KR20110074189A - 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체 및 그의 합성방법 - Google Patents
구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체 및 그의 합성방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체 및 그의 합성방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 검정콩 종피로부터 안토시아닌 조 추출물을 추출하는 과정, 상기 안토시아닌 조 추출물을 물과 에틸 아세테이트로 분획하여 얻은 물층을 농축하여 안토시아닌 추출물을 얻은 다음 순수한 안토시아닌을 분리하는 과정 및, 상기 분리된 안토시아닌을 유도체화하는 과정을 포함하여 이루어지는 안토시아닌 유도체의 합성방법과 안토시아닌 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체를 단시간에 고순도 및 고효율로 합성할 수 있으며, 이를 안토시아닌이 적용될 수 있는 다양한 분야뿐만 아니라, 구조적 안성정이 취약하여 안토시아닌을 적용할 수 없었던 분야에도 적용할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
안토시아닌, 유도체, 검정콩, 구조적 안정성
Description
본 발명은 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체를 합성하고, 이의 활성을 검증하며, 다양한 용도로의 적용 가능성을 확인한 것이다.
안토시아닌(Anthocyanin)은 식물의 꽃, 과실, 줄기, 잎 등에 폭넓게 함유되어 있는 적색, 자색, 청색을 나타내는 수용성 flavonoid 색소이다. Anthocyanin이란 용어는 그리스어로 꽃을 의미하는 anthos 와 푸른색을 의미하는 kyanos 란 말로부터 유래된 용어이며, 1835년 Marquart 가 꽃잎에 함유된 푸른색의 색소를 명명하기 위하여 최초로 사용하였다.
안토시아닌 색소는 일반적으로 식물체의 세포질에서 합성되어 액포에 배당체 형태로 저장되며, 가수분해가 되면 당이 제거된 비당체(aglycone)인 안토시아니딘이 생성된다. 기본적으로 안토시아닌 색소는 안토시아니딘과 당의 결합으로 구성되 지만 경우에 따라서 당고리에 방향족 혹은 비방향족 유기산이 결합되기도 하고, 그 조합에 의해 자연계에 수백종이 존재한다.
최근 안토시아닌 색소는 청량음료, 잼, 사탕 등 가공식품의 첨가제로 활용도가 높다. 가공식품은 특유의 색을 가지고 있으나 가공 또는 저장 중에 고유의 색상이 변하기도 하고 영양적 가치도 변하게 된다. 안토시아닌의 첨가는 식품자체 고유색의 변색 또는 퇴색을 방지하거나, 고유의 색을 보완 미화시켜 식품의 가치를 높이는 효과가 있다. 또한 안토시아닌은 유지 및 가공식품의 저장성을 증진시키는 식품보존제로서의 기능도 보고되며, 식품첨가제 외에 향장공업의 착색원료 및 의약품에도 적극 활용되고 있다.
안토시아닌 색소는 주로 적색으로 독성이 없고, 채소나 과일의 부산물로도 제조가 가능하여 유해성 문제가 대두되는 합성착색료(적색2호,4호,40호)의 대체용으로 청량음료, 주류, 기타 분말제품에 이용되고 있다.
현재 세계적으로 포도, 딸기, 적양배추, 적자소 등에 함유된 안토시아닌을 추출하여 이용하고 있으며, 국내 안토시아닌의 수요는 정확한 통계치가 보고되지 않으나 ‘98년 대규모 식품회사에서 약 100톤 수준을, 소규모 색소공장에서 업체당 300～400Kg을 전량 수입하여 국내 총 수요는 약 150톤 가량으로, 약 800억원 규모의 시장이 형성되는 것으로 추정된다. 한편 일본의 경우 ’94년 385톤의 수요가 창출되었으며, 향후 국민소득의 증대 및 식생활 선진화 추세에 따라 천연색소의 수요가 계속 증대될 것으로 예상된다.
안토시아닌은 천연색소로서의 기능 외에도 다양한 생리활성을 나타내어 항산 화, 콜레스테롤저하, 시력개선효과, 혈관보호기능, 동맥경화, 심장병예방, 항궤양기능, 항암, 항염증, 당뇨억제, 자외선으로부터의 보호기능 등 다양한 생리활성을 나타내어 의약품에도 적극 활용되고 있어 건강식품 및 신 의약품 창출의 새로운 대상으로 조명을 받고 있다.
안토시아닌은 중성 또는 알칼리 용액에서 불안정하며, 산성용액이라도 빛에 노출되면 색이 서서히 탈색되는 현상을 나타내어 구조적으로 가장 불안정한 물질 중 하나로 꼽힌다. 특히 안토시아닌 색소의 안정성에 영향을 주는 요인으로서는 안토시아닌의 화학적 구조, 색소의 농도, 용액의 pH, 온도, 공존색소의 유무, 금속이온, 효소, 산소, 아스코르브산(ascorbic acid), 당 등을 들 수 있으며, 이들 요인의 차이에 의해 색도의 유지, 즉 구조적 안정성에 차이를 나타낸다.
안토시아닌은 구조적으로 1번 위치에 존재하는 산소의 비공유전자쌍 중에서 전자 한 개가 2번 위치의 탄소와 공유결합을 하고 있기 때문에 양이온으로 하전 되어 있는데 이와 같은 것을 옥소늄(oxonium) 화합물이라 하며, 안토시아닌의 구조적 불안정은 바로 이 옥소늄(oxonium) 구조에 기인한 것이며, 이 구조적 불안정성 때문에 식품 및 의약품으로서의 적극적 활용에 많은 어려움이 발생되고 있다.
따라서 본 발명은 안토시아닌의 구조적 불안정성 문제를 극복하기 위하여 안토시아닌을 유도체화하는 방법을 제안하는 것으로, 기존 안토시아닌에 비해 상대적 으로 표백 및 탈색작용에 강한 내성을 나타내고, 높은 색도 및 약산성의 조건에서도 색상이 불안정해 지는 양상이 작은 안토시아닌 유도체를 간단한 방법으로 합성할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 안토시아닌 유도체가 합성된 후 원래의 안토시아닌과 안토시아닌 유도체 간의 다양한 물리ㆍ화학적 특성변화에 따른 구조적 안정성 및 생리활성을 평가하여 구조적으로 안정화된 안토시아닌 유도체의 상업적 활용도 증진방안을 검토하고자 하였다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명은, 다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 유도체를 포함한다.
[화학식 1]
상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 검정콩 종피에 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하고 냉침하여 안토시아닌 조 추출물을 추출한 다음 여과하여 불용물을 제거하고 농축하여 안토시아닌 조 추출물을 얻는 과정, 상기 안토시아닌 조 추출물을 물과 에틸 아세테이트로 분획, 추출하여 얻은 물층을 농축하여 안토시아닌 조추출물 중 극성 안토시아닌 추출물을 얻은 다음 염산 함유 10∼60% 알콜 수용액으로 순차 분리 정제하여 안토시아닌 시아니딘 3- 글루코사이드를 분리하는 과정 및, 상기 분리된 시아니딘 3- 글루코사이드와 소듐 피루브산(Na pruvate)을 40 내지 50 ℃로 유지되는 산함유 알콜 수용액 중에서 10 내지 30 일간 반응시켜 유도체를 합성한 후 분리 정제하여 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체를 얻는 과정을 포함하여 이루어지는 안토시아닌 유도체의 합성방법을 포함한다.
또한, 상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항고혈압제, 항암제 및 항산화제를 포함한다.
또한, 상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체 또는 식품학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 암 및 고혈압의 예방 기능을 갖는 식품첨가제와 이를 포함하는 건강기능식품을 포함한다.
본 발명에 의하면, 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체를 간단한 방법으로 단시간 내에 고순도로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여 합성된 안토시아닌 유도체는 구조적 안정성이 우수하므로 기존의 안토시아닌이 적용되던 다양한 분야에 적용되어 각종의 가공식품, 의약품, 착색염료 등으로 활용될 수 있으며, 강화된 항고혈압활성, 항산화활성 및 항암활성에 의하여 화장료 첨가제, 항고혈압제, 항산화제 및 항암제로서의 용도를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명을 안토시아닌 유도체의 합성방법을 위주로 하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 안토시아닌 유도체의 합성방법은, 검정콩 종피에 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하고 냉침하여 안토시아닌 조 추출물을 추출한 다음 여과하여 불용물을 제거하고 농축하여 안토시아닌 조 추출물을 얻는 과정, 상기 안토시아닌 조 추출물을 물과 에틸 아세테이트로 분획, 추출하여 얻은 물층을 농축하여 조추출물 중 극성 안토시아닌 추출물을 얻은 다음 염산 함유 10∼60% 알콜 수용액으로 순차 분리 정제하여 안토시아닌 시아니딘 3- 글루코사이드를 분리하는 과정 및, 상기 분리된 시아니딘 3- 글루코사이드와 소듐 피루브산(Na pruvate)을 40 내 지 50 ℃로 유지되는 산함유 알콜 수용액 중에서 10 내지 30 일간 반응시켜 유도체를 합성한 후 분리 정제하여 다음 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체를 얻는 과정을 포함하여 이루어진다.
[화학식 1]
이하, 본 발명의 안토시아닌 유도체의 합성방법을 구체적으로 설명하겠으며, 이하 사용된 %는 특별한 언급이 없는 경우 %v/v을 나타낸다.
먼저, 검정콩 종피에 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하고 냉침하여 안토시아닌 조 추출물을 추출한 다음 여과하여 불용물을 제거하고 농축하여 안토시아닌 조 추출물을 얻는 과정이다.
이때, 상기 안토시아닌 조 추출물의 추출은 검정콩 종피에 0.1∼10% 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하여 24시간 내지 72시간동안 냉침을 2 내지 4회 반복 수행하는 추출과정으로 이루어진다.
상기 산으로는 염산이나 유기산을 사용할 수 있으며, 이들의 산성 정도에 따 라 첨가량을 조절하여 냉침에 사용되는 산 함유 물 또는 알콜 수용액의 pH가 안토시아닌 조 추출물의 추출에 적합하도록 한다. 이를 위해 염산을 사용할 경우 농도는 0.1 내지 1% 가 바람직하며, 유기산을 사용할 경우에는 1 내지 10 %가 바람직하다. 유기산으로는 개미산, 초산, 능금산, 호박산 및 구연산 중에서 선택된 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있다.
상기 알콜로는 탄수소 1 내지 4의 저급 알콜을 사용할 수 있으며, 냉침에 사용되는 알콜 농도는 20 내지 80% 범위가 되는 것이 좋다.
냉침에 소요되는 시간이 짧을 경우에는 안토시아닌 조추출물의 완전한 추출이 어렵고, 냉침 시간이 길거나 냉침 반복 횟수가 4회를 초과할 경우에는 효율성이 저하되는 경향이 있다.
냉침한 후 불용성인 검정콩 종피의 제거를 위하여 여과를 실시하며, 불용성 물질을 여과한 다음 물, 알콜 및 염산을 제거하여 안토시아닌 조 추출물을 농축시키는데, 이때 안토시아닌류의 안정성을 고려하여 동결 건조하는 것이 좋다.
다음으로, 상기 안토시아닌 조 추출물로부터 안토시아닌 시아니딘 3- 글루코사이드를 분리하는 과정이다.
즉, 상기 안토시아닌 조 추출물을 물과 에틸 아세테이트를 가하여 분획, 추출하고, 극성인 수용성 안토시아닌이 용해된 물층을 농축하여 안토시아닌 추출물을 얻은 다음 염산 함유 10∼60% 알콜 수용액으로 순차 오픈 컬럼 분리를 실시하여 안토시아닌 시아니딘 3- 글루코사이드를 분리한다.
본 발명에서는 검정콩 종피에서 안토시아닌을 순수 분리한 후 이를 유도체로 전환하고, 다시 순수 분리 정제하여 유도체로 변환되지 않은 일부 원래의 안토시아닌을 제거하여 고순도의 안토시아닌 시아니딘 3-글루코사이드 유도체를 단시간에 얻었다.
상기 분리된 시아니딘 3-글루코사이드를 유도체화 하는데, 이를 위하여 시아니딘 3- 글루코사이드와 소듐 피루브산(Na pruvate)을 40 내지 50 ℃로 유지되는 산함유 알콜 수용액 중에서 반응시킨다. 이때, 산농도는 0.1 내지 10% 범위가 되도록 하고, 사용가능한 산은 다양한 무기산 및 유기산이며, 알콜은 탄소수 1 내지 4 범위의 저급알콜이다.
시아니딘 3-글루코사이드와 소듐 피루브산의 반응은 10 내지 30 일간 수행될 수 있으며, 반응 10 일 경에 안토시아닌인 시아니딘 3-글루코사이드와 이의 유도체의 함량이 비슷해지며 이후에는 유도체의 함량이 증가하는 경향이 있으며, 반응이 30일을 넘어서면 효율성이 저하되는 경향이 있다.
얻어진 안토시아닌 유도체의 분리는 염산 함유 10∼60% 알콜 수용액을 이용하여 1차 오픈컬럼 분리를 수행하였고, 고순도 분리를 위해 분취-HPLC를 사용하였으며, 포믹산 함유 증류수와 포믹산 함유 아세토니트릴을 사용하여 고순도의 분리가 이루어질 수 있다.
본 발명에 의하면 검정콩 종피 함유 안토시아닌으로부터 안토시아닌 유도체를 20 일내외의 단시간에 합성할 수 있으며, 수득율은 85 % 였다.
얻어진 안토시아닌 유도체의 구조는 NMR, MS 등의 다양한 분광분석법으로 동정하였으며, 그 결과 상기 화학식 1과 같은 구조를 가지는 안토시아닌 유도체를 얻 었다.
본 발명에 의하여 합성된 안토시아닌 유도체는, 순수 안토시아닌이 가지는 항산화, 항종양, 항암 등의 생리활성을 동등하거나 그 이상으로 높게 나타내며, 특히, 구조적 안정성이 강화되어 순수 안토시아닌과 대비하여 구조적 안정성의 유지 기간을 2 내지 25 배 가량 연장할 수 있는 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 의하여 합성된 안토시아닌 유도체는 기존의 안토시아닌이 적용되던 분야뿐만 아니라, 저장 안정성 문제로 적용될 수 없었던 분야에도 충분히 적용될 수 있으므로, 안토시아닌의 활용 범위를 확장하는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 항고혈압제, 항암제 및 항산화제를 제공한다.
상기 항고혈압제는 ACE 저해활성이 높게 나타난 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유함으로써, ACE 저해활성이 높아 고혈압치료 및 고혈압에 대한 예방에 유용하게 이용될 수 있다. 상기의 항암제는 항산화활성과 항암활성을 나타내는 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체를 유효성분으로 함유하므로 암세포의 생육을 저해함으로써 다양한 암을 치료하거나 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한 항산화제는 지질과산화를 저해하고 활성산소 제거능이 우수하므로 다양한 질병의 치료제와 병용할 경우 질병의 치료와 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 안토시아닌 유도체는 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들 어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 안토시아닌 유도체를 유효성분으로 포함하는 항산화제 또는 항암제 같은 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 본 발명의 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 포함하는 항고혈압제, 항산화제 또는 항암제 같은 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 신규화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.
상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 안토시아닌 유도체의 유효 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 내지 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 내지 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 일 수회, 바람직하기로는 하루 2 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 안토시아닌 유도체는 특이적 암세포주에 활성을 나타내는 것으로 생각되며, 특정 암세포주에 대한 높은 항암활성을 나타낼 뿐만 아니라, 정상세포에는 크게 영향을 미치지 않기 때문에 항암제로서의 활용 및 기존항암제의 안정성 확보를 위한 병용처리 안정제 및 치료효율을 높일 수 있는 상승제로 활용되어질 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 안토시아닌 유도체는 정상세포에 안전하면서 높은 항산화활성을 가지므로, 인체 내에 자유 라디칼이나 활성 유해 산소의 증가에 의하여 피부의 주름이 증가하거나 탄력 감소를 비롯하여, 기미, 주근깨 및 검버섯 등의 색소 침착 등으로 대표되는 피부의 노화를 억제할 수 있을 것으로 예상되며, 따라서, 상기 항산화제를 화장료에 포함시켜 사용할 수 있을 것이다. 본 발명의 안토시아닌 유도체를 화장료 중에 포함시킬 경우 화장료 총 중량 중 0.001 내지 20 %(w/w), 바람직하기로는 0.01 내지 10 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이며, 함량이 상기 범위 미만이면 항산화효과 활성의 발현으로 인한 피부 노화 방지 효과가 미미할 것이고, 함량이 상기 범위를 초과하여 많으면 초과 투입에 따른 상승효과가 적어 경제적이지 못한 경향이 있다.
본 발명의 안토시아닌 유도체를 화장료에 도입하고자 할 경우, 이들 외에 통상적으로 화장료 성분으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등과 같은 성분들을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료는 제형이 특별히 한정되지 않고 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 에센스, 로션, 아이크림, 영양크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 팩, 젤, 연고, 패취, 분무제 등의 제형으로 제조될 수 있을 것이다.
또한, 식용되는 검정콩으로부터 분리 동정되었으므로 인체에 안정하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하므로, 암의 예방 기능을 갖는 식품첨가제, 건강기능식품으로 개발될 수 있다.
식품첨가제로 개발시에는 식품학적으로 허용되는 식품첨가보조제를 사용할 수 있을 것이며, 식품의 주· 부원료로 하여 제조되거나 다른 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명의 안토시아닌 유도체를 식품첨가제, 또는 건강기능식품 중에 포함시킬 경우 총 중량 중 0.01 내지 50 %(w/w), 바람직하기로는 1 내지 30 %(w/w) 범위로 사용할 수 있을 것이며, 함량이 상기 범위 미만이면 항산화효과 활성의 발현으로 인해 취득되는 효과가 미미할 것이고, 함량이 상기 범위를 초과하여 많으면 초과 투입에 따른 상승효과가 적어 경제적이지 못한 경향이 있다.
즉, 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 중에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품을 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수 있으며, 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화 될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류로 제조될 수 있고, 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의 하게 선택하여 배합할 수 있다.
이하, 본 발명을 도면 및 실시예 등에 의하여 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재료 및 방법
1) 기기 및 시약
안토시아닌 및 안토시아닌 유도체의 분석에 사용된 증류수는 초순수 제조기(Milli-Q system, USA)에서 비저항값이 18 MΩ 이상으로 제조된 초순수 증류수를 사용하였고, 메탄올(methanol) 및 에탄올(ethanol)은 국산 GR 등급을, 염산용액은 일본 화광순약주식회사의 특급시약을 구입하여 사용하였으며, Preparative-HPLC 및 Analytical-HPLC의 이동상 용매로 사용된 아세토니트릴(acetonitrile) 및 포믹산(formic acid)은 Merck Inc. (USA)의 HPLC 등급을 구입하여 사용하였고, 안토시아닌 유도체의 농축을 위한 Sep-pak C18 cartridge는 Waters Co. (USA)의 제품을 사용하였다.
안토시아닌 및 안토시아닌 유도체의 분리를 위한 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)용 옥타데실실리카겔(Octadecylsilica gel, ODS)은 Lichroprep RP-18 (40～63 μm, Merck, Germany)을 사용하였고, 기기분석에 사용된 NMR용 용매는 메탄올-d4, DCl(Merck, Germany)을 사용하였다.
안토시아닌 유도체의 고순도 분리 및 정성분석에 사용된 Preparative-HPLC 및 Analytical-HPLC는 Agillent 1200 series (Agillent, Wilmington, DE, USA)를 사용하였으며, LC/MS는 Agillent 6100 LC/MS (Agillent, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 측정하였다. UV 스펙트로포토미터(spectrphotometer)는 Shimadzu UV-1601 (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였고, NMR은 400 MHz, Inova AS 400, FT-NMR spectrometer (Varian, CA, USA)로 측정하였다.
2) 실험재료
본 발명에 사용한 검정콩은 농촌진흥청에서 품종 등록한 흑미품종(Glycin max)으로서 2007년 10월 농촌진흥청 국립식량과학원 기능성작물부에서 콩 표준재배법으로 재배된 콩(KNU-HMRAL-20071128)을 이용하여 실험을 진행하였다.
실시예 2. 검정콩 안토시아닌의 분리
검정콩 종피를 1% HCl-40%MeOH 용액으로 4℃ 조건에서 24시간씩 3회 추출하였다. 추출된 조색소를 혼합하고 여과지로 여과하여 불용물을 제거한 뒤 35℃ 조건의 감압농축장치에서 메탄올 용액을 완전히 제거하여 수용액 상태로 만든 후 -20℃ 조건에서 동결 시킨 후 동결건조기에서 물 및 염산을 제거하여 농축하였다.
농축된 안토시아닌 조추출물에 증류수 500mL를 첨가하고, 동량의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 3회 반복하여 분획, 분배 추출을 실시하였다. 이때 추출물 중 지용성 및 비극성 물질은 상층인 에틸 아세테이트로 이행하고, 수용성 물질 인 극성 안토시아닌은 아래의 증류수 층으로 이행하였으며, 이 증류수 층을 감압농축장치(35℃)에서 농축하여 양이 약 50mL 수준이 되게 농축하였다.
얻어진 약 50mL의 증류수에 용해된 안토시아닌 농축액은 ODS 칼럼 크로마토그래피(φ 3 × 50 cm, 1%염산 함유 H2O : MeOH = 9 : 1 → 8 : 2 → 7 : 3 → 6 : 4 → 5 : 5 → 4 : 6으로 순차 분리)를 실시하여 2개의 분획(An-1～An-2)을 얻었고, 이들 중 주요 안토시아닌이 함유되어 있는 An 1 분획에서 상대순도 96% 이상의 검정콩 함유 안토시아닌인 시아니딘 3-글루코사이드(cyanidin 3-glucoside)(약 210mg)를 순수하게 분리하였다[도 1].
분리된 시아니딘 3-글루코사이드의 화학적 구조를 확인하기 위해 UV-VIS 흡광특성[도 2 및 표 1]과 LC-ES/MS 질량분석[도 3]을 수행한 결과 문헌적 결과와 완전하게 일치하는 양상을 나타내므로 검정콩 흑미품종을 재료로 하여 분리된 안토시아닌은 시아니딘 3-글루코사이드가 정확함을 확인하였다.
[표 1] 분리 안토시아닌 시아니딘 3-글루코사이드의 UV-VIS 흡광특성
| UV-vis. Characterization(in 1%HCl-40%MeOH) | |||
| λmax(㎚) | Ε uv /Ε vis (%) | Ε acyl /Ε vis (%) | Ε 440 /Ε vis (%) |
| 280, 517 | 67 | 9 | 32 |
실시예 3. 검정콩 분리 안토시아닌 시아니딘 3-글루코사이드의 유도체 합성 및 유도체 화합물의 순수분리
구조가 확인된 분리 안토시아닌 시아니딘 3-글루코사이드 200mg을 0.2% TFA 함유 - 20% EtOH 용액 200mL에 용해하고, 여기에 소듐 피루브산(Na Pruvate)을 2g 첨가한 후 40℃에서 반응시켰으며, 유도체 반응의 중단은 1일 간격으로 on-line HPLC로 유도체 반응물의 생성비율을 조사하면서 반응물의 생성비율이 변하지 않는 시기인 30일째 반응액을 4℃ 저온냉장고에 방치하여 반응을 중단시켰다.
안토시아닌 유도체 반응 중 시아니딘 3-글루코사이드 유도체의 생성 비율을 조사하기 위해 합성시작 전부터 1일 간격으로 30일 동안 on-line HPLC로 유도체 반응물의 생성비율을 조사하였다[도 4]. 그 결과 반응 후 9일이 되면 원 화합물인 시아니딘 3-글루코사이드 보다 합성 유도체의 비율이 증가되기 시작하며, 합성 후 25일이 소요되면 유도체 합성물의 비율이 85% 수준으로 더 이상 증가되지 않는 양상을 나타내어 반응이 거의 종료됨을 알 수 있다[표 2].
[표 2] HPLC 분석에 의한 합성일수별 시아니딘 3-글루코사이드(C3G) 및 시아니딘 3-글루코사이드 유도체 합성물의 비율
| 합성일수 | 비율 (%) | |
| 원래 안토시아닌(C3G) | 합성 안토시아닌 유도체 (C3G epimer) |
|
| 합성전 | 100.0 | 0.0 |
| 1 | 93.2 | 6.8 |
| 2 | 86.1 | 13.9 |
| 3 | 80.2 | 19.8 |
| 4 | 73.7 | 26.3 |
| 5 | 67.8 | 32.2 |
| 6 | 62.8 | 37.2 |
| 7 | 58.0 | 42.0 |
| 8 | 53.7 | 46.3 |
| 9 | 49.6 | 50.4 |
| 10 | 46.1 | 53.9 |
| 11 | 41.0 | 59.0 |
| 12 | 38.0 | 62.0 |
| 13 | 34.2 | 65.8 |
| 14 | 31.4 | 68.6 |
| 15 | 28.7 | 71.3 |
| 16 | 26.3 | 73.7 |
| 17 | 24.3 | 75.7 |
| 18 | 20.6 | 79.4 |
| 19 | 19.7 | 80.3 |
| 20 | 18.3 | 81.7 |
| 21 | 17.7 | 82.3 |
| 22 | 17.2 | 82.8 |
| 23 | 16.5 | 83.5 |
| 24 | 15.7 | 84.3 |
| 25 | 15.0 | 85.0 |
| 30 | 14.8 | 85.2 |
도 5의 합성 후 HPLC 크로마토그램에서 보는 바와 같이 합성용액에는 원래의 안토시아닌인 시아니딘 3-글루코사이드가 소량 존재하고 있고, 또 합성에 이용되고 남은 과량의 수용성 소듐 피루브산(Na pruvic acid)이 존재하고 있으므로 반응액에 함유된 에탄올은 감압농축장치(35℃)에서 제거하고, 유기용매가 제거된 수용액 상태에서 다시 sep-pak C18 카트릿지를 처리하여 반응 후에 잔존하는 과잉의 소듐 피루브산(Na Pruvate)을 제거한 후 메탄올을 이용하여 합성된 안토시아닌 유도체 용액을 회수 하였다.
회수된 합성 안토시아닌 유도체 용액을 다시 감압농축장치(35℃)에서 완전히 농축하여 메탄올을 증발시키고, 건고물을 1% 염산함유-증류수 20mL에 용해한 후 ODS 칼럼 크로마토그래피(φ 3 × 50 cm, 1%염산 함유 H2O : MeOH = 9 : 1 → 8 : 2 → 7 : 3 → 6 : 4 → 5 : 5 → 4 : 6으로 순차 분리)를 실시하여 2개의 분획(AD-1～AD-2)을 얻었고, 이들 중 안토시아닌 유도체가 다량 함유되어 있는 An 2 분획을 다시 35℃ 조건의 감압농축기에서 농축 건조한 후 1%염산 함유-20% 메탄올(50 mL)에 용해 한 후 Preparative-HPLC로 고순도 분리를 실시하여 안토시아닌 유도체(125 mg)을 순수 분리하였다(도 6 및 7).
이때, Preparative-HPLC의 분리에 사용된 prep 칼럼은 HiQ sil C18-10 (21.0 × 250 mm, KYA TECH, Japan)이고, 분석파장 517 nm, 분당 유속 10 mL, 분석 용매로 A용매는 5% 포믹산 함유 증류수, B용매는 5% 포믹산 함유 아세토니트릴을 (0분 : 90% A, 17분 : 80% A, 20분 : 70% A, 22분 : 70% A, 23분 : 90% A, 29분 : 90% A) 사용하였고, 시료 주입량은 2 mL로 조절하여 고순도 분리를 실시하여 안토시아닌의 유도체를 순수분리 하였다.
Preparative-HPLC를 이용하여 순수 분리된 합성 안토시아닌 유도체의 화학적 구조를 동정하기 위해 첨단 분광적 방법(1H13C-NMR, LC-ES/MS 및 DAD)을 이용하여 유도체의 정확한 화학적 구조를 동정하였다.
HPLC-DAD를 이용하여 유도체로 합성된 안토시아닌의 자외-가시 흡광 특성을 분석한 결과 247, 352 및 504nm에서 최대 흡광을 나타내었으며, 각 흡수 영역의 흡광비율을 조사해 볼 때 Ε 440 /Ε vis 의 비율이 40%를 나타내므로 안토시아닌의 비당 체(aglycone) 3번 탄소에만 당이 결합되어 있는 양상을 확인할 수 있고, Ε uv /Ε vis (86%)의 비율 및 Ε acyl /Ε vis (34%) 비율로 볼 때 한 개의 당이 구조적으로 결합되어 있고, 안토시아닌의 구조 중 유기산이 한개 이상 결합되어 있음을 추정할 수 있다.
[표 3] 합성 안토시아닌 유도체의 자외-가시 분광특성
| On-line HPLC DAD | |||
| λmax(㎚) | Ε uv /Ε vis (%) | Ε acyl /Ε vis (%) | Ε 440 /Ε vis (%) |
| 247, 352, 504 | 86 | 34 | 40 |
LC-ES/MS를 이용한 합성 안토시아닌 유도체의 질량분석 결과 [M]+= m/z 355, m/z 449 및 m/z 517을 나타내었으며, 이들 중 [M]+= m/z 449는 합성 전 원래의 안토시아닌인 시아니딘 3-글루코사이드의 분자량과 동일한 양상으로 질량분석 시 분자 쪼개짐 현상에서 구조적으로 결합된 일부의 조직이 깨지면서 시아니딘 3-글루코사이드가 검출됨을 알 수 있고, 유도체 합성 전 시아니딘 3-글루코사이드의 비당체(aglycone)인 시아니딘(cyanidin)이 [M]+= m/z 287을 나타내고, 시아니딘 3-글루코사이드가 [M]+= m/z 449를 나타내었으므로 합성 후 질량분석 결과와 비교해 볼 때 비당체(aglycone)와 당(glycoside) 모두 분자량이 68씩 증가되어 있는 화합물임을 추정할 수 있다.
합성 안토시아닌 유도체의 화학구조는 1H(400㎒), 13C-NMR(100㎒)를 이용한 1차원 및 2차원 데이터(data)에 의해 검정하였다.
합성 안토시아닌 유도체의 1H-NMR 스펙트럼에서 6개의 수소 시그날(signal) (δ 8.16(H-4, s), δ 7.98(H-5', s), 2개의 2H가 짝을 이루고 있는 수소 : δ 7.25 (d, 1.8Hz, H-7)과 δ 7.15 (d, 1.8Hz, H-9) 및 δ 7.73 (d, 2.0Hz, H-6')과 δ 7.68 (d, 2.0Hz, H-2'))이 방향족 영역에서 검출되었는데, 이는 비대칭적으로 치환된 B링을 가지고 탄소 4번 영역이 치환된 안토시아닌의 구조임을 추정할 수 있다.
아울러 합성 안토시아닌 유도체의 HMBC 스펙트럼 중 δ 8.16/171.1(H-4/C-10), δ 8.16/145.5(H-4/C-3), δ 8.16/155.7(H-4/C-5), δ 8.16/115.0(H-4/C-9b) 및 8.16/107.4(H-4/C-4) 영역의 교차 피크(peak)로서 합성 안토시아닌 유도체의 구조 중 각각의 COOH, C-3, C-5, C-9b 및 C-4를 확인할 수 있었고, 또한 C-2는 H-2' 및 H-6'(δ 7.68/161.3 및 δ 7.73/166.2)과의 long-range correlation에 의해 확인되었다.
안토시아니딘의 구조 중 A링에 속하는 탄소들은 각각 δ 7.15/167.1(H-9/C-8), δ 7.15/156.8 (H-9/C-9a), δ 7.15/115.0(H-9/C-9b), δ 7.15/105.8(H-9/C-7), δ 7.25/167.1(H-7/C-8), δ 7.25/155.1(H-7/C-6), δ 7.25/115.0(H-7/C-9b) 및 δ 7.25/96.1(H-7/ C-9)영역의 교차 피크로 확인할 수 있다.
합성된 안토시아닌 유도체의 B링은 δ 7.98(H-5'), δ 7.68(H-2') 및 δ 7.73(H-6')에 나타나는 3개의 수소 시그날에 의해 3'과 4' 위치가 OH로 치환된 디페놀(diphenol)임을 추정할 수 있다. 따라서 합성된 안토시아닌 유도체의 비당체(aglycone)는 COOH가 결합된 피란(pyran)형의 시아니딘(cyanidin) 화합물임을 알 수 있다.
한편 합성 안토시아닌 유도체의 당 영역 시그날(signal)을 볼 때 단지 한 개의 당이 존재함을 알 수 있으며, 당의 1H 및 13C 공명은 1차원 1H NMR, CAPT, HSQC 및 HMBC 실험 결과에 의해 동정되었다. 합성된 안토시아닌 유도체의 1H-1H 결합 상수와 당 영역의 13C 스펙트럼 중에서 여섯개의 13C 공명을 기초로 판단해 볼 때 결합된 당은 β 형태의 글루코피라노스(glucopyranose)이며, HMBC 스펙트럼에서 δ 5.23/145.5(H-1"/C-3)의 교차 peak로 볼 때 비당체(aglycone)의 3-OH와 글루코피라노스(glucopyranose)의 1번 탄소사이에서 결합이 이루어진 것임을 알 수 있다. 또한 앞에서 제시한 합성된 안토시아닌 유도체의 LC-ES/MS 결과 분자량이 [M]+= m/z 517로 조사된 것을 볼 때 합성된 안토시아닌은 화학구조가 C24H21O13=517을 나타내고, 안토시아닌의 비당체에 COOH가 결합된 피란형의 시아니딘 화합물인 안토시아닌 유도체로 확인되었으며, 화학구조를 화학식 1에 나타내었다[그림 10].
[화학식 1]
실험예. 합성 안토시아닌 유도체의 특성
1) 합성 안토시아닌 유도체의 물리ㆍ화학적 조건 변화에 따른 구조적 안정성 검정
순수하게 분리된 합성 안토시아닌 유도체와 유도체화 되지 않은 순수 안토시아닌 C3G를 메탄올에 용해하여 용액농도 100ppm으로 각각 조제하였다. 또한 각각 용액의 pH 조건을 달리하기 위하여 각각의 100ppm용액의 pH를 측정한 결과 유도체 변환을 시도하지 않은 순수 안토시아닌 C3G의 pH는 4.1 수준, 순수하게 분리된 유도체 변환 안토시아닌 용액의 pH는 3.8 수준을 나타내었다.
각 100ppm 용액의 pH 조절을 위해 산성조건으로의 변화는 인산용액을 사용하여 극산성조건인 1.5 및 2, 약산성조건인 4로 조절하고, 약알칼리조건으로의 변화는 0.1N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 조절하였다. 각 용액의 pH 조절 결과 산성조건(pH 1.5, 2 및 4) 에서는 안토시아닌 고유의 색상인 적색이 유지되지만, 약알 칼리조건(pH 7.5)으로 변화 시 유도체 합성 전, 후 모두 안토시아닌 고유의 적색을 잃고, 연보라 - 보라색으로 색상이 변화되며, 일부 침전물이 형성되는 양상을 보였다[도 10 및 11].
따라서 구조적 안정성 검정을 위한 저장조건 실험에서는 유도체화 전, 후 모두 약알칼리조건(pH 7.5)에서는 이미 저장시작 전부터 구조적 파괴에 의한 색상변화가 유도되었으므로 실제 저장조건 실험은 산성조건인 pH 1.5, 2 및 4에서 10일 간격으로 90일간 저장 조건별 용액의 색상변화를 육안으로 확인하고, 안정성을 정량적으로 평가하기 위해 HPLC를 이용하여 안토시아닌 색소 성분의 잔존율을 측정하였다.
저장조건 및 pH 변화에 따른 안토시아닌 색소의 색상변화를 육안으로 관찰한 결과 상온 자연광 조건의 유도체 변환 전 시료는 저장일수가 경과할수록 모든 pH조건에서 적색의 색상이 엷어지는 현상을 느낄 수 있었으며, 특히 저장 50일 부터는 모든 pH조건에서 엷은 황색으로 변화되는 양상이 두드러지게 나타났으며, 저장 90일에는 완전히 황색용액으로 변화되어 완전한 구조적 파괴가 수반됨을 알 수 있었다.
한편, 상온 자연광 조건에서 유도체 변환 후 시료는 저장 40일 까지는 pH에 관계없이 모두 적색의 색상을 그대로 유지하였으나, pH 1.5에서는 저장 50일부터 적색의 색상이 일부 약해지는 양상을 나타내었으며, 저장 90일에는 유도체 전 시료와 유사한 황색용액으로 변화되었다. 그 외 pH 2 및 4의 유도체 변환 후 시료는 처음 저장 전 보다는 적색이 다소 약해지고, 황색의 색상이 일부 보이는 양상이지만 비교적 적색의 색상을 잘 유지하여 구조적으로 안정되어 있는 것으로 조사되었다.
저온 암조건에서 저장된 시료들은 유도체 합성 전 pH 4인 조건에서만 저장일수가 60일이 경과 되었을 때부터 일부 적색의 색상이 옅어지는 양상을 나타내었고, 기타 조건의 시료들은 유도체화 전, 후 모두 pH조건에 관계없이 적색의 색상을 잘 유지하는 것으로 조사되었다[도 12].
따라서 유도체화 전 자연 상태의 안토시아닌은 pH조건에 관계없이 상온 자연광 조건에 노출되는 순간부터 서서히 안토시아닌의 구조적 파괴에 의한 색상 변화가 유도되며, 저장 40일 이후부터는 거의 적색을 잃어버리는 양상을 나타내지만, 유도체화 전 자연상태의 안토시아닌이라도 저온 암조건에서 보관하면 90일 이상 저장하여도 저장 전 대비 육안으로는 색상의 변화를 거의 느끼지 못하는 양상을 확인할 수 있어 안토시아닌의 경우 온도와 빛에 의한 급격한 구조적 변화를 확인할 수 있다.
한편 합성 안토시아닌 유도체 시료는 상온 자연광 조건에서 pH가 2 이하로 떨어질 경우 일부 색상의 변화 및 구조적 파괴가 수반되지만, pH가 2이상 일 때는 상온 자연광 및 저온 암조건에서 90일 이상 저장하여도 모두 색상을 잘 유지하는 양상을 나타내므로 안토시아닌 유도체로 변환 후 육안으로 판별 시 구조적 안정성이 확실히 강화된 양상을 확인 할 수 있다.
저장조건 및 pH 변화에 따른 안토시아닌 색소의 색상변화를 객관적이고, 정량적으로 평가하기 위해 HPLC를 이용하여 정량적으로 안토시아닌 및 안토시아닌 유 도체의 함량을 평가하여 저장기간 및 pH별 색소의 잔존율을 평가하였다. 상온 자연광 조건에서 저장 할 시 유도체화 변환 전 자연상태의 안토시아닌은 pH에 관계없이 저장일이 10 내지 50일 까지 저장일이 10일경과할 때 마다 10 내지 20%씩 함량이 급격히 감소되어 구조적 파괴가 심각하게 유도되는 양상을 나타내었고, 저장일이 50일이 경과하면 구조적 파괴가 완만해지는 양상을 나타내지만 이미 잔존 안토시아닌의 양은 20% 미만의 수준이며, 저장일이 90일이 되면 색소함량은 0 내지 4% 미만으로 pH에 관계없이 거의 완전히 구조적 파괴가 일어나는 양상을 나타내었다.
그러나 안토시아닌 유도체는 상온 자연광 조건하에서 30일 까지는 pH에 관계없이 색소 함량이 전혀 감소되지 않는 양상을 나타내며, 30일 이후 pH 1.5의 강산성 조건에서는 서서히 함량이 감소되는 양상을 나타내어 저장 70일에서 약 53%의 잔존율을, 저장 90일에는 약 28%의 잔존율을 나타내어 유도체로 변환하여도 상온 자연광 조건에서 극한 강산성 조건일 경우 일부 구조적 파괴가 수반되는 양상을 나타낸다.
반면, pH 4 조건에서는 저장 90일이 되어도 색소의 잔존량은 100%를 유지하고, pH 2 조건에서는 저장 90일에 색소의 잔존량이 93%를 유지하고 있으므로 안토시아닌의 파괴가 치명적인 상온 자연광 조건에서 pH가 2 내지 4 수준일 경우 90일 이상 저장하여도 구조적 변성이 거의 일어나지 않는 양상을 나타내어 육안적으로 관찰한 색상의 변화와 유사한 양상을 나타내었고, 유도체로 변환 후 극단적인 물리, 화학적 변화에도 안토시아닌 유도체는 구조적 안정성이 극히 강화된 뛰어난 결과를 확인할 수 있었다[도 13].
또한 저온 암흑 조건에서 저장 할 시 유도체화 변환 전 자연상태의 안토시아닌은 pH 1.5인 강산성 조건에서는 저장 90일 후 약 55%의 색소 잔존율을 나타내었고, pH 2는 71%, pH 4는 약 87%를 나타내어 육안으로는 색상의 변화가 거의 일어나지 않는 양상을 나타내지만 실제 안토시아닌은 구조적 파괴가 수반되어 안토시아니딘으로 변화되어 있는 양상을 확인할 수 있었으며, 저온 암조건에서 저장하여도 일부 안토시아닌이 구조적 변성을 받는다는 것을 확인할 수 있고, pH가 높을수록 구조적 변성이 약하게 일어난다는 것을 확인할 수 있다.
그러나 안토시아닌 유도체의 경우 pH에 관계없이 90일 이상 저장하여도 안토시아닌의 구조적 파괴가 전혀 수반되지 않았고, pH가 강산성 쪽으로 갈수록, 저장기간이 길어질수록 오히려 안토시아닌 유도체 색소의 함량이 일부 증가하는 양상을 나타내었으며, 유도체로 변환 후 온화 혹은 가혹한 물리, 화학적 변화 시에도 안토시아닌 유도체는 구조적 안정성이 강화된 결과를 확인할 수 있다[도 14].
2) 합성 안토시아닌 유도체의 항산화 활성 검정
안토시아닌 유도체와 순수 안토시아닌의 항산화 활성을 비교 검정하기 위해 Nagai 등에 의한 방법을 사용하여 측정하였다. 농도별로 제조된 유도체 변환을 시도하지 않은 순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체 시료 각 0.083mL에 0.208mL의 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)(pH 7.0)을 혼합하고 다시 0.208mL의 2.5% (w/v) 리놀레산(linoleic acid)을 첨가하였다. 산화 유도 시작은 0.021mL의 0.1M 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride를 첨가하여 37° C, 암상태로 반응시키면서부터 시작하여 200분까지 매 50분마다 리놀레산이 산화되는 정도를 검정하였다. 상기 기술한 반응액 0.1mL에 75% 에탄올 4.7mL, 30% 암모늄 티오시아네이트(ammonium thiocyanate) 0.1mL, 3.5% HCl이 포함된 0.02M 페러스 클로라이드( ferrous chloride) 0.1mL를 혼합한 후에 3분 동안 정치하여 두었다가 UV/VIS 스펙트로미터(spectrometer)를 사용하여 과산화물 생성정도를 500nm에서 흡광도로 측정하였다. 대조구는 시료를 첨가하지 않고 리놀레산만을 첨가한 것을 사용하였다. 항산화 활성평가의 대조구는 α-토코페롤(VE)과 아스코르브산(VC)을 100ppm 수준으로 제조하여 사용하였다. 200분 후에 최종 저해율(%)을 농도별로 산출하였다.
유도체로 변환 되지 않은 순수 안토시아닌(A)은 반응 50분 이후 시간이 경과함에 따라 농도와 시간에 따른 변화가 큰 경향을 나타낸 반면 안토시아닌 유도체(AD)의 경우 명확하게 농도 의존적으로 지질과산화에 대한 저해활성을 나타내었을 뿐만 아니라 50ppm 이상으로 처리되어진 안토시아닌 유도체의 경우 화학적으로 안정한 아스코르브산(ascorbic acid)과 토코페롤(α-tocopherol)과 유사하게 저해활성이 일정하게 유지되는 특성을 나타내었다[도 15].
반응하지 200분 후에 최종 지질과산화 저해활성을 비교하여 본 결과 안토시아닌 유도체의 경우 유도체로 변환되지 않은 순수 안토시아닌에 비교하여 유사한 지질과산화 저해활성을 나타내었다. 유도체로 변환되지 않은 순수 안토시아닌의 지질과산화 저해활성이 10에서 50㎍/㎖ 까지는 지질과산화 저해 활성이 점차 증가하다가 100㎍/㎖ 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 반면 안토시아닌 유도체의 경우 농도 의존적으로 저해활성이 증가되는 양상을 나타내었고, 이것은 안토시아닌 유도체가 지질과산화 활성을 나타내는데 농도별로 안정적으로 작용하였다는 것을 나타내며, 이는 안토시아닌 유도체의 구조적 안전성이 증대되어진 것에 따른 양상으로 판단된다[도 16].
3) 안토시아닌 유도체의 고혈압(ACE, Angiotensin Converting Enzyme) 저해능 측정
순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체를 농도별로 조제한 25μL의 시료, 5.83mM HHL(hippuryl-Lhistidyl-L-leucine; Nacalai, Kyoto, Japan)와 1.0M NaCl을 포함하는 75μL의 0.1M 소듐 보레이트(sodium borate)(pH 8.3)를 37°C에서 5분 동안 반응시킨 후 1mU ACE(0.125U/mL, from rabbit lung; Sigma, St. Louis, MO, USA)와 1.0M NaCl, 0.1M 소듐 보레이트 완충액(sodium borate buffer)(pH 8.3)을 포함하는 기질용액 0.025ml를 첨가하고, 혼합액을 다시 37℃ 에서 60분간 인큐베이션(incubation) 하였다. 이후 1N HCl 125μL를 첨가하여 반응을 종결시킨 후 ACE에 의해 HHL로부터 용해된 히푸르산(hippuric acid)을 추출하여 고혈압 억제 활성을 검정하였다. 히푸르산의 추출은 반응액에 3mL의 에틸 아세테이트를 첨가하고 교반한 후 에틸 아세테이트층을 따로 분리한 후 감압농축 하였으며, 2mL의 증류수를 사용하여 재용해하고 228nm (UV-1200; Shimadzu, Kyoto, Japan)에서 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도를 통하여 검량선을 작성하고, ACE를 50%불활성화 시키는 농도(IC50, 50% Inhibition Concentration)를 구하였으며, 대조구로는 상용 ACE 저해제 인 captopril(Sigma St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.
고혈압은 장기간의 당뇨와 연관되어 있고 많은 심혈관계 질환에 노출될 위험성을 가지고 있다. 항고혈압 제제를 사용하여 안지오텐신 I 전환 효소(angiotensin I converting enzyme)(ACE)의 발현 조절을 통해 고혈압을 예방하는 것은 이러한 위험성을 낮출 수 있는 중요한 전략이다. 순수 안토시아닌 및 합성 안토시아닌 유도체의 ACE 저해 활성을 검토한 결과 순수 안토시아닌 및 안토시아닌 유도체 모두 항고혈압 대조구 활성물질인 캡토프릴(captopril)의 수준에는 미치지 못하였으나, 유도체 합성 안토시아닌이 순수 안토시아닌에 비해 약 2배 이상의 고혈압 저해 활성이 높은 수준으로 조사되었다(표 4).
[표 4] 순수 안토시아닌 및 합성 안토시아닌 유도체 항고혈압 활성
| 시료 | Captopril | 순수 안토시아닌 | 안토시아닌 유도체 |
| ACE inhibition Concentration (IC50 ㎍/mL) | 0.085± 0.016 | 301.2± 4.3 | 144.4± 1.7 |
| Mean± S.E obtained from six experiments | |||
4) 안토시아닌 유도체의 인체 항암활성
순수하게 분리된 안토시아닌 유도체와 유도체 변환을 시도하지 않은 순수 안토시아닌의 인체 암세포주에 대한 세포생육억제 효과를 SRB(Sulfo Rhodamine B)법으로 조사하였다. 암세포주는 전립선암 세포주인 LNCaP, 결장암 세포주인 HCT-15, 위암 세포주인 ACHN, 폐암 세포주인 A549, 백혈병 세포주인 MOLT-4F를 사용하였다. 정상세포에 대한 독성을 확인하기 위하여 간세포주인 293(human embryo liver)을 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank)로부터 구입하여 대조구로 사용하였다.
상기 암세포주는 10% 소 태아 혈청이 포함된 RPMI 1640배지를 사용하여 배양하였고, 배양된 세포는 일주일에 한 번 또는 두 번 정도 분주하여 유지하였다. 항암활성을 측정하는데 사용하는 세포 농도는 3,000～6,000개/mL이었으며, 상기 방법에 사용한 모든 시약은 100% DMSO에 녹이고, 이를 단계적으로 희석하여 안토시아닌과 안토시아닌 유도체의 시료 농도를 30, 10, 5, 2.5, 1, 0.1㎍/mL로 조제하였다. 세포의 수를 측정하여 일정한 농도로 96-well plate에 분주하고 하루가 경과한 다음 세포가 나타내는 기본적인 흡광도를 나타내는데 필요한 Tz 플레이트(plate)로서 시료를 처리할 플레이트와 동일한 세포농도를 가진 다른 플레이트를 50% TCA를 사용하여 고정하였다. 그리고 시료를 처리할 플레이트는 시료의 최종 농도를 0.1% DMSO로 맞추어 5개의 농도로 처리하였다. Tz 플레이트(plate)는 1시간이 경과하면 수돗물로 세척하고, 시료를 처리한 플레이트는 2일이 경과한 다음 50% TCA를 well당 50μL씩 처리하여 고정하고 역시 1시간이 경과하면 수돗물로 세척하였다. 세척한 플레이트는 상온에서 건조시키고, 그 후 0.4% SRB 용액을 well 당 100μL씩 가한 다음 30분이 경과하면 1% 아세트산 용액으로 세척하였고, 이를 다시 상온에서 건조 시켰다. 다음 10mM Tris 염기(pH: 10.5)를 well 당 100μL씩 가하여 다시 용해시키고, ELISA 해독기를 사용하여 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 암세포의 성장을 50% 억제하는 화합물의 농도를 GI50(㎍/mL)으로 나타내었고, 대조군으로 아드리아마이신(adriamycin)을 사용하였다. 또한 항암활성 검정 중에 시간의 경 과에 따른 순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체의 안정성에 연관하여 최종 농도에서 낮은 항암활성을 나타낸 A549 암세포주를 대상으로 하여 순수 안토시아닌(A)과 안토시아닌 유도체(AD)를 100㎍/mL의 수준으로 처리하고 6, 12, 48시간 별로 암세포주 저해활성을 검정하였다. 암세포주 저해활성은 시료를 첨가하지 않는 처리구의 흡광도에 대한 시간별 처리구의 흡광도를 측정하여 저해율을 나타내었다.
순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체를 6종의 인체 암세포주에 대한 생장저해 효과를 검정하여 본 결과 순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체 모두 전립선암세포주, 신장암세포주, 결장암세포주, 폐암세포주, 백혈병세포주에 대한 항암활성을 나타내었고, 특히 전립선암세포주(LNCaP) 및 백혈병 세포주(MOLT-4F)에서 높은 활성을 나타내었다(표 5).
[표 5] 순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체의 항암 활성
| GI50 (㎍/ml) | ||||||
| Prostate (LNCaP) | Colon (HCT-15) |
Renal (ACHN) |
Colon (SW-620) |
Lung (A549) |
Leukaemia (MOLT-4F) |
|
| 순수 안토시아닌 | 16.28 | > 30 | 22.14 | > 30 | 26.28 | 24.11 |
| 안토시아닌 유도체 | 2.64 | > 30 | 11.42 | 28.22 | 16.32 | 10.08 |
| Adriamycin | 0.13 | 0.16 | 0.13 | < 0.03 | < 0.03 | 0.05 |
순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체간의 활성을 상호비교하여 보면 활성을 나타내지 않는 HCT-15 결장암세포주를 제외하고 모든 암세포주에 대하여 안토시아닌 유도체가 순수 안토시아닌에 비해 높은 함암활성을 나타내었다. 안토시아닌은 화학적 구조에 따라 서로 다른 비당체(aglycone)를 가지며, 그에 따라 서로 다른 생물학적 활성을 나타낸다고 보고되어지고 있으며, 이러한 구조와 기능 사이의 상 관관계는 세포내에서 작용하는 위치에 의해 결정되어지는 것으로 보고되어지고 있다.
시간 경과에 따른 순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체의 암세포주 저해활성을 비교하여 본 결과 순수 안토시아닌의 경우 6시간부터 12시간 까지는 암세포주 성장저해 효과를 나타내다가 48시간 이후에는 저해효과가 급격하게 감소하는 경향을 나타낸 반면, 안토시아닌 유도체의 경우 48시간 이후에도 암세포주의 성장저해 효과가 높은 수준으로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다[도 17].
보통 특정 세포나 조직에서의 안토시아닌의 활성효과를 검정할 때 사용되어지는 완충액(buffer)은 대부분이 중성 pH인데, 대부분의 안토시아닌은 중성 혹은 알칼리 조건에서 구조적 파괴가 심각하게 수반되어 진다는 보고에 근거하여 볼때 순수 안토시아닌의 경우 시간이 경과함에 따라 항암활성에 사용되어지는 완충액에 의해 구조적 파괴가 수반되어지는 반면 안토시아닌 유도체의 경우 48시간이 경과해도 높은 항암활성을 유지하는 것으로 보아 안토시아닌 유도체가 암세포주의 성장을 저해할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 완충액의 pH 변화에도 불구하고 구조적 안전성이 유지되는 것에 기인한 원인으로 판단된다.
상기에서 확인된 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 안토시아닌 유도체는 우수한 항고혈압, 항산화 및 항암효과를 나타내므로 고혈압 및 암에 대한 치료 및 예방용 약학적 조성물로 제제화될 수 있다.
제제예 1. 시럽제의 제조방법
본 발명의 화학식 1의 안토시아닌 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.
화학식 1 의 안토시아닌 화합물, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.
상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ········ 2 g
사카린 ·······················0.8 g
당 ························ 25.4 g
글리세린······················ 8.0 g
향미료 ······················ 0.04 g
에탄올 ·······················4.0 g
소르브산 ······················0.4 g
증류수 ·······················정량
제제예 2. 정제의 제조방법
유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.
화학식 1의 안토시아닌 유도체 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ····· 250 g
락토오스 ···················175.9 g
감자전분 ····················180 g
콜로이드성 규산 ················ 32 g
10% 젤라틴 용액
감자전분 ····················160 g
활석 ······················ 50 g
스테아르산 마그네슘 ··············· 5 g
제제예 3. 주사액제의 제조방법
유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ····1 g
염화나트륨···················0.6 g
아스코르브산··················0.1 g
증류수·····················정량
상기에서 확인된 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 안토시아닌 유도체는 우수한 항산화효과를 나타내므로 항산화효과에 의해 피부 노화를 억제할 수 있는 화장료 조성물로 제조될 수 있다.
제형예 1: 유연화장수(스킨로션)
하기의 성분과 함량으로 통상의 방법에 따라 유연화장수를 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ········· 0.5 g
1,3-부틸렌글리콜 ········· 6.0 g
글리세린 ········· 4.0 g
올레일알콜 ········· 0.1 g
폴리솔베이트 ········· 20 0.5 g
에탄올 ········· 15.0 g
벤조페논-9 ········· 0.05 g
향, 방부제 미량
정제수 To 100
제형예 2. 영양화장수(밀크로션)
하기의 성분과 함량으로 통상의 방법에 따라 영양화장수를 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ········· 1.0 g
프로필렌글리콜 ········· 6.0 g
글리세린 ········ 4.0 g
트리에탄올아민 ········ 1.2 g
토코페닐아세테이트 ········ 3.0 g
유동파라핀 ········ 5.0 g
스쿠알란 ········ 3.0 g
마카다이아너트오일 ········ 2.0 g
폴리솔베이트 60 ········ 1.5 g
솔비탄세스퀴올레이트 ········ 1.0 g
카르복시비닐 폴리머 ········ 1.0 g
비에이치티이 ········ 0.01 g
EDTA-2Na ········ 0.01 g
향, 방부제 미량
정제수 To 100
제형예 3. 영양크림
하기의 성분과 함량으로 통상의 방법에 따라 영양크림을 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ········ 2.5 g
세토스테아릴알콜 ······ 2.0 g
글리세릴스테아레이트 ······ 1.5 g
트리옥타노인 ······ 5.0 g
폴리솔베이트 60 ······ 1.2 g
솔비탄스테아레이트 ······ 0.5 g
스쿠알란 ······ 5.0 g
유동파라핀 ······ 3.0 g
싸이클로메치콘 ······ 3.0 g
비에이치티이 ······ 0.05 g
델타-토코페롤 ······ 0.2 g
농글리세린 ······ 4.0 g
1,3-부틸렌글리콜 ······ 2.0 g
잔탄검 ······ 0.1 g
EDTA-2Na ······ 0.05 g
향, 방부제 미량
정제수 To 100
제형예 4. 마사지크림
하기의 성분과 함량으로 통상의 방법에 따라 마사지크림을 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ······· 1.0 g
프로필렌글리콜 ········ 6.0 g
글리세린 ········ 4.0 g
트리에탄올아민 ········ 0.5 g
밀납 ········ 2.0 g
토코페릴아세테이트 ········ 0.1 g
폴리솔베이트 60 ········ 3.0 g
솔비탄세스퀴올레이트 ········ 2.5 g
세테아릴알코올 ········ 2.0 g
유동파라핀 ········ 30.0 g
카르복시비닐 폴리머 ········ 0.5 g
향, 방부제 미량
정제수 To 100
제형예 5. 팩
하기의 성분과 함량으로 통상의 방법에 따라 팩을 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ········ 1.0 g
프로필렌글리콜 ········ 2.0 g
글리세린 ········ 4.0 g
카르복시비닐 폴리머 ········ 0.3 g
에탄올 ········ 7.0 g
피이지-40 히드로게네이티드 캐스터 오일 ········ 0.8 g
트리에탄올아민 ········ 0.3 g
비에이치티이 ········ 0.01 g
EDTA-2Na ········ 0.01 g
향, 방부제 미량
정제수 To 100
상기에서 확인된 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 안토시아닌 유도체는 우수한 항고혈압, 항산화 및 항암효과를 나타내므로 암이나 고혈압 같은 다양한 질병에 대한 예방용 건강기능식품으로 제조될 수 있다.
제조예 1. 캔디
하기의 제조비로 캔디를 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ····· 10.5 g
설탕 ················50.0 g
물엿 ··············· 24.0 g
향료 ··············· 0.5 g
물··············· 15 g
제조예 2. 정과
하기의 제조비로 정과를 제조하였다.
화학식 1 의 안토시아닌 유도체 ····· 10.5 g
설탕 ················ 66.4 g
글루코오스 ················ 19.0 g
자당지방산에스테르 ················ 0.2 g
향료 ················ 0.2 g
물 ················ 3.7 g
이상에서 본 발명을 도면 및 실시예 등에 의하여 설명하였으나, 이는 본 발명의 가장 바람직한 실시양태를 기재한 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되지 아니함은 당연하다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 본 명세서의 기재내용에 의하여 다양한 변형 및 모방을 행할 수 있을 것이나, 이 역시 본 발명의 범위를 벗어난 것이 아님은 명백하다고 할 것이다.
도 1은 검정콩 종피에서 분리된 안토시아닌 시아니딘 3-글루코사이드(cyanidin 3-glucoside) 의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 분리 안토시아닌 시아니딘 3-글루코사이드(cyanidin 3-glucoside)의 자외-가시(UV/vis) 분광특성을 나타낸 것이다.
도 3은 분리 안토시아닌 cyanidin 3-glucoside의 LC-ES/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 안토시아닌 유도체 합성일수별 on-line HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 합성 전 및 최종 합성 후 합성용액의 on-line HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 합성된 안토시아닌 유도체의 Prep-HPLC 순수 분리 과정을 나타낸다.
도 7은 Prep-HPLC로 순수 분리된 안토시아닌 유도체의 HPLC 크로마토그램이다.
도 8은 합성 안토시아닌 유도체의 자외-가시 분광특성을 나타낸 것이다.
도 9는 합성 안토시아닌 유도체의 LC-ES/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 유도체 전(상), 후(아래)용액의 pH 조절에 의한 색상 변화를 나타낸 것이고, 도 11은 유도체 전(좌), 후(우) 용액의 pH별 색상을 나타낸 것이며[상좌 : 7.5, 상우 : 4, 하좌 : 2, 하우 : 1.5], 도 12는 상온 자연광(상) 및 저온 암조건(하)에서 저장 90일 후 유도체 전, 후 용액의 pH별 색상을 나타낸 것이다.
도 13은 상온 자연광 조건에서 저장기간 및 pH별 유도체 전, 후 용액의 색소 잔존율을 나타낸 것이다.
도 14는 저온 암흑 조건에서 저장기간 및 pH별 유도체 전, 후 용액의 색소 잔존율을 나타낸 것이다.
도 15는 순수 안토시아닌(A)과 유도체 변환 안토시아닌(AD)의 시간 및 농도별 항산화 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 순수 안토시아닌(A)과 유도체 변환 안토시아닌(AD)의 농도별 항산화 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 폐암 세포주 A549 세포에서 순수 안토시아닌과 안토시아닌 유도체의 시간 경과에 따른 세포생장 억제율을 비교한 것이다.
Claims (11)
- 다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체.[화학식 1]
- 검정콩 종피에 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하고 냉침하여 안토시아닌 조 추출물을 추출한 다음 여과하여 불용물을 제거하고 농축하여 안토시아닌 조 추출물을 얻는 과정,상기 안토시아닌 조 추출물을 물과 에틸 아세테이트로 분획, 추출하여 얻은 물층을 농축하여 안토시아닌 추출물을 얻은 다음 염산 함유 10∼60% 알콜 수용액으로 순차 분리정제하여 안토시아닌 시아니딘 3- 글루코사이드를 분리하는 과정, 및,상기 분리된 시아니딘 3- 글루코사이드와 소듐 피루브산(Na pruvate)을 40 내지 50 ℃로 유지되는 산함유 알콜 수용액 중에서 10 내지 30 일간 반응시켜 유도 체를 합성한 후 분리 정제하여 다음 화학식 1로 표시되는 안토시아닌 유도체를 얻는 과정,을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 유도체의 합성방법.[화학식 1]
- 청구항 2에 있어서,상기 안토시아닌 조 추출물의 추출은 검정콩 종피에 0.1∼10% 산을 함유한 물 또는 알콜 수용액을 첨가하고 24시간 내지 72시간동안 냉침을 2 내지 4회 반복 수행하고 메탄올 수용액으로 추출하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 유도체의 합성방법.
- 청구항 1항에 있어서상기 산함유 알콜 수용액 중에서 산은 유기산 및 무기산을 0.1 내지 10% 포함하고, 알콜은 10 내지 80% 포함하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 유도체의 합성방법.
- 청구항 4에 있어서,상기 산은 염산 0.1 내지 1% 또는 개미산, 초산, 능금산, 호박산 및 구연산 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유기산 1 내지 10%인 것을 특징으로 하는 안토시아닌 유도체의 합성방법.
- 청구항 1의 화학식 1로 나타내는 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 고혈압 치료제.
- 청구항 1의 화학식 1로 나타내는 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 항암제.
- 청구항 1의 화학식 1로 나타내는 안토시아닌 유도체 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화제.
- 청구항 8의 항산화제를 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화활성을 갖는 화장료.
- 청구항 1의 화학식 1로 나타내는 안토시아닌 유도체 또는 식품학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암 및 고혈압의 예방 기능을 갖는 식품첨가제.
- 청구항 10의 식품첨가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 암 및 고혈압의 예방 기능을 갖는 건강기능식품.
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-
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