JP4436055B2 - 抗菌剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌剤に関するものであり、更に詳細には、天然物由来の新規抗菌性物質の単離、構造解析及び抗菌活性に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
グァバ(guava:Psidium guajava L.)は、主に亜熱帯から熱帯にかけて生育しているフトモモ科の常緑樹であって、その葉や、根、果実は古来より病気の処置や保存等に用いられてきた。現在も、果実は生食やジュースとして、葉はグァバ茶として利用されている(例えば、非特許文献1参照)。
【0003】
また、グァバ葉中には、モリン(morin)やケルセチン(クェルセチン:quercetin)等の二次代謝産物が含まれ、これらが抗菌性を有することは既知である。具体的には、例えば次のような微生物に対する抗菌性が検討されている:レジオネラ属菌、インフルエンザ等のウイルス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ヘリコバクター・ピロリ(例えば、それぞれ、特許文献1、2、3、4参照)。また、飲食品の製造分野でも佐藤らによってグァバにも多少の抗菌活性があることが報告されているが(例えば、非特許文献2参照)、グァバ由来のフラボノイド配糖体、特にモリン−リキソシド、モリン−アラビノシドについては、これらの化合物自体が未知であり、ましてや、これらの化合物が有する抗菌活性などは従来報告されておらず、全く新規である。
【0004】
【特許文献1】
特開平11−43442号公報
【0005】
【特許文献2】
特開2000−273048号公報
【0006】
【特許文献3】
特開平08−99893号公報
【0007】
【特許文献4】
特開平08−119872号公報
【0008】
【非特許文献1】
「廣川 薬科学大辞典」、廣川書店、昭和58年4月15日、p.351
【0009】
【非特許文献2】
「J. Biosci. Bioeng.」90巻、4号、2000年、p.442−446
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
抗菌剤としては、化学合成品が多用されているが、人体や環境に対する安全性の面での問題も指摘されており、消費者サイドの意識の変革の高まりとともに、当業界においても、安全性が高く、適用範囲も広いすぐれた抗菌剤の開発が待望されている。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した業界のニーズに応えるためになされたものであって、安全性重視の面から、本発明者らは、天然物に着目し、各種植物の抗菌活性を広範にスクリーニングし、検討した結果、健康茶等として飲用されているグァバの葉に高い抗バクテリア活性があることを見出した。
【0012】
上記新知見に基づき、本発明者らは、グァバ葉のメタノール水溶液抽出物について抗菌活性を詳細に検討、研究の結果、4種類の抗菌活性物質を単離するのに成功し、それぞれの物質の構造解析と抗菌活性の測定を行った結果、4種類の抗菌活性物質(化合物1〜IV)の構造決定に成功した。
【0013】
本発明者らが単離した化合物は、いずれも、フラボノイド配糖体であって、化合物I及びIIは、そのアグリコンがいずれもモリンであり、化合物IIIは、guaijaverinであってそのアグリコンはケルセチンであり、化合物IVはケルセチン自体であった。これらの内、化合物I及びIIは従来未知の新規化合物であって、後記する物理化学的諸性質から、それぞれ、モリン−3−O−α−L−リクソピラノシド(モリン−3−O−リキソシド)及びモリン−3−O−α−L−アラボピラノシド(モリン−3−O−アラビノシド)と同定された。これらの化学構造を下記化5、化6に式(I)、式(II)として示す。
【0014】
【化5】
【0015】
【化6】
【0016】
すなわち、本発明は、式(I)及び/又は式(II)に示される化合物、該化合物を有効成分とする抗菌剤を新たに提供するものである。
以下、本発明について詳述する。
【0017】
本発明に係る化合物の内、化合物I及びIIの物理化学的諸性質は、次のとおりである。なお、化合物III、IVの物理化学的諸性質も下記に示す。
【0018】
化合物 I ( Morin − 3 − O −α− L − lyxopyranoside, Morin − 3 − O − lyxoside )
分子式 C20H18O11
黄色非晶質粉末
融点270−280℃
[α]−40°(c 0.001, MeOH)
TLC:RP−18 F254 0.25mm plate(Merck)メタノ−ル:水:TFA=40:60:0.1(v/v)
Rf値:0.46
UV:λmax(MeOH)nm(ε):260(25,700), 352(18,200)
IR:γmax(polypropylene)cm-1:3367, 1656, 1606, 1502, 1355, 1301, 1193, 1081
HR−FAB−MS m/z(M+):calcd. for C20H18O11 434.0849;found, 434.0890;
APCI−MS m/z:435.02 [M+H]+, 302.95 [M+H−132]+
CD: [θ]227 −15,000, [θ]252 +26,000, [θ]277 −25,000, [θ]305 −1,600, [θ]350 4,800
13C−NMR (Bruker DPX−250)及び1H−NMR (Joel JNM−GX400 spectrometer)から得られたスペクトルは表1を参照。
【0019】
化合物 II ( Molin − 3 − O −α− L − arabopyranoside, Molin − 3 − O − arabinoside )
分子式 C20H18O11
黄色非晶質粉末
融点250−260℃
UV:λmax(MeOH)nm(ε):260(24,500), 352(17,300)
[α]D 25−104°(c 0.001, MeOH)
TLC:RP−18 F254 0.25mm plate(Merck)メタノ−ル:水:TFA=40:60:0.1(v/v)
Rf値:0.41
IR:γmax(polypropylene)cm-1:3352, 1654, 1604, 1514, 1367, 1317, 1109, 1088
HR−FAB−MS m/z(M+):calcd. for C20H18O11 434.0849;found, 434.0890;
APCI−MS m/z:435.02 [M+H]+, 303.28 [M+H−132]+
CD:[θ]227 −21,000, [θ]251 +53,000, [θ]279 −58,000, [θ]308 −6,900, [θ]345 17,500
13C−NMR (Bruker DPX−250)及び1H−NMR (Joel JNM−GX400 spectrometer)から得られたスペクトルは表1を参照。
【0020】
化合物 III ( Quercetin − 3 − O − arabinoside, guaijaverin)
黄色針状結晶体
融点250−260℃
UV:λmax(MeOH)nm(ε):265(31,600), 370(24,000)
IR:γmax(polypropylene)cm-1:3352, 1654, 1604, 1502, 1357, 1301, 1201, 1080
APCI−MS m/z:435.11 [M+H]+, 303.34 [M+H−132]+
1H−NMR spectrum (Joel JNM−GX400 spectrometer):400 MHz in CD3OD
δ:7.74(1H, s, H−2'), 7.57(1H, d, J=8.0 Hz, H−6'), 6.86(1H, d, J=8.0 Hz, H−5'), 6.39(1H, br. s, H−6), 6.19(1H, br. s, H−8), 5.15(1H, d, J=7.0 Hz, H−1''), 3.89(1H, br. d, J=9.6 Hz, H−2''), 3.82(1H, m, H−5''), 3.80(1H, m, H−4''), 3.64(1H, br. d, J=3.6 Hz, H−3''), 3.43(1H, m, H−5'')
13C−NMR spectrum (Bruker DPX−250):62.5 MHz in CD3OD
δ:178.5(C−4), 165.0(C−7), 162.1(C−5), 157.7(C−8a), 157.4(C−2), 148.9(C−4'), 145.0(C−3'), 134.7(C−3), 122.0(C−1'), 121.9(C−6'), 116.5(C−5'), 115.2(C−2'), 104.7(C−4a), 103.6(C−1''), 98.9(C−6), 93.7(C−8), 73.1(C−2''), 71.9(C−3''), 68.1(C−4''), 65.9(C−5'')
【0021】
化合物 IV ( Quercetin )
分子式 C20H18O11
黄色非晶質粉末
融点320−330℃
UV:λmax(MeOH)nm(ε):253(21,400), 366(14,800)
IR:γmax(polypropylene)cm-1:3342, 3315, 1658, 1612, 1562, 1519, 1444, 1371, 1319, 1207, 1166
APCI−MS m/z:303.28 [M+H]+
1H−NMR spectrum (Joel JNM−GX400 spectrometer):250MHz in CD3OD
δ:7.65(1H, d, J=2.5 Hz, H−2'), 7.55(1H, dd, J=10.0, 2.5 Hz, H−6'), 6.80(1H, d, J=10.0 Hz, H−5'), 6.31(1H, d, J=2.5 Hz, H−6), 6.10(1H, d, J=2.5 Hz, H−8)
13C−NMR spectrum (Bruker DPX−250):62.5MHz in CD3OD
δ:178.6(C−4), 164.6(C−7), 161.5(C−5), 157.2(C−2), 147.8(C−4'), 146.3(C−8a), 145.2(C−3'), 136.2(C−3), 123.1(C−1'), 120.7(C−6'), 115.2(C−2'), 115.0(C−5'), 104.7(C−4a), 98.2(C−6), 93.4(C−8)
【0022】
【表1】
表1においてケミカルシフトはppmで示し、sはシングレット、dはダブレット、mはマルチブレットである。DEPTで決定。H−H COSYとHMBCで確認した。
【0023】
化合物I、IIは、グァバの各部位に存在しており、例えばグァバ葉のメタノール水溶液抽出液を、溶媒処理、分配処理、クロマトグラフィーによる分画、精製処理といった常用される各処理を適宜組み合わせて、抗菌活性を指標として分離、精製することにより製造入手することができる。また、これらの化合物は、いずれもその化学構造が明らかになっているので、化学合成によっても製造入手することができる。
【0024】
本発明に係る抗菌剤は、化合物I及び/又はIIを有効成分とするものであるが、これらの化合物は、後記するところからも明らかなように、すぐれた抗菌作用を示すだけでなく、本来、天然物由来であるだけでなく、グァバ葉として長期間飲用されているように安全性が高く(事実、1日当り100mgの化合物をラットに対して経口投与したが、15日間経過後においても急性毒性は認められなかった)。抗菌剤として各種用途に広範に使用することができる。
【0025】
本発明に係る有効成分化合物は、飲食品に対して直接ないし間接的に添加して、飲食品用の日持ち向上剤及び/又は抗菌剤として使用したり、抗カビ剤あるいは果実や野菜等青果物の貯蔵や輸送時の腐敗防止剤(例えばポストハーベスト農薬の代替物)として使用できるほか、医薬品や化粧品あるいは工業薬品の腐敗、変質を防止する抗菌剤としても使用可能である。
【0026】
また、本発明に係る抗菌剤は、医薬品としても使用可能であって、有効成分化合物をそのまま又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体中に、例えば0.1〜99.5%、好ましくは0.5〜90%含有する医薬組成物として投与される。
【0027】
担体としては、固形、半固形、又は液状の希釈剤、充填剤、及びその他の処方用の助剤の一種以上が使用される。本発明医薬組成物は、経口、組織内、局所、経腸投与がそれぞれ可能であって、経皮など外用剤としても使用可能であり、常法にしたがって、これらの投与に適応した剤型に製剤化すればよい。その用量としては、患者の年齢、体重、投与経路、疾病の種類等にしたがって適宜定める。通常は、成人に対して本発明の有効成分量として、一日当たり、10〜2000mgの範囲が一般的であるが、この範囲はひとつの目安であって、必要に応じて増減すればよい。
【0028】
以下、本発明の実施例について述べる。
【0029】
【実施例1】
(1)粉末状にした沖縄産乾燥グァバ葉130gを原料とし、90%(v/v)メタノール水溶液を1.3L用いて常温で一晩抽出を3回繰り返した。抽出液を一つにまとめ、減圧濃縮を行ない、残渣を水に懸濁した。水懸濁物にヘキサン及びクロロホルムを加え疎水性物質を除いた水層を得て、それをさらに酢酸エチルにて分配した。酢酸エチル可溶部は減圧濃縮しメタノール400mlに可溶後、クロロホルムと水を加え二層に分配後、透明な淡黄色の上層を濃縮した。濃縮した油状物質は0.1% TFA(トリフルオロ酢酸)を含む25%メタノール溶液に溶解した。
【0030】
(2)上記の方法で得られた抽出溶液を、以下の条件にて、溶出液として0.1% TFA含有メタノール水溶液を用い、そのメタノール濃度を変えて順次分画を行った。
(分画条件)
【0031】
上記の条件により分けられた4つの分画について、バクテリア指標菌としてBacillus cereus(ATCC 11778)およびSalmonella enteritidis #1の二種を用いて、ペーパーディスク法にて抗菌活性を評価した結果、50%メタノール水溶液抽出区分が最も高い抗菌活性を示した。
【0032】
(3)そこで、下記の分析条件1にてHPLC(高速液体クロマトグラフィー)分画を行い、50%メタノール水溶液抽出画分を得、これを減圧濃縮した。
(分析条件1)
カラム:Cosmosil 5C18−MS(10×250mm)
流 速:2ml/min
溶 媒:50%メタノール水 0.1% TFA
【0033】
(4)上記によって得たHPLC分画の濃縮液について、下記の分析条件2にて段階的にHPLC分画を行い、フラクション1〜4を得た。
(分析条件2)
【0034】
上記条件で精製を行ない得られた4つのフラクション画分のピークをそれぞれ濃縮乾固し、以下の化合物1から4の粉末をそれぞれ各収量で得た。
フラクション1 − 化合物I: 5.8mg
フラクション2 − 化合物II: 5.2mg
フラクション3 − 化合物III:12.1mg
フラクション4 − 化合物IV: 17.2mg
【0035】
(5)これらの化合物について、既述したような物理化学的諸性質を得、これらの構造解析の結果、構造決定がなされ、グァバ抽出液中に含有されていた化合物I〜IVの物質は、以下のものであることが明らかとなった。
化合物I=モリン−3−O−α−L−リクソピラノシド(モリン−3−O−リキソシド)
化合物II=モリン−3−O−α−L−アラボピラノシド(モリン−3−O−アラビノシド)
化合物III=ケルセチン−3−O−アラビノシド(guaijaverin)
化合物IV=ケルセチン
【0036】
化合物I及びIIの化学構造式は、式(I)及び式(II)にそれぞれ示したとおりである。
【0037】
(6)上記した4種の物質(化合物I〜IV)、および、化合物IとIIのアグリコンであるモリン(morin)について、バクテリア指標菌として、バチルス・セレウス(Bacillus cereus:ATCC 11778)、サルモネラ・エンテリティデス(Salmonella enteritidis #1)の二種を使用して、抗バクテリア活性を測定し、最少抑制濃度を評価した。抗菌評価はペーパーディスク法にて実施し、Mueller−Hinton brothで培養した試験菌液に各化合物I−IVを濃度を変えて添加。37度1晩培養し、濁度によりMICを判定した。
得られた結果を下記表2に示した。
【0038】
【0039】
(7)抗バクテリア評価の結果、Morin−3−O−lyxoside(化合物I)およびMorin−3−O−arabinoside(化合物II)はB.cereus、S.enteritidisのどちらにも強い抗菌作用を示した。これらは既に抗菌性が報告されているMorin、Quercetin(化合物IV)およびguaijaverin(化合物III)に対してより強い抗バクテリア活性を有しており、MorinやQuercetinと似た抗バクテリア作用の傾向が認められた。この事からグァバ葉メタノール抽出物の有する抗バクテリア活性の有効成分としてモリン、ケルセチンおよびそれらの配糖体を中心とするフラボノイド類にあることが示された。
【0040】
【発明の効果】
本発明に係る抗菌剤は、天然物由来であるため、抗菌性にすぐれているだけでなく、安全性がきわめて高く、各種の用途に広く使用することができる。また、本発明によって抗菌剤の新規有効成分の構造決定もなされたので、この化合物の誘導体を製造することにより、更に新規な化合物や抗菌剤の創製も期待できるし、抗菌メカニズムの解明も期待することができる。
Claims (5)
- グァバ(guava:Psidium guajava L.)のメタノール水溶液抽出液を溶媒処理及びクロマト処理して、抗菌活性画分をそれぞれ分画すること、を特徴とする式(I)で示されるモリン−3−O−リキソシド及び/又は式(II)で示されるモリン−3−O−アラビノシドの製造方法。
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