, 오일의 유리지방산을 측정하여 오일의 발효 정도를 확인하였다. 시간대 별 자운고 발효 오일의 유리지방산 함량을 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다.

Time(h)	Sample(g)	Potassium Hydroxide(㎕)	Acid Value
3	1.399	120	0.48
7	1.0121	140	0.78
12	1.0043	240	1.34
24	1.0192	360	1.98
48	1.0057	1440	8.03
72	1.0034	2220	12.41
96	1.0243	2980	16.32
120	1.0235	3200	17.54

상기 표 3의 결과와 같이 2차 발효 24시간 후에 자운고 발효 오일의 유리지방산 함량이 급격히 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 2차 발효된 발효 오일을 24시간 정치 후, 배지와 오일의 층 분리를 유도하였다.

이후 분리된 오일을 수거 하여 실리카겔을 사용하여 오일에 남아 있는 수분을 제거 하고, 0.45㎛ 필터를 이용하여 최종적으로 여과하여, 자운고 발효 오일을 얻었다.

<실시예 2 내지 5 및 비교예 1 및 2> 자초 함유량에 따른 자운고 발효 오일

상기 실시예 1과 같은 자운고 발효 오일의 제조 방법에 있어서, 자초의 함유량 만을 달리하여 아래 표 4와 같이 자운고 발효 오일을 제조하고, 제조된 자운고 발효오일의 항산화, 항염, 항노화 및 미백 효과를 평가 하였다. 하기 표 4에서 %는 중량%를 의미하며, 전체 조성물 총중량을 기준으로 한 것이다.

	비교예 1	비교예 2	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
	비타민 E (토코페롤)	올리브오일	-	-	-	-
자운고 발효오일의 자초 함유량	-	-	0.1%	1%	3%	5%

<실험예 1> 자운고 발효 오일의 항산화 효능 : DPPH Assay를 통한 라디컬 소거 효과 검증

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 매우 안정한 프리 라디칼(free radical)로써 517nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. 상기 라디칼은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며, 특히, 여러 가지 항산화 기작 중 프로톤-라디칼 스캐빈저(Proton-radical scavenger)에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰 할 수 있는 장점이 있다.

자초의 함유량에 따라 실시예 2 내지 5의 자운고 발효 오일(F.S.)을 각각 1%, 5% 및 10%의 농도로 n-hexane에 녹여 준비한다. 2mM로 n-hexane에 녹인 DPPH는 1/10 희석 하여 0.2mM로 준비하고, 양성 대조군 (positive control)로 비타민 E를 사용하였다.

준비된 시료 100㎕에 DPPH 100㎕를 첨가하여 15분간 반응 후, 540㎚에서 흡광도를 측정 하였다. 흡광도 측정결과는 아래 표 5 및 도 2 에 나타내었다.

농도	비교예 1	비교예 2	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
1%	16.27907	11.75361	13.47392	34.88372	50.23256	60.05028
5%	36.85765	31.92332	35.60402	51.40792	75.62539	86.70019
10%	76.74419	53.41923	59.36266	65.26398	82.21873	91.39535

상기의 결과와 같이 자운고 발효 오일(실시예)은 기존 오일(비교예 2)에 비하여 라디칼 소거 능력이 향상되었음을 확인 할 수 있었다. 그리고, 자운고 발효 오일의 함량이 높을 수록, 자초 함유량이 높은 시료 일수록 라디칼 소거 능력이 높음을 확인 할 수 있었다.

<실험예 2> 자운고 발효 오일의 항산화 효능: TBARS(Thiobarbituric acid reactive substances) assay를 통한 지질과산화 억제 능력 검층

지질 과산화란 세포막에 있는 지질의 전사를 프리 라디칼(free radical)이 가져옴으로써, 지질을 분해하는 것이다. 이러한 지질과산화에서는 또 다른 라디칼을 생성하게 되며, 이는 또 다른 지질의 과산화를 가져오게 된다. 이러한 현상을 '체인 리엑션 메커니즘(chain reaction mechanism)' 이라고 한다. 이러한 산화반응은 두 개의 라디칼과 만날 때 그 산물로서 논-라디칼(non-radical)이 생성되어 종료 된다.

TBARS Assay는 이러한 지질과산화를 정량하기 위한 방법으로, 지방의 과산화가 진행됨에 따라 최종 산물인 MDA(malondialdehyde)가 생성 되며, 생성된 MDA에 티오바르비툴 산(Thiobarbituric acid)이 반응하여 적색복합체를 생성하는 정색반응으로 지질의 과산화를 측정한다.

증류수 100ml을 0.2㎛ 필터로 여과한 후, 0.69g의 TBA 시약을 첨가하고 5분간 초음파 처리(Sonication) 하여 TBA 용액을 준비하였다. 준비된 TBA 용액의 불순물을 제거하기 위하여 1㎛ 필터로 여과 후 아세트산과 1:1 비율로 혼합하여 최종 0.345% 용액을 준비하였다. 자초 함유량 5%로 준비된 자운고 발효오일(실시예 6)과, 비교예 1 및 2의 시료를 각각 1%, 5%, 10%의 농도로 벤젠에 녹인 후 3.6J/cm² UVB에 노출 시키기 전과 후의 시료를 준비하였다. 상기 준비된 TBA 용액을 시료에 첨가하고, 30초간 볼텍스하여 혼합시킨다. TBA 용액과 혼합한 시료를 원심 분리하여, 상층액은 버리고 침전물을 수거하여 95℃에서 30분간 가열하였다. 가열된 시료는 실온으로 냉각시킨 후 530nm 에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정결과는 아래 표 6 및 도 3에 나타내었다.

구분	UV 노출 전	UV 노출후
시료함량	1%	1%	5%	10%
비교예 1(tocopherol)	20	34	31.8	25.3
비교예 2(Olive)	25.3	41.2	40.2	39.6
실시예 6 (F.S)	21.8	36.7	34.2	30.1

상기 표 6 및 도 3에서 나타난 결과와 같이 자운고 발효 오일(실시예 6; F.S.)과 일반 오일(비교예 1)의 지질과산화 억제 능력을 비교하면, 일반 오일에 비하여 자운고 발효 오일에서 그 능력이 우월함을 확인 할 수 있었다.

<실험예 3> 자운고 발효 오일의 항염 효능 : NO(Nitric Oxide) assay를 통한 측정

일산화 질소(Nitric Oxide)는 포유류 세포의 대식세포(Macrophage)가 면역 항상성을 유지하기 위하여 작동될 때 생기는 주요 산물이다. 대식세포가 생성하는 NO의 양이 증가함에 따라 면역 체계가 작동된다. 따라서, 생성 되는 NO의 양을 측정함으로써 염증 작용의 정도를 파악할 수 있다. 그라나 대부분의 NO는 Nitrite(NO₂ ^-)와 Nitrate(NO₃ ^-)로 산화되어 직접적인 측정이 불가함으로 전환되는 NO₂ ^-의 양을 측정할 수 있는 그리스 반응(Griess Reaction)을 사용한다.

Raw 264.7 cell을 96-well plate에 5x10⁴ cells/well 농도로 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 시료는 배양액의 배지를 제거한 후 최종 농도가 0.01 ~ 2.0%rk 되도록 자운고 발효 오일 추출액을 처리한 후, 염증 유도인자인 LPS를 1㎍/mL의 농도로 처리하였다. LPS 처리 48시간 후, 배양액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 차광된 상태에서 10분간 반응 후 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정결과는 도 4에 나타내었다.

흡광도 측정결과, 자운고 발효 오일은 LPS 대조군에 비하여 NO 소거 능력이 약 1.5배 증가하였고, 자운고 발효 오일 추출액에 의한 NO 소거 능력은 농도 의존적으로 유의성 있게 감소 하였다.

<실험예 4> 자운고 발효 오일의 미백 효능

B16F10 세포주는 멜라닌을 합성하는 melanoma 세포의 한 종류이다. B16F10 세포의 α-Melanocyte-stimulating hormone (alpha-MSH, α-MSH)는 멜라닌 합성을 유도하는 호르몬으로, B16F10에 α-MSH를 처리하면 멜라닌이 합성되어 세포가 검게 변하게 된다. 이러한 원리를 이용하여 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌 합성을 유도한 뒤 시료의 미백효과를 확인하는 실험이다. 양성 대조군으로는 대표적인 미백원료인 0.1% 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.

배양된 B16F10세포에 α-MSH 10nM을 처리한 후, 시료와 알부틴을 넣은 후, 새로운 배지를 첨가하여 각 well 속의 배지 량이 2ml이 되도록 한다. 상기 세포를 48시간동안 배양한 후, PBS를 이용하여 세척 하고, 각 웰에 200㎕의 Trypsin-EDTA 를 첨가하고 5분간 배양하였다. PBS를 이용하여 각 웰의 세포를 수집하여 e-tube로 옮긴 후, 원심분리 하여 세포와 PBS를 분리하고, 상층액인 PBS를 제거한다. 수집된 세포를 65℃ heat block에서 5분간 열을 가한 후, 1M NaOH용액 400㎕ 넣은 후 65℃ heat block에서 20분간 멜라닌 색소를 용해 시킨 후, 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과는 도 5에 나타내었다.

흡광도 측정 결과 α-MSH가 멜라닌 합성을 약 2배 증가 시켰고, 양성 대조군인 0.01% 알부틴이 멜라닌의 합성을 저해 하는 것을 확인 할 수 있었다. 그리고, 자운고 발효 오일 추출액에서도 멜라닌 합성 억제 능력을 확인 할 수 있었으며, 특히, 200㎍/ml 농도의 자운고 발효 오일 추출액에서 0.01% 알부틴과 비슷한 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.

<실험예 5> 자운고 발효 오일의 항노화 효능: 자외선 조사에 의한 콜라겐 분해효소(MMP-1) 억제능 측정

콜라겐은 피부탄력에 있어서 중요한 단백질이다. 자운고 발효 오일의 항노화 효과를 확인하기 위해서 인체 섬유아세포인 HDF(human dermal fibroblast)를 이용하여 콜라겐과 관련된 유전자의 발현량을 확인함으로써 항노화 효과를 확인하였다.

배양된 인체 섬유아세포 HDF를 6-well plate에 3x10⁶cells/well의 농도로 분주한 다음 24시간 배양한 후, 배양 시 사용한 배지를 제거하고 PBS(Phosphate Buffer Saline) 용액으로 1회 세척 후, 각 well에 PBS를 1mL씩 분주하고, 자외선B(ultraviolet B; UVB) 25mJ/cm²을 조사하여 인플라메이징(inflammaging; 염증성 노화)을 유도한 후, 자운고 발효오일로부터 추출한 자운고 발효오일 추출액을 24시간 처리하였다. 이 때, 양성 대조군으로 TGF-β를 5ng/ml 처리하였고, 자운고 발효오일 추출액은 50, 100 및 200 ppm의 농도로 처리하였다. 자운고 발효 오일 추출액 처리 후 배양 1일째의 세포로부터 RNA를 분리한 후, 분리한 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 콜라겐 분해효소 유전자(MMP-1)발현을 확인할 수 있는 TaqMan^?assay(Life technologies)를 이용하여, 유전자의 연쇄중합반응 결과 산물을 정량적으로 확인할 수 있는 Real-Time PCR assay를 통하여 콜라겐 분해효소(MMP-1)의 유전자 발현 양의 변화를 비교하였다.

Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)은 콜라겐 분해효소 중 한가지로, 발현 양이 낮아질수록 항노화 효과가 높다는 것을 알 수 있다.

상기 실험결과는 도 6에 나타내었다.

도 6의 결과를 보면, 자외선을 처리하였을 때 MMP-1의 발현량이 2.3배 정도 증가하였으며, 자운고 발효오일 추출액의 경우 농도별로 유의하게 MMP-1을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 200ppm의 경우 TGF-β와 비슷하게 MMP-1의 발현량이 감소되었다.

<실험예 6> 자운고 발효 오일의 항노화 효능: 자외선 조사에 의한 콜라겐 (COL1A1) 합성능 측정

배양된 인체 섬유아세포 HDF를 6-well plate에 3x10⁶cells/well의 농도로 분주한 다음 24시간 배양한 후, 배양 시 사용한 배지를 제거하고 PBS(Phosphate Buffer Saline) 용액으로 1회 세척 후, 각 well에 PBS를 1mL씩 분주하고, 자외선B(ultraviolet B; UVB) 25mJ/cm²을 조사하여 인플라메이징(inflammaging; 염증성 노화)을 유도한 후, 자운고 발효오일로부터 추출한 자운고 발효오일 추출액을 24시간 처리하였다. 이 때, 양성 대조군으로 TGF-β를 5ng/ml 처리하였고, 자운고 발효오일 추출액은 50, 100 및 200 ppm의 농도로 처리하였다. 자운고 발효 오일 추출액 처리 후 배양 1일째의 세포로부터 RNA를 분리한 후, 분리한 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 콜라겐 유전자(COL1A1)발현을 확인할 수 있는 TaqMan^?assay(Life technologies)를 이용하여, 유전자의 연쇄중합반응 결과 산물을 정량적으로 확인할 수 있는 Real-Time PCR assay를 통하여 콜라겐 유전자(COL1A1)의 유전자 발현 양의 변화를 비교하였다.

콜라겐 타입 1(COL1A1)은 타입 1 콜라겐을 구성하고 있는 주요 부분으로, 합성되는 COL1A1유전자의 양이 많을수록 항노화 효과가 높음을 확인할 수 있다.

상기 실험결과는 도 7에 나타내었다.

도 7의 결과를 보면, 자외선을 처리했을 때 감소한 COL1A1 유전자가 양성대조군인 TGF-β를 처리하였을 때에 비해 2.3배 증가하였으며, 자운고 발효오일 추출액의 경우 농도별로 유의하게 COL1A1의 발현량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.

Claims

자초와 당귀를 포함하는 자운고 재료를 미생물로 발효시켜 얻은 자운고 발효 오일.
제1항에 있어서,
상기 자운고 재료는 감초, 황금, 진피, 고삼, 작약, 금은화, 황기, 연교, 감국, 유근피 및 지실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 자운고 발효 오일.
제1항에 있어서,
미생물을 적정 배지와 식물성 오일 및, 자초와 당귀를 포함하는 자운고 재료가 포함된 1차 배양 배지에서 배양하는 1차 발효 단계;
상기 1차 배양된 배양액을 적정 배지와 식물성 오일 및, 자초와 당귀를 포함하는 자운고 재료가 포함된 2차 배양 배지에 접종하여 배양하는 2차 발효 단계;
상기 2차 발효된 배양액을 정치하여 배지와 오일층을 분리하는 단계;
상기 분리된 오일층을 수거하여 수분을 제거하는 단계; 및
상기 수분이 제거된 오일을 여과하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조된 자운고 발효 오일.
제 3 항에 있어서,
상기 미생물은 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물인 것을 특징으로 하는 자운고 발효 오일.
제 4 항에 있어서,
상기 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물은 슈도지마 속(Pseudozyma sp.)인 것을 특징으로 하는 자운고 발효 오일.
제 4 항에 있어서,
상기 당지질계 생물계면활성제를 생산하는 미생물은 슈도지마 속(Pseudozyma sp.) SY16(KCTC 8950P)인 것을 특징으로 하는 자운고 발효 오일.
제 3항에 있어서,
상기 적정 배지는 글루코스(glucose), 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 으깬 대두 분말(soya bean meal), (NH₄)₂SO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, NaCl 및 정제수로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자운고 발효 오일.
제 3항에 있어서,
상기 식물성 오일은 올리브 오일, 야자 오일, 아르간 오일, 녹차씨 오일, 포도씨 오일, 메도우폼씨 오일, 대두 오일, 해바라기씨 오일, 포도씨 오일, 참깨 오일, 들깨 오일, 아마 오일, 홍화씨 오일, 옥수수 오일, 유채씨 오일, 카놀라 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자운고 발효 오일.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 자운고 발효 오일을 포함하는 피부 외용제 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 피부 외용제 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱 오일, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 피부 외용제 조성물.