KR102359044B1 - 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물, 또는 피부 미백용 식품 조성물 또는 의약외품 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물을 이용하여 피부 미백을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 피부미백용 조성물은 컬러감자의 외심 또는 내심의 추출물 또는 그의 분획물을 포함하므로, 컬러감자의 효과적인 이용에 널리 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물, 또는 피부 미백용 식품 조성물 또는 의약외품 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물을 이용하여 피부 미백을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정된다. 인체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 자외선으로 발생하는 피부손상을 차단하는 중요한 역할을 하고 있다. 멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나제의 작용이 가장 중요한 것으로 보고되어 있고, 타이로시네이즈(tyrosinase)는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)을 멜라닌 중합체 생성의 중간산물인 도파(DOPA) 및 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환함으로써 피부 흑화 과정에 핵심적 역할을 수행한다.
미백 기능성 화장품은 피부를 환하고 깨끗하게 만들어주는 화이트닝 기능을 가진 제품으로 상기 화장품은 이미 만들어진 멜라닌을 분해하여 피부를 하얗게 만들어주는 것이 아니라, 자외선이나 피부 노화로 인한 멜라닌 생합성 과정을 차단하는 효과를 가진다. 미백 효과를 가지는 유효 성분들은 스킨, 로션, 에센스를 포함하여 자외선 차단제나 파운데이션등의 다양한 제품군에 널리 사용될 수 있다. 현재까지 한국 식품의약품안전청에 미백 성분으로 고시된 물질은 닥나무추출물, 알부틴, 에틸아스코빌에텔, 감초추출물, 아스코빌글루코사이드, 마그네슘아스코빌포스페이트, 나이아신아마이드, 알파-비사보롤, 아스코빌테트라이소팔미테이트, 속수자종자추출물, 백출유, 감국추출물, 루시놀, 천궁추출물, 상지추출물 등이 있다. 닥나무추출물과 알부틴, 알파-비사볼올, 유용성감초추출물은 티로시나제가 활성되는 것을 억제하는 효과가 있으며, 아스코빌글루코사이드와 에칠아스코빌에텔, 아스코빌테트라이소팔미테이트는 티로시나제 효소에 자극받은 티로신이 산화되는 것을 막아주며, 나이아신아마이드는 이미 생성된 멜라닌이 멜라닌세포에서 각질형성세포로 전달되는 과정을 억제시키는 효과를 가진다. 최근들어 한국을 포함하여 전 세계적으로 효과가 탁월한 화학제품보다는 안전한 천연 식물을 이용한 화장품 소재를 선호하는 경향이 우세하다.
감자는 비타민C가 풍부하여 예로부터 감자로 뜨거운 태양에 익은 피부의 상처 완화에 이용돼 왔다. 한편 컬러감자의 천연색소인 시아니딘 및 카로틴계 화합물의 생리 활성 효과도 다양한 연구결과로 보고되고 있다. 그러나, 지금까지 컬러감자의 미백효과에 대해 공지된 바 없다. 또한, 컬러감자 수요증가에 따라 박피감자, 컬러감자칩과 같은 가공식품산업의 발전이 기대된다. 이 경우 가공과정에서 많은 양의 껍질이 폐기물로 발생해 이의 활용방안 마련이 필요한 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 멜라닌이 증식하면 피부 기미가 생기는 등 피부를 흑화시키는 주요 원인으로서, 멜라닌은 티로시나아제 효소의 연속적 산화반응으로 생합성되는바, 피부 미백 효과를 달성하면서 컬러감자의 외심의 활용성을 높이고자, 예의 노력한 결과, 티로시나아제 효소의 활성을 억제할 수 있는 유효성분을 포함하고 있는 컬러감자의 내심 및 외심의 추출물 또는 이의 분획물을 화장료 조성물로 사용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 인간을 제외한 개체의 피부에 처리하여 피부 미백을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "컬러감자"는 감자의 괴경색상을 형성하는데 관여하는 유전자의 다양성에 의해 괴경색상이 적색 및 보라색 등 시아니딘계 천연색소를 함유하는 감자를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 컬러감자는 특별히 이에 제한되지 않으나 일 예로서, 홍영, 자영, 수미, 서홍, 하령 등의 감자가 될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 상기 컬러감자의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 예컨데, 본 발명의 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명에 있어 상기 추출물은 컬러감자의 내심 또는/및 외심 추출물일 수 있다. 상기 '외심'은 감자의 껍질부분으로 구체적으로 바깥부터 10 mm까지, 보다 구체적으로는 5 mm 까지를 의미한다. 상기 '내심'은 외심을 제외한 나머지 부분을 의미한다.
본 발명의 상기 컬러감자 추출물에 있어서, 상기 컬러감자를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 컬러감자를 추출하는 데에 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 컬러감자 추출물은 물 또는 에탄올 추출물일 수 있다. 보다 구체적으로는, 80% 에탄올을 이용하여 5시간 환류추출기를 이용하여 추출 후 진공여과된 상층액을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 노회를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexan), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "피부미백"이란 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "타이로시나제(tyrosinase)"는 멜라닌의 생성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 타이로시나제는 타이로신을 기질로 하는 여러 반응을 통해 멜라닌을 형성하므로, 멜라닌 합성을 억제하기 위한 수단으로써 타이로시나제의 활성을 억제하는 방법이 많이 이용되고 있다.
이때, 상기 용어 "멜라닌"은 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 흑색 내지는 갈색 색소를 총칭한다. 세포 내에서 다양한 요인에 의해 합성되며, 표피에 존재하는 멜라닌은 자외선을 흡수하여 세포의 단백질이나 핵산의 손상을 방지하는 역할을 한다. 그러나, 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지게 되면, 멜라닌 생성과정에 이상이 생겨 기미, 주근깨, 검버섯, 일광흑색증(solar lentigines), 사마귀, 밀크커피반점, 오타모반, 청색모반, 몽고반점, 과다 색소침착 반(macule) 또는 잡티 등의 색소 침착을 유발한다.
본 발명의 상기 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물은 티로시나아제 효소 활성 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과를 나타내며, 이는 본 발명에서 최초로 규명된 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선스크린-크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 다양한 담체 또는 첨가제를 사용하여 다양한 형태의 화장품 제조에 사용될 수 있다.
일 예로서, 본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
다른 예로서, 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 제형이 팩(필오프 팩, 워시오프(wash off) 팩, 또는 마스크 시트팩)인 경우에는 담체 성분으로서 폴리비닐알코올, 카올린, 탈크, 산화아연, 또는 이산화티탄 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 컬러감자 추출물, 피부 미백은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품" 은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명에 따른 컬러감자 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 컬러감자 추출물, 피부 미백은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어 "식품 조성물"은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 컬러감자 추출물 또는 이의 분획물을 인간을 제외한 개체의 피부에 처리하는 단계를 포함하는, 피부 미백을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 '개체'는 인간을 제외한 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 피부미백용 조성물은 컬러감자의 외심 또는 내심의 추출물 또는 그의 분획물을 포함하므로, 컬러감자의 효과적인 이용에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 5품종 컬러감자 부위별 추출물의 티로시나아제 효소의 활성 억제 정도 평가 그래프이다.
도 2는 B16F10 세포에 대한 컬러감자 부위별 추출물 30 ppm 농도에서 세포독성을 평가한 그래프이다.
도 3은 α-MSH(α-Melanocyte stimulating hormone, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬) 처리된 B16F10 세포에 컬러감자 부위별 추출물 30 ppm 농도에서 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 피부세포(HaCaT cell)에 대한 세포독성 평가 그래프이다.
도 5은 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 간세포(HepG2)에 대한 세포독성 평가 그래프이다.
도 6는 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 피부세포(HaCaT cell) 보호 평가 그래프이다.
도 7는 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 간세포(HepG2) 보호 평가 그래프이다.
도 8은 자영 외심 클로로포름 분획물의 LPS 유도 처리된 RAW 246.7 대식세포에서의 일산화질소(Nitric oxide, NO)생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9은 자영 외심 클로로포름 분획물의 LPS 유도 처리된 RAW 246.7 대식세포에서의 PGE2 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 B16F10 세포에 대한 컬러감자 부위별 추출물 30 ppm 농도에서 세포독성을 평가한 그래프이다.
도 3은 α-MSH(α-Melanocyte stimulating hormone, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬) 처리된 B16F10 세포에 컬러감자 부위별 추출물 30 ppm 농도에서 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 피부세포(HaCaT cell)에 대한 세포독성 평가 그래프이다.
도 5은 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 간세포(HepG2)에 대한 세포독성 평가 그래프이다.
도 6는 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 피부세포(HaCaT cell) 보호 평가 그래프이다.
도 7는 컬러감자의 추출물 100 ppm 농도에서 간세포(HepG2) 보호 평가 그래프이다.
도 8은 자영 외심 클로로포름 분획물의 LPS 유도 처리된 RAW 246.7 대식세포에서의 일산화질소(Nitric oxide, NO)생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9은 자영 외심 클로로포름 분획물의 LPS 유도 처리된 RAW 246.7 대식세포에서의 PGE2 생성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 컬러감자 추출물의 제조
컬러감자의 외심 및 내심을 박리 후 초저온동결건조기를 이용하여 -70℃상에서 48시간 동안 동결건조를 하였다. 건조된 시료는 추출 수율을 높이기 위하여 분쇄를 하였다. 분쇄된 각 시료는 시료 10 g에 80% 에탄올 100 mL을 추가하여 상온에서 5시간동안 환류추출기를 이용하여 추출 후 진공여과하여 상등액을 회수하였다. 위와 같은 추출 방법을 같은 시료에 3회 반복하여 추출 및 여과를 진행하고, 상등액은 진공농축기를 이용하여 농축 후 활성 측정을 진행하였다.
실시예 2. 티로시나아제 억제 효과 평가
피부미백효과를 평가하기 위해 컬러감자 5종(수미, 자영, 서홍, 하령 및 홍영)을 대상으로 상기 실시예 1의 방법을 수행하여 수득한 각각의 추출물 중에서 최적의 미백효과를 나타내는 추출물을 결정하고자, 각각의 용매추출물을 수득하고, 상기 수득한 각 추출물의 티로시나아제 억제활성을 비교하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 피부는 산화 스트레스 또는 UV 등에 노출되면 멜라닌이 증가하고 이로 인하여 기미가 생성된다. 멜라닌은 티로시나아제 효소의 연속적 산화반응으로 생합성되며, 티로시나아제는 멜라닌 생합성 과정의 주요 효소로 알려져있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 5품종의 감자의 내심과 외심 추출물의 티로시나아제 억제 활성을 통해 피부 미백 효과가 있음을 확인하였고, 그중에서도 특히 외심 추출물이 내심 추출물에 비해 현저히 우수한 피부 미백효과가 있음을 나타내어 외심 추출물의 활용 가능성을 시사하였다.
실시예 3. B16F10 세포의 세포독성 및 멜라닌생성 억제 효과 평가
3.1 B16F10 세포에 대한 세포독성 평가
컬러감자 부위별 추출물의 멜라닌 생성 저해 효과 측정시에 이용한 B16F10 멜라닌 세포(melanoma cell)는 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 와 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin) 100 unit/mL을 첨가한 세포 배양 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)를 이용하였으며 배양조건은 37℃, 5% CO2에서 계대 배양하여 사용하였다. 세포독성은 colorimetric assay인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 방법을 이용하여 측정하였다. 세포는 1.5 Х 104 cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 추출물을 처리하였다. 20시간 후 0.5 mg/ml MTT 용액을 각 well에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 생성된 포르마잔 생성물(formazan product)을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 재용해 한 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 멜라닌생성 세포인 B16F10 세포에 대한 세포독성은 각 컬러감자의 품종에 따른 부위별 추출물 농도 30 μg/mL(ppm)에서 90%이상 세포 생존율을 확인하였으며, 이를 통해, 농도 30 μg/mL(ppm) 에서는 세포독성이 없는 것으로 알 수 있었다. 따라서 멜라닌 색소 생성 억제 실험은 상기 추출물 농도 30 μg/mL(ppm)에서 실시하였다.
3.2 B16F10 세포에서 멜라닌생성 억제 효과 평가
B16F10 세포에 α-MSH(α-Melanocyte stimulating hormone, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬)와 컬러감자 추출물을 함께 처리하여 5일간 배양하고 세포를 수거하여 Phosphate-buffered saline(PBS)로 2회 수세하여 수획하였다. 10% dimethylsulfoxide (DMSO, Ameresco, Solon, Ohio, USA)가 첨가된 1 N NaOH 용액을 처리하여 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 멜라닌 정량은 합성멜라닌을 이용하여 ELISA reader (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA)로 475 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 농도별 표준곡선을 작성한 후 작성된 표준곡선에서 각 시료의 멜라닌 농도를 구하였다. 각 컬럼감자의 품종에 따른 부위별 추출물의 멜라닌생성 세포인 B16F10 세포에 대한 멜라닌 색소 생성 억제 실험은 각 컬러감자의 품종에 따른 부위별 추출물 농도 30 μg/mL(ppm)에서 실시 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 대부분의 컬러감자에서 B16F10 세포내 멜라닌생성 억제효과를 나타냈다. 그 중 자영과 서홍 품종의 억제율이 가장 좋았으며, 홍영, 하령 순으로 멜라닌생성 억제 효과를 나타냈다. 컬러감자 추출물을 처리 하지 않고 멜라닌색소 유발물질 α-MSH만 처리 하였을 경우 대조군의 180%를 나타낸 반면 컬러감자 추출물과 α-MSH 동시 처리 하였을 경우 대부분 멜라닌생성이 감소하는 것으로 나타났다. 특히 자영 외심 추출물의 경우, 대조군의 115%로 매우 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 나타냈다.
실시예 4. 피부세포 및 간세포 독성 평가
상기 실시예 1로부터 수득한 5품종의 컬러감자 추출물의 세포독성은 colorimetric assay인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 방법을 이용하여 측정하였다. 세포는 1.5 Х 104 cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 추출물을 처리하였다. 20시간 후 0.5 mg/ml MTT 용액을 각 well에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 생성된 포르마잔 생성물(formazan product)을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 재용해 한 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 4 및 도 5에 각각 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 5품종의 컬러감자 부위별 추출물 100 ppm 농도에서 내심 추출물은 수미, 자영, 홍영에서 피부세포에 대한 세포독성이 없는 것을 알 수 있었으며, 외심 추출물은 5품종 모두 세포독성이 없는 것을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 인체 유래 간세포에서는 5품종 추출물 모두에서 세포독성이 없음을 확인하였다.
실시예 5. 세포 산화 스트레스 보호 효과 평가
HepG2 세포는 1.5 Х 104 cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 추출물을 처리하였다. 20시간 후 500 μM TBHP로 4시간 동안 산화적 스트레스를 유도하고 0.5 mg/ml MTT 용액을 각 well에 첨가하였다. 4시간 배양 후 생성된 포르마잔 생성물(formazan product)을 DMSO에 재용해한 후 microplate reader를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다
상기 실시예 1로부터 수득한 5품종의 컬러감자 추출물의 산화적 스트레스로부터 인체 유래 피부 세포(HaCaT cell) 및 간세포(HepG2) 보호 활성 효과를 확인하였으며, 그 결과는 도 6 및 도 7에 각각 나타내었다. 5품종의 컬러감자 부위별 추출물 100 ppm 농도에서 자영 및 홍영의 세포보호 효능이 우수함을 알 수 있었다. 또한, 5품종 컬러감자 추출물 모두 외심 추출물의 세포보호 활성이 더 큼을 확인하였다. 이는, 컬러감자 외심의 활용성을 시사하는 것이다.
실시예 6. '자영' 부위별 추출물의 항염 활성 평가
상기 실시예 2 내지 5의 결과로부터, 5종의 컬러감자 중에서 자영이 상대적으로 우수한 티로시나아제 억제활성을 나타내면서도 피부 및 간세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 확인하였으므로, 상기 자영의 내심 및 외심 추출물을 대상으로 이의 항염증 활성을 평가하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1로부터 수득한 컬러감자 추출물 중 자영의 내심 및 외심 추출물을 마우스 대식세포(Raw 264.7)에 처리하여 일산화질소(NO) 생성 저해효과 및 세포내에서 염증 반응이 일어날 때 발현되는 사이토카인 단백질 발현 저해 효과를 확인하였고, 그 결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다. 일산화질소(NO)는 내피 세포, 신경세포, 혈관 평활근 및 간세포에 이르기까지 다양한 종류의 세포들에 의하여 합성되며, 세포내 NOS(Nitric oxide synthase) 에 의하여 아미노산인 L-아르기닌으로부터 합성되고, 산화되어 안정적이고 불활성 산화물인 아질산 이온(NO2 -)과 질산이온(NO3 -) 으로 되며, 염증 발생 시에 NO와 종양 괴사 인자인 TNF-α, IL-1(interlukin-1) 및 IL-6(interlukin-6) 등의 많은 사이토카인들이 급격히 생성된다. 일산화질소(Nitric oxide, NO)양의 측정은 그리스 시약(Griess reagent) [1% (w/v) 설파닐아마이드 (sulfanilamide), 0.1% (w/v) N-1-나프틸에틸렌디아민-염산 (naphtylethylenediamine-HCl)을 5% (v/v) 인산(phosphoric acid)용액에 혼합한 것]를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다. 그리스 시약(Griess reagent)을 100 μl씩 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)로 유도된 마우스 대식세포인 RAW 246.7 PGE2(Prostaglandin E2)양의 측정은 각 컬러감자의 품종에 따른 부위별 추출물을 처리한 세포 및 대조군의 세포배양액을 취해 assay design kit(Amersham Pharmacia Biotech Co., USA)의 지시에 따라 측정하였다. 웨스턴 블랏(Western blot) 시험 샘플을 처리한 세포 및 대조군을 용해 완충액(lysis buffer)인 PROPREP(Intron Biotechnology Co., Korea)으로 세포를 용해한 후 원심분리하여 상등액을 취하여 단백질을 추출하였다. 상등액을 브래드포드 시약(Bradford reagent)을 사용해 단백질 농도를 정량하여 30 μg의 단백질을 취했다. 추출된 단백질은 10%의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 시킨 후 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Poly(vinylidene fluoride) membrane, PVDF membrane)으로 겔(gel)의 단백질을 블랏시켰다. 5% 스킴 밀크(skim milk)로 90분 블로킹(blocking)한 후 1:1000의 비율로 일차 항체(primary antibody)를 상온에서 4시간 방치 후 T-TBS (Tween-tris-buffered saline)로 10분 간격으로 3회 세척하였다. 이차 항체(secondary antibody)를 1:2000의 비율로 상온에서 1시간 방치 후 T-TBS로 10분 간격으로 3회 세척한 후 화학 발광(chemiluminescence; Carestream Molecular Imaging Co.,USA)으로 현상하였다. 그 결과, LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 PGE2 생성이 40%까지 억제되는 것을 도 9을 통해 알 수 있었다.
이는, 컬러감자의 추출물 또는 이의 분획물은 NO 및 PGE2의 생성에 직접적으로 관여하는 Inos (Inducible nitric oxide synthase)와 COX-2 (Cyclooxygenase-2)와 같은 단백질 효소의 발현을 저해함으로써 우수한 항염증 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.
종합하면, 컬러감자 5품종의 외심 및 내심 추출물 또는 이의 분획물을 이용하여 실험한 결과 멜라닌 세포, 간세포 및 피부세포에 대해 세포독성이 거의 없고, 세포의 산화 스트레스로부터 보호하는 역할을 하며 항염효과 및 피부미백 효과가 있음을 알 수 있었다. 특히, 피부 미백 효과와 관련하여 티로시나아제 활성 억제 및 멜라닌 생성 억제 효과가 있음을 확인하여 피부 미백 화장료 조성물로서 활용가능성이 높음을 확인하였다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
Claims (7)
- 자영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 추출물은 자영의 외심 또는 내심 추출물인 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 미백은 티로시나아제의 활성 억제에 의해 달성되는 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
- 자영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 의약외품 조성물.
- 자영 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 식품 조성물.
- 자영 추출물 또는 이의 분획물을 인간을 제외한 개체의 피부에 처리하는 단계를 포함하는, 피부 미백을 촉진하는 방법.
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| 농촌진흥청, "감자의 끝없는 진화, 천연색 컬러감자", 대한민국 정책브리핑, 2009.06.24., 페이지 1-2* |
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