KR20130072706A

KR20130072706A - 탁시폴린 배당체를 함유하는 작약추출물의 제조방법 및 작약추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20130072706A
Application number: KR1020110140245A
Authority: KR
Inventors: 주철규; 이근하; 주연정; 조영롱; 박청; 권순상; 정용철; 주일우
Original assignee: (주)모아캠
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2013-07-02
Also published as: KR101390465B1

Abstract

본 발명은 작약으로부터 탁시폴린 함유 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 작약을 용매 추출하여 탁시폴린 배당체를 함유하는 추출액을 수득하고, 이를 농축, 분획 및 초저온 또는 초고압 재결정을 공정거쳐, 고함량의 탁시폴린을 함유하는 작약추출물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 탁시폴린 고함유 작약추출물을 유효성분으로 포함하는 미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호효과가 우수한 화장료 및 피부외용제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 작약으로부터 고함량의 탁시폴린을 함유하는 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 추출물을 함유하는 화장료 및 피부외용제 조성물은 미백효과, 주름개선효과, 항염효과, 항균효과, 아토피 개선효과, 자외선 보호효과가 매우 뛰어나다.

Description

탁시폴린 배당체를 함유하는 작약추출물의 제조방법 및 작약추출물을 함유하는 화장료 조성물{Method for Preparing Paeonia lactiflora Extracts Containing Taxifolin-3-glucoside and Cosmetic Composition Containing Preparing Paeonia lactiflora Extracts}

본 발명은 탁시폴린 함유 작약추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 작약을 용매 추출하여 taxifolin-3-glucoside가 포함된 추출물을 제조하고, 이를 농축, 분획, 초저온 또는 초고압 재결정을 공정거쳐, 고함량의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약추출물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 탁시폴린 함유 작약추출물을 유효성분으로 포함하는 미백, 주름개선, 항염, 항균, 아토피 개선 및 자외선 보호효과가 우수한 화장료 및 피부외용제에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적 변화가 일어나고, 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분된다.

자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망이 파괴되고, 세포 및 조직이 손상되어 성인병 및 노화가 촉진되게 된다. 구체적으로는 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 하이알루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하 등의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 메탈로프로티나아제(MMP)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었으므로, 본 발명자들은 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현양 및 활성을 조절하고자 하였다.

피부노화의 또 다른 원인은 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라조이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

한편, 아토피(atopy)성 피부염의 원인은 아직 확실하게 규명되지 못하고 있으므로 피부건조, 습진 등으로 표현되는데, 아토피성 피부염(atopic dermatitis)은 다수의 요인에 의하여 기인한다. 아토피 피부염 악화에 관련하는 여러 외적 환경요인들은 잘 알려져 있으며 그 증거로 혈중 Ig E의 증가, IL-4와 IL-5의 증가, INF-r등이 있으며 피부적인 이상은 표피내 수분함량이 저하되고 자연보습 인자의 성분이 감소되고 경피 수분손실량이 증가되고 있다.

한편, 작약(Paeonia lactiflora)이란 한국이 원산지인, 쌍떡잎식물 작약과 작약속의 여러해살이풀로 주로 산기슭이나 골짜기에서 자란다. 가지는 옆으로 길게 2m 이상 뻗고 털이 없으나 갈고리 같은 가시가 있으며, 줄기는 여러 개가 한 포기에서 나와 곧게 서고 높이 60cm 정도이며 잎과 줄기에 털이 없다. 뿌리는 여러 개가 나오지만 가늘고 양끝이 긴 뾰족한 원기둥 모양으로 굵다. 잎은 어긋나고 밑부분의 것은 작은잎이 3장씩 두 번 나오는 겹잎이다. 작은 잎은 바소꼴 또는 타원형이나 때로는 2~3개로 갈라지며 잎맥 부분과 잎자루는 붉은색을 띤다. 잎 표면은 광택이 있고 뒷면은 연한 녹색이며 가장자리는 밋밋하다. 꽃은 5~6월에 줄기 끝에 1개가 피는데 크고 아름다우며 재배한 것은 지름 10cm 정도이다. 꽃색은 붉은색 ·흰색 등 다양하며 많은 원예 품종이 있다. 열매는 달걀 모양으로 끝이 갈고리 모양으로 굽으며 내봉선을 따라 갈라지고 종자는 구형이다. 꽃은 주로 원예용으로 쓰며 뿌리는 진통·복통·월경통·무월경·토혈·빈혈·타박상 등의 약재로 쓰인다. 중국에서는 진(晉)과 명(明)시대에 이미 관상용으로 재배되어 그 재배 역사는 모란보다 오래되었다. 송(宋)을 거쳐 청(淸)시대에는 수십 종류의 품종이 기록되어 있고, 한국·몽골·동시베리아 등지에 분포한다.

작약을 이용한 화장료 관련 기술에는 작약종자 추출물을 이용한 화장비누 제조법(대한민국 등록특허 제10-0804993호)와 작약추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 보습용 세정제 조성물(대한민국 공개특허 제2005-0118819)이 기재되어 있으나, 작약(Paeonia lactiflora)으로부터 고함량의 taxifolin-3-glucoside를 추출하여, 미백, 주름개선, 아토피 등의 효과를 가지는 화장료 조성물을 제조한 예는 없었다.

이에, 본 발명자들은 천연물에서 화장품으로의 응용할 수 있는 유용물질을 추출하고자 예의 노력한 결과, 작약으로부터 고함량으로 추출된 탁시폴린 배당체를 추출하고, 상기 추출된 탁시폴린 배당체가, 미백효과, 주름개선효과, 항염효과, 항균효과, 아토피 개선효과, 자외선 보호효과가 매우 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 작약으로부터 고함량의 탁시폴린을 함유하는 추출물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 작약을 용매를 사용하여 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 추출물을 감압건조하여 농축시켜 1차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (c) 상기 1차 농축된 파우더를 물에 용해시킨 다음, 유기용매를 첨가하여 극성에 따라 분획한 후, 용매를 제거하고 농축시켜 2차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (d) 상기 2차 농축된 파우더를 수용액에 용해시킨 다음, 색소 및 클로로필을 칼럼을 사용하여 제거하는 단계; (e) 상기 색소 및 클로로필이 제거된 용액을 초저온 또는 초고압 상태에서 재결정화시키는 단계; 및 (f) 상기 재결정화된 추출물을 분무건조 또는 동결건조하여 taxifolin-3-glucoside를 함유하는 파우더 형태의 작약추출물을 수득하는 단계를 포함하는 탁시폴린을 함유하는 작약추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 기능을 가지는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 기능을 가지는 피부외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 작약으로부터 고함량의 탁시폴린을 함유하는 추출물을 제조할 수 있으며, 상기 추출물을 함유하는 화장료 및 피부외용제 조성물은 미백효과, 주름개선효과, 항염효과, 항균효과, 아토피 개선효과, 자외선 보호효과가 매우 뛰어나다.

도 1은 본 발명에 따른 작약으로 부터 Taxifolin-3-glucoside의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 Taxifolin-3-glucoside 함유 작약추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 (a) 작약을 용매를 사용하여 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 추출물을 감압건조하여 농축시켜 1차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (c) 상기 1차 농축된 파우더를 물에 용해시킨 다음, 유기용매를 첨가하여 극성에 따라 분획한 후, 용매를 제거하고 농축시켜 2차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (d) 상기 2차 농축된 파우더를 수용액에 용해시킨 다음, 색소 및 클로로필을 칼럼을 사용하여 제거하는 단계; (e) 상기 색소 및 클로로필이 제거된 용액을 초저온 또는 초고압 상태에서 재결정화시키는 단계; 및 (f) 상기 재결정화된 추출물을 분무건조 또는 동결건조하여 taxifolin-3-glucoside를 함유하는 파우더 형태의 작약추출물을 수득하는 단계를 포함하는 탁시폴린을 함유하는 작약추출물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 탁시폴린 함유 작약 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 함유하는 작약 추출물의 제조방법에서, 추출공정을 통해 작약으로부터 taxifolin-3-glucoside를 용출시키게 되는데, 본 발명에 의한 최적의 추출공정은 0.5∼20.0 %의 비율로 작약 중량을 용매(물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 용매)에 가하여 0.5∼5시간을 추출하는 것이 바람직하다.

상기 추출공정을 통해 taxifolin-3-glucoside가 용출된 작약 추출물은 용매제거를 위해 1차 농축공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 1차 농축공정은 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조 등 여러 가지 방법으로 응용될 수 있다.

상기 1차 농축공정을 통해 수득된 작약 추출물은 극성에 따라 화합물을 나누어 분리하는 분획공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 분획공정은 용매(물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종이상의 용매)를 이용한다.

본 발명의 분획공정은 헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순서로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층 수득하는 것이 바람직하다.

상기 분획공정을 거친 후 분획물은 유기용매의 제거를 위해 2차 농축공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 2차 농축공정은 가열건조, 감압건조, 분무건조 및 동결건조 등 여러 가지 방법으로 응용될 수 있다.

상기 2차 농축공정을 거친 후 분획농축파우더는 색소 및 클로로필을 제거하는 컬럼공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 컬럼공정은 흡착수지를 이용한 레진 컬럼에 적합하며 상기 레진은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진 및 다이아이온 HP-10, 20, 30, 40, 50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 레진을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 컬럼공정을 거친 후 컬럼 통과액에 압력 및 온도를 조절하여 침전시키는 재결정화 공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 재결정화 공정에서, 초저온 재결정 공정은 -300 ∼ -30에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 초고압 재결정 공정은 50~800 MPa에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 재결정화된 침전 펠렛은 분무건조 또는 동결건조하여 파우더형태의 고함량의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물을 얻는 수득공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 수득공정은 원심분리, 필터 및 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 스프레이 드라이어, 동결건조를 이용하여 분말상의 고함량 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물을 얻을 수 있으며,

표 1에 나타난 바와 같이, 추출물 중 97%이상이 taxifolin-3-glucoside인 것을 확인할 수 있다.

상기 연속 공정으로 얻어진 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 뛰어난 미백효과, 주름개선효과, 항염, 항균, 자외선보호효과 그리고 아토피 개선효과를 나타낸다.

다른 관점에서, 본 발명은 (a) 작약을 용매를 사용하여 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 추출물을 감압건조하여 농축시켜 1차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (c) 상기 1차 농축된 파우더를 물에 용해시킨 다음, 유기용매를 첨가하여 극성에 따라 분획한 후, 용매를 제거하고 농축시켜 2차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (d) 상기 2차 농축된 파우더를 수용액에 용해시킨 다음, 색소 및 클로로필을 칼럼을 사용하여 제거하는 단계; (e) 상기 색소 및 클로로필이 제거된 용액을 초저온 또는 초고압 상태에서 재결정화시키는 단계; 및 (f) 상기 재결정화된 추출물을 분무건조 또는 동결건조하여 taxifolin-3-glucoside를 함유하는 파우더 형태의 작약추출물을 수득하는 단계를 포함하는 탁시폴린을 함유하는 작약추출물의 제조방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 기능을 가지는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어 상기 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 10 %중량인 것이 바람직하며, 이러한 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다.

구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 작약을 용매를 사용하여 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 추출물을 감압건조하여 농축시켜 1차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (c) 상기 1차 농축된 파우더를 물에 용해시킨 다음, 유기용매를 첨가하여 극성에 따라 분획한 후, 용매를 제거하고 농축시켜 2차 농축된 파우더를 수득하는 단계; (d) 상기 2차 농축된 파우더를 수용액에 용해시킨 다음, 색소 및 클로로필을 칼럼을 사용하여 제거하는 단계; (e) 상기 색소 및 클로로필이 제거된 용액을 초저온 또는 초고압 상태에서 재결정화시키는 단계; 및 (f) 상기 재결정화된 추출물을 분무건조 또는 동결건조하여 taxifolin-3-glucoside를 함유하는 파우더 형태의 작약추출물을 수득하는 단계를 포함하는 탁시폴린을 함유하는 작약추출물의 제조방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 기능을 가지는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

상기 피부외용제 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형의 화장료 조성물 또는 연고 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1

작약을 70% 에탄올 수용액에 10%중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출하였다. 그 후 80 mesh 필터와 1.2 μm 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득 된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시하여, 탁시폴린 추출물 함유 농축파우더를 얻었다.

실시예 2

작약을 70% 에탄올 수용액에 10%중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출하였다. 그 후 80 mesh 필터와 1.2 μm 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득 된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시하여, 탁시폴린 추출물 함유 농축파우더를 얻었다.

실시예 3

작약을 70% 에탄올 수용액에 10%중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간동안 추출하였다. 그 후 80 mesh 필터와 1.2 μm 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득 된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산하여 Diaion HP-20 컬럼에 투입, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였고, 유속 20 ml/min 조건하에 최종적으로 70 % ∼ 99.5% 에탄올 컬럼액을 받아 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시하여, 탁시폴린 추출물 함유 농축파우더를 얻었다.

실시예 4

작약을 70% 에탄올 수용액에 10%중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간 동안 추출하였다. 그 후 80 mesh 필터와 1.2 μm 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득 된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산하여 Diaion HP-20 컬럼에 투입, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였고, 유속 20 ml/min 조건하에 최종적으로 70 % ∼ 99.5 % 에탄올 컬럼액을 받아 초고압장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100 MPa, 25 ℃, 1시간 동안 초고압 재결정화 처리하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리 하고, 1.2 um 필터로 여과를 수행, 최종적으로 Dryoven 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여 탁시폴린 추출물 함유 파우더를 수득하였다.

실시예 5

작약을 70% 에탄올 수용액에 10%중량으로 가하여 냉각콘덴서가 달린 환류추출기에서 온도 80℃ 조건하에 2시간동안 추출하였다. 그 후 80 mesh 필터와 1.2 μm 필터로 여과하여 추출 여액을 얻었고, 수득 된 추출여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었다. 수득된 농축파우더에 10 배 중량의 증류수를 투입하여 고르게 분산한 뒤 분획여두를 사용하여 증류수와 같은 부피의 헥산을 투입, 분획하였고 차례로 에틸아세테이트, n-부탄올을 차례로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층을 얻었다. 수득된 에틸아세테이트 분획여액을 진공농축기(Rotary Evaporator NE-series, Eyela, Japan)를 이용하여 65℃, 20 hPa 조건하에 1시간 동안 농축을 실시, 농축파우더를 얻었으며, 농축파우더를 10 배 중량의 증류수에 다시 분산하여 Diaion HP-20 컬럼에 투입, 증류수와 99.5% 에탄올을 사용한 기울기 용법으로 크로마토그래피를 수행하였고, 유속 20 ml/min 조건하에 최종적으로 70 % ∼ 99.5 % 에탄올 컬럼액을 받아 초저온장치(DF-9010, Ilshin, Korea)를 이용하여 -90℃, 2시간 동안 초저온 재결정화 처리 하였다. 이를 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 15분간 원심분리 하고, 1.2 um 필터로 여과를 수행, 최종적으로 Dryoven 60℃ 조건하에 1시간 동안 건조하여, 탁시폴린 추출물 함유 파우더를 얻었다.

시험예 1: 작약추출물의 taxifolin -3- glucoside 의 함량분석

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 제조방법 단계별에 따른 taxifolin-3-glucoside의 함량변화를 확인하기 위하여, 실시예 별 시료의 HPLC를 이용한 함량분석을 하기와 같이 수행하였다.

상기 실시예를 통해 제조된 제조방법 단계별 시료의 taxifolin-3-glucoside의 정성, 정량분석을 위하여 High pressure liquid chromatography(HPLC)를 이용해 분석을 수행하였다. 시료는 각 용매로 적당 농도를 제조 하여 0.2um filter에 여과, 전처리 후 기기에 주입하였다. 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, USA)를 사용하여 UV detector를 이용, UV 전영역에서 분석하였으며, C₁₈컬럼(Zorbax XDB-C₁₈ 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2 % Acetic acid in DW 용매와 Acetonitrille 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다. 분석에 사용된 용매는 모두 HPLC급 시약을 사용하였으며, 표준곡선을 구한 후 정량분석을 수행하였다.

시료명	제조방법 단계	taxifolin3-glucoside 함량(%)
실시예 1	추출, 농축	2.5
실시예 2	추출, 농축, 분획	11.4
실시예 3	추출, 농축, 분획, 컬럼	32.9
실시예 4	추출, 농축, 분획, 컬럼, 초고압재결정	97.4
실시예 5	추출, 농축, 분획, 컬럼, 초저온재결정	99.3

표 1에 나타난 바와 같이, 작약으로부터 추출, 농축, 분획, 컬럼, 재결정 공정을 거칠수록 taxifolin-3-glucoside의 함량이 비약적으로 상승함을 확인할 수 있었으며, 초저온 재결정공정을 통해 99 %가 넘는 고함량의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물을 제조할 수 있음을 확인하였다.

시험예 2: 작약추출물의 타이로시네이즈 활성저해 시험

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 타이로시네이즈의 작용을 억제하는 정도를 측정하여 미백효과를 검정하는 방법(Pomerantz S. H., J. Biochem ., 24:161-168, 1966)을 응용해 판정하였다. 시험방법은 하기와 같다.

시료 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL 및 1.5 mM L-타이로신 용액 1.0 mL을 넣은 후, 37℃에서 10분간 유지시켰다. 머쉬룸타이로시네이즈(1,500 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, UV-vis spectrophotometer(Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하여 타이로시네이즈에 대한 저해율을 측정하였다.

상기 타이로시네이즈 활성저해시험을 위한 대조군은 시료액 대신 완충용액을 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 타이로시네이즈 대신 완충용액을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻은 경우로 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 실시예 5에서 수득한 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물과 여러 연구결과에서 미백효과가 뛰어나다고 알려진 arbutin(Arbutin synthetic, Sigma)을 비교하였고, 하기 수학식 1을 이용하여 타이로시네이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 2에 나타내었다. IC₅₀은 타이로시네이즈 활성을 50 % 저해하는데 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

타이로시네이즈저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)

시료	Tyrosinase 활성저해율, IC₅₀(mg/mL)	비고
실시예 5의 시료	0.022
arbutin	0.032

표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 5에서 수득한 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물은 현재 미백효과가 뛰어나다고 알려진 arbutin과 비교하여 미백효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

시험예 3: 작약추출물의 엘라스테이즈 활성저해시험

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여 엘라스테이즈 활성저해시험(elastase inhibition activity test)을 실시하였다.

엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법을 사용하였다.

완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl (Sigma), 기질액은 8.8 mM N-Succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10 ug/mL (Sigma)의 농도로 사용하였다. 완충액 60μl, 기질액 20 μl와 상기 실시예 5의 시료를 농도별로 3차 증류수에 희석한 시료액 100 μl를 섞은 후, 효소액 20 μl를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 p-니트로아닐린의 생성량을 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 사용하여 파장 405nm에서 측정하였다.

상기 엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 실시예 5에서 수득한 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물과 기존 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 Retinol(>99%, Sigma, USA)을 양성대조군으로 비교하여 실험하였고, 하기 식을 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 3에 나타내었다. IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50 % 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

엘라스테이즈활성저해율(%) = 100 - ((시료의흡광도)/대조군의 흡광도) x 100)

시료	엘라스테이즈 활성저해율, IC₅₀(mg/mL)
실시예 5	0.20
Retinol	0.38

표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 5에서 수득한 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물은 기존 주름개선효과가 뛰어나다고 알려진 Retinol과 비교하여 엘라스타아제 억제효과가 더 우수하였다.

시험예 4; 작약추출물의 콜라겐 합성 효과 시험

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다.

시험 방법은 하기와 같이 진행한다.

사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1x10⁵ 세포/웰) 37℃, 5 % 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 다음과 같이 수행한다.

24시간 배양한 배리를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05 % Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 블로킹 용액(5 % skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 μl씩 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 이차 항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 μl씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100 μl씩 넣고 항온 25℃에서 발색시킨 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시, 평균값을 구하였다.

하기 식을 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 계산하여 표 4에 나타내었다.

(대조군의 흡광도-시료의 세포배양액 흡광도)

콜라겐 합성효과(%) = 100 + -------------------------------------- x100

대조군의 흡광도

콜라겐 합성효과 (%)	시료	농도(ug/mL)
	시료	0	1	10	100
	실시예 5	100.00	111.59	122.84	133.21
	아스코르빈산(vitamin-C)	100.00	108.45	123.57	131.58

표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 5에서 수득한 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물은 기존 콜라겐합성효과가 우수하다고 알려진 아스코르빈산과 비교하였을때, 거의 대등한 콜라겐 합성효과를 나타냈다.

시험예 5: 작약추출물의 자외선 조사 후 MMP -1 발현억제 평가

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 자외선 조사 후 MMP-1 발현 억제를 평가하기 위해 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하는 효소면역분석법(ELISA)을 하기와 같이 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 매스킹 후 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였고, UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이며 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수, 96-웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시키고, 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응, 마이크로플레이트 리더로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 5의 시료는 48 % 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율 보다 우수한 결과이다 (표 5).

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)	비고
실시예 5	0.1	48
레티놀	0.1	28

시험예 6: 작약추출물의 B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 미백효과를 검정하기 위해 하기와 같이 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Cμlture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄 (Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1 % Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH (10 % DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율 (%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율 (%)은 하기 식에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50 % 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 실시예 5의 시료의 IC₅₀은 0.08 %로 기존의 미백제인 알부틴, 유용성 감초 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다 (표 6).

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC50)
실시예 5	0.1	0.08%
알부틴	0.1	0.21%
유용성 감초 추출물	0.1	0.03%

시험예 7: 작약추출물의 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500μl의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 실시예 5의 시료를 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕ 배지와 MTT 용액(2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565 nm 흡광도를 측정하였다. 하기 식에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율을 계산하였다.

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

그 결과, 실시예 5의 시료는 자외선에 의한 세포 독성을 0.1% 농도에서 41%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다 (표 7).

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
실시예 5	0.1	41

시험예 8: 작약추출물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 실시예 5를 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 실시예 5의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 하기 식에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

그 결과, 실시예 5의 시료는 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.1 % 농도에서 41 % 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다 (표 8).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 5	0.05	25
실시예 5	0.1	41

시험예 9: 작약추출물의 항균 효과

본 발명의 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물에 대한 항균력 효과 검정시험으로 고체 배양 희석법 과 Paper disc method법에 의하여 항균시험을 실시하였다. 실험균주는 한국생명공학연구원으로부터 분양받았으며, 그람양성균으로 포도상구균(Staphylococcus aureus KCTC 6910), 그람음성균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637), 대장균(E. Coli KCTC 1039), 효모로는 캔디다 효모(Candida albicans KCTC 7965), 사상균으로 흑국균(Aspergillus niger KCTC 6910) 이상 총 4종의 균주를 사용하였으며, 실험 방법과 결과는 하기와 같다.

taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 항균력을 측정하기 위해 고체 배양 희석법(Agar Serial Dilution Method)을 이용하여 최소 저해 농도를 측정하였다.

세균류는 트립틱 소이 배지를 사용하였고, 배지에 균을 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 24시간동안 전배양하여 사용하였다. 효모의 배양에는 포테이토 덱스트로스 배지를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃ 진탕 배양기에서 2일간 전배양하여 사용하였다. 사상균의 배양에는 포테이토덱스트로스 한천배지를 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃배양기에서 7일간 전배양하여 사용하였다.

보다 구체적인 항균시험은 먼저 세균의 경우, 트립틱소이 배지에 균을 접종하여 37℃에서 24시간 전배양하여 준비하고, 효모의 경우, 포테이토덱스트로스 배지에 균을 접종하여 25℃에서 2일간 전배양하며, 사상균은 포테이토 덱스트로스 한천배지에 균을 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 전배양한 후, 도말봉을 이용, 배지 표면에 형성된 사상균의 포자를 회수하여 멸균된 식염수에 희석하여 사용하였다.

멸균된 패트리 디쉬에 시료 및 실험균종 별로 5% Dimethylsμlfoxide(DMSO) 생리식염수용액에 적절한 농도로 희석한 각각의 추출물을 2 mL씩 넣고, 대조군은 5% 생리식염수 용액에 적절한 농도로 희석한 각 실시예 2의 시료 2 mL씩 넣고, 대조군은 5% DMSO 생리식염수용액 2 mL을 넣은 후, 각 패트리 디쉬에 멸균하고 48 ℃로 냉각한 트립틱소이 한천배지 및 포테이토덱스트로스 한천배지를 18 mL씩 첨가하여 교반 후 정치하여 응고시켰다.

이후 전배양시킨 각각의 시험균을 세균의 경우 최종농도 약 1 X 10⁶ CFU/mL 의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말하고, 효모의 경우 1 X 10⁵ CFU/mL, 사상균의 경우 약 1 X 10⁴ CFU/mL의 균농도로 각각의 페트리디쉬에 도말하였다. 각각의 페트리 디쉬는 세균은 37℃에서 24시간 배양하고 효모는 25℃에서 3일간 배양, 사상균은 25℃배양기에서 7일간 배양한 후 각 구획 안에 Colony 형성여부를 관찰하여 성장이 되지 않은 평판의 최소 시료 농도를 최소저해농도(MIC, Minimum inhibitory concentration)로 하며, 그 결과를 표 9에 나타내었다. 이때, 최소저해농도는 값이 작을 수록 항균효과가 높음을 의미한다.

균주	추출방법	최소저해농도(MIC, ug/mL)
S. aureus	실시예 5	50
P. aeruginosa	실시예 5	21
E. Coli	실시예 5	12
C. albicans	실시예 5	110
A. niger	실시예 5	140

표 9에 나타난 바와 같이, taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물은 4종의 세균, 효모, 사상균에 대하여 모두 월등한 항균력 효과를 나타내었다.

또한, taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물의 항균력 효과를 검정하기 위해 Paper disc method법에 의하여 다음와 같이 실험하였다. 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10 mL에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10 mL에 균액을 0.1 mL 접종하여 6시간배양한 후 평판배지 1개당 균액을 약 10⁷ cfu/mL이 되게 접종하여 멸균된 도발봉으로 균일하게 도말하였다. 그 후 멸균된 paper disc(6 mm, Satorius, Germany)를 고체 평판 배지에 올려놓은 다음 용매에 녹인 실시에 5의 시료를 0.05 ml/disk가 되도록 흡수시켜 배양하였다. Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , E. Coli는 37℃, 진균 종류인 Candida albicans , Aspergillus niger는 27℃에 각 각 24시간, 120시간 배양하여 disc 주위 투명존의 직경을 측정하였다. 비교군으로 항균활성이 강력하다고 알려진 methyl paraben을 사용하였으며, 결과는 하기 표 10에 나타내었다. 이 때, disc주위의 투명존은 해당 균주에 대해 증식억제 정도의 지표이며, 직경이 클수록 해당 균주에 대해 항균력 효과가 높음을 의미한다.

균주	추출방법	투명존 직경(mm)
S. aureus	시료 5	13
S. aureus	Methyl paraben	11
P. aeruginosa	시료 5	15
P. aeruginosa	Methyl paraben	12
E. Coli	시료 5	24
E. Coli	Methyl paraben	18
C. albicans	시료 5	17
C. albicans	Methyl paraben	13
A. niger	시료 5	25
A. niger	Methyl paraben	24

표 10에 나타난 바와 같이, taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물은 강력한 항균제로 알려진 Methyl paraben보다 4종의 세균, 효모, 사상균에 대해 더 강력한 항균활성을 나타내었다.

제형실시예 1 및 제형비교예 1

실시예 5에 따른 taxifolin-3-glucoside를 포함하는 작약 추출물을 함유하는 영양크림의 성분구성을 하기 표 11과 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	실시예 5	1.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 11의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 15 및 17의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 원료 1 내지 11 및 16을 80℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 15 및 17의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3,000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18를 투입하여 5분간 교반 시킨 후 실온으로 냉각하였다.

시험예 10: 제형 적용 미백효과 측정

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 미백효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 기미, 주근깨 및 색소 침착증을 갖고 있는 25세이상 여성 30명을 대상으로 상기 제형 실시예1 및 제형 비교예1의 영양크림을 12주간 사용하게 한 후 피부색의 변화를 Chromameter(CR-410, Minolta, Japan)를 이용하여 색의 밝기 변화 (ΔL)을 측정하였다. 총 30명의 평균값을 통하여 계산하였으며, 밝기 변화 값이 높을 수록 미백효과가 높음을 의미한다. 실험 결과는 하기 표 12에 나타내었다.

	평균값
피부색 밝기 변화(ΔL)	제형 실시예1	제형 비교예1
피부색 밝기 변화(ΔL)	6.19	0.22

상기 표 12와 같이 실시예 5의 시료가 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 5의 시료가 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 미백효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

시험예 11: 제형 적용 주름개선효과 측정

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대이상 여성 10명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름(crow feets)부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer(SV-600, C+K, Germany)를 이용하여 주름의 깊이(um)를 측정하고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
도포전	329 ± 13	326 ± 12
도포 12주 후	255 ± 11	320 ± 22
주름깊이 감소율(%)	22.5	1.8

상기 결과와 같이 실시예 5의 시료가 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 5의 시료가 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 주름개선효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

시험예 12: 제형 적용 아토피 개선효과 측정

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 아토피 개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부장벽 손상방법으로 아세톤을 도포하였다. 8∼12주령의 무모생쥐의 배부에 아세톤을 점적하여 경피수분손실량(TEWL; transepidermal water loss)이 4.0 g/m²/h에 도달하면 상기제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 도포하였다. TEWL은 C+K사(Cologne, Germany)의 증발계인 Tewameter 210으로 측정하였다. 도포 6시간 경과후에 TEWL을 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써 피부장벽기능이 회복되는 정도를 측정하였다. 효능평가에 사용된 회복율의 계산은 하기 식과 같이 계산하였고 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.

Br(Barrier Recovery)= (1-(B_t ₌₆- B_t ₌₀)/(B_t _=d - B_t ₌₀))*100

B_t ₌₆ : 피부장벽 손상후 6시간 경과후의 TEWL 측정값

B_t ₌₀ : 피부장벽 손상이전의 TEWL 측정값

B_t _=d : 피부장벽손상직후의 TEWL 측정값

회복율(%)	평균값
6시간 경과 회복율 (초기 TEWL 기준)	제형 실시예1	제형 비교예1
6시간 경과 회복율 (초기 TEWL 기준)	39	12

상기 결과와 같이 실시예 5의 시료가 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 5의 시료가 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 피부장벽 손상후 회복 효과가 상승하는 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.

[제형예 1] 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	실시예 5	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

[제형예 2] 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	실시예 5	1.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

[제형예 3] 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	실시예 5	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

[제형예 4] 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	실시예 5	1.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

[제형예 5] 팩

번호	성 분	함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	실시예 5	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 탁시폴린을 함유하는 작약추출물의 제조방법:
(a) 작약을 용매를 사용하여 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 추출물을 감압건조하여 농축시켜 1차 농축된 파우더를 수득하는 단계;
(c) 상기 1차 농축된 파우더를 물에 용해시킨 다음, 유기용매를 첨가하여 극성에 따라 분획한 후, 용매를 제거하고 농축시켜 2차 농축된 파우더를 수득하는 단계;
(d) 상기 2차 농축된 파우더를 수용액에 용해시킨 다음, 색소 및 클로로필을 칼럼을 사용하여 제거하는 단계;
(e) 상기 색소 및 클로로필이 제거된 용액을 초저온 또는 초고압 상태에서 재결정화시키는 단계; 및
(f) 상기 재결정화된 추출물을 분무건조 또는 동결건조하여 taxifolin-3-glucoside를 함유하는 파우더 형태의 작약추출물을 수득하는 단계.
제1항에 있어서, (a) 단계의 용매는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종이상의 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (c) 단계의 분획에 사용되는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, (c) 단계의 분획은 헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순서로 분획하여 최종적으로 에틸아세테이트층 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 컬럼은 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트 DAX 레진 및 다이아이온 HP-10, 다이아이온 HP-20, 다이아이온 HP-30, 다이아이온 HP-40 및 다이아이온 HP-50 레진으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 레진을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 초저온 재결정 공정은 -300 ∼ -30℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 초고압 재결정 공정은 50~800 MPa에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 기능을 가지는 기능성 화장료 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 탁시폴린을 함유하는 작약 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름완화, 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화, 항염, 항균 및 아토피 개선으로 구성된 군에서 선택되는 기능을 가지는 피부외용제 조성물.