CN116421525A - 一种芍药根提取物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种芍药根提取物及其制备方法,属于植物提取技术领域。将白芍根粉碎酶解后,沸腾提取,醇沉,制得芍药多糖,滤渣超临界流体萃取,加入丁二醇,萃取液进行二级分子蒸馏,得到蒸馏产物,将固体和未蒸馏出的物质与碳源、氮源、维生素、无机盐加入水,制得培养基,接种活化的白参菌、富硒酵母菌发酵培养,制得发酵产物,与芍药多糖、蒸馏产物混合均匀,制得芍药根提取物。本发明制得的芍药根提取物含有丰富的活性组分,可用于制备美白、抗氧化、抗辐射、保湿、提高皮肤弹性、促进皮肤细胞损伤修复的产品。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域,具体涉及一种芍药根提取物及其制备方法。
背景技术
人体面部皮肤薄而柔软,富于弹性,含有较多的皮脂腺、汗腺和毛囊、腮腺管以及丰富的血管运动神经,受到外界刺激时反应极其灵敏。尤其是现今社会,许多职业女性每天在电脑前工作的时间一般都在10h左右,导致许多皮肤问题,如:肤色暗沉、干燥、容易产生细纹等等,加之工作压力大,没有时间和精力进行肌肤保养,加速了肌肤的老化。对于面部皮肤护理而言,滋养美白一直是女性的共同追求,每个女人都希望自己的肌肤赛雪欺霜、白里透红。早期人们使用各类谷物、中药、水果鲜花、鲜奶以及铅汞等方式来达到美白效果。上世纪八、九十年代真正意义上的美容护肤品开始在我国大街小巷普及,那时候的人们注重的是保湿。随着生活水平的日益提高,敏感肌、痘痘肌成为困扰当代年轻人最多的肌肤问题,然而,这一类人群对护肤品的要求除了需要具有抗炎、抗菌、保湿和抗氧化功效外,更要求天然无刺激来避免产生更多的肌肤问题。
芍药根是毛茛科芍药亚科芍药属多年生草本植物的干燥根。芍药根含有苷类化合物、萜类化合物、黄酮类化合物、酚类化合物和糖类化合物等多种药物活性成分,具有扩张血管、降压镇痛、清热解痉等作用,具有较高的药用价值。现有技术中制备芍药根提取物时普遍以有机溶剂(例如乙醇)或是水为提取剂,进行回流提取,但这些方法存在有效活性成分损失较大,能耗高,或是,导致终产品中存在有机溶剂残留刺激皮肤等缺点。
中国专利申请CN113616565A公开了一种芍药根提取物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用,包括如下步骤:新鲜芍药根经压榨,收集压榨液,制得芍药根提取物,压榨的过程中不添加溶剂,压榨的压力为130-180MPa,该过程虽然简单,但对芍药根的利用率不高,大部分活性物质没有被提取出来,造成了原料的浪费。
中国专利申请CN112807257A公开了一种芍药根提取物的制备方法,包括以下步骤:将新鲜芍药根切片、烘干和粉碎,得芍药根原料;将所述芍药根原料用乙醇溶液浸泡,同时进行超声提取,离心,取上清液作为提取液;采用减压蒸馏的方式去除所述提取液中的乙醇,得芍药根提取物;将所述芍药根提取物通过大孔吸附树脂,用浓度依次递增的洗脱剂依次冲洗所述大孔吸附树脂,得洗脱液;采用减压蒸馏的方式去除所述洗脱液中的所述洗脱剂,得提纯后的芍药根提取物,该方法能够提高提取率,而且最大限度的保护有效成分不被破坏,但是制备过程对设备要求高,其工艺难度大,制备过程复杂。
发明内容
本发明的目的在于提出一种芍药根提取物及其制备方法,含有丰富的活性组分,包括芍药苷、黄酮类化合物、三萜化合物、酚酸化合物、活性多糖、活性肽等,提取率高,对于弹性蛋白酶、透明质酸酶、酪氨酸酶均有很好的抑制效果,抗氧化效果佳,对于紫外线损伤的细胞修复有很好的作用,可用于制备美白、抗氧化、抗辐射、保湿、提高皮肤弹性、促进皮肤细胞损伤修复的产品。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供一种芍药根提取物的制备方法,将白芍根粉碎,加水酶解后,沸腾提取,醇沉,过滤干燥,制得芍药多糖,滤渣超临界流体萃取,加入丁二醇,固体留用,萃取液进行二级分子蒸馏,得到蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用,将固体和未蒸馏出的物质与碳源、氮源、维生素组合物、无机盐加入水,灭菌制得培养基,接种活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液发酵培养,制得发酵产物,与芍药多糖、蒸馏产物混合均匀,制得芍药根提取物。
作为本发明的进一步改进,包括以下步骤:
S1.酶解:将白芍根洗净,粉碎,制得白芍根粉,加入水中,加入复合酶,酶解,制得酶解产物;
S2.水提取:将步骤S1制得的酶解产物加热至沸,提取,过滤,重复加热至沸提取,过滤,合并滤液,滤渣留用,滤液浓缩,加入乙醇沉淀,过滤,固体干燥,制得芍药多糖,滤液回收乙醇后,干燥,制得提取物;
S3.超临界流体萃取:将步骤S2中的滤渣干燥,和步骤S2制得提取物混合均匀,进行超临界流体萃取,乙醇为夹带剂,回收乙醇,加入1,3-丁二醇,得到萃取液,固体留用;
S4.分子蒸馏:将步骤S3中的萃取液加入分子蒸馏装置中,加热至第一温度蒸馏,去除一级蒸馏产物,提高至第二温度蒸馏,收集二级蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用;
S5.培养基的制备:将步骤S3中的固体、步骤S4中未蒸馏出的物质、碳源、氮源、维生素组合物、无机盐加入水中,调节培养基pH值,搅拌混合均匀,灭菌,制得培养基;
S6.发酵:将活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液接种至步骤S5中的培养基中,发酵培养第一时间段,加入增抗组合物,继续发酵第二时间段,过滤,灭菌,加入活性炭脱色,制得发酵产物;
S7.芍药根提取物的制备:将步骤S2制得的芍药多糖、步骤S4制得的二级蒸馏产物、步骤S6制得的发酵产物混合均匀,制得芍药根提取物。
作为本发明的进一步改进,步骤S1中所述白芍根粉和水的固液比为1:5-10g/mL,所述复合酶选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、ɑ-淀粉酶、β-淀粉酶中的至少两种,优选地,为纤维素酶和果胶酶,质量比10-12:5,所述酶解的条件为40-50℃,时间为2-3h。
作为本发明的进一步改进,步骤S2中所述提取的时间为2-3h,所述重复加热至沸提取的时间为1-2h,加入乙醇至体系乙醇含量为60-70%,所述沉淀时间为5-7h;步骤S3中所述滤渣和提取物的质量比为10-15:3-5;所述超临界流体萃取条件为:萃取压力:16-32MPa,萃取温度:35-45℃,CO2流量:5-10L/h,萃取时间:1-3h,所述夹带剂的添加量为2-3wt%。
作为本发明的进一步改进,步骤S4中所述第一温度为65-75℃,所述第二温度为95-105℃,所述蒸馏冷凝温度为3-7℃,刮膜转速为150-250r/min,进料流量为2-4mL/min,系统真空度为50-70Pa。
作为本发明的进一步改进,步骤S5中所述固体、未蒸馏出的物质、碳源、氮源、维生素组合物、无机盐的质量比为10-20:7-12:12-15:7-10:0.5-1:2-3,所述碳源选自糖蜜、菊粉、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的至少一种;所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、鱼粉中的至少一种;所述维生素组合物选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素A、维生素K、维生素D1、维生素D3、叶酸、维生素E中的至少两种;优选地,为维生素B1和维生素B12的混合物,质量比为5-7:2;所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化亚铁、硫酸亚铁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的至少一种,所述调节培养基pH值至6.8-7.2。
作为本发明的进一步改进,步骤S6中所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的制备方法为将白参菌、富硒酵母菌分别接种至高氏培养基中,37-40℃,50-70r/min,活化培养12-18h,制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液;所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的接种量分别为1.5-2%和1-2%,所述第一时间段为48-72h,所述第二时间段为48-72h,所述发酵培养的条件为37-40℃,50-70r/min;所述增抗组合物为维生素B12和氯化钙的混合物,质量比为5-7:4。
作为本发明的进一步改进,步骤S7中所述芍药多糖、二级蒸馏产物、发酵产物的质量比为7-10:5-7:10-15。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的芍药根提取物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的芍药根提取物在制备美白、抗氧化、抗辐射、保湿、提高皮肤弹性、促进皮肤细胞损伤修复的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果:
本发明中,白芍根经过复合酶酶解后,在纤维素酶和果胶酶的协同作用下,能够促进芍药根细胞壁分解,细胞内胶质酶解,从而促进细胞内容物溶出,大量的多糖、黄酮类物质、皂苷类物质、萜类化合物、酚类化合物进入溶液中,经过水沸腾提取,使得大部分多糖溶于水中,乙醇沉淀制得芍药多糖,该芍药多糖提取率高,在酶解作用下获得小分子的活性多糖,与未经过酶解直接水提取得到的多糖相比,大大提高了抗氧化活性。
进一步,将制得的滤渣和醇沉过滤后的滤液干燥得到的提取物混合,进行超临界流体萃取,超临界流体萃取具有萃取效率高、无溶剂残留、操作条件温和等优点,克服了传统萃取工艺的弊端,有效保持了天然活性物质的特性,被称为“绿色萃取技术”,但超临界CO2流体萃取白芍根油成分复杂,不仅含有挥发性的精油,还含有非挥发性的其他物质,需要对其进一步分离纯化,分子蒸馏利用不同物质分子平均自由程及挥发性的差别而实现高效分离,在高真空远低于沸点的温度下进行的,物料受热时间短且分离效果好,特别适用于浓缩、纯化或分离分子量高、沸点高、粘度高的物质及热稳定性差的有机混合物,与普通真空蒸馏相比,分子蒸馏能避免热分解,精准精馏,减少了重要成分的损失,极大的保留了原活性物质的分子结构不被分解。采用超临界CO2流体萃取技术联合分子蒸馏技术能较好的保持白芍根挥发性成分稳定,提升产品品质,同时,分子蒸馏技术截取了白芍根中三萜类物质、小分子酚酸,如没食子酸等组分,促进了这些活性组分在萃取液中的分离。
将经过超临界流体萃取后的固体和分子蒸馏未蒸馏出的物质与碳源、氮源、维生素组合物、无机盐加入水中,制得培养基,添加的维生素组合物为维生素B1和维生素B12的混合物,能明显提高发酵菌的产率,加快其进入稳定期,大大提高了产率。
在培养基中接种白参菌、富硒酵母菌进行发酵,白参菌能产生多种酶,催化基质中纤维素产生阿魏酸,其中含有纤维素酶,并能产生苹果酸等,发酵液中含有氨基酸、多肽、蛋白质、单糖、还原糖与多糖类、有机酸、皂苷类物质、黄酮类物质和油脂等化学成分,使得芍药中活性组分的提取率大大提高,同时,在富硒酵母的作用下,使得制得的发酵产物含有部分有机硒,进一步提高了抗氧化活性,同时,制得的发酵产物对于弹性蛋白酶、透明质酸酶、酪氨酸酶均有很好的抑制效果。
在发酵过程中添加增抗组合物,包括维生素B12和氯化钙,维生素B12能明显提高发酵菌的抗性,提高产量,氯化钙能延长发酵菌的稳定期,两者协同作用下,能明显提高产物的收率,大大提高了发酵产物的抗氧化、抑制酶活性,同时,制得的发酵产物对于细胞修复有很好的作用。
在制备芍药根提取物中还需要添加丁二醇,这是因为在超临界萃取过程加了夹带剂乙醇,回收乙醇时大部分乙醇蒸出,由于中草药里的活性物质量很少,少了乙醇后会产生类似渣的沉淀,加入丁二醇可以取代乙醇的作用,而且丁二醇的挥发点比较高,可以通过二级分餾,与活性物质共存留下,最后混合时也可以有抑制细菌存在的作用。
本发明制得的芍药根提取物含有丰富的活性组分,包括芍药苷、黄酮类化合物、三萜化合物、酚酸化合物、活性多糖、活性肽等,提取率高,对于弹性蛋白酶、透明质酸酶、酪氨酸酶均有很好的抑制效果,抗氧化效果佳,对于紫外线损伤的细胞修复有很好的作用,可用于制备美白、抗氧化、抗辐射、保湿、提高皮肤弹性、促进皮肤细胞损伤修复的产品。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
白芍根购于。
纤维素酶,SDG-2425,1万U/g,果胶酶,SDG-2408,2.5万U/g,购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。
白参菌,购于湖北千宝食用菌有限公司;富硒酵母菌,购于安琪酵母股份有限公司。
实施例1
本实施例提供一种芍药根提取物的制备方法,包括以下步骤:
S1.酶解:将白芍根洗净,粉碎,制得白芍根粉,将100重量份加入水中,所述白芍根粉和水的固液比为1:5g/mL,加入2重量份复合酶,所述复合酶为纤维素酶和果胶酶,质量比10:5,40℃酶解2h,制得酶解产物;
S2.水提取:将步骤S1制得的酶解产物加热至沸,提取2h,过滤,重复加热至沸提取1h,过滤,合并滤液,滤渣留用,滤液浓缩,加入乙醇至体系乙醇含量为60%,沉淀5h,过滤,固体干燥,制得芍药多糖,滤液回收乙醇后,干燥,制得提取物;
S3.超临界流体萃取:将10重量份步骤S2中的滤渣干燥,和3重量份步骤S2制得提取物混合均匀,进行超临界流体萃取,乙醇为夹带剂,回收乙醇,向10重量份产物中加入5重量份1,3-丁二醇,得到萃取液,固体留用;
所述超临界流体萃取条件为:萃取压力:16MPa,萃取温度:35℃,CO2流量:5L/h,萃取时间:1h,所述夹带剂的添加量为2wt%;
S4.分子蒸馏:将步骤S3中的萃取液加入分子蒸馏装置中,加热至65℃蒸馏,去除一级蒸馏产物,提高至95℃蒸馏,收集二级蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用;
所述蒸馏冷凝温度为3℃,刮膜转速为150r/min,进料流量为2mL/min,系统真空度为50Pa;
S5.培养基的制备:将10重量份步骤S3中的固体、7重量份步骤S4中未蒸馏出的物质、10重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、6重量份鱼粉、1重量份硝酸铵、0.5重量份维生素组合物、1.5重量份氯化钠、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.1重量份硫酸锌、加入500重量份水中,调节培养基pH值至6.8,搅拌混合20min,紫外线灭菌,制得培养基;
所述维生素组合物为维生素B1和维生素B12的混合物,质量比为5:2。
S6.发酵:将活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液接种至步骤S5中的培养基中,所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的接种量分别为1.5%和1%,37℃,50r/min,发酵培养48h,加入增抗组合物,所述增抗组合物为维生素B12和氯化钙的混合物,质量比为5:4,所述增抗组合物的添加量为2g/L,继续发酵48h,过滤,灭菌,加入5g/L活性炭,搅拌脱色,过滤,冷冻干燥,制得发酵产物;
所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的制备方法为将白参菌、富硒酵母菌分别接种至高氏培养基中,3℃,50r/min,活化培养12h,制得含菌量为108cfu/mL的菌种种子液;
S7.芍药根提取物的制备:将7重量份步骤S2制得的芍药多糖、5重量份步骤S4制得的二级蒸馏产物、10重量份步骤S6制得的发酵产物,搅拌混合20min,制得芍药根提取物。
实施例2
本实施例提供一种芍药根提取物的制备方法,包括以下步骤:
S1.酶解:将白芍根洗净,粉碎,制得白芍根粉,将100重量份加入水中,所述白芍根粉和水的固液比为1:10g/mL,加入2重量份复合酶,所述复合酶为纤维素酶和果胶酶,质量比12:5,50℃酶解3h,制得酶解产物;
S2.水提取:将步骤S1制得的酶解产物加热至沸,提取3h,过滤,重复加热至沸提取2h,过滤,合并滤液,滤渣留用,滤液浓缩,加入乙醇至体系乙醇含量为70%,沉淀7h,过滤,固体干燥,制得芍药多糖,滤液回收乙醇后,干燥,制得提取物;
S3.超临界流体萃取:将15重量份步骤S2中的滤渣干燥,和5重量份步骤S2制得提取物混合均匀,进行超临界流体萃取,乙醇为夹带剂,回收乙醇,向10重量份产物中加入5重量份1,3-丁二醇,得到萃取液,固体留用;
所述超临界流体萃取条件为:萃取压力:32MPa,萃取温度:45℃,CO2流量:10L/h,萃取时间:3h,所述夹带剂的添加量为3wt%;
S4.分子蒸馏:将步骤S3中的萃取液加入分子蒸馏装置中,加热至75℃蒸馏,去除一级蒸馏产物,提高至105℃蒸馏,收集二级蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用;
所述蒸馏冷凝温度为7℃,刮膜转速为250r/min,进料流量为4mL/min,系统真空度为70Pa;
S5.培养基的制备:将20重量份步骤S3中的固体、12重量份步骤S4中未蒸馏出的物质、10重量份葡萄糖、3重量份蔗糖、2重量份果糖、10重量份尿素、1重量份维生素组合物、1重量份氯化钾、1重量份氯化钙、0.5重量份硫酸锌、0.5重量份硫酸铜加入500重量份水中,调节培养基pH值至7.2,搅拌混合20min,紫外线灭菌,制得培养基;
所述维生素组合物为维生素B1和维生素B12的混合物,质量比为7:2。
S6.发酵:将活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液接种至步骤S5中的培养基中,所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的接种量分别为2%和2%,40℃,70r/min,发酵培养72h,加入增抗组合物,所述增抗组合物为维生素B12和氯化钙的混合物,质量比为7:4,所述增抗组合物的添加量为2g/L,继续发酵72h,过滤,灭菌,加入5g/L活性炭,搅拌脱色,过滤,冷冻干燥制得发酵产物;
所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的制备方法为将白参菌、富硒酵母菌分别接种至高氏培养基中,40℃,70r/min,活化培养18h,制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S7.芍药根提取物的制备:将10重量份步骤S2制得的芍药多糖、7重量份步骤S4制得的二级蒸馏产物、15重量份步骤S6制得的发酵产物,搅拌混合20min,制得芍药根提取物。
实施例3
本实施例提供一种芍药根提取物的制备方法,包括以下步骤:
S1.酶解:将白芍根洗净,粉碎,制得白芍根粉,将100重量份加入水中,所述白芍根粉和水的固液比为1:7g/mL,加入2重量份复合酶,所述复合酶为纤维素酶和果胶酶,质量比11:5,45℃酶解2.5h,制得酶解产物;
S2.水提取:将步骤S1制得的酶解产物加热至沸,提取2.5h,过滤,重复加热至沸提取1.5h,过滤,合并滤液,滤渣留用,滤液浓缩,加入乙醇至体系乙醇含量为65%,沉淀6h,过滤,固体干燥,制得芍药多糖,滤液回收乙醇后,干燥,制得提取物;
S3.超临界流体萃取:将12重量份步骤S2中的滤渣干燥,和4重量份步骤S2制得提取物混合均匀,进行超临界流体萃取,乙醇为夹带剂,回收乙醇,向10重量份产物中加入5重量份1,3-丁二醇,得到萃取液,固体留用;
所述超临界流体萃取条件为:萃取压力:25MPa,萃取温度:40℃,CO2流量:7L/h,萃取时间:2h,所述夹带剂的添加量为2.5wt%;
S4.分子蒸馏:将步骤S3中的萃取液加入分子蒸馏装置中,加热至70℃蒸馏,去除一级蒸馏产物,提高至100℃蒸馏,收集二级蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用;
所述蒸馏冷凝温度为5℃,刮膜转速为200r/min,进料流量为3mL/min,系统真空度为60Pa;
S5.培养基的制备:将15重量份步骤S3中的固体、10重量份步骤S4中未蒸馏出的物质、13.5重量份碳源、7重量份尿素、1.5重量份硝酸铵、0.7重量份维生素组合物、1重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份氯化镁、0.1重量份氯化铁、0.1重量份硫酸锌、0.1重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化亚铁加入500重量份水中,调节培养基pH值至7,搅拌混合20min,紫外线灭菌,制得培养基;
所述维生素组合物为维生素B1和维生素B12的混合物,质量比为6:2。
S6.发酵:将活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液接种至步骤S5中的培养基中,所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的接种量分别为1.7%和1.5%,38℃,60r/min,发酵培养56h,加入增抗组合物,所述增抗组合物为维生素B12和氯化钙的混合物,质量比为6:4,所述增抗组合物的添加量为2g/L,继续发酵56h,过滤,灭菌,加入5g/L活性炭,搅拌脱色,过滤,冷冻干燥,制得发酵产物;
所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的制备方法为将白参菌、富硒酵母菌分别接种至高氏培养基中,38℃,60r/min,活化培养15h,制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液;
S7.芍药根提取物的制备:将8.5重量份步骤S2制得的芍药多糖、6重量份步骤S4制得的二级蒸馏产物、12重量份步骤S6制得的发酵产物,搅拌混合20min,制得芍药根提取物。
实施例4
与实施例3相比,不同之处在于,所述复合酶为单一的纤维素酶。
实施例5
与实施例3相比,不同之处在于,所述复合酶为单一的果胶酶。
实施例6
与实施例3相比,不同之处在于,所述维生素组合物为单一的维生素B1。
实施例7
与实施例3相比,不同之处在于,所述维生素组合物为单一的维生素B12。
实施例8
与实施例3相比,不同之处在于,所述增抗组合物为单一的维生素B12。
实施例9
与实施例3相比,不同之处在于,所述增抗组合物为单一的氯化钙。
对比例1
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S1。
对比例2
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S2。
对比例3
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S3。
对比例4
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S4中仅加热至70℃蒸馏。
对比例5
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S4中仅加热至100℃蒸馏。
对比例6
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S4。
对比例7
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未接种白参菌,富硒酵母菌的菌种种子液的接种量为3.2%。
对比例8
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未接种富硒酵母菌,白参菌的接种量为3.2%。
对比例9
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未加入增抗组合物,发酵时间为112h。
对比例10
与实施例3相比,不同之处在于,未进行步骤S5和S6。
测试例1抗氧化性测试
用超纯水将实施例1-9和对比例1-10制得的芍药根提取物稀释成0.05g/mL的样品溶液,按A1:100μL水+100μL DPPH自由基乙醇溶液(浓度为0.1mmol/L);A2:100μL样品溶液+100μL DPPH自由基溶液;A3:100μL样品溶液+100μL无水乙醇,加入到96孔板,混匀后于室温避光反应30min,于517nm波长处测定吸光度。按公式(1)计算样品对DPPH自由基的清除率(%)。以维生素C为阳性对照。
DPPH自由基的清除率(%)=A1(A2-A3)/A1×100%
式中:A1——溶剂本底吸光值;A2——样品溶液吸光值;A3——样品溶液空白吸光值
结果见表1。
表1
由上表可知,本发明实施例1-3制得的芍药根提取物具有较好的抗氧化性能。
测试例2
用超纯水将实施例1-9和对比例1-10制得的芍药根提取物稀释成0.05g/mL的样品溶液。
1、酪氨酸酶抑制实验
参考《T/SHRH015-2018化妆品-酪氨酸酶抑制实验方法》并进行优化,用pH=6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸(PBS)缓冲液将样品溶液,按照A:1mL样品溶液+0.5mL100u/mL酪氨酸酶溶液;B:1mL样品溶液+0.5mL PBS缓冲液;C:1mL PBS缓冲液+0.5mL 100U/mL酪氨酸酶(购于美国Worthington公司)溶液;D:1.5mL PBS缓冲液加入10mL离心管中,混匀,于37℃避光孵育10min。依次在各管中加入1.0mg/mL的左旋多巴(购于Aladdin公司)溶液2mL,反应5min,即刻在475nm处测定吸光值。酪氨酸酶抑制率(%)按下式计算:
酪氨酸酶抑制率(%)=[1-(A-B)/(C-D)]×100%
式中:A——为样品溶液与酪氨酸酶反应后溶液吸光值;B——不含酪氨酸酶样品溶液本底吸光值;C——未加样品溶液时酪氨酸酶和多巴反应的吸光值;D——溶剂本底吸光值。
2、猪胰弹性蛋白酶抑制实验
参照文献:姚亚红,等.黄芩素的酶解提取工艺及其抑制弹性蛋白酶活性研究[J].光谱实验室,2009,26(4):993-996。绘制猪胰弹性蛋白酶与刚果红-弹性蛋白反应的标准曲线。
取2mg/mL猪胰弹性蛋白酶(30U/mg,购于合肥博美生物科技有限责任公司)溶液2mL,加入样品溶液2mL,充分涡旋混匀,在37℃、500r/min摇床振荡25min,立即加入pH=6.0的0.5mol/L磷酸盐缓冲液5mL,混匀,取混匀液适量至2mL离心管内,在5000r/min下离心10min,精密吸取上清液200μL至96孔板内,在波长495nm处测定吸光度。以底物加酶溶液为空白对照组,底物加酶和样品溶液为酶抑制组,底物加样品溶液不加酶溶液作扣背景用。每组均设3复孔。
猪胰弹性蛋白酶抑制率(%)=[1–(An–An′)/(A0–A0′)]×100%
式中,An为仅加样品溶液的吸光度,An′为加样品溶液不加酶的吸光度,A0为加酶不加样品溶液的吸光度,A0′为仅加底物不加样品溶液和酶的吸光度。
3、透明质酸酶抑制实验
将25μL样品溶液与25μL 30U/mL的透明质酸酶溶液混匀,37℃孵育10min。加入50μL 0.04wt%的透明质酸溶液(溶解于0.15mg/mL NaCl-0.01mg/mL磷酸缓冲液中,pH=5.3),37℃孵育45min。加入900μL牛血清白蛋白(2.5mg/mL),室温静置10min,于540nm处测定吸光度。以超纯水和单宁酸分别作为阴性、阳性对照,所有试验测定3次。按下式计算透明质酸酶抑制率(%)。
透明质酸酶抑制率(%)=[1–(An–An′)/(A0–A0′)]×100%
式中,An为仅加样品溶液的吸光度,An′为加样品溶液不加酶的吸光度,A0为加酶不加样品溶液的吸光度,A0′为仅加底物不加样品溶液和酶的吸光度。
结果见表2。
表2
由上表可知,本发明实施例1-3制得的芍药根提取物具有较好的酪氨酸酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶抑制效果,对于增加皮肤弹性,提高皮肤保湿性能,美白具有明显的效果。
测试例3
制备含有芍药根提取物的精华:
原料组成(重量份):将本发明实施例1-9和对比例1-10制得的芍药根提取物2份、甘油4份、1,2-丁二醇1份、卡波姆0.5份、尿囊素0.1份、烟酰胺0.1份、去离子水50份、甘草酸二钾0.5份、霍霍巴油2.5份。
制备方法:
S1.将甘油、1,2-丁二醇、甘草酸二钾加入去离子水中,加热至55℃,搅拌混合20min,制得A相;
S2.将烟酰胺、尿囊素、芍药根提取物、霍霍巴油加热至65℃,搅拌混合20min,制得B相;
S3.将A相加入B相中,加入卡波姆,12000r/min乳化12min,出料,制得含有芍药根提取物的精华。
选择190位皮肤健康的女性受测者,分为19组,分别为实施例1-9和对比例1-10组,每组10人,受测者左半脸涂抹制备的含有芍药根提取物的精华为实验组,另半脸不涂抹任何物质为空白组。实验为期8周,分别于第1周、第4周及第8周由各项仪器进行受测者皮肤的检测分析,评估化妆水对于皮肤水分含量、皮肤弹性、细纹、皮肤粗糙度、皮肤黑色素含量的改善功效,第1周、第4周及第8周三次测试的平均值。
1、皮肤水分含量变化反映在测试周期内,实验区域皮肤水分含量随时间变化规律。其值越大,皮肤水分含量越大,保湿效果越好,反之,保湿效果越差。
皮肤水分含量差值(%)==[使用产品后水分含量-使用产品前水分含量]/使用产品前水分含量×100%
2、皮肤弹性变化反映在测试周期内,实验区域皮肤弹性随时间变化规律。其值越大,皮肤弹性越大,反之,皮肤弹性越小。
皮肤弹性差值(%)=[使用产品后皮肤弹性-使用产品前皮肤弹性]/使用产品前皮肤弹性×100%
3、细纹变化反映在测试周期内,实验区域皮肤细纹量随时间变化规律。其值越大,细纹量越大,反之,细纹量越小。
细纹差值(%)=[使用产品后皮肤细纹量-使用产品前皮肤细纹量]/使用产品前皮肤细纹量×100%
4、皮肤粗糙度变化反映在测试周期内,实验区域皮肤粗糙度随时间变化规律。其值越大,皮肤粗糙度越大,反之,皮肤粗糙度越小,皮肤越光滑细嫩。
皮肤粗糙度差值(%)=[使用产品后皮肤粗糙度-使用产品前皮肤粗糙度]/使用产品前皮肤粗糙度×100%
5、皮肤黑色素含量变化反映在测试周期内,实验区域皮肤黑色素含量随时间变化规律。其值越大,皮肤黑色素含量越大,反之,皮肤黑色素含量小,皮肤越白净。
黑色素含量差值(%)=[使用产品后黑色素含量-使用产品前黑色素含量]/使用产品前黑色素含量×100%
结果见表3。
表3
由上表可知,本发明实施例1-3制得的芍药根提取物制得的含芍药根提取物精华具有较好的祛皱、淡化细纹、改善皮肤、美白的效果。
实施例4、5与实施例3相比,所述复合酶为单一的纤维素酶或果胶酶。对比例1与实施例3相比,未进行步骤S1。抗氧化性能下降,抑制酪氨酸酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶效果均明显下降,制得的含芍药根提取物的精华祛皱、淡化细纹、改善皮肤、美白效果减弱。本发明中白芍根经过复合酶酶解后,在纤维素酶和果胶酶的协同作用下,能够促进芍药根细胞壁分解,细胞内胶质酶解,从而促进细胞内容物溶出,大量的多糖、黄酮类物质、皂苷类物质、萜类化合物、酚类化合物进入溶液中,大大提高了产物的活性。
实施例6、7与实施例3相比,所述维生素组合物为单一的维生素B1或维生素B12。抗氧化性能下降,抑制酪氨酸酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶效果均下降,制得的含芍药根提取物的精华祛皱、淡化细纹、改善皮肤、美白效果减弱。本发明将经过超临界流体萃取后的固体和分子蒸馏未蒸馏出的物质与碳源、氮源、维生素组合物、无机盐加入水中,制得培养基,添加的维生素组合物为维生素B1和维生素B12的混合物,能明显提高发酵菌的产率,加快其进入稳定期,大大提高了产率。
实施例8、9与实施例3相比,所述增抗组合物为单一的维生素B12或氯化钙。对比例9与实施例3相比,步骤S6中未加入增抗组合物,发酵时间为112h。抗氧化性能下降,抑制酪氨酸酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶效果均下降。本发明在发酵过程中添加增抗组合物,包括维生素B12和氯化钙,维生素B12能明显提高发酵菌的抗性,提高产量,氯化钙能延长发酵菌的稳定期,两者协同作用下,能明显提高产物的收率,大大提高了发酵产物的抗氧化、抑制酶活性,同时,制得的发酵产物对于细胞修复有很好的作用。
对比例2与实施例3相比,未进行步骤S2。抗氧化性能下降,抑制弹性蛋白酶效果均下降,制得的含芍药根提取物的精华祛皱、淡化细纹、改善皮肤效果减弱。本发明酶解产物经过水沸腾提取,使得大部分多糖溶于水中,乙醇沉淀制得芍药多糖,该芍药多糖提取率高,在酶解作用下获得小分子的活性多糖,与未经过酶解直接水提取得到的多糖相比,大大提高了抗氧化活性。
对比例3与实施例3相比,未进行步骤S3。抑制酪氨酸酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶效果均明显下降,制得的含芍药根提取物的精华祛皱、淡化细纹、改善皮肤、美白效果减弱。本发明将制得的滤渣和醇沉过滤后的滤液干燥得到的提取物混合,进行超临界流体萃取,超临界流体萃取具有萃取效率高、无溶剂残留、操作条件温和等优点,克服了传统萃取工艺的弊端,有效保持了天然活性物质的特性,被称为“绿色萃取技术”,但超临界CO2流体萃取白芍根油成分复杂,不仅含有挥发性的精油,还含有非挥发性的其他物质,需要对其进一步分离纯化。
对比例4、5与实施例3相比,步骤S4中仅加热至70℃蒸馏或仅加热至100℃蒸馏。对比例6与实施例3相比,未进行步骤S4。抗氧化性能,抑制酪氨酸酶、透明质酸酶效果均下降,制得的含芍药根提取物的精华改善皮肤、保持水分、美白效果减弱。本发明分子蒸馏利用不同物质分子平均自由程及挥发性的差别而实现高效分离,在高真空远低于沸点的温度下进行的,物料受热时间短且分离效果好,特别适用于浓缩、纯化或分离分子量高、沸点高、粘度高的物质及热稳定性差的有机混合物,与普通真空蒸馏相比,分子蒸馏能避免热分解,精准精馏,减少了重要成分的损失,极大的保留了原活性物质的分子结构不被分解。采用超临界CO2流体萃取技术联合分子蒸馏技术能较好的保持白芍根挥发性成分稳定,提升产品品质,同时,分子蒸馏技术截取了白芍根中三萜类物质、小分子酚酸,如没食子酸等组分,促进了这些活性组分在萃取液中的分离。
对比例7、8与实施例3相比,步骤S6中未接种白参菌或富硒酵母菌。对比例10与实施例3相比,未进行步骤S5和S6。抗氧化性能、抑制酪氨酸酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶效果均明显下降,制得的含芍药根提取物的精华祛皱、淡化细纹、改善皮肤、美白效果减弱。本发明在培养基中接种白参菌、富硒酵母菌进行发酵,白参菌能产生多种酶,催化基质中纤维素产生阿魏酸,其中含有纤维素酶,并能产生苹果酸等,发酵液中含有氨基酸、多肽、蛋白质、单糖、还原糖与多糖类、有机酸、皂苷类物质、黄酮类物质和油脂等化学成分,使得芍药中活性组分的提取率大大提高,同时,在富硒酵母的作用下,使得制得的发酵产物含有部分有机硒,进一步提高了抗氧化活性,同时,制得的发酵产物对于弹性蛋白酶、透明质酸酶、酪氨酸酶均有很好的抑制效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种芍药根提取物的制备方法,其特征在于,将白芍根粉碎,加水酶解后,沸腾提取,醇沉,过滤干燥,制得芍药多糖,滤渣超临界流体萃取,加入丁二醇,固体留用,萃取液进行二级分子蒸馏,得到蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用,将固体和未蒸馏出的物质与碳源、氮源、维生素组合物、无机盐加入水,灭菌制得培养基,接种活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液发酵培养,制得发酵产物,与芍药多糖、蒸馏产物混合均匀,制得芍药根提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.酶解:将白芍根洗净,粉碎,制得白芍根粉,加入水中,加入复合酶,酶解,制得酶解产物;
S2.水提取:将步骤S1制得的酶解产物加热至沸,提取,过滤,重复加热至沸提取,过滤,合并滤液,滤渣留用,滤液浓缩,加入乙醇沉淀,过滤,固体干燥,制得芍药多糖,滤液回收乙醇后,干燥,制得提取物;
S3.超临界流体萃取:将步骤S2中的滤渣干燥,和步骤S2制得提取物混合均匀,进行超临界流体萃取,乙醇为夹带剂,回收乙醇,加入1,3-丁二醇,得到萃取液,固体留用;
S4.分子蒸馏:将步骤S3中的萃取液加入分子蒸馏装置中,加热至第一温度蒸馏,去除一级蒸馏产物,提高至第二温度蒸馏,收集二级蒸馏产物,未蒸馏出的物质留用;
S5.培养基的制备:将步骤S3中的固体、步骤S4中未蒸馏出的物质、碳源、氮源、维生素组合物、无机盐加入水中,调节培养基pH值,搅拌混合均匀,灭菌,制得培养基;
S6.发酵:将活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液接种至步骤S5中的培养基中,发酵培养第一时间段,加入增抗组合物,继续发酵第二时间段,过滤,灭菌,加入活性炭脱色,制得发酵产物;
S7.芍药根提取物的制备:将步骤S2制得的芍药多糖、步骤S4制得的二级蒸馏产物、步骤S6制得的发酵产物混合均匀,制得芍药根提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中所述白芍根粉和水的固液比为1:5-10g/mL,所述复合酶选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、ɑ-淀粉酶、β-淀粉酶中的至少两种,优选地,为纤维素酶和果胶酶,质量比10-12:5,所述酶解的条件为40-50℃,时间为2-3h。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S2中所述提取的时间为2-3h,所述重复加热至沸提取的时间为1-2h,加入乙醇至体系乙醇含量为60-70%,所述沉淀时间为5-7h;步骤S3中所述滤渣和提取物的质量比为10-15:3-5;所述超临界流体萃取条件为:萃取压力:16-32MPa,萃取温度:35-45℃,CO2流量:5-10L/h,萃取时间:1-3h,所述夹带剂的添加量为2-3wt%。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中所述第一温度为65-75℃,所述第二温度为95-105℃,所述蒸馏冷凝温度为3-7℃,刮膜转速为150-250r/min,进料流量为2-4mL/min,系统真空度为50-70Pa。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S5中所述固体、未蒸馏出的物质、碳源、氮源、维生素组合物、无机盐的质量比为10-20:7-12:12-15:7-10:0.5-1:2-3,所述碳源选自糖蜜、菊粉、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的至少一种;所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、鱼粉中的至少一种;所述维生素组合物选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素A、维生素K、维生素D1、维生素D3、叶酸、维生素E中的至少两种;优选地,为维生素B1和维生素B12的混合物,质量比为5-7:2;所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化亚铁、硫酸亚铁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的至少一种,所述调节培养基pH值至6.8-7.2。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S6中所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的制备方法为将白参菌、富硒酵母菌分别接种至高氏培养基中,37-40℃,50-70r/min,活化培养12-18h,制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液;所述活化的白参菌、富硒酵母菌的菌种种子液的接种量分别为1.5-2%和1-2%,所述第一时间段为48-72h,所述第二时间段为48-72h,所述发酵培养的条件为37-40℃,50-70r/min;所述增抗组合物为维生素B12和氯化钙的混合物,质量比为5-7:4。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S7中所述芍药多糖、二级蒸馏产物、发酵产物的质量比为7-10:5-7:10-15。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的芍药根提取物。
10.一种如权利要求9所述的制备方法制得的芍药根提取物在制备美白、抗氧化、抗辐射、保湿、提高皮肤弹性、促进皮肤细胞损伤修复的产品中的应用。
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