KR101493158B1

KR101493158B1 - 가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101493158B1
Application number: KR20130067790A
Authority: KR
Inventors: 김영철; 박은예; 김상남; 신수진; 윤종백
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2015-02-13
Also published as: KR20140145393A

Abstract

본 발명은 본 발명은 가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 가공인삼은 수삼을 110 내지 120℃에서 1 - 3 시간 숙성하고, 70 내지 90℃에서 9 - 11 시간 숙성하는 것을 4 내지 8회 반복하고, 이를 압축 및 건조시켜 제조한 가공인삼인 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 가공인삼 열수추출물은 멜라닌 합성을 감소시키고 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 저해시켰으며, 주름개선 실험에서 콜라겐(collagen) 합성을 증가시키고 콜라겐 분해를 저해시켜 피부 미백 및 주름개선 기능성 화장품 천연 소재로서 활용 가능성이 있을 것으로 판단된다.

Description

가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving skin whitening or wrinkle comprising extract from processed ginseng}

본 발명은 가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 평균수명의 연장과 레저활동의 증가로 인해 UV 노출의 기회 증가와 더불어 환경오염에 의한 오존층 파괴 및 이에 따른 UV의 절대량 증가로 UV에 의한 홍반반응, 색소반응, 피부노화, 피부암 등의 피부 변화가 증가 되고 있는 추세이다. 멜라닌은 주로 피부색의 색소침착을 책임지고 피부 발암에 대해 중대한 역할을 한다. 비정상적인 멜라닌 색소 침착은 기미, 주근깨, 노인성 검버섯과 관련된 피부생리적인 무질서의 원인이 된다. 자외선 조사에 의해 노출된 피부에서 멜라닌합성은 티로시나아제(tyrosinase) 효소를 통해 시작된다. 피부의 노화는 나이의 증가와 자외선 등의 외부요인이 주요 원인이 된다. 나이가 증가하면 섬유아세포의 작용과 세포 수가 감소하여 섬유성분의 합성량이 줄어들고 구조가 느슨해져서 탄력이 감소되며 피부세포 내 수분이 손실되며 각질층의 구조가 변화된다. 한편 자외선과 같은 외부요인은 활성산소종을 발생시켜 여러 가지 신호전달 체계를 활성화시킴으로써 activator protein-1(AP-1)과 nuclear factorkB (NF- kB)의 활성화에 의한 염증반응과 작용이 증가하며 피부를 구성하는 지질, 단백질, 핵산, 효소 등이 손상되어 노화가 일어난다.

알부틴(Arbutin), 코지산(kojic acid), 리놀레산(linoleic acid), 레티노산(retinoic acid) 등을 포함하는 많은 피부 미백 및 주름개선제가 광범위하게 사용되고 있으나 많은 부작용을 가지고 있다. 이에 비해 천연식물이 함유하고 있는 항산화 성분은 순수 자연성분으로 안전성을 가지고 그 효과가 탁월하여 노화방지, 주름개선, 피부 미백 등 기능성 화장품 제제로 활용될 수 있다.

인삼(Panav ginseng C. A. Meyer)은 오가피나무과 인삼 속에 속하는 다년생 초본류로서 뿌리를 중요한 약재로 사용하여 왔으며, Panax의 Pan은 희랍어로 ‘모든 것’을 의미하며, Axos는 ‘치료’란 뜻으로 인삼의 어원에는 ‘만병통치’라는 의미가 있다. 그동안 수삼, 백삼 그리고 홍삼 그대로의 상태로 건강식품으로 사용되어 오던 인삼류는 가공방법에 따라 그 생리활성 효능이 달라지면서 열 및 효소 등의 처리에 의해 인삼 제품이 가공되어 맞춤형 제품 등이 출시되고 있다. 인삼의 약리작용으로는 해독작용, 당뇨병 및 고지혈증 예방, 면역기능 증진, 항암활성 등이 보고되었으며 주요 활성 성분으로는 사포닌 성분이 알려져 프로토파낙사디올(protopanaxdiol)계, 프로토파낙사트리올(protopanaxtriol)계, 올레아놀릭산(oleanolic acid)계의 진세노사이드(ginsenoside)가 분리되어 그 화학구조가 밝혀졌다. 최근에는 진세노사이드(ginsenoside)의 함량을 더 증강시키고자 하는 노력으로 흑삼이라는 새로운 원형 삼류 신제품이 개발되어 인삼가공제품의 원료로 사용되고 있다. 흑삼은 수삼의 새로운 가공인삼으로 화학성분은 진세노사이드(ginsenoside) Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1 함량이 백삼 홍삼보다 증가되며, 열처리에 의해 진세노사이드(ginsenoside) Rg1, Rg2, Rh1, Rh2 등은 홍삼보다 높은 함량을 나타낸다. 또한, 기존의 백삼이나 홍삼에 비해서 월등히 항암 효과 및 비만 억제 효과가 우수하다는 사실이 밝혀진 바 있다.

한편, 한국특허출원 제10-2010-0007340호는 인삼 사포닌 Rg1을 이용한 피부 재생 및 주름 개선용 화장수 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 사포닌 Ｒｇ1 1-20%을 물에 가열 용해시킨 후 20-50℃에서 5-15일간 숙성시켜 침전을 여과 제거한 여액을 사용하여 제조하는 화장수에 대해 개시하고 있으나, 본 발명에 의해 제조되는 가공인삼 열수추출물에 대한 언급은 없다.

따라서, 본 발명자들은 가공인삼 열수추출물을 사용하여 항산화능을 확인하고, melan-a 세포와 인체피부섬유아세포를 이용하여 피부 미백 및 주름개선 효능을 확인함으로써 피부 기능성 화장품 천연소재로서의 활용 가능성을 탐색하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가공인삼 열수추출물을 유효성분으로 함유하며, 상기 가공인삼은 수삼을 110 내지 120℃에서 1 - 3 시간 숙성하고, 70 내지 90℃에서 9 - 11 시간 숙성하는 것을 4 내지 8회 반복하고, 이를 압축 및 건조시켜 제조한 가공인삼인 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상세하게는 상기 가공인삼 열수추출물은 상기 가공인삼 300-500g에 물 4 내지 8L를 첨가하여 열수추출한 것을 특징으로 한다.

상세하게는 상기 가공인삼 열수추출물은 멜라닌 합성 및 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하고, 콜라겐 합성을 증가시키고, 콜라겐 분해를 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 가공인삼 열수추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어 항산화제, 안정화제, 용제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위해 피부 흡수 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 보다 상세하게는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 가공인삼 열수추출물은 화장료 총 중량에 대해 0.01~10 중량%의 양으로 첨가되어 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 가공인삼 열수추출물은 항산화능을 지닌 것으로 확인되었으며, melan-a 세포를 이용한 피부미백 실험에서 멜라닌 합성을 감소시키고 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 저해시켰다. 인체피부섬유아세포를 이용한 주름개선 실험에서 콜라겐(collagen) 합성을 증가시키고 콜라겐 분해를 저해시켜 가공인삼 열수추출물은 피부 미백 및 주름개선 기능성 화장품 천연 소재로서 활용 가능성이 있을 것으로 판단된다.

도 1은 가공인삼 열수추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타낸다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다.
도 2는 가공인삼 열수추출물의 전자공여능을 나타낸다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다.
도 3은 가공인삼 열수추출물에 대한 melan-a 세포의 생장률을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PGWE: 가공인삼 열수추출물.
도 4는 Melan-a 세포에서 멜라닌 생성 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PC: 알부틴(arbutin), PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다.
도 5는 세포내 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PC: 알부틴(arbutin), PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다.
도 6은 세포 추출물 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PC: 알부틴(arbutin), PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다.
도 7은 Melan-a 세포에서 티로시나아제(tyrosinase) 유전자 발현 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PC: 알부틴(arbutin), PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다. **p<0.01은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 대조군과 비교하였다.
도 8은 Melan-a 세포에서 TRP-1 유전자 발현 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PC: 알부틴(arbutin), PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다. **p<0.01은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 대조군과 비교하였다.
도 9는 Melan-a 세포에서 TRP-2 유전자 발현 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. C: 대조군, PC: 알부틴(arbutin), PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다. *p<0.05은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 대조군과 비교하였다.
도 10은 Melan-a 세포에서 MITF-M 유전자 발현 저해능을 측정한 결과이다. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다. **p<0.01은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 대조군과 비교하였다.
도 11은 가공인삼 열수추출물에 대한 인체피부섬유아세포의 생장률을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다.
도 12는 인체피부섬유아세포에서 콜라겐 합성 효율을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. PC: TGF-β1 5ng/ml, PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다.
도 13은 인체피부섬유아세포에서 MMP-1 유전자 발현 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. PC: TGF-β1 5ng/ml, PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다.
도 14는 인체피부섬유아세포에서 MMP-2 활성 저해능을 측정한 결과이다. 수치는 3번 측정을 통해 평균±SD로 나타냈다. PC: TGF-β1 5ng/ml, PGWE: 가공인삼 열수추출물. 다른 어깨글자(superscript)가 나타내는 수치는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에 의한 유의적 차이(p<0.001)이다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > In vitro 항산화능 실험

1. 시약 및 기기

디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO), 포타슘 포트록소디설페이트(potassium potroxodisulfate), 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl; DPPH), 3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; MTT), 탄닌산(tannic acid)는 Sigma 사(USA)의 제품을 사용하였고, RPMI-1640, Dulbecco's modified eagle medium(DMEM), 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/ streptomycin)은 Lonza 사(USA)의 제품을 사용하였으며, 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다.

세포주 관찰은 도립현미경(inverted microscope, CKX41, Olympus, Japan)를 사용하였고, 세포주 배양은 CO₂ incubator(MCO-15AC, Sanyo electric, Japan)를 사용하였다.

2. 가공인삼 추출물 제조

경상북도 청송에서 재배된 6년근 수삼을 110-120℃에서 2시간, 70-90℃에서 10시간, 6회 반복하여 압축한 후 70℃에서 건조시켜 제조한 가공인삼 420g에 물 6ℓ를 첨가하여 얻은 추출물을 농축하고 동결 건조시켜 실험에 사용하였다.

3. 총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법에 의해 비색 정량하였다. 적절한 배율로 희석한 시료 1㎖에 folin-reagent 1㎖를 가하여 3분간 정치한 후 10% Na₂CO₃ 1㎖를 혼합하고 1시간 실온에서 방치하여 760㎚에서 흡광도를 측정하였다. 검량곡선은 탄닌산(tannic acid)을 이용하여 작성하였다.

4. 총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 Davis 변법을 이용하였다. 시료 용액 1㎖에 디에틸렌 글리콜(diethylene glycol) 10㎖를 첨가하고 5분간 반응시킨 다음 1N NaOH 1㎖를 첨가하여 혼합한 후 30℃에서 1시간 반응시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량곡선은 루틴(rutin, sigma Co., USA)을 이용하여 작성하였다.

5. 전자공여능

전자공여능은 Blois의 방법으로 측정하였다. 동결 건조시킨 가공인삼 열수추출물의 분말을 100, 500, 1000㎍/㎖의 농도로 DMSO에 녹여 제조하고, 1㎖를 test tube에 취하여 4×10^-4M의 DPPH 용액 4㎖를 가하여 60℃ 수욕상에서 10초간 진탕하고 실온에서 20분 동안 방치한 후에 525㎚에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 무 첨가구에는 시료 대신 에탄올(ethanol) 1㎖를 첨가하여 동일하게 실험하고 추출물 첨가구에 대한 흡광도의 감소비율로 전자공여능을 나타내었다. 양성대조군으로 합성 항산화제인 BHT를 동일한 방법으로 실험하였으며, 다음 식으로 전자공여능(%)을 구하였다.

전자공여능(%) = [1-(추출물 첨가구의 흡광도/추출물 무 첨가구의 흡광도)]×100

6. 결과

가공인삼 열수추출물의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량은 각각 12.0, 16.7mg/g이였다(도 1). 또한, 전자공여능 측정 결과, 양성대조군인 BHT와 가공인삼 열수추출물 1,000㎍/㎖에서 각각 83.0, 11.0%였다(도. 2).

< 실시예 2 > In vitro 피부 미백 실험

1. 세포주 및 배양

C57BL/6 마우스에서 유래한 불사화세포주(immortalized cell line)인 melan-a 세포는 Dr. Bennett(Cancer Research Center, London, England)으로부터 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% PS(penicillin/streptomycin), 200nM TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 함유된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 10% CO₂ 조건의 incubator에서 배양하였다.

2. 세포생장률

MTT 분석법은 MTT[3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포르마잔(formazan)을 형성하는데, 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로서 세포의 생장율을 측정하는 대표적인 방법이다.

Melan-a 세포를 10% FBS, 1% P/S, 200nM TPA가 함유된 RPMI-1640 배지에 풀어 37℃, 10% CO₂ incubator에서 72시간 동안 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. Melan-a 세포를 96 well plate에 적정 세포수(0.5×10⁴ cells/well)로 분주하고 37℃, 10% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 다음 가공인삼 열수추출물을 농도별(25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 희석시켜 200㎕씩 넣은 후 37℃, 10% CO₂ incubator에서 48시간 배양하였다. 플레이트(Plate)를 1,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 PBS로 1회 세척(washing)하고 MTT가 0.5㎎/㎖ 함유된 배지를 200㎕씩 넣은 후 37℃, 10% CO₂ incubator에서 3시간 배양하였다. 플레이트(plate)를 1,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 cell이 바닥에 가라앉게 한 다음 배지를 버리고 DMSO를 200㎕씩 넣고 plate shaker에서 15분간 cell을 녹여낸 다음 ELISA reader로 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생장률은 다음 식에 의해 산출하였다.

세포생장률(%) = (시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도)×100

3. 멜라닌 생성 저해능

Melan-a 세포를 10% FBS, 1% P/S, 200nM TPA가 함유된 RPMI-1640 배지에 풀어 37℃, 10% CO₂ incubator에서 72시간 동안 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. Melan-a 세포를 48-well plate에 적정 세포수(2×10⁴ cells/well)로 분주하고 37℃, 10% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 다음 가공인삼 열수추출물을 농도별(25, 50, 100 200㎍/㎖)로 희석시켜 500㎕씩 넣어 1차 물질 처치를 가하고 37℃, 10% CO₂ incubator에서 72시간 배양한 후 다시 2차 물질 처치와 72시간 배양한 후 1N NaOH 용액으로 멜라닌을 용해시켜 490nm에서 흡광도를 측정하였고, 양성대조군은 알부틴을 사용하였다. 멜라닌 정량은 다음 식에 의해 산출하였다.

멜라닌 양(%) = (시료 첨가구의 흡광도/시료 무 첨가구의 흡광도)×100

4. 세포 내 티로시나아제(Intra-cellular tyrosinase) 활성 저해능

Melan-a 세포를 둥근 60φ cell culture dish에 적정세포수(4×10⁵ cells/ well)로 분주하고 incubator에서 24시간 배양한 다음, 가공인삼 열수추출물을 농도별(25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 희석시켜 다시 incubator에서 72시간 배양한 후 1% triton X-100 용액을 처치하여 용해시켰다. 그 후 혼합(vortex)하면서 1시간 가량 방치한 다음 원심분리한 상층액을 티로시나아제(tyrosinase) 활성 측정 용액으로 사용하였다. 추출한 세포 추출물(cell extract)과 0.1M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 6.8)을 총 100㎕가 되게 섞은 후 L-DOPA를 100㎕씩 처치한 다음 490nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.

5. 세포 추출물 티로시나아제(Cell-extracted tyrosinase) 활성 저해능

Melan-a 세포를 둥근 60φ cell culture dish에 적정 세포 수(4×10⁵ cells/well)로 분주한 후 incubator에서 72시간 배양한 다음 1% triton X-100 용액을 처치하여 용해시켰다. 그 후 10분 간격으로 혼합(vortex)하면서 1시간 가량 방치한 다음 원심 분리하여 얻은 상층액 50㎕, 0.1M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 6.8) 49㎕, 가공인삼 열수추출물을 농도별(25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 혼합한 후 1시간 동안 방치하였다. 여기에 L-DOPA를 100㎕씩 처치한 다음 490nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.

6. 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2, MITF 유전자 발현 저해능

Total RNA는 제조사에서 제공된 지시에 따라 Trizol-Reagent (Invitrogen, Caylsbad, CA)를 이용해 분리하였다. Total RNA 5㎍을 40㎕ 용량에서 M-MLV RT 5× 배지의 8㎕, 10mM dNTPs의 3㎕, 10,000 U RNase inhibitor 0.45㎕, 50,000 U M-MLV 역전사효소(Promega, Madison, USA) 0.3㎕ 그리고 50 pmol/㎕ oligo dT (Bioneer, Chungbuk, Korea) 1.5㎕를 이용해 역전사하였다. Single stranded cDNA는 5× green Go Taq flexi buffer 4㎕, 10 mM dNTPs 0.4㎕, 500 U Taq polymerase 0.1㎕, 25mM MgCl2(Promega, Madison, USA) 1.2㎕와 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF-M, -Actin의 specific sense와 antisense primer의 각각 20 pmol/L 0.4㎕를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열과 예상 크기는 표 1과 같다. 프라이머는 내부표준물질로 β-Actin(51℃, 30 cycle), 실험물질로 티로시나아제(tyrosinase, 56℃, 28 cycle), TRP-1(56℃, 28 cycle), TRP-2(64℃, 28 cycle), MITF-M(54℃, 30 cycle)을 사용하였다. PCR 산물을 1.2% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동 시킨 후 분석하였다.

	프라이머		예상 크기(bp)¹ ⁾
Tyrosinse² ⁾	F⁶⁾ (5′→3′) R⁷ ⁾ (5′→3′)	CAT TTT TGA TTT GAG TGT CT TGT GGT AGT CGT CTT TGT CC	1192
TRP-1³⁾	F (5′→3′) R (5′→3′)	GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT	268
TRP-2⁴⁾	F (5′→3′) R (5′→3′)	GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC	1044
MITF-M⁵ ⁾	F (5′→3′) R (5′→3′)	TAC AGA AAG TAG AGG GAG GAG GAC TAAG CAC AGT TGG AGT TAA GAG TGA GCA TAG CC	326
β-Actin	F (5′→3′) R (5′→3′)	ACC GTA AAA AGA TGA CCC AG TAC GGA TGT CAA CGT CAC AC	528

¹⁾bp: 염기쌍(basepair)

²⁾티로시나아제(Tyrosinase)

³⁾TRP-1: 티로시나아제 관련 단백질-1(tyrosinase related protein-1)

⁴⁾TRP-2: 티로시나아제 관련 단백질-2(tyrosinase related protein-2)

⁵⁾MITF-M: 소안구증-관련 전사인자-M(microphthalmia-associated transcription factor-M)

⁶⁾F: 정방향(forward)

⁷⁾R: 역방향(reverse)

7. 결과

In vitro에서 가공인삼 열수추출물에 대한 melan-a 세포의 생장률을 측정한 결과는 도 3과 같다. 가공인삼 열수추출물의 melan-a 세포에 대한 최대허용농도는 200㎍/㎖이상인 것으로 확인되었다.

Melan-a 세포에서 멜라닌 생성 저해능을 측정한 결과는 도 4와 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 29.1% 유의하게(p<0.001) 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 23.6% 유의하게(p<0.001) 저해되었다.

세포내 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정한 결과는 도 5와 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 26.9% 유의하게(p<0.001) 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 6.4% 유의하게(p<0.001) 저해되었다.

세포 추출물 티로시나아제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정한 결과는 도 6과 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 55.9% 유의하게(p<0.001) 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 50.9% 유의하게(p<0.001) 저해되었다.

RT-PCR을 이용한 티로시나아제(tyrosinase) 유전자 발현 저해능을 측정한 결과는 도 7과 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 28.4% 유의하게(p<0.01) 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 9.4% 저해되었다. RT-PCR을 이용한 TRP-1 유전자 발현 저해능을 측정한 결과는 도 8과 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 1.7% 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 5.1% 저해되었다. RT-PCR을 이용한 TRP-2 유전자 발현 저해능을 측정한 결과는 도 9와 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 18.0% 유의하게(p<0.05) 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 14.0% 유의하게(p<0.05) 저해되었다. RT-PCR을 이용한 MITF-M 유전자 발현 저해능을 측정한 결과는 도 10과 같다. 대조군에 비해 양성대조군인 알부틴 처치군은 50㎍/㎖에서 10.4% 저해되었고, 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 28.6% 유의하게(p<0.01) 저해되었다. 즉, 가공인삼 열수추출물은 양성대조군인 알부틴 보다 TRP-2, MITF-M 유전자 발현 저해능이 우수하였다.

< 실시예 3 > In vitro 주름개선 실험

1. 세포주 및 배양

인체피부섬유아세포는 (주)아모레퍼시픽에서 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% P/S(penicillin/streptomycin)가 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 배지에 풀어 37℃, 5% CO₂ incubator에서 48시간 동안 안정화시킨 후 실험에 사용하였다.

2. UVA 조사 및 시료 처리

인체피부섬유아세포를 1.5×10⁵ cells/㎖의 농도로 100 mm culture dish에 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 배양한 후 배지를 버리고 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 배지내 혈청(serum) 성분을 없앤 후 6.3 J/cm² UVA(Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 시료를 농도별로 처리한 후 UVA를 조사한 세포를 24시간 배양하였다.

3. 세포생장률

배양중인 인체피부섬유아세포에 가공인삼 열수추출물을 농도별(12.5, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 처리한 다음 MTT 시약을 첨가한 후 3시간 배양하고, DMSO를 처리한 다음 ELISA reader로 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생장률은 다음 식에 의해 산출하였다.

4. 타입-I 프로콜라겐(Type-I procollagen) 합성능

인체피부섬유아세포에 동결 건조시킨 분말로 된 가공인삼 열수추출물 시료를 DMEM 배지에 농도별(12.5, 25, 50, 100㎍/㎖)로 희석하여 처치한 후 상청액(supernatants)을 취해 EIA kit(Takara, Japan)를 사용하여 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 타입-I 프로콜라겐(type I-procollagen) 단백질 생성량을 산출하였다. 양성대조군으로 TGF-β1(5ng/㎖)을 사용하였다.

5. MMP-1 유전자 발현 저해능

(1) 총 RNA 분리

배양한 인체피부섬유아세포에 1㎖ Trizol-Reagent(Invitrogen, USA)를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 200㎕ 클로로포름(chloroform)을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하는 과정을 2번 반복하여 상층액을 분리하였다. 500㎕ 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 이용하여 RNA를 침전시킨 후 70% 에탄올(ethanol)로 세척하고 자연 건조시켰다. DEPC-water에서 RNA를 녹인 후 -70℃에 저장하였다.

(2) cDNA 제조

대조군 및 시험군에서 각각 분리한 총 RNA 5㎍을 40㎕ 용량에서 M-MLV RT 5× buffer 8㎕, 10 mM dNTPs 3㎕, 10,000U RNase inhibitor 0.45㎕, 50,000U M-MLV 역전사효소(Promega, USA) 0.3㎕ 그리고 50pmol/㎕ oligo dT(Bioneer, Korea) 1.5㎕를 이용해 역전사하였다.

(3) RT-PCR과 전기영동

Single stranded cDNA는 5×green Go Taq flexi buffer 4㎕, 10mM dNTPs 0.4㎕, 500U Taq polymerase 0.1㎕, 25mM MgCl₂(Promega, Madison, USA) 1.2㎕와 MMP-1, β-Actin의 specific sense와 antisense primer를 각각 20pmol/L 0.4㎕ 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열과 예상 크기는 표 2와 같다. 내부표준물질로 β-Actin(50℃, 28 cycle), 실험물질로 MMP-1(50℃, 28 cycle)을 사용하였다. PCR 산물을 1.2% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동 시킨 후 분석하였다.

	프라이머		예상 크기 (bp)¹⁾
MMP-1²⁾	F³⁾ (5′→3′) R⁴ ⁾ (5′→3′)	AAA GGG AAT AAG TAC TGG GC AAT TCC AGG AAA GTC ATG TG	237
β-Actin	F (5′→3′) R (5′→3′)	ATG CAG AAG GAG ATC ACT GC CTG CGC AAG TTA GGT TTT GT	248

¹⁾bp: 염기쌍(basepair)

²⁾MMP-1: 매트릭스 메탈로프로티나제-1(matrix metalloproteinase-1)

³⁾F: 정방향(forward)

⁴⁾R: 역방향(reverse)

6. MMP-2 유전자 발현 저해능

세포 배양액을 수거하여 같은 단백질 양을 로딩(loading) 할 수 있도록 조절해서 샘플과 같은 부피의 샘플 완충액(2×)를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 10% zymogram gel(Invitrogen, USA)에서 로딩(loading)하였다. 전기영동으로 단백질을 분리하고, Novex zymogram renaturing buffer(1×)로서 30분간 반응시켰다. 이후 Novex zymogram developing buffer(1×)로 바꾸어서 약 1시간 상온에서 반응시킨 후 새로운 developing buffer로 교체하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. Simply blue safe stain(Invitrogen, USA)으로 염색 후 멸균증류수로 세척하여 MMP-2의 활성정도를 밴드(band)로서 확인하고 image analyzer로 정량하였다.

7. 자료분석

SPSS(v 20.0) 통계프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 동질성을 분석하였고, 각 군 간의 비교는 Duncan’s multiple range test로 사후 분석을 실시하였다. 통계학적인 유의성 검증은 p<0.001, 0.01, 0.05에서 실시하였다.

8. 결과

In vitro에서 가공인삼 열수추출물에 대한 인체피부섬유아세포의 생장률을 측정한 결과는 도 11과 같다. 가공인삼 열수추출물의 인체피부섬유아세포에 대한 최대허용농도는 200㎍/㎖ 이상인 것으로 확인되었다.

인체피부섬유아세포에서 타입-I 프로콜라겐(type-I procollgen) 합성능을 측정한 결과는 도 12와 같다. 용매대조군에 비해 양성대조군인 TGF-β1은 5ng/㎖에서 165% 유의하게(p<0.001) 증가하였다. 가공인삼 열수추출물 처치군은 50㎍/㎖에서 124.6% 유의하게(p<0.001) 증가하였다.

RT-PCR을 이용한 MMP-1 유전자 발현 저해능을 측정한 결과는 도 13과 같다. 대조군에 비해 가공인삼 열수추출물 처치군은 100㎍/㎖에서 72.5% 유의하게(p<0.001) 저해되었다. Zymography를 이용하여 MMP-2 활성 저해능을 측정한 결과는 도 14와 같다. 대조군에 비해 가공인삼 열수추출물 처치군은 100㎍/㎖에서 47.6% 유의하게(p<0.001) 저해되었다.

Claims

가공인삼 열수추출물을 유효성분으로 함유하며, 상기 가공인삼은 수삼을 1) 110 내지 120℃에서 1 - 3 시간 숙성하는 단계, 2) 70 내지 90℃에서 9 - 11 시간 숙성하는 단계 및 3) 상기 1)단계 및 상기 2)단계를 4 내지 8회 반복하고, 이를 압축 및 건조시켜 제조한 가공인삼이고, 상기 가공인삼 열수추출물은 상기 가공인삼 300-500g에 물 4 내지 8L를 첨가하여 열수추출한 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 가공인삼 열수추출물은 멜라닌 합성 및 티로시나아제(tyrosinase) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 가공인삼 열수추출물은 콜라겐 합성을 증가시키고, 콜라겐 분해를 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가공인삼 열수추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.