KR20220123506A

KR20220123506A - 콜라겐 손실 억제용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20220123506A
Application number: KR1020227015205A
Authority: KR
Inventors: 탈 옵페르; 타냐 세드로브; 요압 샤로니; 요셉 레비; 라셸 레비; 카린 린네위엘 헤르모니
Original assignee: 라이코드 리미티드
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2020-10-08
Publication date: 2022-09-07
Also published as: EP4041207A4; CN114786655A; IL292057A; CA3153568A1; AU2020363042B2; AU2020363042A1; US20220387344A1; BR112022006820A2; TW202114645A; WO2021070184A1; EP4041207A1; JP2023502312A

Abstract

본 발명은 피토엔, 피토플루엔 및 제타 카로틴을 포함하는 조성물, 및 콜라겐 손실 감소용 등을 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

콜라겐 손실 억제용 조성물 및 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 10월 10일자로 출원된 "콜라겐 손실 억제용 조성물 및 방법" 제하의 미국 가특허출원 제62/913,220호의 우선권 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로 여기에 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 예컨대 콜라겐 손실을 비롯한 피부-관련 병태 치료용 카로티노이드 분야, 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

노화로 인한 피부 생물학적 구조 및 기능의 감퇴는 주로 인구 평균 수명의 증가로 인해 큰 주목을 받고 있다. 섬유아세포는 진피의 주성분이며 콜라겐 및 탄력섬유를 생산하는 것으로 알려져 있다. 광 노화된 피부의 특징은 아마도 세포외 기질(ECM) 분해의 최종 산물인 태양 탄력증이다. 피부 조직의 세포를 지원하는 ECM에는 콜라겐, 탄력 섬유 및 피브릴린이 포함된다.

호중구는 태양광 모의 방사선(SSR) 및 자연 햇빛의 일부인 자외선 B(UVB)의 홍반성 선량에 노출된 후 피부에 침투하는 것으로 보고되었다. UV, 적외선 또는 열의 특정 임계값에 인간 피부가 노출되면 호중구가 유입된다. 이 호중구는 콜라겐 및 탄력 섬유를 분해할 수 있는 강력한 단백질 분해 효소로 가득 차 있다. 호중구- 유래 단백질분해 효소는 여러 비-피부과적 병태에서 관찰되는 ECM 손상에 관여한다. 또한, 케라티노사이트 및 섬유아세포보다는 호중구가 광노화의 핵심 역할을 할 수 있다고 제안되었다. SSR의 홍반성 선량에 흰 피부가 노출된 후 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 아닌 침윤성 호중구가 단백질분해 효소(특히 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 및 엘라스타제)의 주요 공급원인 것으로 보고되었다. 산소-유래 대사산물은 단백질분해 효소의 활성화를 유도하고/하거나 이러한 효소가 항단백질분해효소에 의해 비활성화되는 것을 방지하므로 ECM 손상을 유도하여 결국 태양 탄력증을 유발할 수 있다.

호중구-유래 단백질분해 효소의 방출을 방지하여 콜라겐 손상으로부터 보호하기 위한 조성물 및 방법이 여전히 크게 요구되고 있다.

요약

다음의 구현양태 및 이의 측면은 범위를 제한하지 않고 예시적이고 설명적인 것으로 의도된 시스템, 도구 및 방법과 함께 설명되고 예시된다.

제 1 측면에 따르면, 조성물에서의 총 카로티노이드의 55-65%(w/w) 양의 피토엔, 조성물에서의 총 카로티노이드의 10-20%(w/w) 양의 피토플루엔, 조성물에서의 총 카로티노이드의 15-25%(w/w) 양의 제타 카로틴, 및 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.

또 다른 측면에 따르면, 치료적 유효량의 본원에 개시된 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 콜라겐-손실을 예방 또는 치료하는 단계를 포함하는, 콜라겐 손실의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 콜라겐 손실의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

다른 측면에 따르면, 대상체에게 치료적 유효량의 본원에 개시된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, matrix metalloprotease), 골수과산화효소(MPO, myeloperoxidase), 초산화물(SO, superoxide), 엘라스타제, 산화질소(NO), 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 양, 활성 또는 둘 모두의 감소를 필요로 하는 대상체에서 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 골수과산화효소(MPO), 초산화물(SO), 엘라스타제, 산화질소(NO), 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 양, 활성 또는 둘 모두를 감소시키는 방법이 제공된다.

일부 구현양태에서, 피토엔 및 피토플루엔의 합 대 제타 카로틴의 중량비는 15:1(w/w) 내지 2:1(w/w) 범위이다.

일부 구현양태에서, 조성물은 리코펜, 베타 카로틴, 감마 카로틴, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 카로티노이드를 추가로 포함한다.

일부 구현양태에서, 리코펜은 조성물에서 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양으로 존재하거나, 베타 카로틴은 조성물에서 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양으로 존재하거나, 감마 카로틴은 조성물에서 총 카로티노이드의 0.2-1.5%(w/w)의 양으로 존재하거나, 또는 이들의 조합이다.

일부 구현양태에서, 조성물은 총 카로티노이드를 조성물의 10-15%(w/w)의 양으로 포함한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 토코페롤을 추가로 포함한다.

일부 구현양태에서, 토코페롤은 조성물에서 총 카로티노이드의 10-30%(w/w) 양으로 존재한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 피토스테롤을 추가로 포함한다.

일부 구현양태에서, 피토스테롤은 조성물에서 총 카로티노이드의 5-15%(w/w) 양으로 존재한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 콜라겐 손실 감소용, 콜라겐 수준 증가용, 또는 이들 둘 모두로 사용하기 위한 것이다.

일부 구현양태에서, 예방 또는 치료는 콜라겐 손실을 50-90% 감소시키는 것이다.

일부 구현양태에서, MMP는 MMP-9, MMP-8, MMP-1, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 콜라겐-손실 관련 질환을 앓고 있다.

일부 구현양태에서, 콜라겐-손실 관련 질환은 연령-관련 질환, 피부 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현양태에서, 피부 질환은 방사선, 산화 스트레스, DNA 손상, 텔로미어 단축, 염증, 담배 사용, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나에 의해 유도된 피부 손상을 포함한다.

일부 구현양태에서, 방사선은 자외선, 가시광선, 적외선, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현양태에서, 자외선은 UVA, UVB, UVC, 또는 이들의 임의의 조합이다.

일부 구현양태에서, 대상체는 대조군에 비해 피부, 전신 또는 둘 모두에서 MMP, MPO, SO, 엘라스타제, NO 및 이들의 조합 중 어느 하나의 증가된 양, 증가된 활성 또는 둘 모두를 갖는다.

일부 구현양태에서, 투여는 경구 투여, 국소 투여, 또는 둘 모두를 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및/또는 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 구현양태의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 하기에 기재되어 있다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 특허 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시에 불과하며 반드시 제한하려는 의도는 아니다.

본 발명의 추가 구현양태 및 적용가능성의 전체 범위는 이하에 주어진 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현양태를 나타내면서 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

위에서 설명된 예시적인 측면 및 구현양태 이외에, 추가 측면 및 구현양태는 도면을 참조하고 다음의 상세한 설명의 연구에 의해 명백해질 것이다.

도 1a-1c는 종양 괴사 인자 α(TNFα, 1a); 인터루킨 8(IL8, 1b) 및 포르밀-메티오닌-류신-페닐알라닌(fMLP, 1c) 작용제에 의해 자극된 인간 호중구로부터 매트릭스 메탈로프로테아제 9(MMP-9) 분비의 동역학을 보여주는 수직 막대 그래프이다. 값은 5개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 2a-2c는 TNFα(2a); IL8(2b) 및 fMLP(2c) 작용제에 의해 자극된 인간 호중구로부터의 골수과산화효소(MPO) 분비의 동역학을 보여주는 수직 막대 그래프이다. 값은 5개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 3a-3c는 MMP-9 분비에 대한 루메나토(Lumenato)(황금 토마토 초임계 추출물 또는 GTE)의 억제 효과를 나타내는 수직 막대 그래프이다. 인간 호중구는 TNFα(3a); IL8(3b), 및 fMLP(3c) 작용제에 의해 자극되었고, MMP-9 분비의 용량 의존적 억제가 GTE의 존재 하에 관찰되었다. 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 4a-4c는 MPO 분비에 대한 GTE의 억제 효과를 보여주는 수직 막대 그래프이다. 인간 호중구는 TNFα(4a); IL8(4b), 및 fMLP(4c) 작용제에 의해 자극되었고, MPO 분비의 용량 의존적 억제가 GTE의 존재 하에 관찰되었다. 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 5a-5c는 초산화물 분비에 대한 GTE의 억제 효과를 보여주는 수직 막대 그래프이다. 인간 호중구는 TNFα(5a); IL8(5b), 및 fMLP(5c) 작용제에 의해 자극되었고, 초산화물 분비의 용량 의존적 억제가 GTE의 존재 하에 관찰되었다. 값은 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 6a-6s는 GTE의 첨가가 용량 의존적 방식으로 호중구에 의해 유도된 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)에서 콜라겐-3 손상을 방지함을 보여주는 면역형광 현미경 사진 및 수직 막대 그래프이다. 호중구는 100ng/ml TNFα로 자극되었고 점진적으로 증가된 GTE 농도 존재하에서 인큐베이트되었다: 6.5μg/ml(6c, 6j), 13μg/ml(6d, 6k), 26μg/ml(6e, 6l), 52μg/ml(6f, 6m) 및 104μg/ml(6g, 6n). 대조군: 음성(TNFα 없음, 6a 및 6h), 양성(GTE 없음, 6b 및 6i). (6a-6g)는 40배 확대된 콜라겐-3의 대표적인 면역형광 염색이다. (6h-6n)은 200배 확대된 콜라겐-3의 대표적인 면역형광 염색이다. (6a-6n) 각 실험에서 각 처리의 10개 필드가 스캔되었다. (6o)는 콜라겐-3의 면역형광 염색 농도 측정법으로 분석한 GTE에 의한 콜라겐 손상 방지를 나타내는 수직 막대 그래프이다. 값은 5가지 다른 실험의 평균을 나타낸다. (6p) 및 (6q)는 각각 콜라겐 손실 방지에 대한 리코덤(LycoDerm) 및 리코마토(LycoMato) 농도를 점진적으로 증가시킨 효과를 나타내는 수직 막대 그래프이다. 더 높은 농도의 리코덤(LycoDerm) 또는 리코마토(LycoMato)는 세포에 유독했다. 대조적으로, 104μg/ml(사용된 최고 농도)에서 GTE에 대해서는 세포 독성 효과가 관찰되지 않았다(6r). 콜라겐-3의 면역형광 염색 농도측정을 나타내는 그래프(6a-6n). 세 가지 다른 실험의 평균 ± SEM이 표시된다. (6s)는 공동-배양의 상층액으로 분비되는 프로-콜라겐-3의 양을 나타낸 그래프이다. 각각 3번씩 세 가지 다른 실험의 평균 ± SEM이 표시된다. 수평 파선은 호중구의 영향 없이 루메나토(Lumenato)의 효과를 나타낸다. Lum - 루메나토(Lumenato)(μg/ml), Fib - 섬유아세포, Neu - 호중구.
도 7a-7c는 GTE가 NHDF와 공동배양된 호중구로부터 MMP-9 방출의 억제를 유도함을 보여주는 수직 막대 그래프이다(도 6에 기술된 바와 같음). MMP-9는 공동-배양물의 상층액에서 정량화되었다(7a). 값은 5가지 다른 실험의 평균을 나타낸다. (7b) 및 (7c)는 각각 MMP-9 수준에 대한 리코덤 및 리코마토 농도를 점진적으로 증가시킨 효과를 나타내는 수직 막대 그래프이다. 더 높은 농도의 리코덤 또는 리코마토는 세포에 유독했다. 대조적으로, 104μg/ml(사용된 최고 농도)에서 GTE에 대해서는 세포 독성 효과가 관찰되지 않았다.
도 8a-8c는 GTE가 NHDF와 공동배양된 호중구로부터 MPO 방출의 억제를 유도함을 보여주는 수직 그래프이다(도 6에 기술된 바와 같음). MPO 정량화는 공동배양의 상층액에서의 활성을 기반으로 결정되었다(8a). 값은 5가지 다른 실험의 평균을 나타낸다. (8b) 및 (8c)는 각각 MPO 활성에 대한 리코덤 및 리코마토 농도를 점진적으로 증가시킨 효과를 나타내는 수직 막대 그래프이다. 더 높은 농도의 리코덤 또는 리코마토는 세포에 유독했다. 대조적으로, 104μg/ml(사용된 최고 농도)에서 GTE에 대해서는 세포 독성 효과가 관찰되지 않았다.
도 9는 GTE가 NHDF와 공동배양된 호중구로부터 초산화물 방출의 억제를 유도함을 나타내는 수직 막대 그래프이다(도 6에 기술된 바와 같음). 앰플렉스 레드(Amplex red)를 사용하여 초산화물 수준을 검출했다. 값은 5가지 다른 실험의 평균을 나타낸다.
도 10은 GTE가 NHDF와 공동배양된 호중구로부터 MMP-8(콜라게나제) 방출의 억제를 유도함을 나타내는 수직 막대 그래프이다(도 6에 기술된 바와 같음). MMP-8은 공동 배양물의 상층액에서 정량화되었다. 값은 5가지 다른 실험의 평균을 나타낸다.
도 11은 GTE가 NHDF와 공동배양된 호중구로부터 엘라스타제 방출의 억제를 유도함을 나타내는 수직 막대 그래프이다(도 6에 기술된 바와 같음). 엘라스타제 정량화는 공동 배양물의 상층액에서의 활성을 기반으로 결정되었다. 값은 5가지 다른 실험의 평균을 나타낸다.
도 12a-12b는 지질다당류(LPS)에 의해 자극된 대식세포로부터의 산화질소(NO) 방출에 대한 펄프 또는 GTE의 효과를 보여주는 수직 막대 그래프이다. 펄프를 매질에 용해하고 여과되었다; GTE를 DMSO에 용해시켰다. 테스트된 모든 농도에서 MTT 감소에 의해 결정된 바와 같이 세포 생존에 영향이 없었다. (12a)는 여과된 펄프의 효과를 나타내고, (12b)는 NO 생성에 대한 GTE의 효과를 나타낸다. 결과는 수행된 2회 실험의 평균을 나타낸다.
도 13a-13c는 GTE에 존재하는 비율로 자극된 호중구에 대한 토코페롤 및 피토스테롤의 첨가가 TNFα로 활성화된 호중구로부터의 MPO 방출 및 활성의 유의한 상승적 억제를 초래하였음을 보여주는 수직 막대 그래프이다. 토코페롤(13a) 또는 피토스테롤(13b)의 단독 첨가는 TNFα로 활성화된 호중구로부터 MPO의 방출 및 활성에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 225μg/ml의 토코페롤 및 62.5μg/ml의 피토스테롤은 MPO 활성을 약 20% 억제하는 상승 효과를 냈지만 10배 더 높거나 낮은 비율은 상승 효과를 제공하지 못했다(13c).
도 14는 자극된 호중구에 피토엔, 토코페롤 또는 피토스테롤과 함께 제타 카로틴을 GTE에 존재하는 비율로 첨가하는 것이 MPO 활성의 유의한 상승작용적 억제를 초래하였음을 나타내는 수직 막대 그래프이다. 제타 카로틴, 토코페롤, 피토엔 또는 피토스테롤을 단독으로 첨가하면 MPO 활성이 최대 5% 억제되거나 대부분의 경우 효과가 없었다. 제타 카로틴을 토코페롤, 피토엔, 피토스테롤 중 어느 하나와 함께 GTE에 존재하는 비율로 첨가하면 TNFα-활성화 호중구로부터 MPO 활성 또는 방출의 상승적 억제가 유도되었다.
도 15a-15b는 GTE(예를 들어, 루메나토) 캡슐이 카로티노이드 생체이용률을 증가시켰음을 보여주는 그래프이다. 황금 토마토 추출물의 주요 카로티노이드인 피토엔, 피토플루엔 및 제타-카로틴이 잘 흡수되는 것으로 나타났다. 제타 카로틴은 혈장 농도의 급격한 증가(15a)에 의해 반영되는 것과 같이 극히 잘 흡수되었다. (15b)는 피토엔 및 피토플루엔 단독의 생체이용률 동역학을 나타내는 그래프이다.
도 16a-16b는 H₂O₂가 용량 의존적 방식으로 세포 사멸을 유도하고 MMP1의 분비를 증가시키는 것을 보여주는 그래프이다. H₂O₂를 첨가하기 전에 표시된 농도의 루메나토를 첨가하면 세포 생존율이 증가하고(16a) MMP1의 분비가 감소했다(16b).
도 17은 GTE(예를 들어, 루메나토)가 용량 의존적 방식으로 ARE/Nrf2 전사 활성의 활성도를 증가시켰음을 보여주는 그래프이다. 리코마토는 참조로 표시된다. 표시된 농도는 리코펜(리코마토의 경우) 및 피토엔(루메나토의 경우)에 대한 것이다.
도 18은 공동-배양물의 상층액에서 프로-콜라겐-3의 수준을 나타내는 수직 막대 그래프를 포함한다. 각각 3번씩 4가지 다른 실험의 평균 + SEM이 표시된다. 6.5-104μg/ml 범위의 루메나토는 두 가지 다른 농도로 플레이팅된 섬유아세포에 첨가되었다.
도 19는 루메나토가 H₂O₂ 유도된 콜라겐 1a1 분비 감소를 교정함을 나타내는 그래프를 포함한다.

일부 구현양태에서, 본 발명은 다수의 카로티노이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 부분적으로 다량의 피토엔, 피토플루엔 및 제타 카로틴을 포함하는 토마토 추출물이 다른 토마토 추출물에 비해 더 높은 수준으로 콜라겐 손실을 예방하고 매트릭스 메탈로프로테아제 9(MMP-9) 및 골수과산화효소(MPO) 활성을 억제하며 동일한 토마토 추출물에 비해 감소된 세포 독성을 갖는다는 놀라운 발견에 기초한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 피토엔, 피토플루엔, 및 제타 카로틴을 포함한다. 한 구현양태에서, 조성물은 피토엔, 피토플루엔, 제타 카로틴, 및 추가의 카로티노이드를 포함한다. 한 구현양태에서, 조성물은 피토엔, 피토플루엔, 제타 카로틴, 리코펜, 베타 카로틴, 감마 카로틴, 토코페롤, 및 피토스테롤을 포함한다.

일부 구현양태에서, 카로티노이드는 과일, 채소 또는 식물(식물 부분 포함)로부터 추출, 분리 또는 정제된 천연 카로티노이드이다. 다른 구현양태에서, 카로티노이드는 토마토 식물로부터 추출된 카로티노이드이다. 다른 구현양태에서, 카로티노이드는 토마토 과일로부터 추출된 카로티노이드이다. 다른 구현양태에서, 토마토 카로티노이드는 카로티노이드가 풍부한 토마토 추출물이다. 다른 구현양태에서, 토마토 카로티노이드는 전부 천연인 카로티노이드-풍부한 토마토 추출물이다. 다른 구현양태에서, 토마토 카로티노이드는 토마토 카로티노이드 복합체이다. 다른 구현양태에서, 토마토 카로티노이드 복합체는 다수의 카로티노이드(피토엔, 피토플루엔, 제타 카로틴, 베타-카로틴 등), 토코페롤 및 피토스테롤을 포함하는 식물성 영양소의 복합체를 포함한다. 일부 구현양태에서, 카로티노이드는 합성 카로티노이드이다.

일부 구현양태에서, 본 발명은 혁신적인 추출 프로토콜에 의해 수득된 토마토 추출물을 제공한다. 피토엔, 피토플루엔 및 제타 카로틴을 (아래에 명시된 양으로) 포함하는 이 특정 추출물은 감소된 세포 독성을 갖는다. 일부 구현양태에서, 감소된 세포 독성은 다른 토마토 추출물과 비교된다. 일부 구현양태에서, 감소된 독성은 대상체의 생존, 웰빙 또는 둘 모두를 저하시키지 않으면서 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 조성물을 더 높은 용량으로 제공할 수 있게 한다. 일부 구현양태에서, 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것은 높은 세포 독성으로 인한 대상체의 생존, 웰빙 또는 둘 모두를 감소시키지 않으면서 치료 효과를 증가시키는 더 많은 양으로 활성 성분, 예컨대 피토엔, 피토플루엔 및 제타 카로틴을 제공함으로써 치료 효능을 증가시키게 할 수 있다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 토마토와 같은 다른 식물, 과일 또는 채소-유래 추출물과 비교하여 감소된 독성을 갖는 카로티노이드를 더 다량으로 제공한다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 토마토와 같은 다른 식물-, 과일- 또는 채소-유래 추출물과 비교하여 독성을 감소시키면서 치료 효능을 증가시킨다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 천연 카로티노이드, 합성 카로티노이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 피토엔을 조성물에서 총 카로티노이드의 10-40%(w/w), 15-35%(w/w), 20-45%(w/w), 25-35%(w/w), 20-30%(w/w), 또는 30-50(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 피토플루엔을 조성물에서 총 카로티노이드의 1-10%(w/w), 3-12%(w/w), 4-14%(w/w), 5-10%(w/w), 8-15%(w/w), 또는 2-9%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 제타 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의 4-20%(w/w), 6-18%(w/w), 5-15%(w/w), 6-12%(w/w), 9-17%(w/w), 또는 10-17%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 피토엔 및 피토플루엔의 합 대 제타 카로틴의 중량비는 20:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 15:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 20:1(w/w) 내지 6:1(w/w), 15:1(w/w) 내지 2:1(w/w), 17:1(w/w) 내지 4:1(w/w), 16:1(w/w) 내지 7:1(w/w), 13:1(w/w) 내지 8:1(w/w), 10:1(w/w) 내지 3:1(w/w) 또는 15:1(w/w) 내지 10:1(w/w)의 범위이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 추가의 카로티노이드를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "추가 카로티노이드"는 피토엔, 피토플루엔 및 제타 카로틴 이외의 또는 이들과 상이한 임의의 카로티노이드 또는 이의 대사산물을 지칭한다.

일부 구현양태에서, 추가의 카로티노이드는 리코펜, 베타 카로틴, 감마 카로틴, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

일부 구현양태에서, 조성물은 리코펜을 조성물에서 총 카로티노이드의 10%(w/w) 미만, 7%(w/w) 미만, 5%(w/w) 미만, 3%(w/w) 미만, 2%(w/w) 미만, 또는 1%(w/w) 미만, 또는 그 사이의 임의의 값 및 범위로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다. 일부 구현양태에서, 조성물은 리코펜을 조성물에서 총 카로티노이드의 1-3%(w/w), 1-5%(w/w), 2-6%(w/w), 0.5-4.5%(w/w), 0.1-3%(w/w), 0.6-4.8%(w/w), 또는 2.5-4%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 베타 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의10%(w/w) 미만, 7%(w/w) 미만, 5%(w/w) 미만, 3%(w/w) 미만, 2%(w/w) 미만, 또는 1%(w/w) 미만, 또는 그 사이의 임의의 값 및 범위의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다. 일부 구현양태에서, 조성물은 베타 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의 1-3%(w/w), 1-5%(w/w), 2-6%(w/w), 0.5-4.5%(w/w), 0.1-3%(w/w), 0.6-4.8%(w/w), 또는 2.5-4%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 감마 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의 적어도 0.15%(w/w), 적어도 0.18%(w/w), 적어도 0.2%(w/w), 적어도 0.25%(w/w), 적어도 0.35%(w/w), 적어도 0.5%(w/w), 적어도 0.75%(w/w), 적어도 0.9%(w/w), 적어도 1%(w/w), 적어도 1.2%(w/w), 적어도 1.35%(w/w), 또는 적어도 1.7%(w/w), 또는 그 사이의 임의의 값 및 범위의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다. 일부 구현양태에서, 조성물은 감마 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의 0.15-3%(w/w), 0.2-2%(w/w), 0.2-1.5%(w/w), 0.5-3%(w/w), 0.7-1.6%(w/w), 0.4-2.8%(w/w), 또는 1.2-3.2%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 리코펜을 조성물에서 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양으로 포함하고, 베타 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양으로 포함하고, 감마 카로틴을 조성물에서 총 카로티노이드의 0.2-1.5%(w/w)의 양, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 추가의 카로티노이드를 0.1-3%(w/w), 0.2-3.5%(w/w), 0.5-2.5%(w/w), 0.15-1.75%(w/w), 0.35-2.75%(w/w), 0.8-4%(w/w), 1-5%(w/w), 또는 1.5-4.75%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 리코펜은 조성물에서 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양으로 존재한다.

일부 구현양태에서, 조성물은 총 카로티노이드를 조성물의 5-25%(w/w), 10-15%(w/w), 12-35%(w/w), 3-17%(w/w), 2-20%(w/w), 또는 1-30%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 조성물은 토코페롤(예를 들어, 비타민 E)을 추가로 포함한다. 일부 구현양태에서, 조성물은 토코페롤을 조성물의 1-30%(w/w), 3-35%(w/w), 5-25%(w/w), 2-20%(w/w), 4-41%(w/w), 8-32%(w/w), 또는 13-39%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 피토엔 및 피토플루엔의 합 대 토코페롤의 중량비는 20:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 15:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 20:1(w/w) 내지 6:1(w/w), 17:1(w/w) 내지 4:1(w/w), 16:1(w/w) 내지 7:1(w/w), 13:1(w/w) 내지 8:1(w/w), 10:1(w/w) 내지 3:1(w/w) 또는 15:1(w/w) 내지 10:1(w/w)의 범위이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 제타 카로틴 대 토코페롤의 중량비는 3:1(w/w) 내지 1:3(w/w), 3:1(w/w) 내지 1:2(w/w), 3:1(w/w) 내지 1:1(w/w), 2:1(w/w) 내지 1:1(w/w), 2:1(w/w) 내지 1:2(w/w), 2:1(w/w) 내지 1:3(w/w), 1:1(w/w) 내지 1:2(w/w) 또는 1:1(w/w) /w) 내지 1:3(w/w)의 범위이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 피토스테롤은 콜레스테롤 브라시카스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, △5-아베나스테롤, △7-아베나스테롤, △7-스티그마스테롤, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

일부 구현양태에서, 조성물은 피토스테롤을 조성물의 1-20%(w/w), 2-19%(w/w), 10-25%(w/w), 5-25%(w/w), 8-16%(w/w), 6-18%(w/w), 3-20%(w/w), 4-17% (w/w), 또는 5-15%(w/w)의 양으로 포함한다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 피토엔 및 피토플루엔의 합 대 피토스테롤의 중량비는 20:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 15:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 20:1(w/w) 내지 6:1(w/w), 17:1(w/w) 내지 4:1(w/w), 16:1(w/w) 내지 7:1(w/w), 13:1(w/w) 내지 8:1(w/w), 10:1(w/w) 내지 3:1(w/w) 또는 15:1 (w/w) 내지 10:1(w/w)의 범위이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

일부 구현양태에서, 제타 카로틴 대 피토스테롤의 중량비는 6:1(w/w) 내지 2:1(w/w), 5:1(w/w) 내지 2:1(w/w), 4:1(w/w) 내지 2:1(w/w), 3:1(w/w) 내지 2:1(w/w), 6:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 5:1(w/w) 내지 3:1(w/w), 4:1(w/w) 내지 3:2(w/w) 또는 6:1(w/w) 내지 3:1(w/w) 범위이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

카로티노이드와 같은 식물성영양소의 양을 결정하는 방법은 일반적이며 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 방법에 대한 비제한적인 예에는 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

일부 구현양태에서, 조성물은 경구 조성물 또는 국소 조성물이다. 일부 구현양태에서, 조성물은 약제학적 또는 기능식품(nutraceutical) 조성물이다. 일부 구현양태에서, 조성물은 약제학적 또는 기능식품으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구현양태에서, 조성물은 화장료 조성물이다. 일부 구현양태에서, 조성물은 화장료로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 구현양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 섭취가능한 피부 조성물이다.

일부 구현양태에서, 경구 조성물은 연질 겔 캡슐 형태이다. 일부 구현양태에서, 경구 조성물은 음료, 샷, 젤리 또는 분말 형태이다. 일부 구현양태에서, 경구 조성물은 초콜릿, 아이스크림 또는 기타와 같은 식품으로 혼합되거나 동화된다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 콜라겐 손실을 감소시키거나, 콜라겐 수준을 증가시키거나, 또는 둘 모두에 사용하기 위한 것이다.

콜라겐 수준을 측정하는 방법은 일반적이고 당업자에게 자명할 것이다. 콜라겐 수준을 결정하거나 측정하는 방법의 비제한적 예에는 면역형광 현미경, 전자 현미경, 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR이 포함되며, 이들 중 일부는 하기에 예시되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 존재 및 부재하에 측정된 콜라겐 수준을 비교함으로써, 콜라겐 손실, 증가된 콜라겐 수준, 또는 둘 모두가 결정될 수 있다.

일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 콜라겐 수준을 증가시키는 활성을 갖는다. 일부 구현양태에서, 콜라겐 수준을 증가시키는 활성은 콜라겐 합성 증가, 조직 중량당 콜라겐 중량 증가, 콜라겐 원섬유 수, 길이 또는 둘 모두 증가, 자연적으로 또는 적절하게 폴딩된 콜라겐의 양 증가, 구조적으로 손상된 콜라겐 양 감소 및 이들의 조합으로부터 선택된 임의의 활성을 포함한다.

일부 구현양태에서, 콜라겐은 프로-콜라겐 3, 콜라겐 3, 콜라겐 1a1, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현양태에서, 콜라겐은 프로-콜라겐 3이다. 일부 구현양태에서, 콜라겐은 콜라겐 3이다. 일부 구현양태에서, 콜라겐은 콜라겐 1a1이다. 일부 구현양태에서, 콜라겐은 콜라겐 3, 프로-콜라겐 3, 및 콜라겐 1a1의 조합이다.

한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 개체에게 제공될 수 있다. 한 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 기능식품 조성물의 일부로서 개체에게 제공될 수 있다.

한 구현양태에서, "약제학적 조성물", "화장료 조성물" 또는 "기능식품 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 함께 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물, 화장료 조성물, 또는 기능식품 조성물의 목적은 유기체에 대한 조성물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

일부 구현양태에서, 20-30%(w/w) 양의 피토엔, 5-10%(w/w) 양의 피토플루엔, 5-15%(w/w)의 제타 카로틴 및 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현양태에서, 상기 방법은 본원에 개시된 황금 토마토를 추출하는 것을 포함한다. 일부 구현양태에서, 본 발명의 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 황금 토마토 추출물을 포함한다.

한 구현양태에서, "병용 제제"는 특히 전술한 병용 물질이 독립적으로 투여되거나 또는 고유한 양의 병용 물질과 함께, 즉, 동시에, 시간을 겹쳐서(concurrently), 개별적으로 또는 순차적으로 독립적으로 투여될 수 있다는 의미에서 특히 "복수 구성요소로 된 키트(kit of parts)"를 정의한다. 일부 구현양태에서, 복수 구성요소로 된 키트에서 구성요소는 예를 들어, 복수 구성요소로 된 키트의 임의의 구성요소에 대해 동시에, 또는 상이한 시점에 순서대로 시차를 두고, 즉, 동일 또는 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현양태에서, 병용 물질의 총량의 비율은 병용 제제로 투여될 수 있다. 한 구현양태에서, 병용 제제는 치료될 환자 하위집단의 요구 또는 구체적인 질병, 질병의 중증도, 연령, 성별 또는 체중에 따라 달라질 수 있는 개별 환자의 요구에 대처하도록 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

한 구현양태에서, 상호교환적으로 사용되는 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용가능한 담체"라는 문구는 포유동물에게 심각한 자극을 일으키지 않고 투여된 조성물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 이 문구에 보조제가 포함된다.

한 구현양태에서, "부형제"는 활성 성분의 투여를 더 용이하게 하기 위해 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 한 구현양태에서, 부형제는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 다양한 유형의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

한 구현양태에서, 적합한 투여 경로는, 예를 들어 근육내, 피하 및 골수내 주사 뿐만 아니라 척수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사를 포함하는, 경구, 직장, 경점막, 비강, 장 또는 비경구 전달을 포함한다.

일부 구현양태에 따르면, 치료적 유효량의 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 콜라겐 손실의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 콜라겐 손실을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

일부 구현양태에서, 대상체는 건강한 대상체이다. 일부 구현양태에서, 대상체는 노화, UV, 오염, 및 연기와 같은 환경 요인에의 노출, 수면 부족, 스트레스, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나로 인해 콜라겐 손실을 앓고 있다.

일부 구현양태에서, 콜라겐-손실 관련 질환을 앓고 있는 대상체는 감소된 피부 탄력, 감소된 표피 두께, 손상에 대한 증가된 피부 취약성(기계적 손상과 같음), 증가된 피부 주름, 처짐, 또는 둘 다 및 이들의 조합을 갖는 것이 특징이다.

피부 탄력 또는 표피 두께 중 어느 하나를 결정하는 방법은 일반적이고 당업자에게 자명할 것이며, 이러한 방법의 비-제한적 예에는 피부 흡입 또는 압입 및 후속 광학 측정에 의한 피부 변위 감지 및 피부 생검의 조직학적 분석을 포함한다.

일부 구현양태에 따르면, 치료적 유효량의 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, MMP, MPO, 초산화물(SO), 엘라스타제, 산화질소(NO), 및 이의 임의의 조합 중 하나의 양, 활성 또는 둘 다의 억제 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 MMP, MPO, 초산화물(SO), 엘라스타제, 산화질소(NO), 및 이의 임의의 조합 중 하나의 양, 활성 또는 둘 다를 억제하거나 감소시키는 방법이 제공된다.

한 구현양태에서, MMP는 MMP-9, MMP-8, MMP-1, 또는 이들의 임의의 조합이다.

MMP, MPO, SO, 엘라스타제, NO 중 어느 하나의 양, 활성 또는 둘 모두를 결정하는 방법은 일반적이고 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 ELISA, 면역조직화학, 산화 검정, 및/또는 아래에 예시된 것과 같은 효소 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 구현양태에서, 억제 또는 감소는 대조군과 비교하여 50-60%, 50-75%, 50-90%, 50-99%, 65-95%, 70-90% 또는 75-99%이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

본원에 사용된 대조군은 건강한 대상체의 피부를 포함한다. 일부 구현양태에서, 대조군은 동일한 대상체(예를 들어, 콜라겐-손실 관련 질병을 앓고 있는 대상체)로부터 유래, 분리 또는 수득된 건강한 피부 샘플이다.

일부 구현양태에서, 투여는 경구 투여를 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여는 국소 투여를 포함한다. 일부 구현양태에서, 투여는 경구 투여 및 국소 투여의 병용을 포함한다.

일부 구현양태에서, 콜라겐-손실 관련 질환은 연령-관련 질환, 피부 질환, 및 염증성 질환으로부터 선택된다.

본원에 사용된 "연령 관련 질환"은 연령에 따라 빠르게 증가하는 발병률을 갖는 질환 또는 이와 관련된 병태를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "급속하게"는 기하급수적으로(exponentially)이다.

'경미한 노화 질환'(lesser ailments of aging, LAA)'이라고 총칭할 수 있는 연령 관련 병태의 비제한적인 예에는 일반적인 근육 약화, 저온 불내성, 경미한 기억력 감퇴를 포함하는 연령 관련 인지 감퇴, 피부 주름 및 피부 멍의 느린 치유, 소모성(총 체중 감소) 근육량 감소 및 골밀도 감소가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 연령 관련 질병의 비제한적인 예는 심혈관 질환, 암, 관절염, 치매, 백내장, 골다공증, 당뇨병을 포함하는 대사 질환, 콜레스테롤 증가 및 지질 프로필의 열화, 고혈압, 및 알츠하이머병을 포함하나 이에 제한되지 않는 신경퇴행성 질환을 포함한다.

본원에 사용된 "피부 질환"이라는 문구는 임의의 피부 병리학적 병태 또는 이의 증상을 지칭한다. 한 구현양태에서, 콜라겐 손실은 피부 질환의 발병을 이끄는 병원성 인자이다. 한 구현양태에서, 콜라겐 손실은 피부 질환의 발병, 개시, 진행, 또는 이들의 임의의 조합으로 인한 병태생리학적 인자이다. 한 구현양태에서, 콜라겐 손실은 발현 중인 또는 진행 중인 피부 질환에서 특징적인 병태이다.

일부 구현양태에서, 피부 질환은 면역-관련 피부 질환이다. 한 구현양태에서, 면역-관련 피부 질환은 염증성 피부 질환, 자가염증성 피부 질환, 또는 자가면역 피부 질환이다.

본원에 사용된 "염증성 질환"이라는 문구는 유해한 외인성 개체, 예를 들어 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 원생동물, 알레르겐 등에 대한 유기체(예를 들어, 면역계 세포, 사이토카인과 같은 분자 신호 매개체 등)의 다성분 반응을 포함하는 임의의 질병을 지칭한다.

일부 구현양태에서, 피부 질환은 피부 손상에 근거하여 특징규명되거나 결정된다. 일부 구현양태에서, 피부 손상은 방사선, 산화 스트레스, DNA 손상, 텔로미어 단축, 염증, 담배 사용, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나에 의해 유도된다.

일부 구현양태에서, 방사선은 광 스펙트럼 내의 임의의 방사선 파장을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "광 스펙트럼"은 10^-9m 내지 10^-3m 범위의 파장을 포함한다. 일부 구현양태에서, 광 스펙트럼 내의 방사선 파장은 자외선, 가시광선, 적외선, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현양태에서, 방사선에 대한 노출은 햇빛에 대한 노출을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "자외선(UV)"은 UV 범위의 임의의 파장을 포함한다. 일부 구현양태에서, UV는 자외선이다. 일부 구현양태에서, UV는 UVA 방사선, UVB 방사선, UVC, 또는 이들의 임의의 조합이다.

본원에 사용된 용어 "적외선"은 700nm 내지 1,000nm(430THz 내지 300GHz의 주파수를 가짐)에 걸친 파장을 포함한다.

일부 구현양태에서, 대상체는 대조군에 비해 피부, 전신 또는 둘 다에서 MMP, MPO, SO, 엘라스타제, NO, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 증가된 양, 증가된 활성 또는 둘 다를 가지고 있다.

일부 구현양태에서, 증가는 대조군 대비 1-10%, 5-30%, 15-50%, 25-75%, 70-150%, 100-350%, 250-550%, 500-750%, 또는 700-1,000%이다. 각 가능성은 본 발명의 별도의 구현양태를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 이의 적어도 하나의 증상의 완화, 이의 중증도의 감소, 또는 이의 진행의 억제를 포함한다. 치료가 질환, 장애 또는 병태가 완전히 치유되었음을 의미할 필요는 없다. 효과적인 치료가 되기 위해, 본원의 유용한 조성물은 질환, 장애 또는 병태의 중증도를 감소시키거나, 이와 관련된 증상의 중증도를 감소시키거나, 환자 또는 대상체의 삶의 질에 개선을 제공하기만 하면 된다.

본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 병태의 "예방"이라는 용어는 질환, 장애 또는 병태의 발병의 지연, 예방, 제어 또는 억제를 포함한다. 현재 기술된 주제(subject matter)에 따라 사용되는 용어 "예방"은 질환/장애 과정의 유도 또는 발병 이전에 현재 기술된 조성물 또는 제형에 대상체가 노출되는 예방 과정에 관한 것이다. 이것은 예방할 질병/장애의 발생에 대한 소인을 나타내는 유전 가계도를 개체가 가지고 있는 경우에 수행될 수 있다. 예를 들어, 이것은, 예를 들어 염증성 장애와 같은 특정 유형에 대한 소인을 보이는 조상의 개체에게 해당될 수 있다. "억제"라는 용어는 질병/장애 과정이 이미 시작되었지만 상태의 명백한 증상이 아직 실현되지 않은 상태를 설명하는 데 사용된다. 따라서 개체의 세포에 질병/장애가 있을 수 있지만 질병/장애의 외부 징후는 아직 임상적으로 인식되지 않았다. 어느 경우든 예방이라는 용어는 예방과 억제를 모두 포함하도록 적용될 수 있다. 반대로, "치료"라는 용어는 환자에게서 이미 실현된 임상 증상을 갖는 기존 병태를 퇴치하기 위한 활성제의 임상적 적용을 의미한다.

일부 구현양태에서, 예방은 질환 중증도 감소, 질환 발병 지연, 질환 누적 발병률 감소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 치료를 필요로 하는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체, 예를 들어 인간을 지칭한다.

논의에서 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 구현양태의 특징 또는 특징들의 조건 또는 관계 특성을 수정하는 "실질적으로" 및 "약"과 같은 형용사는 조건 또는 특징이 의도된 적용에 대한 구현양태의 작동에 대해 허용가능한 허용 오차 내에서 정의된다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 단어 "또는"은 배타적인 또는이 아닌 포괄적인 "또는"으로 간주되며, 이것이 결합하는 항목 중 적어도 하나 또는 임의의 조합을 나타낸다.

상기 및 본원의 다른 곳에서 사용된 용어 "하나"는 열거된 구성요소 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 단수의 사용은 복수를 포함한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 용어 "하나" 및 "적어도 하나"는 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다.

본 교시 내용을 더 잘 이해하기 위한 목적으로 교시 내용의 범위를 제한하지 않고 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 양, 백분율 또는 비율, 및 기타 수치를 나타내는 모든 숫자가 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수정됨이 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표시되지 않는 한, 다음 명세서 및 첨부된 청구범위에 설명된 수치 매개변수는 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한 각 수치 매개변수는 보고된 유효 자릿수의 관점에서 및 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.

본 출원의 설명 및 청구범위에서, 각각의 동사 "포함하다", "포함하다" 및 "갖다" 및 그 활용은 동사의 목적어 또는 목적어들이 동사의 주어 또는 주어의 구성 요소, 요소 또는 부분의 반드시 완전한 목록일 필요가 없음을 나타내기 위해 사용된다.

본원에 사용된 다른 용어는 당업계에 잘 알려진 의미에 의해 정의되는 것을 의미한다.

구체적으로 언급되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다.

본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 임의의 인용된 정수 또는 정수 군의 포함을 나타내지만 임의의 다른 정수 또는 정수 군의 배제를 나타내지 않는다.

본원에 사용된 용어 "로 본질적으로 구성되다", 또는 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 "로 본질적으로 구성된" 또는 "로 본질적으로 구성되는"과 같은 변형은 인용된 정수 또는 정수 군의 포함, 및 지정된 방법, 구조 또는 조성의 기본 또는 신규 특성을 실질적으로 변경하지 않는 인용된 정수 또는 정수 군의 임의의 포함을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는", "가지는" 등은 "포함하는", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "로 본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 구성되다"는 마찬가지로 미국 특허법에 정의된 의미를 가지며 이 용어는 개방형이며, 인용된 것을 초과하는 존재가 있더라도 인용된 것의 기본 또는 신규한 특징이 변경되지 않고 선행 기술 양태를 배제한다면 인용된 것을 초과하는 존재가 허용된다. 한 구현양태에서, 용어 "포함하다", "포함하는", "갖는"은 "구성되는"과 상호교환가능하다.

본 발명의 추가 목적, 이점, 및 신규 특징은 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 검토하면 당업자에게 명백해질 것이다. 추가로, 위에서 기술되고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구현양태 및 측면 각각은 하기 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.

실시예

일반적으로, 여기에서 사용된 명명법과 본 발명에서 사용된 실험실 절차는 화학적, 분자적, 생화학적 및 세포 생물학 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al.,(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed.(1994); "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed.(1994); The Organic Chemistry of Biological Pathways by John McMurry and Tadhg Begley(Roberts and Company, 2005); Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions by Richard Silverman(Academic Press, 2002); Organic Chemistry(6^th Edition) by Leroy "Skip" G Wade; Organic Chemistry by T. W. Graham Solomons and, Craig Fryhle) 참조한다.

재료 및 방법

GTE 준비

건조 분쇄된 황금 토마토(Lycopersicon esculentum Mill.(Fam. Solanaceae) 또는 Solanum lycopersicum) 펄프를 추출 유형-초임계 CO₂ 추출, 압력 360 bar, 및 60℃의 온도의 조건 하에서 추출하였다. 원료로부터의 조 추출물의 양은 2.7%(w/w)였다.

상대량(relative amount)을 포함하여 초임계 추출된 황금 토마토 내에서 확인된 화합물에 대한 비-제한적인 예가 아래에 명시되어 있다(표 1). 총 추출물 중량은 7.55g이었다.

표 1. 초임계 추출로 수득한 조 GTE 내에서 확인된 화합물

리코덤(LycoDerm), 리코마토(LycoMato)의 함량

총 카로티노이드의 10%로 표준화된 GTE 추출물을 루메나토(Lumenato)라고 한다. 루메나토, 리코덤 및 리코마토 6% 간의 활성 성분 비교는 표 2에 제시되어 있다.

표 2. 식물성영양소 함량 비교

인간 호중구의 준비

건강한 지원자로부터 혈액을 채취했다. 채혈 후 1시간 이내에 피콜-하이파케(Ficoll-Hypaque) 원심분리, 덱스트란 침강 및 적혈구의 저장성 용해에 의해 순도 95%의 호중구를 얻었다. 세포를 계수하고 트립판 블루 배제에 의해 생존력을 결정하였다.

세포 배양

정상 인간 진피 섬유아세포(NHFD) 성인 공여자(PROMOCELL, Heidelberg, Germany)는 섬유아세포 성장 배지-2(배지에서의 최종 보충적 농도: 소 태아 혈청 0.002%(v/v), 염기성 섬유아세포 재조합 인간 성장 인자 1mg/ml 및 재조합 인간 인슐린 5μg/ml), 2mM L-글루타민; 100U/ml 페니실린; 100μg/ml 스트렙토마이신(Beit-Haemek, Israel)가 보충된 섬유아세포 성장 배지-2(PROMOCELL)에서 배양되었다. 세포는 5% CO₂를 함유하는 가습된 대기에서 37℃로 유지되었다. NHDF는 80% 초과의 합류에 도달했을 때 24-웰 플레이트에 시딩되었다.

면역형광 분석

면역형광 검출을 위해, NHFD를 20℃에서 3분 동안 메탄올로 고정한 후 인산염 완충 식염수(PBS)에서 세척하였다. 고정 NHFD를 5%(w/v) BSA/PBS에서 90분 동안 실온에서 항-콜라겐-3 항체(Santa Cruz) 1:50과 함께 인큐베이션했다. 세포를 PBS에서 3회 세척하고 실온에서 60분 동안 Cy3 항-마우스(5%(w/v) BSA/PBS에서 1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, PA, USA)와 함께 인큐베이션했다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 핵을 DAPI로 염색하였다. 그런 다음 최종 세척을 수행하고, 형광 현미경(Olympus, BX60, Hamburg, Germany)을 사용하여 세포를 분석했다. 셀 프로파일러(CellProfiler) 프로그램을 사용하여 콜라겐-3에 대한 형광 강도를 결정했다. 형광 영역의 %는 셀 프로파일러(CellProfiler) 프로그램을 사용하여 결정되었다.

초산화물 생성

사이토크롬 C 환원 - 호중구에 의한 초산화물 음이온의 생성은 마이크로타이터 플레이트 기술에 의한 페리사이토크롬 c의 초산화물 디스뮤타제 억제가능한 환원으로서 측정되었다. 세포(2.5×10⁵/웰)를 페리사이토크롬 c(150mM)를 함유하는 100μl 행크스의 균형잡힌 염 용액(Hanks' Balanced Salts Solution, HBSS)에 현탁시켰다. 아세틸 페리사이토크롬 c의 환원은 2분 간격으로 550nm에서의 써모맥스 마이크로플레이트(Thermomax Microplate) 판독기(Molecular Devices, Melno Park, CA)에서 흡광도 변화로 이어졌다. 초산화물 생성의 최대 속도는 흡광 계수 E₅₅₀ = 21mM^-1·cm^-1을 사용하여 결정되고 나노몰 O₂-/10⁶ 세포/분으로 표현되었다.

앰플렉스 레드(Amplex red) - 고감도 형광 바이오센서 앰플렉스 레드(Amplex red)의 서양고추냉이 과산화효소(Horse Radish Peroxidase, HRP)-의존성 산화를 사용했다. 앰플렉스 레드(Amplex red)의 산화는 NADPH 산화효소의 첫 번째 산물인 O₂-의 자발적인 불균화분해(dismutation)에 의해 생성되자마자 H₂O₂를 가두는 HRP에 의해 세포 외부에서 발생한다. 휴지 및 활성화된 호중구(2 x 10⁴/w웰)를 HRP(0.1 단위/ml) 및 앰플렉스 레드(Amplex red)(50μM)를 함유하는 KRPG 완충액(인산염 완충액, 145mM NaCl, 4.86mM KCl, 1.22mM MgSO₄, 5.5mM D-글루코스, 0.54mM CaCl₂, pH 7.35)에 현탁시켰다. 형광은 535nm 여기 및 595nm 방출 파장으로 마이크로플레이트 판독기에 기록되었다. 배경 형광은 미세교세포가 없는 상태에서 측정되었다.

골수과산화효소(MPO) 활성

100μl의 37℃ O-디아니시딘 하이드로클로라이드 용액(1mg O-디아니시딘, 10ml 인산염 완충액 pH 6.0 + 0.0015% H₂O₂)을 광학 밀도가 측정되기 직전에 96-웰 플레이트의 100μl 상층액에 첨가하였고, 써모맥스 마이크로플레이트(Thermomax Microplate) 판독기(Molecular Devices, Melno Park, CA)에서 2분 간격으로 450nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다.

100ng/ml TNFα를 첨가하기 20분 전에 토코페롤 및 피토스테롤을 5 x 10⁵ 인간 호중구에 첨가하고 5% CO₂를 함유하는 습한 대기에서 37℃에서 밤새 유지하였다. MPO 활성은 배양된 호중구의 상층액에서 측정하였다.

100ng/ml TNFα를 첨가하기 20분 전에 제타 카로틴, 피토엔, 토코페롤, 피토스테롤, 또는 이들의 조합을 5×10⁵ 인간 호중구에 첨가하고 5% CO₂를 함유하는 습한 대기에서 37℃에서 밤새 유지하였다. MPO 활성은 위에서 설명한 대로 측정되었다.

MMP-9

세포 배양 상층액 중 인간 MMP-9 농도는 ELISA 키트(R&D systems Minneapolis, MN, USA)에 의해 정량화되었다.

MMP-8(콜라게나제)

세포 배양 상층액에서 인간 MMP-8 농도는 ELISA 키트(OriGene, Technologies, Inc. Rockville, MD, USA)에 의해 정량화되었다.

엘라스타제 활성

N-메톡시숙시닐-ala-ala-pro-Val-P-니트로아닐리드를 100μl의 상층액에 첨가하여 0.5mM의 최종 농도에 도달한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 써모맥스 마이크로플레이트(Thermomax Microplate) 판독기(Molecular Devices, Melno Park, CA)에서 405nm에서의 흡광도를 측정했다.

대식세포의 분리 및 배양

수확 4일 전에 티오글리콜레이트 브로스(4%) 1.5ml를 복강내 주사한 후 6-8주령 수컷 ICR 마우스(Harlan, Israel)의 복강으로부터 복막 대식세포를 수집하였다. 복막 대식세포를 PBS로 3회 세척한 후 적혈구를 저장성 용해시켜 고도로 농축된(90-95%) 대식세포 집단을 생성했다. 대식세포는 FACS(Becton Dickinson, Mountain View, CA)에 대한 유동 미세형광측정법에 의해 FITC-접합된 래트 항-마우스 F4/80(MCA497F)(Serotec, Oxford, England)을 사용한 FACS 분석에 의해 확인되었다. 각 샘플에 대해 10,000개의 광산란-게이트 생존 세포를 분석했다. 복막 대식세포(1 x 10⁶ 세포/웰)를 96-웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 대기, 10% FCS, 2mM L-글루타민; 100U/ml 페니실린; 100μg/ml 스트렙토마이신(Beit-Haemek, Israel)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 세포는 성분의 부재 또는 존재하에 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피무리움으로부터의 100ng/ml LPS로 자극되었다. LPS는 이스라엘 시그마(Sigma, Israel)에서 구입했다.

모든 화합물은 DMSO에 용해되었고, DMSO의 부피는 테스트 플레이트에서 0.1-0.2%를 초과하지 않았다. 적절한 부피의 DMSO(0.1-0.2%)를 대조군 플레이트에 첨가하였다. 각 튜브 테스트에서 % 억제율은 대조군 대비 계산되었다.

산화질소(NO) 생산 검정

세포 배양물의 상층액 중 NO 수준은 표준으로서 그리스(Griess) 시약 및 아질산나트륨을 사용하여 아질산염 농도를 검정함으로써 결정되었다.

세포 생존

세포 생존은 트리판 블루 배제를 사용한 세포 계수에 의해 또는 비색 MTT([3-4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨) 대사 활성 검정에 의해 평가되었다. MTT 측정을 위해 세포를 96웰 플레이트에서 배양하였다. MTT를 배지(5mg/ml)에 용해시키고 배양 배지 부피의 10%와 동일한 양으로 각 샘플에 첨가하였다. 4시간 동안 인큐베이션한 후, 포르마잔 결정을 배양 배지와 동일한 부피의 이소프로판올 중 100mM HCl, 10% 트리톤(Triton) X-100에 용해시켰으며, 배지는 배경으로만 사용되었다. 흡광도는 써모맥스 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Melno Park, CA, USA)로 570nm에서 기준 파장 690nm로 측정하였다.

프로-콜라겐-3

세포 배양 상층액에서 인간 프로-콜라겐-3 농도는 인간 PⅢNP(N-말단 프로-콜라겐 Ⅲ 프로펩티드) ELISA 키트(Elabscience Biotechnology Inc. Houston, Texas, USA)에 의해 정량화되었다. 섬유아세포 상층액에서 프로-콜라겐-3 농도가 매우 낮기 때문에, 상층액을 증발 농축하였다.

콜라겐-3

세포 배양 용해물 및 상층액 중 인간 콜라겐-3 농도는 인간 콜라겐, 유형 III, 알파 1(COL3A1) ELISA 키트(Cusabio Technology Inc., Houston, Texas, USA)에 의해 정량화되었다.

콜라겐 1a1

세포를 루메나토(Lumenato)와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 과산화수소(H₂O₂)를 첨가하고, 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션하여 산화 스트레스를 유도하였다. 인큐베이션 배지를 수집하고 배지로의 콜라겐 1a1 단백질 분비 수준을 특정 ELISA 검출 키트를 사용하여 분석했다.

통계 분석

평가된 매개변수 사이의 유의미한 차이는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용한 ANOVA에 의해 결정된 후 본페로니(Bonferroni) 사후 보정 다중 비교가 뒤따랐다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 유의: ^* - p< 0.05, ^** - p<0.001, ^*** - p<0.0001.

실시예 1

GTE는 자극된 호중구에서 분해 효소의 분비를 감소시킨다

콜라겐에 손상을 일으킬 가능성이 있는 효소 방출에 대한 GTE 효과를 연구하기 위해, 본 발명자들은 먼저 활성화된 호중구로부터 이러한 효소의 방출 동역학을 결정했다. 호중구는 UV에 노출되는 동안 피부 세포에서 방출되어 100ng/ml TNFα 또는 100ng/ml IL8에 의해 활성화되었다. 또한, 호중구는 비교를 위해 5×10^-7 fMLP로 활성화되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 인간 호중구에 TNFα를 첨가하면 활성화 2시간(16.52 ± 0.5ng/ml)에서 MMP-9의 유의한(p<0.001) 방출이 야기되었고, 이는 4시간에서 동일한 수준으로 지속되었다. IL8의 첨가는 활성화 4시간 동안 용량 의존적 방식으로 MMP-9의 방출을 야기하였다. MMP-9의 유의한(p<0.001) 방출은 IL8(9.12 ± 0.2ng/ml)을 사용한 활성화 2시간에서 검출되었으며, 4시간에서 17.86 ± 0.4ng/ml로 추가로 유의하게(p<0.0001) 증가했다. fMLP는 활성화 30분(10.41 + 0.4ng/ml)에서 MMP-9의 빠르고 유의한(p<0.001) 방출을 유도했으며, 이는 활성화 4시간 동안 13.45 + 0.3ng/ml로 점차 증가했다. 도 2에 나타난 바와 같이, TNFα 또는 IL8의 첨가는 활성화 2시간에서 MPO의 유의한(p<0.0001) 방출을 유도하였고, 이는 4시간에서 각각 0.28 ± 0.001ng/ml 및 0.4 ± 0.08ng/ml로 추가로 증가하였다. fMLP는 30분에 0.54 ± 0.004ng/ml로 MPO의 신속하고 유의한(p<0.0001) 방출을 유도했으며, 이는 4시간에 이 수준에서 지속되었다. 24시간 동안의 호중구 활성화는 4시간과 비교하여 MMP-9 또는 MPO의 방출을 증가시키지 않았다(데이터는 표시되지 않음).

MMP-9 또는 MPO 방출에 대한 GTE 효과를 연구하기 위해, 호중구를 4시간 동안 TNFα 또는 IL8에 의해 활성화시키고 30분 동안 fMLP에 의해 활성화시켰다. GTE는 활성화 전에 37℃에서 10분 동안 호중구에 첨가되었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 26-210μg/ml 농도 범위의 GTE 첨가는 용량 의존적 방식으로 TNFα, IL8 또는 fMLP에 의해 자극된 호중구로부터 MMP-9의 방출을 억제하였다. MMP-9 분비의 최대 억제는 TNFα, IL8 또는 fMLP에 의해 자극된 호중구에서 각각 95.4 ± 4.6%, 83.19 ± 12.0% 또는 76.6 ± 12.0%였다. 유사하게, GTE는 TNFα, IL8 또는 fMLP에 의해 자극된 호중구로부터 각각 46.0 ± 6.7%, 33.86 ± 0.7% 또는 38.5 ± 4.5%의 최대 억제로 MPO의 용량 의존적 억제를 유도했다(도 4).

다음으로, 호중구로부터의 초산화물 방출에 대한 GTE의 효과를 사이토크롬 C 환원에 의해 분석하였다. 초산화물은 불안정하기 때문에 전술한 각각의 작용제(예를 들어, TNFα, IL8 등)를 첨가한 직후에 분석을 수행하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 자극 전 10분 동안 GTE를 첨가하면 초산화물 생성의 용량 의존적 억제가 유도되어 TNFα, IL8 및 fMLP에 의해 호중구가 자극되어 최대 억제율이 각각 63.27 ± 13%, 67.55 ± 3.4%, 56.81 ± 2.4%에 도달하였다.

실시예 2

GTE는 섬유아세포-호중구 공동배양에서 콜라겐 손실을 감소시킨다

활성화된 호중구에 의해 유도된 콜라겐-3의 손상에 대한 GTE의 효과를 연구하기 위해, 본 발명자들은 배양된 섬유아세포 및 호중구의 최적 조건을 사용하였다. 1×10⁵ 섬유아세포를 24시간 동안 플레이팅하여 융합 배양물을 얻었다. 2×10⁵ 활성화된 호중구의 첨가는 약 30%의 유의한 콜라겐-3 손상을 유도했지만, 콜라겐-3의 면역 형광 염색에 의해 나타난 바와 같이 배양물을 파괴하지 않았다(도 6a-6n). 세포 생존력은 각 처리에서 측정되었으며 GTE의 부재 또는 존재하에 자극된 호중구의 첨가에 의해 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다. 공동 배양 실험에 사용된 호중구의 농도는 호중구 연구에 사용된 것보다 낮았다(도 1-5). 호중구를 24시간 동안 배양물에 첨가하기 전에 37℃에서 10분 동안 GTE와 함께 인큐베이션하였다. 콜라겐 3의 면역 형광 염색(도 6a-6n)에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포 배양물에 첨가하기 전에 6.5-104μg/ml 범위의 GTE와 함께 사전-인큐베이션된 호중구를 첨가하면 콜라겐 3 손상의 용량 의존적 억제를 유발하였다. 콜라겐 손상의 최대 방지는 52μg/ml GTE에서 도달했다(약 80% 보호). 농도계에 의해 결정되고 도 6o에 제시된 배양물에서 콜라겐-3 수준의 정량화는 다른 토마토-유래 조성물보다 더 컸다(도 6p-6q). 공동 배양물에서 루메나토(Lumenato)의 존재는 분비된 프로-콜라겐-3의 용량 의존적 증가를 104ug/ml 루메나토의 존재 하에서 호중구에 의해 유도된 프로-콜라겐-3(대시 수평선으로 표시됨)의 수준을 뺀 68.21 ± 7.1pg/ml로 야기시켰으며(도 6s), 이는 104ug/ml 루메나토의 존재하에서 약 10pg/ml의 증가를 나타내었다. 또한, 밤새 섬유아세포에 루메나토를 첨가해도 MTT 또는 DAPI 염색에 의해 측정된 섬유아세포 수에 영향을 미치지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 그럼에도 불구하고, 루메나토의 첨가는 상층액에서 용량 의존적 방식으로 프로-콜라겐-3 수준의 유의한 증가를 유도했다(도 18).

NHDF 세포를 50μM H₂O₂로 처리하면 콜라겐 1a1 분비가 약 10배 감소했다(도 19). 루메나토는 이미 사용된 최저 농도에서 콜라겐 분비 감소를 완전히 없앴다. 이 결과는 MMP1 분비를 감소시키는 루메나토의 능력을 고려할 때 루메나토가 생체 내에서 피부 콜라겐 수준을 증가시키고 피부 노화를 감소시키는 유망한 물질임을 시사한다.

전술한 공동 배양 시스템(도 6에 기술된 바와 같이) 하에서 방출된 분해 효소의 양/수준을 배양 24시간 후 상층액에서 측정하였다. 공동 배양 실험에서 더 낮은 농도의 호중구가 사용되었기 때문에(5×10⁶/ml와 비교하여 2.5×10⁵/ml), 공동 배양 실험에 사용된 GTE의 농도는 호중구에 대한 영향을 연구하는 데 사용된 농도보다 낮았다(도 1-5). 도 7a에 도시된 바와 같이, MMP-9의 용량 의존적 억제는 GTE에 대해 관찰되었지만, 다른 토마토-유래 조성물에서는 관찰되지 않았다(도 7b-7c). GTE의 억제는 약 12.5 ± 3.9% 억제였다. 상층액에서의 활성을 기반으로 결정된 MPO 방출은 13μg/ml만큼 낮은 GTE 농도에서 유의하게 억제되었으며, 이는 점차 증가하여 테스트된 최대 농도에서 45.8 ± 5.6% 억제에 도달했다(도 8a). GTE MPO-억제 효과는 다른 토마토-유래 조성물과 비교하여 약 2배였다(도 8b-8c). 초산화물 생성에 대한 GTE의 영향은 앰플렉스 레드(Amplex red)에 의해 연구되었으며, 이는 호중구 자극 직후(초산화물은 불안정하다) 수행되었다. 도 9에 도시된 바와 같이, GTE는 78.5 ± 0.9% 억제에 도달하는 유의한 용량 의존적 억제를 유도하였다. 공동배양에서 GTE의 유익한 효과는 도 10에 제시된 바와 같이 MMP-8(콜라게나제)의 억제에 의해 추가로 예시되었다. GTE는 MMP-8 방출의 점진적인 억제를 유도했으며, 최대 억제율은 26μg/ml의 GTE에서 43.0 ± 7.1%이었고, 이는 더 높은 GTE 농도에서도 지속되었다. 엘라스타제 활성은 자극된 호중구 및 섬유아세포의 공동배양에서 GTE의 존재하에서 유의하게 증가하지 않았다(도 11).

실시예 3

GTE는 자극된 대식세포에서 산화질소 생성을 감소시킨다

대식세포를 LPS로 자극한 후 여과된 펄프 또는 GTE의 농도를 증가시켜 함께 인큐베이션하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, GTE는 여과된 펄프에 비해 산화질소(NO) 생성을 억제하는 데 2배 더 효과적이었다. GTE는 약 20% 억제를 나타내는 5μg/ml의 낮은 농도에서 시작하여 용량 의존적 방식으로 NO 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. NO 생성 억제 수준은 GTE 농도가 100μg/ml인 경우 약 55%까지 지속적으로 증가했다.

실시예 4

다중 식물영양소의 조성물이 MPO 활성을 상승적으로 억제한다

본 발명자들은 자극된 호중구에서 MPO 활성에 대한 다중 식물영양소의 효과를 조사하였다. 토코페롤 또는 피토스테롤의 단독 첨가는 TNFα로 활성화된 호중구로부터 MPO의 방출 및 활성에 영향을 미치지 않았다(도 13a-13b). 그러나, 225μg/ml의 토코페롤 및 62.5μg/ml의 피토스테롤을 보충하면 대조군에 비해 MPO 활성이 약 20% 억제되는 상승 효과가 나타났다(도 13c).

본 발명자들은 또한 제타 카로틴을 피토엔, 토코페롤 또는 피토스테롤과 함께 첨가하는 것이 MPO 활성에 미치는 영향을 조사했다. 제타 카로틴, 토코페롤, 피토엔, 또는 피토스테롤의 단독 첨가는 MPO 활성의 최대 5% 억제로 억제 효과가 없었다(도 14). 그러나 GTE에 존재하는 비율로 토코페롤, 피토엔 또는 피토스테롤 중 어느 하나와 제타 카로틴을 첨가하면 TNFα-활성화된 호중구로부터 MPO 활성 또는 방출의 상승적 억제가 유도되었다(도 14).

실시예 5

증가된 카로티노이드 생체이용률을 갖는 루메나토 캡슐

본 발명자들은 루메나토 캡슐 내에서 전달되는 카로티노이드의 생체이용률을 조사했다. 다음의 카로티노이드는 투여 후 1주, 2주, 3주 및 4주에 혈장에서 정량화되었다. 루메나토(황금 토마토 추출물)의 주요 카로티노이드인 피토엔, 피토플루엔 및 제타-카로틴이 잘 흡수되었다(도 15). 제타 카로틴은 혈장 농도의 급격한 증가에 의해 반영되는 바와 같이 매우 잘 흡수되는 것으로 밝혀졌다(도 15a).

실시예 6

피부 세포에서 산화 스트레스 유도 손상의 균형시험

다음으로 본 발명자들은 황금 토마토 추출물인 루메나토가 피부 탄력을 향상시키고 인간 케라티노사이트에서 산화 스트레스-유도 피부 손상을 예방하는지 여부를 조사했다. H₂O₂와 같은 활성 산소종(ROS)은 피부에서 염증 과정을 유발하고 피부 세포에서 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix Metalloproteinase, MMP) 생성을 증가시켜 콜라겐 분해를 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 과산화수소 H₂O₂를 사용하여 KERTr 인간 케라티노사이트에서 산화 스트레스를 유도하고, 세포 수(세포 사멸) 및 MMP1 분비에 대한 효과를 분석하였다. 세포 생존율은 XTT 세포 증식 키트를 사용하여 결정되었고 MMP1 수준은 ELISA로 측정되었다. H₂O₂로 세포를 처리하면 용량 의존적 세포 사멸이 발생하고(도 16a) MMP1의 분비가 증가했다(도 16b). H₂O₂를 첨가하기 전에 표시된 농도의 루메나토를 첨가하면 세포 생존력이 증가하고 MMP1의 분비가 감소했다.

위에서 언급한 보호 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 항산화제 반응 요소 전사 시스템(ARE/Nrf2)의 활성화이다. 따라서, 본 발명자들은 리포터 유전자 검정을 사용하여 이러한 전사 시스템의 활성화를 측정하였다. 루메나토에 의한 ARE/Nrf2 전사 활성의 용량 의존적 활성화가 관찰되었다(도 17).

실시예 7

피부 상태 및 외관

본 발명자들은 연구 제품인 루메나토를 투약하기 전과 후에(예를 들어, 기준선에서 및 12주 후) 참가자의 피부 상태 및 외관에 대해 참가자에게 질문하는 14개 질의를 포함하는 기준선 피부 설문지를 구성했다. 그 결과(표 3) 14개 질문 중 11개 질문(3, 10, 11번 질문 제외)에서 만족도가 크게 향상되었음을 보여준다.

표 3. 기준선 피부 설문지 결과

추가로, 본 발명자들은 연구 제품인 루메나토(4주, 8주 및 12주차)를 복용하는 동안 참가자의 피부 상태 및 외관에 관해 참가자에게 묻는 14개의 질문을 포함하는 피부 업데이트 설문지를 수집했다. 그 결과(표 4) 14개 문항 중 10개 문항(3, 8, 11, 12번 문항 제외)에서 만족도가 크게 향상되었음을 보여준다(표 4).

표 4. 피부 업데이트 설문지 결과

본 발명이 구체적으로 설명되었지만, 당업자는 많은 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 특별히 설명된 구현양태로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 범위 및 개념은 하기 청구범위를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다.

Claims

조성물에서, 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 55-65%(w/w) 양의 피토엔, 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 10-20%(w/w) 양의 피토플루엔, 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 15-25%(w/w) 양의 제타 카로틴, 및 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 피토엔 및 상기 피토플루엔의 합 대 상기 제타 카로틴의 중량비가 15:1(w/w) 내지 2:1(w/w) 범위인, 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 리코펜, 베타 카로틴, 감마 카로틴, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 카로티노이드를 추가로 포함하는, 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양의 상기 리코펜, 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 5%(w/w) 미만의 양의 상기 베타 카로틴, 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 0.2-1.5%(w/w) 양의 상기 감마 카로틴, 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 10-15%(w/w)의 양의 총 카로티노이드를 포함하는, 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 토코페롤을 추가로 포함하는, 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 토코페롤을 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 10-30%(w/w)의 양으로 포함하는, 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 피토스테롤을 추가로 포함하는, 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 피토스테롤을 상기 조성물에서의 총 카로티노이드의 5-15%(w/w)의 양으로 포함하는, 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 손실 감소용, 콜라겐 수준 증가용, 또는 둘 모두를 위한, 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 콜라겐-손실을 예방 또는 치료하는 단계를 포함하는, 콜라겐 손실의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 콜라겐 손실을 예방 또는 치료하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 예방 또는 치료는 콜라겐 손실을 50-90% 감소시키는, 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 골수과산화효소(MPO), 초산화물(SO), 엘라스타제, 산화질소(NO), 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 양, 활성 또는 이들 둘 모두의 감소를 필요로 하는 대상체에서 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 골수과산화효소(MPO), 초산화물(SO), 엘라스타제, 산화질소(NO), 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 양, 활성 또는 이들 둘 모두를 감소시키는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 MMP는 MMP-9, MMP-8, MMP-1, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 방법.
제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 콜라겐-손실 관련 질환을 앓고 있는, 방법.
제 15항에 있어서, 상기 콜라겐-손실 관련 질환은 연령-관련 질환, 피부 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제 16항에 있어서, 상기 피부 질환이 방사선, 산화 스트레스, DNA 손상, 텔로미어 단축, 염증, 담배 사용, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나에 의해 유도된 피부 손상을 포함하는, 방법.
제 17항에 있어서, 상기 방사선은 자외선, 가시광선, 적외선, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
제 18항에 있어서, 상기 자외선은 UVA, UVB, UVC, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
제 11항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 대조군과 비교하여 피부에서, 전신적으로 또는 둘 모두에서 MMP, MPO, SO, 엘라스타제, NO, 및 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 증가된 양, 증가된 활성 또는 둘 모두를 갖는, 방법.
제 11항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 경구 투여, 국소 투여 또는 둘 모두를 포함하는, 방법.