KR101175195B1

KR101175195B1 - 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 함유하는 염증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101175195B1
Application number: KR1020100050897A
Authority: KR
Inventors: 정명근; 황영선; 박영은; 정진철; 조현묵; 백남인; 이대영; 이경태
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2010-05-31
Publication date: 2012-08-20
Also published as: KR20110131452A

Abstract

본 발명은 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 함유하는 염증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유색감자로부터 분리된 자색 색소가 염증성 질환을 야기하는 것으로 알려진 NO 생성과 TNF-a 및 IL-6 생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인함으로써 염증성 질환의 예방 및 치료와 건강식품의 재료로 유용하게 사용될 수 있는 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 함유하는 염증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

유색감자로부터 분리된 자색 색소를 함유하는 염증 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and treatment of anti-inflammatory effects comprising purple pigments isolated from purple-potato}

본 발명은 유색감자에서 분리해 낸 자색 색소가 항염증 활성을 나타냄을 확인하고 이를 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용한 의약품 및 건강식품으로의 용도로 사용할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

안토시아닌(Anthocyanin)은 식물의 꽃, 과실, 줄기, 잎 등에 폭넓게 함유되어 있는 적색, 자색, 청색을 나타내는 수용성 플라보노이드(flavonoid) 색소이다. 이러한 안토시아닌은 천연색소로서의 기능 외에도 다양한 생리활성을 나타내어 항산화, 콜레스테롤저하, 시력개선효과, 혈관보호기능, 동맥경화, 심장병예방, 항궤양기능, 항암, 항염증, 당뇨억제, 자외선으로부터의 보호기능 등 다양한 생리활성을 나타내어 의약품에도 적극 활용되고 있어 건강식품 및 신 의약품 창출의 새로운 대상으로 조명을 받고 있다.

한편, 감자(Solanum tuberosum L.)는 가지과(Solanaceae)에 속하는 다년생 식물로서 원산지는 남아메리카 안데스산맥의 중부고산지, 즉 칠레의 중북부로부터 볼리비아, 페루, 에쿠아도르에 이르는 지역으로 평가하고 있고, 고대 잉카국에서는 감자를 식용으로 재배하였다는 보고가 있고, 현재와 같은 재배종은 1,000 여년전부터 재배되었으며, 16세기에 스페인 사람들에 의해 서구로 전래되었다. 우리나라에는 1830년 경 네덜란드인에 의해 중국으로부터 씨감자가 도입되어 재배되기 시작하였다. 감자는 생육기간이 짧고, 단위면적당 생산량이 높으며 환경적응성도 비교적 강하여 세계 130 여개 나라에서 재배되며, 벼, 밀, 콩, 옥수수 등과 함께 세계주요 식량작물로 여겨지고 있다.

현재 전 세계적으로 재배되고 있는 감자의 괴경색은 백색이나 연황색이 주종을 이루지만 자연계에는 괴경 색상 형성에 관여하는 유전자의 다양성에 의해 적색 및 보라색 등 안토시아닌 색소를 함유하고 있는 다양한 색상의 유색감자도 존재한다.

감자는 우리나라에서도 식용으로의 이용이 대부분이며, 우리나라 전역에서 재배되고 있으며, 식용으로 사용하는 감자는 대부분 괴경색이 백색 - 연황색을 나타내는 일반종이 사용되고 있고, 최근 소비자의 기호와 건강 기능성에 관심이 고조되면서 국내에서도 일부 유색감자의 재배가 시작되고 있는 실정이다.

덩이줄기 내부에 적색 또는 보라색 안토시아닌 색소를 함유하는 유색감자는 그들만이 가지는 색깔과 독특한 맛을 함유하고 있을 뿐만 아니라 샐러드나 튀김용으로 사용할 경우 요리 후에도 그 색상을 유지하고 있어 유색감자에 대한 소비자의 요구도가 증대되고 있으며, 유색감자는 다량의 안토시아닌 색소와 페놀산(phenolic acid)을 함유하고 있는 것으로 보고되고 있고, 미국의 경우 채소로서 소비되는 유색감자의 양은 1인당 135 파운드에 이르고 있다.

최근에는 이러한 유색감자 추출물의 항산화, 항돌연변이, 세포증식억제, 특정 암세포의 생장저해 효과가 보고 된 바 있으나, 각 활성의 근원물질에 대한 정보는 전무한 상황에 있다.

한편, 염증(Inflammation)은 세포 및 조직의 손상이나 감염에 대한 국부적인 또는 전신적인 방어기작이다. 염증은 주로 면역계를 이루는 수많은 체액성 매개체(humoral mediator)가 직접 반응하거나 국부적 또는 전신적 작동 시스템(effector system)을 자극함으로써 일어나는 연쇄적인 생체반응에 의해 유발된다. 이러한 염증반응에 관여하는 매개체들로는 PMN (polymorphonuclear leukocytes), CTL (cytotoxic T lymphocyte), NK 세포, 대식세포 등과 같은 면역세포와 사이토카인 등이 있다. 염증성 질환은 특히, 염증성 사이토카인의 불균형과 효과세포(effector cell)의 상호작용에 의해 야기된다.

주요 염증성 질환으로는 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염; 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨성 안질환 등이 있다.

현재까지 알려진 주요한 염증성 사이토카인으로는 대식세포 및 단핵구 세포에 의해 생성되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1, IL-6 및 IL-18 등이 있다.

이 중에서 TNF-α는 저농도에서 적절한 지혈 및 방어 작용을 수행하지만, 고농도에서는 전신 또는 특정조직에서 IL-1과 같은 다른 종류의 염증성 사이토카인과 함께 작용하여 염증반응을 악화시킨다고 알려져 있다.

본 발명은 유색감자 괴경의 추출물로부터 2종의 안토시아닌 화합물을 순수분리하였고, 이들 중 1개의 안토시아닌 화합물이 우수한 항염증 활성을 나타냄을 확인하였다. 즉, 본 발명은 유색감자 괴경의 추출물에서 분리한 자색 색소인 안토시아닌 화합물 및 상기 안토시아닌계 자색 색소를 유효성분으로 함유하는 추출물이 NO 생성량을 억제하고, TNF-α 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들의 생성량을 감소시키는 특성을 확인하였으며, 이를 염증 예방과 치료 및 개선을 위한 조성물로서 이용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물과 예방 및 개선을 위한 건강식품의 재료로 유용하게 사용될 수 있는 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 함유하는 염증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명은, 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 다음 화학식 1로 표시되는 안토시아닌계 자색 색소를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌계 자색 색소를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 특징으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 일례로서, 상기 염증성 질환은 류마티스를 비롯한 골관절 및 퇴행성 관절염 질환, 세균 및 진균에 의한 급성 및 만성 피부염, 홍반 및 부종을 수반하는 피부질환, 치은 및 치주염을 포함하는 구강 및 치주 질환 등의 과다 염증반응에 의하여 발생하는 질환 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 분리하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 유색감자를 세절하여 산을 함유하는 물 또는 알콜 수용액에 침지하여 안토시아닌 조 추출물을 추출한 다음 여과하여 불용물을 제거하고 농축하여 안토시아닌 조 추출물을 얻는다.

이때, 상기 안토시아닌 조 추출물의 추출은 세절한 유색감자에 0.1 내지 10% 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하여 24시간 내지 72시간 동안 침지하는 과정을 2 내지 4회 반복 수행하는 추출과정으로 이루어진다.

상기 산으로는 염산이나 유기산을 사용할 수 있으며, 이들의 산성 정도에 따라 첨가량을 조절하여 냉침에 사용되는 산 함유 물 또는 알콜 수용액의 pH가 안토시아닌 조 추출물의 추출에 적합하도록 한다. 이를 위해 염산을 사용할 경우 농도는 0.1 내지 1% 가 바람직하며, 유기산을 사용할 경우에는 1 내지 10%가 바람직하다. 유기산으로는 개미산, 초산, 능금산, 호박산 및 구연산 중에서 선택된 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있다.

상기 알콜로는 탄수소 1 내지 4의 저급 알콜을 사용할 수 있으며, 침지에 사용되는 알콜 농도는 20 내지 80% 범위가 되는 것이 좋다.

침지 시간은 짧을 경우에는 안토시아닌 조추출물의 완전한 추출이 어렵고, 침지 시간이 길거나 반복 횟수가 4회를 초과할 경우에는 효율성이 저하되는 경향이 있다.

상기와 같이 산을 함유하는 물 또는 알콜 수용액에 침지한 후 여과하여 잔사를 제거하고, 물, 알콜 및 산을 제거하여 안토시아닌 조 추출물을 농축시킨다.

상기 농축물에 산을 함유하는 물을 첨가하고, 물과 알콜의 농도구배를 달리한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 안토시아닌 색소 분획을 얻어 각 분획을 농축 건조하고 재용해한 다음 분취 HPLC를 사용하여 순수 분리한다.

얻어진 안토시아닌 화합물의 구조는 NMR, MS 등의 다양한 분광분석법으로 동정하였으며, 그 결과 상기 화학식 1과 같은 구조를 가지는 안토시아닌계 자색 색소를 얻었다.

상기와 같이 유색감자로부터 분리된 안토시아닌계 자색 색소는 다양한 염증성 질환을 야기하는 것을 알려진 NO 생성과 TNF-α 및 IL-6 생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였으며, 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물은 NO 생성과 TNF-α 및 IL-6 생성에 의하여 야기되는 것으로 알려진 다양한 염증성 질환에 대하여 적용할 수 있으며, 대표적으로 이러한 염증성 질환으로는 류마티스를 비롯한 골관절 및 퇴행성 관절염 질환; 세균 및 진균에 의한 급성 및 만성 피부염과 홍반 및 부종을 수반하는 피부질환; 치은 및 치주염을 포함하는 구강 및 치주 질환 등의 과다 염증반응 등 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 염증성 피부질환을 구체적으로 예를 들면, 아토피 피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상 등에 의해 촉발되는 홍반성 질환, 산 화상, 수포성 피부병, 태선 모양 종류 질환, 알레르기에 기한 가려움증, 지루성 습진, 장미 여드름, 심상성 천포창, 다형 삼출성 홍반, 결절 홍반, 귀두염, 음문염, 원형 탈모증과 같은 염증성 모발 손실, 피부 T-세포 림프종 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 유색감자 물 또는 알콜 추출물 또는 화학식 1의 안토시아닌계 자색 색소를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품, 의약외품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 외용제로 적용될 수 있으며, 구체적으로 스프레이제, 패치제, 파우더, 연고, 로션, 젤 등으로 제제화 될 수 있다. 파우더 또는 스프레이제로 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 스프레이제로 적용할 경우에는 추가적으로 클로로플루오르히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 치주질환의 효과적인 예방, 치료 및 개선을 위하여 구강용 조성물 형태로 제공될 수 있으며, 상기 구강용 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 제형을 가질 수 있다. 구체적으로는 치약, 구강세정제 또는 구강청정제 등의 제형을 가질 수 있다. 본 발명에서 제공하는 구강용 조성물은 그 제형에 따라 제제화에 필요한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 예를 들면, 구강용 조성물의 제형이 치약류인 경우, 연마제, 습윤제, 기포제, 결합제, 감미제, pH조절제, 방부제, 약효성분, 향료, 증백제, 색소, 용제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 유색감자의 물 또는 에탄올 추출물 또는 화학식 1의 화합물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 유색감자로부터 분리된 물 또는 에탄올 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌계 자색 색소는 식용되는 감자로부터 분리 동정되었으므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 염증성 질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 건강식품으로 개발될 수 있다.

본 발명의 유색감자로부터 분리된 물 또는 에탄올 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌계 자색 색소를 건강식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이다.

즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수 있으며, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.

본 발명은 유색감자로부터 분리된 자색 색소가 염증성 질환을 야기하는 것으로 알려진 NO 생성과 TNF-α 및 IL-6 생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인함으로써 염증성 질환의 예방 및 치료와 건강식품의 재료로 유용하게 사용될 수 있는 유색감자로부터 분리된 자색 색소를 함유하는 염증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

도 1은 실시예 1에서 유색감자로부터 분리된 안토시아닌 An 2의 UV-VIS 흡광 특성을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 유색감자 조추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 얻어진 유색감자로부터 분리된 안토시아닌의 5개 분획의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 도 3의 Fra 4.를 분취-HPLC를 사용하여 고순도 분리하여 얻어진 분리 안토시아닌 An 2를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1에서 분리된 안토시아닌(An 2)의 FAB-MS DATA를 나타낸 것이다.
도 6는 실시예 1에서 분리된 안토시아닌(An 2)의 ¹H-NMR 스펙트럼(a)과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 1에서 분리된 안토시아닌(An 2, peonanin)의 RAW 264.7 세포에서의 세포독성(cytotoxicity)을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 1에서 분리된 안토시아닌(An 2, peonanin)가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 1에서 분리된 안토시아닌(An 2, peonanin)가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 PGE2에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 1에서 분리된 안토시아닌(An 2, peonanin)가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-6 분비에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참고예 . 재료 및 방법

1) 기기 및 시약.

유색감자 함유 안토시아닌의 추출을 위해 사용된 증류수는 초순수 제조기(Milli-Q system, USA)에서 비저항값이 18 MΩ 이상으로 제조된 초순수 증류수를 사용하였고, 메탄올은 국산 GR 등급을, 염산용액은 일본 화광순약주식회사의 특급시약을 구입하여 사용하였으며, Preparative-HPLC 및 Analytical-HPLC의 이동상 용매로 사용된 아세토나이트릴(acetonitrile) 및 포름산(formic acid)은 Merck Inc.(USA)의 HPLC 등급을 구입하여 사용하였다.

안토시아닌 분리를 위한 컬럼 크로마토그래피(Column chromatography)용 ODS(octadecylsilica gel)은 Lichroprep RP-18 (40?63μm, Merck, Germany)을 사용하였고, 기기분석에 사용된 NMR용 용매는 methanol-d ₄, Dcl(Merck, Germany)의 특급시약을 사용하였다.

유색감자 함유 안토시아닌의 고순도 분리 및 정성분석에 사용된 Preparative- HPLC 및 Analytical-HPLC는 Agillent 1200 series(USA)를 사용하였으며, HRFAB-MS는 JMS 700 (JEOL, Japan)를 사용하여 측정하였다. NMR은 400 MHz, Inova AS 400, FT-NMR spectrometer (Varian, USA)로 측정하였다.

2) 실험재료

본 발명에 사용한 유색감자는 농촌진흥청에서 품종 등록한 자영품종으로서 2008년 4월 농촌진흥청 국립식량과학원 고령지농업연구센타에서 감자 표준재배법으로 재배된 감자(KNU-HMRAL-20080612)를 이용하여 실험을 진행하였다.

실시예 1. 안토시아닌의 분리

유색감자 자영의 껍질을 제거하고 2 내지 3mm 수준으로 자른 생체 1 kg을 1%염산 함유-메탄올(20 L)에서 24시간 상온 추출하였다. 얻어진 추출물을 여과하고, 남은 것은 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 얻어진 여액을 모두 합치고 40 ℃ 조건에서 감압 농축하여 농축액을 얻었다.

이때 Preparative-HPLC의 분리 조건으로 컬럼은 HiQ sil C18-10 (21.0 × 250mm, KYA TECH, Japan)을 이용하였고, 분석파장 530nm, 분당 유속 10mL, 분석 용매로 A용매는 5% 포믹산 함유 증류수, B용매는 5% 포믹산 함유 아세토나이트릴을 농도구배(0분 : 85% A, 15분 : 85% A, 20분 : 70% A, 21분 : 85% A, 30분 : 85% A의)로 사용하였고, 시료 주입량은 2mL로 조절하여 고순도 분리를 실시하였다. 표 1에는 분리 안토시아닌 An 2의 분광적 특성을 간단하게 정리하였으며, 도 1에는 분리 안토시아닌 An 2의 UV-VIS 흡광 특성을 크로마토그램으로 나타내었다.

An 2, red amorphous powder; UV (MeOH) λ_max 523 nm; FAB-MS [M+H]+ m/z 917[M+H]+, 755[M-glc], 627, 463, 301; ¹H-NMR (400 MHz): 8.96 (1H, s, H-4), 8.21 (1H, d, 8.0 Hz, H-5'), 8.11 (1H, d, 1.6 Hz, H-2'), 7.49 (1H, d, 16.0 Hz, H-7p), 7.34 (2H, d, 8.4 Hz, H-2p,6p), 7.04 (1H, br s, H-8), 7.00 (1H, dd, 8.0, 1.6 Hz, H-6'), 6.97 (1H, br s, H-6), 6.75 (1H, 8.4 Hz, H-3p,5p), 6.18 (1H, d, 16.0 Hz, H-8p), 5.58 (1H, d, 7.6 Hz, H-1''), 5.20 (1H, d, 7.6 Hz, H-1'''), 4.87 (1H, dd, 8.4, 8.4 Hz, H-4''''), 4.71 (1H, br s, H-1''''), 4.02 (1H, br d, 10.8 Hz, H-6''a), 3.92 (3H, s, peonidin-OCH₃), 3.90~3.40 (sugar moiety), 0.98 (3H, d, 6.0 Hz, H-6''''). ¹³C-NMR (100 MHz) 169.5 (C-7), 168.7 (C-9p), 163.8 (C-4p), 161.2 (C-2), 156.7 (C-9), 156.4 (C-5), 149.3 (C-3'), 146.7 (C-7p), 145.7 (C-3), 134.5 (C-4), 131.0 (C-2p,6p), 129.3 (C-5'), 126.9 (C-1p), 120.6 (C-1'), 117.8 (C-5'), 116.6 (C-3p,5p), 115.1 (C-2'), 114.8 (C-6p), 113.0 (C-10), 105.4 (C-6), 102.5 (C-1'', 1'''), 101.9 (C-1''''), 97.5 (C-8), 78.5 (C-5'''), 78.0 (C-5''), 77.7 (C-3'''), 77.4 (C-3''), 75.2 (C-4''''), 74.7 (C-2'', 2'''), 71.9 (C-3''''), 71.1 (C-4'''), 70.8 (C-4''), 70.2 (C-2''''), 67.7 (C-5''''), 67.2 (C-6''), 62.0 (C-6'''), 57.1 (peonidin-OCH₃), 17.9 (C-6'''').

Anthocyanin	On-line HPLC-DAD spectral data
Anthocyanin	λmax (nm)	E _acyl/E _max	E ₄₄₀ /E _max
An 2	281, 294, 311, 523	83%	15%

유색감자 자영의 1%염산 함유-메탄올로 추출물을 ODS c.c. 및 분취(Preparative)-HPLC 분리를 실시하여 1종의 강력한 항염증 활성을 나타내는 안토시아닌 화합물 An 2를 분리하였다.

안토시아닌 2(An 2)는 적색의 분말상으로써, TLC에 전개시켜 관찰한 결과 UV 흡수가 있었고, 10% aq. H₂SO₄로 분무, 건조 및 가열하였을 경우 진한 붉은색으로 발색되었고, FAB-MS 스펙트럼(spectrum)으로부터 m/z: 917 [M]⁺의 피크가 관측되었고, UV 스펙트럼으로부터 λmax 523 nm으로 측정되어, 안토시아닌(anthocyanin) 화합물임을 예측할 수 있었다.

¹H-NMR (400MHz, CD₃OH) 스펙트럼에서 δH 8.96 (1H, s, H-4), 8.21 (1H, d, 8.0 Hz, H-5'), 8.11 (1H, d, 1.6 Hz, H-2'), 7.00 (1H, d, 8.0, 1.6 Hz, H-6'), 7.04 (1H, br s, H-8) 및 6.97 (1H, br s, H-6)의 값으로부터 올레핀성 페틴 프로콘 시그널(olefinic methine proton signal)을 확인할 수 있었고, 각 시그널의 짝짓기 패턴(coupling pattern)으로부터 A-고리의 1,2,3,5-4치환 및 B-고리의 1,3,4-3치환된 페오니딘(peonidin)의 구조임을 예상할 수 있었다.

δH 5.58 (1H, d, 7.6 Hz, H-1''), 5.20 (1H, d, 7.6 Hz, H-1'''), 4.71 (1H, br s, H-1'''')의 시그널에서 당 분자들의 아노머 프로톤(anomer proton)이 관측되었고 세 개의 당 분자가 존재함을 예상하였다. 산소가 치환된 영역에서 다수의 산소화 메틴(oxygenated methine), 메틸렌 프로톤 시그널(methylene proton signal) (δH 3.90~3.50, sugar moiety)들이 관측되었고, 메톡시 시그널(methoxy signal) (δH 3.92, peonidin-OCH₃)이 관측되었다. 또한, 아로마성(aromatic) 영역에서 올레핀 메틴 시그널(olefine methine signal) [δH 7.49 (1H, d, 16.0 Hz, H-7p), 7.34 (2H, d, 8.4 Hz, H-2p, 6p), 6.75 (1H, 8.4 Hz, H-3p, 5p), 6.18 (1H, d, 16.0 Hz, H-8p)]이 관측됨에 따라 페놀산(phenolic acid)이 존재함을 예상하였다. 고자장 영역에서 메틸 프로톤 시그널(methyl proton signal) [δH 0.98 (d, 6.0 Hz, H-6'''')]이 관측되었다.

¹³C-NMR 및 DEPT 스펙트럼에서 모두 44개의 시그널이 관측되었으며, 저자장 영역에서 카르복실 카본 시그널(carboxyl carbon signal) [δc 168.7 (C-9p)]과 아그리콘(aglycone)의 올레핀 쿼터너리 카본 시그널(olefine quaternary carbon signal) [δc 169.5 (C-7), 161.2 (C-2), 156.7 (C-9), 156.4 (C-5), 149.3 (C-3'), 145.7 (C-3), 120.6 (C-1'), 113.0 (C-10)] 및 올레핀 메틴 카본 시그널(olefine methine carbon signal) [δc 134.5 (C-4), 129.3 (C-5'), 115.1 (C-2'), 113.8 (C-6'), 105.4 (C-6), 97.5 (C-8)]이 관측되었다. 메톡시 시그널(Methoxy signal) [δc 57.1 (peonidin-OCH₃)]이 HMBC 스펙트럼에서 아그리콘의 올레핀 쿼터너리 카본(olefine quaternary carbon) [δc 149.3 (C-3')]과의 cross-peak를 확인한 결과, 아그리콘은 페오니딘(peonidin)으로 구조 동정하였다.

¹H-NMR 스펙트럼에서 확인된 페놀산(phenolic acid)의 프로톤 짝짓기 패턴(proton coupling pattern) 및 짝짓기(coupling) 값을 계산하고 동정된 시그널을 HSQC, HMBC 스펙트럼을 통하여 카본 시그널을 동정한 결과, 파라-쿠마로일(para-coumaroyl)로 구조 동정하였고, 올레핀 메틴 프로톤(olefin methine proton) (H-7p, H-8p)이 16.0 Hz로 짝짓기하는 것으로 미루어 트랜스(trans)임을 확인하였다.

아그리콘에 결합되어 있는 당 분자들의 아노머 프로톤 시그널(anomeric proton signal)을 토대로 COSY를 측정하고, 연결된 각 프로톤 시그널을 HSQC 스펙트럼을 바탕으로 카본 시그널과 크로스-피크(cross-peak)를 확인한 결과, 아그리콘에 결합되어 있는 당은 글루코스(glucose) [102.5 (C-1'', 1'''), 78.5 (C-5'''), 78.0 (C-5''), 77.7 (C-3'''), 77.4 (C-3''), 74.7 (C-2'', 2'''), 71.1 (C-4'''), 70.8 (C-4''), 67.2 (C-6''), 62.0 (C-6''')] 두 분자와 람노스(rhamnose) 한 분자 [101.9 (C-1''''), 75.2 (C-4''''), 71.9 (C-3''''), 70.2 (C-2''''), 67.7 (C-5''''), 17.9 (C-6'''')]들이 결합되어 있는 것을 확인하였다. HMBC 스펙트럼을 통해, 글루코스의 아노머 프로톤 시그널 [δH 5.58 (d, 7.6 Hz, H-1'')]과 아그리콘의 올레핀 쿼터너리 카본 시그널 [δc 145.7 (C-3)]과 상호 관련(correlation)하는 것이 확인되었고, 산소화 메틸렌 시그널(oxygenated methylene signal) [δH 4.02 (1H, brd., 10.8 Hz, H-6''a)]이 람노스의 아노머 카본 [101.9 (C-1'''')]과 결합되어 있으며, H-6'' a 시그널이 글리코시데이션 시프트(glycosidation shift)에 의해 2 ppm 정도 저자장으로 이동함을 확인되었다.

¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 확인된 파라-쿠마로일(para-coumaroyl)의 카르복실 카본 [168.7 (C-9p)]이 람노스의 산소화 메틴 프로톤 [δH 4.87 (dd, 8.4, 8.4 Hz, H-4'''')]과 상호 연관하는 것을 HMBC로 확인하였고, 화학적 시프트(chemical shift)로부터 아실화(acylated)된 것을 확인하였다. HSQC로부터 연결되는 카본이 δc 75.2 (C-4'''')임을 확인하였고, 역시 약 2 ppm (일반적으로 73 ppm 정도의 값을 가짐) 정도 저자장으로 시프트되는 것을 확인하였다. 아그리콘 5번 카본에는 또 다른 글루코스의 아노머 프로톤 시그널 [δH 5.20 (d, 7.6 Hz, H-1''')]이 아그리콘의 올레핀 쿼터너리 카본 시그널 [δc 156.4 (C-5)]과 상호 연관 하는 것을 HMBC 스펙트럼으로 확인되었다.

따라서, 안토시아닌 2(An 2)는 페오니딘, 3-O-[6-O-(4-O-E-p-coumaroyl-O-α-L-rhmnopyranosyl)-β-glucopyranoside]-5-O-β-glucopyranoside로 유색감자 자영에서는 처음 분리되었으며, 일반명이 페오나닌(peonanin)인 화합물로 구조동정하였다[화학식 1].

실시예 2. 항염증 활성 측정

1) 세포의 배양

RAW 264.7 세포는 10% FBS 및 페니실린(penicillin) (100 μg/mL), 스트렙토마이신(streptomycin) (100 U/mL)이 포함된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 배양했다. RAW 264.7 세포에 시료용액의 여러 농도 (25, 50, 100 μM) 또는 양성 대조군을 1시간 전처리 한 후 LPS (1 μg/mL)를 처리하고 24시간 배양하였다.

2) 세포독성 시험

96 웰 플레이트(well plate)에 1× 10⁵ cells/well로 세포를 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양한 후 여러 농도의 시료용액을 두 군으로 나누어 배지에 희석하여 첨가 하였다. 1시간 후 한 군에만 LPS (1 μg/mL)를 처리하였다. 24시간이 지난 후 MTT시약을 넣고 4시간 동안 방치한 후 상등액을 제거하고 형성된 포르마잔(formazan)을 DMSO 100 μL를 첨가하여 녹였다. 30분 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3) 니트라이트( Nitrite ) 양의 측정

RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂의 형태로서 측정하였다. 즉 세포배양 상등액 100 μL와 Griess시약 [1% (w/v) 설프아닐아미드(sulfanilamide) in 5% (v/v) 인산(phosphoric acid)과 0.1% (w/v) 나프틸에틸렌디아민(naphtylethylenediamine) -HCl] 100 μL를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) PGE2 , TNF -α 및 IL -6 양의 측정

세포배양액을 취해 각각 R&D 시스템 (MN, U.S.A.) 키트의 지시에 따라 PGE2, TNF-α 및 IL-6를 정량하였으며, 그 결과는 도 7, 8, 9 및 10 에 각각 나타내었다.

분리된 유색감자 안토시아닌 An 2 화합물에 대한 항염증 활성을 측정하여 본 결과, 농도 의존적으로 NO 생성을 저해하였으며 3.125 μg/mL에서 NO 생성을 40% 저해하였다. 이러한 NO 생성 저해가 세포독성에 기인하는 것을 확인하기 위하여 MTT법을 이용하여 세포독성을 관찰하였으나 최대 200 μM에서 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

RAW 264.7 세포에서 염증인자인 PGE2의 억제효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. LPS에 의한 PGE2 생성이 An 2를 처리하였을 때 농도 의존적으로 유의성 있게 감소되었으며, 3.125 μg/mL 농도에서 PGE2 형성이 50% 저해되었다. An 2가 RAW 264.7 세포에서 염증유도 사이토카인인 TNF-α와 IL-6을 억제하는지 알아보기 위해 ELISA kit를 이용하여, TNF-α와 IL-6의 형성실험을 진행하였다. LPS 처리에 의해 생성된 TNF-α는 효과가 없었다. LPS에 의한 IL-6 형성은 An 2에 의해 농도 의존적으로 감소되었으며, 3.125 μg/mL 농도의 An 2에서 50% 저해됨을 확인되었고, TNF-α와 IL-6의 형성 억제효과와 상관성이 있음을 확인하였다.

상기한 결과는 An 2를 이용하여 염증성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 약물로서 개발될 수 있는 가능성을 시사한다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

삭제

Claims

유색감자로부터 분리된 자색색소로, 하기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌계 자색색소를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물:
[화학식 1]
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 염증성 질환은 류마티스를 비롯한 골관절 및 퇴행성 관절염 질환; 세균 및 진균에 의한 급성 및 만성 피부염과 홍반 및 부종을 수반하는 피부질환; 치은 및 치주염을 포함하는 구강 및 치주 질환 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물.
유색감자로부터 분리된 자색색소로, 하기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌계 자색색소를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품:
[화학식 1]
삭제
청구항 4에 있어서,
상기 염증성 질환은 류마티스를 비롯한 골관절 및 퇴행성 관절염 질환; 세균 및 진균에 의한 급성 및 만성 피부염과 홍반 및 부종을 수반하는 피부질환; 치은 및 치주염을 포함하는 구강 및 치주 질환 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품.