KR20240019018A

KR20240019018A - 유도인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 쌀의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20240019018A
Application number: KR1020230070234A
Authority: KR
Inventors: 백소현; 김진숙
Original assignee: 국립순천대학교산학협력단
Priority date: 2022-08-02
Filing date: 2023-05-31
Publication date: 2024-02-14

Abstract

본 발명은 유도인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 쌀의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로,
본 발명의 제조방법을 이용하면 쌀의 레스베라트롤 및 피세이드 함량이 크게 증가시킬 수 있으며, 나아가 상기 쌀을 포함하는 화장품 등의 제조에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유도인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 쌀의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물{A method for producing rices having high-content resveratrol using elicitors and Cosmetic composition containing thereof}

본 발명은 유도인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 쌀의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품 성분은 일반적으로 피부에 염증이나 뾰루지, 부종 등 각종 트러블을 발생시키는 것으로 알려져 있다(Maibach. H. I., Contact Dermatitis, 6. 369-404,1980). 또한, 기능성 화장품의 원료로 사용되는 다양한 물질들도 피부에 대한 낮은 안정성 또는 미미한 효과를 나타내는 문제점이 있다.

일 예로, 피부 주름 개선 및 탄력 개선 화장료로 레티노이드, 아데노신, 동물 태반유래 단백질, 및 클로렐라 추출물 등이 알려져 있다. 가장 널리 알려진 레티놀은 피부 적용 시 자극 등의 안전성 문제로 사용량 제한이 있고, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부 탄력 증진 및 주름 개선 효과를 기대하기가 어렵다.

피부미백에 대한 관심은 건강, 미용지향의 증가에 영향을 받아 점점 늘어나고 있다. 자외선에 의한 피부손상 등으로 하얀 피부에 대한 선호도가 높아지고 있고 투명 화장으로 보다 맑고 깨끗한 피부를 추구함에 따라 피부미백효과를 얻을 수 있는 방법에 대한 관심이 고조되고 있다.

피부 미백에 영향을 미치는 색소 침착은 외부에서 자외선, 염증 및 내인성 호르몬 등의 변화와 같은 다양한 자극에 의하여 유도되는 것으로 알려져 있다. 색소 침착은 표피 기저층에 있는 melanocytes에서 일어나며 현재까지는 주로 티로시나아제(tyrosinase) 발현제어에 의하여 가장 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 이외에도 멜라닌 세포 자극 호르몬(Melanocyte stimulating hormone), 염증성 화학적 매개체 그리고 DNA 손상 및 활성산소의 과다생성에 의하여 주로 과색소침착이 유도된다.

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체로 환경에 대한 세포의 생존율과 경쟁력을 높여주는 물질이다. 멜라닌은 피부에 존재하면서 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능이 있지만 멜라닌의 과잉 생산은 인체에 기미, 주근깨 등을 형성하고 피부 노화를 촉진하거나 피부암의 유발에 관여하는 것으로 보고되었다. 또한, 오존층 파괴로 자외선 노출이 심해지면서 발생하는 과잉된 멜라닌 합성은, 인체의 피부 노화에 치명적인 해를 가져오고 있다. 이에, 강력한 멜라닌 생합성 저해활성 물질의 개발에 많은 노력을 기울이고 있다.

식물 유래의 유용성분들은 2차 대사산물로서 생합성 경로가 복잡하여 식물로부터 직접 추출하여 이용되고 있다. 그러나, 그의 수율이 낮고, 계절, 장소, 기후, 재배조건, 식물체의 부위 등에 따라 생산성이 변화되므로, 안정적으로 원료식물을 공급받기가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위해 식물의 세포 배양을 통한 유용성분의 생산 연구에 관심이 모아 지고 있다.

레스베라트롤은 가장 잘 알려진 공급원인 적포도주에서 발견되는 항산화 화합물이지만, 식물에서는 대량으로 발견되지 않는다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 효모 추출물을 처리한 쌀은 레스베라트롤 및 피세이드 함량이 증가할 뿐만 아니라, 피부 미백, 피부 재생, 주름 개선 및 탄력 개선 효과가 현저히 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 효모 추출물을 쌀에 처리하는 단계를 포함하는, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 효모 추출물을 유효성분으로 포함하는 레스베라트롤 합성효소 발현 증가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 하나의 양태는 효모 추출물 0.5 내지 7g/L을 쌀에 처리하는 단계를 포함하는, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "레스베라트롤(resveratrol)"이란, 식물이 곰팡이나 해충같은 안좋은 환경에 처했을 때 만들어지는 강한 항산화성을 가지는 폴리페놀계 물질의 일종을 의미하는데 화학적인 구조의 측면에서 시스 형태(cis)와 트랜스 형태(trans)가 존재한다. 상기 레스베라트롤은 포도껍질, 포도씨, 땅콩 등에 과량 함유되어 있다고 알려져 있다. 본 발명의 용어, "피세이드(piceid)"란 스틸베노이드 글루코사이드로 레스베라트롤의 유도체이다. 본 발명에서 "총 레스베라트롤"은 레스베라트롤 및 피세이드를 의미한다.

본 발명의 용어 " 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀"이란, 쌀의 염색체에 레스베라트롤 합성 유전자가 도입되어, 생합성된 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 레스베라트롤 합성 유전자가 동진벼의 12번째 염색체에 삽입된 형질전환체로부터 생산된 쌀인 레스베라트롤라이스 DJ526이 될 수 있고, 다른 예로서, 한국등록특허 제10-1594969호에서 제공하는 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀이 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 조성물에 포함되는 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀의 형태는 특별히 이에 제한되지 않으며, 도정되지 않은 쌀 전체를 사용할 수도 있고, 도정을 통해 얻어진 현미, 백미 등의 형태로 사용할 수도 있으며, 상기 쌀을 마쇄하여 수득한 분말형태, 상기 쌀을 추출하여 얻어진 추출물 형태, 상기 추출물을 분획하여 얻어진 분획물 형태 등을 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "효모 추출물"이란, YE로도 약칭되며, 본 발명에서는 "YE"로도 칭해질 수 있다. 본 발명에서 사용한 효모는 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 효모 추출물은 분말형태로 사용하거나, 증류수 또는 통상의 용매에 YE 파우더를 녹여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "유도인자(elicitor)이란, 는 일반적으로 생체 방어 기구의 활성화 작용을 갖는 물질을 말한다. 본 발명에서 유도인자는 효모 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 효모 추출물 0.5 내지 7g/L을 쌀에 처리한 경우, 레스베라트롤 및 피세이드 함량을 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

상기 효모 추출물은 레스베라트롤 및 피세이드 함량을 증가시키는 효과를 가지는 범위에서 적절한 농도로 처리할 수 있다.

일 실시예로, 본 발명의 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법은 상기 효모 추출물을 0.5 내지 7g/L 농도로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 효모 추출물은 0.6 내지 6g/L, 0.8 내지 5.5g/L, 1 내지 5g/L 농도로 처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 하나의 양태는 효모 추출물을 처리하여 쌀을 배양하는 단계; 상기 쌀 추출물 수득하는 단계를 포함하는, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물 제조방법을 제공한다.

상기 효모 추출물, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "추출물"이란, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서 제공하는 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀의 추출물은 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀의 추출물에 있어서, 상기 추출방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 추출에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 구체적으로 메탄올이 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물은 레스베라트롤 합성효소(resveratrol synthase, RS) 유전자의 발현이 증가된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 효모 추출물을 처리하는 경우 총 레스베라트롤 생산 함량 및 레스베라트롤 합성효소(RS) 유전자 발현이 다른 유도인자를 처리한 경우 대비 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 효모 추출물을 유효성분으로 포함하는 레스베라트롤 합성효소 발현 증가용 조성물을 제공한다.

상기 효모 추출물, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀, 레스베라트롤 합성효소은 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀, 추출물은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "피부 개선"은 피부 미백, 피부 재생, 주름 개선 및 탄력 개선으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 피부 미백, 피부 재생, 주름 개선 및 탄력 개선 중 어느 하나 이상을 모두 포함할 수 있다.

상기 피부 개선은 ABTS라디칼 소거 촉진, 멜라닌 함량 감소 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과, 상처 봉합율 증가 효과, MMP-9 유전자 발현 억제 효과, MMP-13 유전자 발현 억제 효과 또는 COL1A의 유전자 발현 증가 효과를 통해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명자들은 효모 추출물을 처리하여 제조한 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물이 피부 개선 효과가 우수함을 확인하였다. 더욱 구체적으로, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물은 ABTS라디칼 소거 촉진, 멜라닌 함량 감소 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과, 상처 봉합율 증가 효과, MMP-9 유전자 발현 억제 효과, MMP-13 유전자 발현 억제 효과 또는 COL1A의 유전자 발현 증가 효과 등이 우수함을 확인하였다. 따라서, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물이 피부 미백, 피부 재생, 주름 개선 및/또는 탄력 개선 등의 피부 개선 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미하는 것으로서, 구체적으로는 피부 미백을 의미할 수 있다. 상기 "피부 미백"은 티로시나제 활성이 저해됨에 따라 멜라닌의 생성이 저해되어 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상, 예컨대 기미, 주근깨 개선으로서 이해될 수 있다.

본 발명의 일 실시예서는 효모 추출물을 처리하여 제조한 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물은 세포 독성이 없어 안전하며, 멜라닌 함량을 유의하게 감소키고, 티로시나아제 억제 활성이 우수함을 확인하였다. 또한, 멜라닌 합성 유전자인 tyrosinase 발현 및 티로시나아제 단백질 발현을 하향 조절함을 확인하였다.

본 발명의 용어, "재생"은 세포, 조직, 기관의 기능 저하를 억제하거나 저하 된 기능을 회복하는 것을 의미한다. 세포, 조직, 기관의 기능 저하는 세포, 조직, 기관의 손상으로 인한 것일 수 있다. 이러한 손상은 방사선치료, 약물치료, 수술, 감염, 염증, 퇴행성 질환, 자가면역질환, 노화 등 다양한 요인에 의해 발생할 수 있다. 한편 상기 재생은 세포 분화 촉진에 의해 달성될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 "피부 재생"은 피부조직의 손상된 부위를 다시 복원시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 피부 재생은 세포활성 증진에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예서는 효모 추출물을 처리하여 제조한 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물은 세포 독성이 없어 안전하며, 상처 회복력이 우수하며, 세포 성장 및 세포 이동을 촉진하여, 세포 재생 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명의 용어, "주름"은 크게 얼굴표정을 짓는데 쓰이는 표정근에 의한 표정 주름과 전반적 혹은 국소적으로 피부가 쇠하여 생기는 잔주름으로 구분 할 수 있다. 구체적으로 주름은 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 탄력 섬유의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 피부 노화가 진행되면 콜라겐 생성을 억제하는 효소(MMP, matrix metalloproteinase)의 유전자 발현이 촉진된다. 본 발명의 목적상 주름은 표정 주름 또는 잔주름을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "탄력"은 피부를 손가락으로 눌렀을 때 팽팽하게 버티는 힘으로, "탄력 개선" 또는 "탄력 증진"은, 개체의 피하 지방층 구조를 강화시켜 피부의 탄력을 높이는 것을 의미로서, 본 발명의 조성물을 이용하여 피부의 탄력을 높이는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예서는 효모 추출물을 처리하여 제조한 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 추출물은 세포 독성이 없어 안전하며, 콜라게나제 유전자인 MMP-9, MMP-13 발현은 억제하고, 1형 콜라겐인 COL1A1 발현은 증가시킴을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 효모 추출물은 쌀의 MMP 발현을 억제하고 콜라겐 합성을 회복시켜 피부 주름 예방 및 탄력 개선 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명의 제조방법을 이용하면 쌀의 레스베라트롤 및 피세이드 함량이 크게 증가시킬 수 있으며, 나아가 상기 쌀을 포함하는 화장품 등의 제조에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 유도인자를 처리한 종자의 레스베라트롤 함량을 비교한 그래프이다.
도 1b는 유도인자를 처리한 종자의 레스베라트롤 합성효소 유전자 발현을 비교한 그래프이다.
도 2는 유도인자를 처리한 melan-a 세포의 생존율을 비교한 그래프이다.
도 3은 유도인자를 처리한 melan-a 세포의 멜라닌 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 유도인자를 처리한 melan-a 세포의 티로시나아제 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 멜라닌 합성 유전자 발현을 비교한 그래프이다.
도 6은 멜라닌 합성 단백질 발현을 비교한 그래프이다.
도 7은 스크래치 상처 치유 활성을 비교한 그래프이다.
도 8은 피부 주름 개선 및 탄력 개선 유전자 발현을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 유도인자(Elicitor) 처리 준비

1 및 5g/L의 효모 추출물(각각 YE1 및 YE5, Thermo Fisher Scientific(USA)사의 Bacto Yeast Extract(Cat No. 212750), Saccharomyces cerevisiae cell), 메틸 자스모네이트(MJ; 0.1 및 0.01mM) 및 JA(0.1 및 0.01mM)가 처리된 2N6 배지에서 5일된 DJ526 종자의 발아를 유도하였다. 그 후, 상기 발아된 DJ526 종자를 수확하고 물로 헹구어 과량의 배양 배지를 제거하고, 60℃에서 48시간 동안 열풍 오븐 방법을 사용하여 종자를 건조시킨 후, 전기 믹서를 사용하여 미세 분말로 분쇄하였다. 분쇄한 분말은 1시간 동안 초음파 처리 하에 80% 메탄올을 사용하여 추출하였다. 그 다음, 50℃에서 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후 동결 건조하여 조 추출물(crude extracts)을 농축하였다. 조 추출물은 1, 10 및 100 mg/mL 농도로 준비하였다.

실험예 2. 유전자 발현 분석

정량적 PCR은 레스베라트롤 합성효소(resveratrol synthase, RS)의 유전자, melan-a 세포의 멜라닌 생성 관련 유전자, TNF-α 유도 HaCaT 세포의 염증성 사이토카인 생성, HaCaT 세포의 type 1 콜라겐 발현 여부를 분석하는데 이용하였다.

구체적으로, RNA 추출은 TRI 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였고, Power cDNA Synthesis Kit(Intron Biotechnology)를 이용하여 샘플당 총 1 μg의 용출된 RNA를 cDNA로 역전사하였다. 반응 혼합물은 RealMODTM Green W2 2x qPCR mix(Intron, Korea), 프라이머(표 1), cDNA 주형 및 18.2MΩ·cm 물을 혼합하여 제조하였으며, qPCR 기계(CFX96 Real-time PCR detection system, BioRaD, 캘리포니아, 미국)을 이용하여 분석하였다. mRNA 발현은 CFX Maestro™ 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, Actin, GAPDH 및 HPRT1은 각각 DJ526, melan-a 세포(마우스 멜라닌 세포) 및 HaCaT 세포(인간 각질 세포)에서 RS 발현을 위한 하우스키핑 유전자로 사용하였다.

	Genes	Sequences
서열번호 1, 2	GAPDH	Forward 5′AACTTTGGCATTGTGGAAGG 3′ Reverse 5′ACACATTGGGGGTAGGAACA 3′
서열번호 3, 4	Tyrosinase	Forward 5′GACGGTCACTGCAGACTTTG 3′ Reverse 5′GCCATGACCAGGATGAC 3′
서열번호 5, 6	HPRT1	Forward 5' TGCTCGAGATGTGATGAAGG 3' Reverse 5' TCCCCTGTTGACTGGTCATT 3'
서열번호 7, 8	TNF-α	Forward 5' CAGAGGGCCTGTACCTCATC 3' Reverse 5' GGAAGACCCCTCCCAGATAG 3'
서열번호 9, 10	MMP-9	Forward 5' TCTTCCCTCCCATCAGTTTG 3' Reverse 5' GGACACCAGACCAAGGAAGA 3'
서열번호 11, 12	MMP-13	Forward 5' CTTCCTGGTCAACCTCTCCA 3' Reverse 5' CCAATTGGCACCTTCTCTTT 3'
서열번호 13, 14	COL1A1	Forward 5' GCAAGATGGAGTCAGGGAAA 3' Reverse 5' AGCCAGCAGATCGAGAACAT 3'

실시예 1. 총 레스베라트롤 (레스베라트롤 및 피세이드) 함량 측정

조 추출물을 80% 메탄올에 희석하고, 0.45μm 멸균 주사기 필터를 통해 여과하여 C18 컬럼 (4.6 x 150 mm; Waters, Milford, MA, USA)이 장착된 HPLC (Waters e2695)을 이용하여 분석을 수행하였다. 데이터는 Empower 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 크로마토그래피 분리의 이동상 용매는 증류수 (A), 아세토나이트릴 (acetonitrile, B)로서, 10% 용매 B (0-37분), 30% 용매 B (37-38분), 100% 용매 B (38-45분) 및 10% 용매 B (45-50분)를 처리하였다. 유속은 1mL/min으로 설정하였으며, 주입부피는 10μL이다. 용출액은 308nm에서 모니터링하였으며, 총 분석 시간은 40분이였다.

유도인자를 처리하지 않은 DJ526 (대조군)은 약 56.8 μg/g의 총 레스베라트롤이 포함되어 있고, 0.01mM 및 0.1mM MJ 및 JA 처리군은 레스베라트롤 농도에 유의한 차이가 없는 반면, YE5를 처리한 DJ526는 최대 50.7%(85.6μg/g; 25μg/g 레스베라트롤 및 60.6μg/g 피세이드)로 총 레스베라트롤 생산히 현저히 증가하였으며, YE1를 처리한 DJ526는 19.2%(67.7μg/g; 19.72μg/g) 레스베라트롤 및 48.0 μg/g 피세이드)를 생산함을 확인하였다 (도 1a).

또한, YE1 처리 후 레스베라트롤 합성효소(resveratrol synthase, RS)의 유전자 발현은 20.7%, YE5 처리로 80% 상향 조절됨을 확인하였다 (도 1b).

이에 따라, 효모 추출물 (YE)은 총 레스베라트롤 생산 함량을 현저히 증가시킬 뿐만 아니라, 레스베라트롤 합성효소(RS)의 발현도 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 2. 항산화 활성(ABTS) 분석

7mM ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate, 0.0384g) 및 2.45mM 과황산칼륨(0.0066g)을 10mL의 증류수에 용해시킨 다음, ABTS와 과황산칼륨의 1:1(v/v) 용액을 혼합한 ABTS 혼합액을 12-16시간 동안 암실에서 배양하였다. ABTS·+ 용액(ABTS 혼합액)은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 ABTS와 과황산칼륨 용액을 1:1로 희석한 후 반응액으로 사용하였다.

유도인자가 처리된 100 mg/L DJ526 종자 추출물 20mL의 추출물을 96웰 플레이트에 180μL의 ABTS·+ 시약과 혼합하고 실온에서 7분 동안 암실에서 배양하였다. 추출물을 처리하지 않은 ABTS·+ 시약을 블랭크로 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 하기 식으로 계산하였다. ABTS 라디칼 50% 소거하는 추출물의 유효 농도(IC₅₀)는 각 처리의 항산화 활성을 비교하기 위해 계산하였다 (표 2).

% 소거 활성 = (A734 블랭크 - A734 처리^*)/A734 블랭크 Х 100

(^* A734는 734 nm에서의 흡광도)

Elicitor-Treated DJ526 Extracts	Concentration (mg/mL)	Antioxidant Activity (%)	Vitamin C Equivalents of Antioxidant Capacity (mg VEAC/g DW)	IC50 (mg/mL)
DJ526	100	90.7 ± 0.92	6.73 ± 0.061	2.2 ± 0.015
YE1	100	93.2 ± 0.42	6.90 ± 0.028	2.1 ± 0.006
YE5	100	94.3 ± 0.07	6.97 ± 0.005	1.7 ± 0.008
MJ 0.01 mM	100	42.6 ± 0.88	3.58 ± 0.058	3.2 ± 0.010
MJ 0.1 mM	100	56.5 ± 5.35	4.49 ± 0.350	2.5 ± 0.077
JA 0.01 mM	100	41.7 ± 5.27	3.52 ± 0.346	3.2 ± 0.402
JA 0.1 mM	100	41.3 ± 1.21	3.49 ± 0.079	3.0 ± 0.299

그 결과, 상기 표 2에서 알 수 있듯이 효모 추출물은 다른 유도인자 대비 ABTS 라디칼 소거능이 우수하였으며, 구체적으로 효모 추출물은 다른 인자 대비 약 2.3배 이상 ABTS 라디칼 소거능이 우수함을 확인하였다. 또한, 효모 추출물의 IC₅₀의 값이 가장 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 효모 추출물을 쌀에 처리한 경우, 쌀의 항산화 활성이 현저히 증가함을 알 수 있었다.

실시예 3. 피부 미백 효과 평가

실시예 3-1. 세포 배양 및 생존율 평가 (Cell Viability Assay)

melan-a 세포는 10% FBS, 페니실린 (50 U m/L), 페니실린-스트렙토마이신 및 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, 200 nM)가 첨가되어 있는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂의 조건에서 유지하였다.

세포 생존율은 Ez-cytox Assay Kit (DogenBio, Seoul, Korea)를 이용하여, 테트라졸륨염을 처리하면 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의하여 테트라졸륨염 (tetrazolium salt)의 전달에 의해 포마잔(formazan)으로 전환되는 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 세포를 웰당 최종 부피가 100 μL되도록, 2 x 10⁴ cells/Ml을 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 배양한 다음, 조 추출물을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 각 웰에 10 μL의 Ez-Cytox 용액을 첨가하고 4시간 동안 배양한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 DMSO를 처리하였으며, 양성 대조군으로는 알부틴을 사용하였다.

% 세포 생존율 = (A₄₀₅ ^* 처리 - A₄₀₅ 블랭크)/(A₄₀₅ DMSO - A₄₀₅ 블랭크) Х 100

(^*A₄₀₅₅는 405 nm에서의 흡광도)

그 결과, 유도인자를 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인하여, 본 발명의 유도인자가 멜라닌 세포에 안전함을 알 수 있었다 (도 2).

실시예 3-2. 멜라닌 함량 및 티로시나아제 활성 평가

melan-a 세포(8 x 10⁴)를 6웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 조 추출물(1, 10, 100 mg/mL)을 처리하고 37℃, 5% CO2에서 72시간 배양하였다. 그 후, 세포를 수확하고 PBS (인산완충식염수)로 두 번 세척하고, 트립신-EDTA(1x)를 사용하여 세포를 분리한 다음, 4℃에서 10분 동안 2000rpm에서 원심분리를 수행하였다. 얻어진 펠렛을 차가운 PBS로 세척한 후, 얼음에서 30분 동안 용해 완충액(0.5M EDTA, 1% Triton-X 및 0.1M 인산나트륨)으로 용해하고 13,000rpm에서 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 펠렛은 세포의 멜라닌 함량을 평가하는데, 상층액은 티로시나아제 활성을 평가하는데 활용하였다.

원심분리한 상층액은 새 튜브로 옮기고, 펠렛은 100% 에탄올로 세척한 후 80℃, 1시간 동안 1N NaOH로 용해시켰다. 흡광도는 405 nm에서 측정되었고 멜라닌 함량은 대조군(DMSO)의 백분율로 계산하였다.

티로시나아제 활성은 Bradford protein assay을 이용하여 상등액의 단백질(40μg)을 정량 하였으며, 용해 버퍼를 이용하여 부피를 조절하며 측정하였다. 구체적으로, 상등액에 L-DOPA(2 mg/mL)를 용해물에 첨가하고 37℃, 1시간 동안 배양한 후, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 효모 추출물을 처리한 경우 멜라닌 함량이 유의하게 감소하였고, 알부틴(양성 대조군)과 유사한 효과를 나타냄을 확인하였다. 10 및 100 mg/mL YE1는 대조군(DMSO)의 32.2% 및 26.7%로 멜라닌 함량을 감소시켰는데, 이는 알부틴과 유사하였으며, 동일한 농도에서 DJ526과 비교하였을 때 각각 23.1% 및 16.6% 감소하였다. 10 및 100 mg/mL 농도의 YE5는 대조군(DMSO)의 46.1% 및 43.4% 및 DJ526과 비교하여 각각 37.0% 및 33.3%로 멜라닌 함량을 감소시켜 강력한 항멜라닌 활성을 나타내었다. 또한, DJ526은 1 mg/mL에서 100 mg/mL으로 농도가 증가하는 동안 멜라닌 함량 감소 효과 증가가 약 10% 수준으로 미미하나, 효모 처리한 경우 농도가 증가할수록 효과 증가는 약 30 내지 50%으로 확인하였다 (도 3).

유도인자를 처리하지 않은 DJ526 (대조군)은 티로시나아제 억제 활성을 보이지 않는 반면, 10 mg/mL의 YE1 및 YE5은 티로시나아제 활성을 각각 53.4% 및 75.9% 억제하였다. 특히 YE5는 양성대조군보다 더 강한 티로시나아제 억제 활성을 나타내었다 (도 4).

이를 통해, 본 발명의 효모추출물은 10 mg/Ml의 낮은 농도로 멜라닌 함량과 티로시나아제 활성을 현저히 감소시켜 쌀의 미백 효과를 현저히 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 3-3. 멜라닌 합성 유전자 발현 분석

실험예 2.의 방법으로 10 mg/mL 유도인자를 처리한 후, melan-a 세포의 멜라닌 생성 관련 유전자인 타이로시나아제 (tyrosinase)의 mRNA 발현을 분석하였다.

그 결과, 효모 추출물을 처리한 경우 타이로시나아제 유전자 발현은 대조군 대비 각각 약 9.1%, 12.6% 및 19% 하향 조절함을 알 수 있었다 (도 5).

실시예 3-4. 멜라닌 합성 단백질 발현 분석 (Western blot analysis)

Melan-a 세포 용해물은 1% 페닐-메틸설포닐 플루오라이드와 1X 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 RIPA 완충액을 사용하여 제조하였다. 용해물(40μg)을 SDS-PAGE에 로딩하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 단백질은 항-타이로시나아제 (anti-tyrosinase)를 포함한 항체 기반 프로브를 사용하여 측정하였고, GADPH는 대조군 항체로 사용하였다.

그 결과, 효모 추출물을 처리한 경우 티로시나아제의 단백질 발현은 유의하게 하향조절함을 확인하였다 (도 6). 이에 통해 효모 추출물은, 티로시나아제의 유전적 발현뿐만 아니라 단백질 발현도 유의하게 하향조절 함으로써 쌀의 미백 효과를 현저하게 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 5. 피부 재생 및 주름 개선 효과 평가

실시예 5-1. 세포 배양 및 생존율 평가 (Cell Viability Assay)

HaCaT 세포(Human keratinocyte cell line)는 10% FBS, 10% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가되어 있는 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2의 조건에서 유지하였다.

구체적으로, 세포 생존율 평가 방법은 실시예 3-1.과 동일하다. HaCaT 세포의 세포독성에 대한 TNF-α 및 조 추출물과의 혼합에 따른 생존율은 DMEM 무혈청 배지에서 측정하였다.

그 결과, 100mg/mL 비타민 C는 세포 독성이 있는 반면, 효모 추출물 유도인자를 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인하여, 본 발명의 유도인자가 HaCaT 세포에 안전함을 알 수 있었다.

실시예 5-2. 스크래치 상처 치유 분석 (Wound-Healing Scratch Assay)

HaCaT 세포 (4 Х 10⁵ cell/mL)를 24웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 식물 추출물로 전처리한 후, 세포들간에 약 95% 합류 지점에 도달할 때까지성장시킨 다음 200μL 멸균 마이크로피펫 팁을 사용하여 수직으로 긁어 스크래치를 만들고, 세포 찌꺼기가 관찰되지 않을 때까지 무혈청 배양 배지로 2번 세척하였다. 그 다음, DJ526 (resveratrol rice, RR), 효모 추출물이 처리된 DJ526를 웰당 1, 10 및 100 mg/mL의 농도로 분주하고, 0, 24 및 48시간에서 세포 이동 및 상처 부위의 치료여부를 관찰하였다. 비타민 C는 이 실험의 양성 대조군으로 사용하였다.

시간 의존적 세포 이동을 분석하여 상처 치유 효과를 확인한 결과, 처음 24시간에 10 mg/mL YE1의 상처 봉합율은 60.2% 및 YE5의 상처 봉합율은 56.1%로 양성 대조군인 비타민 C보다 상처 봉합율이 현저히 높은 바, 본 발명의 유도인자를 처리한 경우 상처 간격을 빠르게 감소시켜 우수한 상처 회복력을 보임을 확인하였다. DJ526은 농도가 1에서 100으로 높아져도 상처 봉합율 및 상처 간격의 차이가 미비하여, 치료 속도가 변화 없이 거의 비슷함을 확인하였다. 이와 달리, YE1, YE5은 1mg/ml 보다 10 mg/ml에서 치료율이 약 2배 이상 증가함을 확인하였다. 또한, 48시간에서는 DJ526을 1mg/ml 처리한 경우 상처 봉합율이 80%에 미치지 못하는 반면, 효모 추출물을 처리한 경우 최대 78.2-100%로 거의 완전히 치료되는 것을 확인하였다 (도 7).

이를 통해 본 발명의 유도인자를 처리한 경우, 상처 봉합은 세포 성장 및 세포 이동을 유도함으로써 세포 재생에 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 5-3. 피부 주름 개선 및 탄력 개선 유전자 발현 분석

실험예 2.의 방법으로 유도인자를 처리한 후, TNF-α, 콜라게나제(collagenase) 유전자인 MMP(matrix metalloproteinase) 및 COL1A 유전자(Collagen Type I Alpha)의 mRNA 발현을 분석하였다.

그 결과, 효모 추출물 YE1 및 YE5을 처리한 경우 대조군 (HaCaT 세포에 TNF-α 처리)과 비교하여 TNF-α 발현을 유의하게 감소하였고, 특히 100 mg/mL YE1 및 YE5는 각각 약 4.3배 및 2.6배 감소시켰다. 효모 추출물은 TNF-α 유도 세포에서 MMP-9를 억제하였으며, MMP-13를 하향 조절하였고, 대조군보다도 MMP-13의 발현이 억제되었다.

또한, COL1A의 유전자 발현은 대조군 및 TNF-α 처리된 세포 대비 YE5에서 약 2.6배, YE1 처리된 세포에서 약 0.4배 상향 조절하였다 (도 8).

이에 따라, 본 발명의 유도인자는 MMP의 발현을 억제하고, COL1A 발현은 증가시킴으로써 피부 노화 방지 및 피부 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

효모 추출물 0.5 내지 7g/L을 쌀에 처리하는 단계를 포함하는, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 쌀은 레스베라트롤을 내재적으로 포함하는 쌀인 것인, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인 것인, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효모 추출물은 레스베라트롤 합성효소(resveratrol synthase, RS) 유전자 발현을 증가시키는 것인, 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀 제조방법.
효모 추출물을 유효성분으로 포함하는 레스베라트롤 합성효소 발현 증가용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 레스베라트롤 및 피세이드 고함유 쌀의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 피부 개선은 피부 미백, 피부 재생, 주름 개선 및 탄력 개선으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 ABTS라디칼 소거 촉진, 멜라닌 함량 감소 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과, 상처 봉합율 증가 효과, MMP-9 유전자 발현 억제 효과, MMP-13 유전자 발현 억제 효과 또는 COL1A의 유전자 발현 증가 효과를 갖는 것인, 화장료 조성물.