JPWO2006090830A1 - プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法 - Google Patents

プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質とを酸性溶液中で加熱して得られる、フロロ/レゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物、その製造方法、及びその組成物の健康食品及び医薬品等への用途に関する。本発明によれば、植物原料から高収量で得ることが困難であった、生物活性を有し、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合した生体に吸収される程度まで低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを効率よく簡単に得ることができる。

Description

本発明は、植物中のプロアントシアニジンポリマーを生体(の腸管から容易)に吸収できる程度まで容易に低分子化することのできるプロアントシアニジンオリゴマーの製造方法に関する。
さらに詳しく言えば、プロアントシアニジンポリマーを含有する原料を、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質と酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造が結合した、重合度が2〜4のプロアントシアニジンオリゴマーを含む組成物、その製造方法、その組成物の用途、及びフロログルシノール環またはレゾルシノール環が結合した、新規なプロアントシアニジンオリゴマーに関する。
本発明により得られるプロアントシアニジンオリゴマーを含む組成物は、食品、健康食品、特定保健用食品、化粧品、医薬品に使用することができ、特に活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用組成物及び医薬品組成物として有用である。
食生活の変化による脂肪摂取の過多や、環境の変化、オゾン層破壊等による紫外線への暴露量の増加、環境汚染物質の増加等により、高脂血症、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病、癌等のいわゆる生活習慣病が増加し、さらにアレルギー、痴呆症などの脳疾患の患者も増加しつつある。今後、高齢化社会の進展と共に痴呆、アルツハイマー症候群等の患者の増加も危惧されるが、これらの要因に生体内で生成する活性酸素種の関与が指摘されている(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10 (2002),2497-2509 ;非特許文献1)。しかし活性酸素種の完全な生成抑制乃至制御技術は開発されていないため、現状では生活習慣病や脳疾患等に有効・確実な予防・治療技術は十分に確立されていない。
植物に存在して生理活性を示す天然物質、特にポリフェノール類の化合物に近年関心が集中している。ポリフェノール類は一般に茶、野菜、果実、ハーブ類等に含まれ、食品あるいは嗜好品として長期間の摂取経験のある、副作用のない治療・予防剤として期待できるものである。
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物で、植物界に普遍的、かつ多量に存在し、多彩な生理活性を示すことが知られ、古くは薬学、植物化学等の分野で、近年も健康食品分野で注目を集めている。例えば、茶のポリフェノール、特にカテキン類は、抗菌、抗ウイルス、抗突然変異、抗酸化、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など、広範囲の生理活性を有することが知られている。
ポリフェノールの中でもプロアントシアニジン類は幅広い植物に含まれるポリフェノールである。プロアントシアニジン類が、多彩な生理活性を示すには、プロアントシアニジン化合物が腸管を通じて生体内に吸収される必要がある。しかしプロアントシアニジン類の分子量は一般に数千乃至数万のオーダーと言われている。このような分子の大きな物質は腸管を通じての吸収は困難で、摂取しても生体に吸収されずに利用されないことが多い。
プロアントシアニジンは、フラバン−3−オール(カテキンとも称される)、及びそれらに没食子酸がエステル結合したものを構成単位とする2量体、3量体、4量体さらに10量体以上の高分子のプロシアニジン、プロデルフィニジン、プロペラルゴニジン等及びそれらの立体異性体の総称であり、酸処理によりアントシアニジンを生成するポリフェノール化合物群である。各構成単位は、炭素骨格の4位と8位または4位と6位の間の炭素炭素結合、時にはその結合に加えて2位と7位酸素との間のエーテル結合により結合している。
プロアントシアニジンは優れた抗酸化作用(Arch. Biochem. Biophys., 374巻, 347-355 頁, 2000年:非特許文献2)を有し、その他にも血流改善、抗ストレス、抗高血圧、抗菌、抗腫瘍、抗白内障、下痢止めなどの作用があることから、健康維持効果のある天然由来物質として応用されている。
プロアントシアニジンは松樹皮、未熟リンゴ果実、ブドウ種子などから混合物として分離され、飲料、菓子類、健康食品、化粧品、育毛剤などに配合されて市販されるに至っている。
プロアントシアニジンを含有する多くの植物では、重合度の大きいものから小さいものまで、さまざまなプロアントシアニジンが混合物として含まれており、柿、バナナ、カリンなどのように特に重合度の大きいものを主成分とする植物が多い。しかし、プロアントシアニジンの中でも重合度の大きいプロアントシアニジンポリマーは、腸からの吸収が悪いために薬理活性の点で重合度2〜4のプロアントシアニジンオリゴマーに劣るとされ、また、渋味が強く水溶性に乏しいことから食品などに応用する際には除去することが望ましいものである(Free Radical Res., 29 巻, 351-358 頁, 1998年:非特許文献3)。このようなことから、重合度が2〜4のプロアントシアニジンオリゴマーに特に優れた健康維持効果があるとして注目され、松樹皮由来のものが飲料、健康食品として使用されている。
植物エキスからプロアントシアニジンのみを得るには吸着法(例えば、特開平6−49053号公報:特許文献1)などが使用されるが、重合度の異なるものを分離することは困難である。重合度が2〜4のプロアントシアニジンオリゴマーのみを得るためには、酢酸エチル溶媒分配法、酢酸メチル固相抽出法やクロマトグラフィー法(国際公開第00/64883号パンフレット:特許文献2)、キチン吸着法(国際公開第03/091237号パンフレット:特許文献3)などにより低分子プロアントシアニジンだけを抽出分離する手法が取られている。しかし、これらの手法では、多量の高分子プロアントシアニジンポリマーが廃棄されることになり収量が悪い。
プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料から、重合度2〜4のプロアントシアニジンオリゴマーを分離する方式に代わる方法として、本発明者らは先にプロアントシアニジンポリマー含有原料をシステイン等のSH含有化合物と酸性溶液中で反応させてプロアントシアニジンオリゴマーを低分子量化する方法を提案している(国際公開第2004/103988号パンフレット;特許文献4)。この方法によれば、システインが結合し低分子量化した、体内吸収性に優れたプロアントシアニジンオリゴマーが得られる。このシステインが結合したプロアントシアニジンオリゴマーは毒性がなく、安全に使用できることが確認されているが、現在、国(日本を含む)によっては天然化学物質でないシステイン等の結合したプロアントシアニジンの健康食品などへの利用については、当局の許認可を受けるための厳格な手続を要するという問題がある。
特開平6−49053号公報 国際公開第00/64883号パンフレット 国際公開第03/091237号パンフレット 国際公開第2004/103988号パンフレット Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10 (2002), 2497-2509 Arch. Biochem. Biophys., 374巻, 347-355 頁, 2000年 Free Radical Res., 29巻, 351-358 頁, 1998年
本発明はプロアントシアニジンポリマーとして広く天然に分布しているが、そのオリゴマーとしては天然由来原料が限られていたプロアントシアニジンオリゴマーを、プロアントシアニジンポリマー、それを含む植物またはその抽出物を原料とし、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質と結合させて低分子化する簡便かつ効率的な方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、カキ(渋柿)、バナナ、ブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カリン、ライチ、ヨウバイヒ、ケイヒなどのプロアントシアニジンポリマーを含有する果実、果皮、樹皮、葉など、またはその抽出物(エキス)を、低分子量のカテキンを多量に含む緑茶あるいは新鮮茶葉と共に酸性水溶液中で穏やかに2〜3時間煮沸することにより、プロアントシアニジンが断片化され低分子化すると共に、末端にカテキンが結合したプロアントシアニジンオリゴマーに変換されることを見出した。さらに本発明者らは緑茶あるいは新鮮茶葉に代えて、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、及びその物質を含有する他の植物原料(ブドウ種子、ブドウ果皮等)またはその抽出物を用いることにより、同様にプロアントシアニジンが断片化され低分子化し、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合したプロアントシアニジンオリゴマーに変換されることを見出し、これらの知見に基づいて本発明に到達した。
すなわち、本発明は、下記1〜14に記載の通りの、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物またはそのエキスを緑茶または新鮮茶葉と酸性水溶液中加熱することにより、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物(1〜5)、その製造方法(6〜9)、その組成物の用途(10〜12)、及び新規なプロアントシアニジンポリマー(13〜14)に関する。
1.プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
2.プロアントシアニジンポリマーを含有する植物がブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カカオ、柿、バナナ、カリン、リンゴ、サンザシ、ライチ、ヨウバイヒ及びケイヒから選択される少なくとも1種である前記1に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
3.フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が、レスベラトロール、フロログルシノール、フラボノイド及びフラバノイド(カテキンのガロイルエステル)から選択される少なくとも1種類であるである前記1に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
4.フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質を含有する植物が、緑茶、新鮮茶葉、ブドウ種子、ブドウ種皮、アセンヤク、紅藻類及びこれらの抽出物から選択される少なくとも1種類である前記1に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
5.重合度が2〜4であるプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する前記1に記載の組成物。
6.プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱し、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする前記1乃至5のいずれか1項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
7.プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする前記1乃至5のいずれか1項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
8.無機酸、有機酸またはこれらの両方を用いて酸性条件とする前記6または7記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
9.塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも1種を使用する前記8に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
10.活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用である前記1乃至5のいずれかに記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
11.活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための医薬品用である前記10に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
12.活性酸素種の生成が原因となる老化の予防のための化粧品用である前記10に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
13.下記式(1)
(式中、nは0または1〜2の整数である)
で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。
14.下記式(2)
(式中、nは0または1〜2の整数である)
で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。
本発明は、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、これを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱した反応液を濃縮、乾燥して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物及びその製造方法を提供したものである。本発明によれば、プロアントシアニジンポリマー含有原料から、活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用組成物及び医薬品組成物等として有用な末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを効率よく製造することができる。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の方法でプロアントシアニジンオリゴマーを製造する原料は、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物(果実、果皮、樹皮、葉など)またはその抽出物である。
ここで、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物としては、渋柿、バナナ、リンゴ、ナシ、ブドウ、イチゴ、アボカド、コケモモ、サンザシ、レンコン、ソバ、ライチ、ヨウバイヒ等の果菜類、ハーブ・スパイス類、木材、ケイヒ、マツ樹皮等が挙げられる。これらの中でも、渋柿、バナナ、ブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カリン、ライチ及びヨウバイヒが好ましく用いられる。
本発明ではこれらのプロアントシアニジンポリマーを含む植物を、細切り(裁断)したもの、砕いたものが使用されるほか、これらを水系溶媒中で加熱し濃縮/乾燥した抽出物が用いられる。
本発明の反応で用いられるフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質としては、レスベラトロール、フロログルシノール、フラボノイド及びフラバノイド(カテキンのガロイルエステル等)またはそれらを含有する植物、抽出物を含有するものであれば、特に限定されない。具体例としては、緑茶、新鮮茶葉、ブドウ種子、ブドウ種皮、アセンヤク、紅藻類およびこれらの抽出物が挙げられる。これらの中でも、本発明で製造するプロアントシアニジンオリゴマーの主用途が健康食品、特定保健用食品素材、化粧品、医薬品であること、特に健康食品および医薬品に使用するものであることを考慮すると、古くから飲用に供され安全であることが確認されている、ブドウ種子、ブドウ種皮、緑茶あるいは新鮮茶葉、およびその抽出物が好ましい。
反応で使用するプロアントシアニジンポリマー含有植物原料とフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質の割合は任意であるが、低分子量化したプロアントシアニジンポリマー断片に結合するのに十分な量が好ましい。フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質の量を少なくした場合、高分子量のプロアントシアニジンが残留する可能性があるが、その場合は、カラムクロマトグラフィーにより残留高分子量プロアントシアニジンを容易に除くことが可能である。
プロアントシアニジン類を含有する植物またはその抽出物に含まれるプロアントシアニジンと、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質(以下、単に「フロロ/レゾルシノール環含有物質」ということがある。)との反応は溶媒中で加熱して行なわれる。
反応溶媒としては、水、メタノール、エタノール等の1種類または2種以上の混合物が用いられるが、食品、医薬品等の用途を考慮すれば、水、エタノールが好ましい。
反応は酸性条件で行なうのが好ましい。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類、あるいは酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸等の有機酸類から選ばれる適宜の酸が0.1N〜1.0N程度、好ましくは0.5N程度の濃度で用いられる。
プロアントシアニジン類を含む植物または植物抽出物とフロロ/レゾルシノール環含有物質との反応は、室温〜100℃で0.5時間〜1週間、好ましくは90〜100℃で1〜4時間行なわれる。
反応後の反応液はろ過などの方法により固形分を除去分液し、プロアントシアニジンオリゴマーを含む抽出液(液体)を濃縮乾燥した濃縮液、乾燥粉末、ゲル状物、固形成形物など多種の形状で使用可能であるが、反応後の反応液を濃縮、乾燥し、あるいは、反応液を濃縮し、分画処理してもよく、これらの方法により目的物を反応液から分離濃縮し、常法により精製してもよい。例えば、反応液から残渣をろ別して、ろ液を濃縮した後、その抽出エキスを膜処理(限外ろ過、逆浸透等)、吸着剤で処理する等により、目的物を分離濃縮し、濃縮液の精製を行なうことができる。
吸着剤としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤、メタクリル酸系吸着剤、親水性ビニルポリマー、修飾デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、逆相系シリカゲル、イオン交換樹脂等が用いられる。これらの吸着剤を用いる場合には、これに吸着する画分(以下、吸着画分という。)にフロロ/レゾルシノール環含有物質と反応し低分子量化したプロアントシアニジンオリゴマーが含まれている。この吸着画分を含水アルコール、アルコール、アセトン等で溶出させることにより種々の分子量の成分を得ることができる。このとき、芳香族系合成吸着剤を使用するカラムクロマトグラフィーにより目的の重合度2〜4のプロアントシアニジンオリゴマーを反応液から分離すると分子量の大きいプロアントシアニジンを篩い分けることができ溶出液の濃縮も容易であるので好ましい。芳香族系合成吸着剤としては、セパビーズ等の架橋スチレン系の多孔質重合体が好ましい。
このようにして得られるプロアントシアニジンオリゴマーは、H−NMR、UV、HPLC、GPC及びTLCを使用した測定結果から、典型的なプロアントシアニジンオリゴマーの化学構造式が下記一般式(1)及び(2)で示されるプロアントシアニジンの2量体〜4量体を含むことが確認されている。
(式中、Rは水素原子または水酸基を表わし、Rは水素原子またはガロイル基
を表わし、nは0または1〜2の整数を表わす。)。
上記一般式(1)及び(2)では、4位と8位間で結合する構造のもののみを示したが、4位と6位間で結合するもの、2−O−7結合するものも存在する。
本発明に係るプロアントシアニジンポリマーとフロロ/レゾルシノール環含有物質との反応により、生体内に吸収できない高分子量(重合度で5程度以上)のプロアントシアニジンポリマーを容易に断片化して、吸収可能な低分子量体とすると共にフロロ/レゾルシノール環と結合した分子量が約1200以下の2量体から4量体程度のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする組成物が得られる。
本発明で得られる末端にフロロ/レゾルシノール環構造を有する物質が結合したプロアントシアニジンオリゴマーはDPPH、TEAC、FRAPの各抗酸化試験において強い抗酸化活性を示し、他のポリフェノール素材と比較して高い抗酸化能を有する。また、生活習慣病の動物モデル実験やヒトに対する抗酸化指標のモニター試験で、抗酸化効果に基づくと判断されるデータも得られている。
従って、本発明のプロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする製品は、生体の過酸化脂質生成抑制作用を有するだけでなく、活性酸素により起こる酸化障害に起因する疾病に効果を有するので、過酸化脂質あるいは活性酸素生成に起因する各種臓器の障害、老化の防止効果を有し、それにより生ずる各種疾病の治療及び防止に有効である。また脳の老化が原因と考えられる痴呆等の脳機能障害の抑制・防止・治療にも有効と考えられる。同時に脳機能の改善により、学習機能の向上、イライラ感の減少、不眠症解消、落着き回復等の効果も期待出来る。このため、本発明のプロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする製品は、健康食品、医薬ならびに化粧品等として利用することが出来る。
本発明のプロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする製品には毒性は全く認められず、十分安全に使用できる。これら製品は経口または非経口で用いられるが、経口的に使用される場合の投与量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当り、一回につき、50〜1000mgの範囲である。本発明の製品を経口投与する際には、経口投与として一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口投与として注射剤、塗布剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤とする際には、必要により適宜の補助資材(澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等)を使用することもできる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例1
プロシアニジンB4(100mg)とエピガロカテキン3−O−ガレート(100mg)を2%クエン酸水溶液40mLに溶かし、100℃で2時間加熱した。放冷後、反応液をMCI-gel CHP20P(含水メタノール)カラムクロマト、ついでセファデックスLH−20(60%メタノール)カラムクロマトにて分離し、原料のプロシアニジンB4(10mg)、エピガロカテキン3−O−ガレート(59.2mg)を回収すると共に、新たに生成した(−)−エピカテキン(25.4mg)、及び(+)−カテキン−(4β→8)−(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレートを17.3mg得た。生成したカテキンとプロアントシアニジンは、H−NMRスペクトルを文献記載のものと比較することによって同定した(上記構造式参照)。
実施例2
ビンロウジより抽出したプロシアニジンポリマー0.5gと(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレート(0.5g)を2%クエン酸水溶液200mLに溶かし、3時間95℃に加熱した。反応液は実施例1と同様のカラムクロマトにより分離して、エピガロカテキン−3−O−ガレート(403mg)、及び新たに生成した(+)−カテキン(48.6mg)とプロアントシアニジンである(−)−エピカテキン−(4β→8)−(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレート(148.3mg)を得た(上記構造式参照)。
実施例3
カテキン・プロシアニジン混合物を含有するヒノキ樹皮5gと緑茶1gを2%クエン酸水溶液100mLに溶かし、3時間95℃に加熱した。冷後エタノールを100mL加えて吸引ろ過。ろ液をHPLCで分析した。HPLC条件は以下の通りである。
カラム:Cosmosil 5C18 ARII(4.6×250mm)、
カラム温度:35℃、
移動相:A;50mMリン酸、B;CHCN、
B4%から30%(39分間)、30%から75%(15分間)、
流速:0.8mL/min、
検出:フォトダイオードアレイ検出。
ヒノキ樹皮5gと緑茶1gをそれぞれ別々に同じ条件でクエン酸水溶液中加熱処理後抽出し、同様にHPLC分析した(図1のHPLC参照)。ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸水溶液処理した抽出液には、ヒノキ樹皮や緑茶にはない多数の新しい化合物由来のピークが検出された。これらの化合物がいずれもプロアントシアニジン類であることは、各ピークの紫外吸収スペクトルを、実施例1及び2で得られたものと比較することにより推定した。
実施例3で得たヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸水溶液で加熱して得た抽出液を濃縮し、水50mLと酢酸エチル50mLで溶媒分配を5回繰り返した。得られた酢酸エチル層は合わせて濃縮し、酢酸エチル抽出物0.67gを得た。ヒノキ樹皮と緑茶それぞれ別々に処理して得たエキスについても同様に溶媒分配してヒノキ樹皮から酢酸エチル抽出物を0.30g、緑茶から酢酸エチル抽出物を0.37g得た。3つの酢酸エチル抽出物についてTLCで分析した。TLCの条件は以下の通りである。
シリカゲル(Silica gel)60、
展開溶媒:ベンゼン−ギ酸エチル−ギ酸(1:7:1、v/v)、
発色:バニリン塩酸試薬(図2のTLC参照)。
バニリン塩酸試薬は、カテキン及びプロアントシアニジン類の検出試薬であり、これらが存在すると特有の赤色を呈する。ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸水溶液処理したものには、あらたにプロアントシアニジン2量体、3量体由来のスポットが認められた。
実施例3において酢酸エチル分配した後に残った水層には、酢酸エチル層に移行するものに比べて分子量の大きいプロアントシアニジンが残留している。そこで、水層に含まれるプロアントシアニジン類のアセチル化物についてゲルパーミエーションクロマトグラフィー分析による分子量の比較を行なった。ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸処理した後の水層と、ヒノキ樹皮の水層を濃縮乾固し、無水酢酸−ピリジンに溶解後、室温で8時間放置した。反応液はそれぞれ氷水中に注ぎ、析出した不溶物をろ取して真空乾燥した。得られたアセチル化体について、TSK-GEL G4000H6カラム、溶媒テトラヒドロフラン、検出254nm紫外吸収の条件で分析し、ベンゼン及び分子量4000、25000、50000のポリスチレンを用いて作成した校正曲線をもとに分子量を推定したところ、ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸処理した後の水層に含まれるプロアントシアニジンのピークトップ分子量は約1300、ヒノキ樹皮の水層に含まれるプロアントシアニジンのピークトップ分子量は約2000となった。緑茶を加えクエン酸処理することで分子量が小さくなっていることが分った。
実施例4
新鮮なバナナ果皮100gをアセトン水混液(4:1、v/v)300mLと共にワーリングブレンダーで破砕し、吸引ろ過した。ろ液はエバポレータでアセトンを留去して水溶液とし、不溶物をろ去して、ろ液は水を加えて全量を200mLとした。別に緑茶3gを水300mLで煮沸抽出し、吸引ろ過した後、ろ液は水を加えて300mLとした。バナナ抽出液100mL(バナナ果皮50gに相当)と緑茶抽出液100mL(緑茶1gに相当)を混合し、クエン酸2gを溶解した後、3時間95℃で加熱した。冷後、酢酸エチルで3回抽出し、酢酸エチル抽出物0.312gを得た。同様にバナナ抽出液と緑茶抽出液を別々に酢酸エチルで分配して、それぞれ酢酸エチル抽出物0.015g及び0.18gを得た。得られた酢酸エチル抽出物はTLCで分析した(図3のTLC参照)。バナナ果皮抽出物のプロアントシアニジンは高分子量であるためTLC上では原点だけがバニリン塩酸試薬に陽性であるが、バナナ果皮抽出液と緑茶抽出液をクエン酸処理したものには、もとの抽出液には無い新しいプロアントシアニジン2量体、3量体由来のスポットが認められた。
実施例5
渋柿に大量に含まれる渋味成分は、茶の4種のカテキン類を構成成分とする非常に分子量の大きいプロアントシアニジンである(Tanaka et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 1013-1022, 1994)。新鮮な柿未熟果実100gを1%クエン酸水溶液500mLと共にワーリングブレンダーで破砕し、さらに1%クエン酸水溶液500mLと緑茶20gと合わせて、3時間穏やかに煮沸した。反応液は熱いうちに吸引ろ過し、ろ液950mLを得た。ろ液の半分475mLは酢酸エチルで4回分配し、酢酸エチル層2.56gを得た。残りの半分475mLは、セパビーズSP850(200mL)のカラムにかけ、水で洗浄し糖分を洗い出した後、吸着されたポリフェノール類を40%から60%エタノールで溶出した。溶出液を濃縮することで、カテキン及びプロアントシアニジン含有画分3.26gを得た。一方、柿未熟果実200gをアセトン水混液(4:1、v/v)900mLと共に破砕して抽出し、ろ液のアセトンを完全に留去して得た抽出水溶液をセパビーズSP850(200mL)のカラムにかけたところ、ほとんどの柿プロアントシアニジン(柿タンニン)は吸着されずに水だけで溶出してきた。カラムに吸着され含水アルコールで溶出されてきたポリフェノール画分はわずか0.76gであった。柿のプロアントシアニジンは、分子量が大きくおよそ1.38×104と推定されており(Mastuo, T. et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1637-1643, 1978)、セパビーズの細孔に入ることが出来ない。一方、緑茶で処理した柿プロアントシアニジンは断片化されて分子量が小さくなっているため、セパビーズの細孔に入って吸着される。本実験によりセパビーズによって分子量の大きいプロアントシアニジンを篩い分けることが出来ることがわかった。本実験で得られた緑茶とクエン酸で処理した柿の酢酸エチル抽出物とセパビーズSP825吸着部を、緑茶エキス酢酸エチル抽出物及び、柿未熟果実含水アセトン抽出物とTLCにより比較した(図4のTLC参照)。セパビーズSP825吸着部については順相HPLCでの分析を行ない、ヒノキ熱水抽出物をダイヤイオンHP20SS カラムクロマトで分離して得たポリフェノール画分(カテキン単量体、プロシアニジン2量体、3量体、4量体及びさらに高分子量のプロシアニジンを含む)と比較した(図5のHPLC参照)。順層HPLCの条件は以下の通りである。
カラム:LiChroCART Superspher Si 60(4.6×250mm)、
カラム温度:28℃、
移動相:ヘキサン:メタノール:テトラヒドロフラン:トリフルオロ酢酸(45:40:13.5:1.5)、
流速:1.0mL/min、
検出:254nm。
標品としては、(−)−エピカテキン(単量体)、プロシアニジンB4(2量体)、プロシアニジンC1(3量体)、シンナムタンニンA2(4量体)を用いた。これらの標品はビワ種子より分離し、H−NMRスペクトルを文献記載の値と比較して同定したものである。HPLCではカフェインのピークが認められるが、それ以外には4量体くらいまで存在することがわかり、ヒノキのプロアントシアニジンに比べてそれ以後のテーリングが少ない。
実施例6
新鮮な柿未熟果実1kgを水2リットルと共に破砕し、緑茶200g及びクエン酸80gと合わせた後、水を加えて総量8リットルとして3時間穏やかに煮沸した。加熱後、熱いうちにろ過し、ろ液は冷後、セパビーズSP825のカラムに付し水洗、吸着部は含水エタノールで溶出、濃縮後、凍結乾燥してカテキン・プロアントシアニジン混合物59.0gを得た。得られた混合物の6gを、セファデックスLH-20カラムにエタノールでかけて、8つのフラクション(Fr.)に分画した(図6参照)。Fr.1は主にエピカテキンとエピガロカテキンを含み0.79g得られた。Fr.2は主にエピカテキン−3−O−ガレートを含み、0.15g得られた。Fr.3は、主にエピガロカテキン−3−O−ガレートを含み、0.87g得られた。Fr.4はエピガロカテキン−3−O−ガレートとプロアントシアニジン2量体の混合物で0.2g得られた。Fr.5とFr.6はいずれもプロアントシアニジン2量体を含み、それぞれ0.25gと0.51g得られた。Fr.7は主にプロアントシアニジン3量体を含み、0.88g得られた。Fr.8はFr.7と同じかそれよりも大きい分子量のプロアントシアニジンを含み、1.63g得られた。これらのフラクションのうち、Fr.5とFr.6はさらにMCI-gel CHP20PカラムクロマトとChromatorex ODS カラムクロマト(いずれも溶媒は含水メタノール)で精製して、(−)−エピカテキン−(4β→8)−(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレートを101.6mg、(−)−エピガロカテキン−(4β→8)−(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレートを121.1mg、(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレート−(4β→8)−(−)−エピガロカテキン−3−O−ガレートを24.3mgを得た(下記構造式参照)。他にも多種のプロアントシアニジン2量体類が存在するが、以上3種について純粋分離に成功し、H−NMRスペクトルの比較によって構造を確定した。
実施例7:レスベラトロール結合体の製造例
ブドウ種子ポリフェノール末(Grape Seed P.E.,LAYN社製,プロアントシアニジン含量95%以上))100mgおよびレスベラトロール20mgを100mgのクエン酸とともに10mLの水に溶解して3時間湯煎(87〜93℃)、反応させた後、室温まで放冷した。この液をセファデックスLH-20で調製したカラム(内径2cm、長さ15cm、約50mL、70%メタノール)にチャージした。70%メタノールを50mL、次いで100%メタノール50mLを通じて目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末(以下、発明物質Aと略す)6.0mgを得た。
この乾燥粉末を1mLの70%メタノールに溶解し、MCI-gel CHP-20で調製したカラム(内径2cm、長さ15cm、約50mL)にチャージした。同溶媒50mLを通じて目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末2.4mgを得た。得られた粉末をHR−FAB−MS(高分解能高速原子衝撃法質量スペクトル)およびH−NMR(水素核磁気共鳴スペクトル、表1参照)に供した。得られた画分に主に含まれる化合物はHR−FAB−MSにおいて[M]がm/z:516.1404に観測され、分子式C2925に相当する計算値516.1420と3.1ppmの誤差で一致した。したがって、分子式C2925を有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンにレスベラトロールが炭素−炭素結合した化学構造が考えられた。
当該化合物のH−NMR(表1参照)においてカテキンおよびエピカテキンに共通する芳香環上の5個のプロトンシグナルの他に、酸素原子を付け根に有するシグナル群がδ5.04(1H,br.s,2−H)およびδ4.01(1H,br.s,3−H)に認められ、エピカテキンの立体配置を有することを示唆している。δ4.64(1H,br.s)のシグナルはエピカテキン部分の4a位に帰属され、レスベラトロール部分が4b位に配置していると考えられた。別に、δ6.55に1のフロログルシノール部分で認められたシグナルと同型の2H分のenvelopeが0.56ppm低磁場シフトして認められ、同様に、新たに形成したC−C結合が類似した立体環境であることを示唆している。その他、レスベラトロールのトランススチルベン構造に由来するE型共役二重結合上のABシステム(δ6.79,6.97,each 1H,J=16.5Hz)、ならびに他方の芳香環上のA2B2シグナル(δ6.80,7.36.each 2H,J=8.6Hz)が認められた。これらの情報に基づき、当該化合物の化学構造を下記式に示すように4b−(4−レスベラトロイル)−(−)−エピカテキンと推定した。
実施例8:フロログルシノール結合体の製造例
ブドウ種子ポリフェノールおよびフロログルシノールの各1.00gを500mgのクエン酸とともに50mLの水に溶解して3時間湯煎(87〜93℃)、反応させた後、室温まで放冷した。この液をダイヤイオンHP20で調製したカラム(内径3cm、長さ14cm、約100mL)にチャージした後、約300mLの水で洗浄後、約200mLのメタノールで溶出して目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末(発明物質Bと略す)1.24gを得た。
発明物質Bを5mLの70%メタノールに溶解し、セファデックスLH-20で調製したカラム(内径3cm、長さ25cm、約180mL)にチャージした。同溶媒500mLを通じて目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末62.2mgを得た。得られた粉末をHR−FAB−MSおよびH−NMRに供した。得られた画分に主に含まれる化合物はHR−FAB−MSにおいて[M]がm/z:414.0941に観測され、分子式C2118に相当する計算値414.0950と2.2ppm(10ppm以内は許容)の誤差で一致した。したがって、分子式C2118を有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンにフロログルシノールが炭素−炭素結合した化学構造が考えられた。当該化合物のH−NMR(表2参照)においてカテキンおよびエピカテキンに共通する芳香環上の5個のプロトンシグナルの他に、酸素原子を付け根に有するシグナル群が5.01(1H,br.s,2−H)および3.96(1H,br.s,3−H)に認められ、エピカテキンの立体配置を有することを示唆している。δ4.53(1H.br.s)のプロトンシグナルはエピカテキン部分の4位に帰属されフロログルシノール部分が4位に配置していると考えられた。別に、δ5.99にフロログルシノール由来C−4および−6に帰属される2H分のシグナルが等価なenvelopeとして認められ、新たに形成したC−C結合が回転障害を生じていることを示唆している。これらの情報に基づき、当該化合物の化学構造を下式に示すように4−(2−フロログルシノイル)−(−)−エピカテキンと推定した。化合物の13C−NMR(炭素−13核磁気共鳴スペクトル、表3参照)はこの化学構造を支持している。
実施例9:ブドウ種子由来エピガロカテキンガレート(EGCG)結合体の製造例
ブドウ種子ポリフェノール末(Grape Seed P.E.,LAYN社製,プロアントシアニジン含量95%以上)5.00gを約100mLの水に分散・溶解後、セパビーズSP850で調製したカラム(内径3.8cm、長さ20cm、約230mL)に付して水で溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥してポリマー末2.44g(48.8%)を得た。
得られたブドウ種子ポリフェノールポリマー末およびEGCGの各1.00gを500mgのクエン酸とともに50mLの水に溶解して3時間湯煎(87〜93℃)、反応させた後、室温まで放冷した。この液をダイヤイオンHP20で調製したカラム(内径3cm、長さ14cm、約100mL)にチャージした後、約300mLの水で洗浄後、約200mLのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末(発明物質Cと略す)1.85gを得た。
実施例10:ヨウバイヒポリフェノール(EGCGポリマー)EGCG結合体の製造例
ヤマモモ(ヤマモモ科)、Myrica rubra (Myricaceae)樹皮片、すなわち生薬「楊梅皮(ヨウバイヒ)」を5〜10倍量(W/V)の50%アセトンに3〜7日間冷浸して得た暗褐色抽出液を濃縮後、析出するミリシトリン(myricitrin)(myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside)の黄色結晶を繰り返しろ紙でろ去した。得られたろ液を更に濃縮後、凍結乾燥して濃褐色粉末を樹脂片から14%の収率で得た。この粉末14.0gを約70mLの50%メタノールに溶解し、セファデックスLH-20で調製したカラム(内径5cm、長さ20cm、約400mL)にチャージした。同溶媒を1.5L、次いで70%メタノール0.7Lを通じた後に、70%アセトン1Lを通じてEGCGポリマー画分を回収、濃縮後凍結乾燥してEGCGポリマー末を9.37g(66.9%)得た。ヨウバイヒ由来のEGCGポリマー及びEGCGの各1.00gを500mgのクエン酸とともに50mLの水に溶解して3時間湯煎(87〜93℃)、反応させた後、室温まで放冷した。この液をDIAION HP20で調製したカラム(内径3cm、長さ14cm、約100mL)にチャージした後、約300mLの水で洗浄後、約200mLのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末(発明物質Dと略す)を1.85g得た。
実施例11:柿皮由来茶ポリフェノール結合体の製造例
柿皮乾燥粉末1.00gおよび茶抽出物(PF−TP90、株式会社ファーマフーズ研究所製、茶ポリフェノール含有量90%以上、総カテキン含有量80%以上うちEGCG含量50%以上)300mgを500mgのクエン酸とともに50mLの水に溶解して3時間湯煎(87〜93℃)、反応させた後、室温まで放冷した。この液をセパビーズSP850で調製したカラム(内径3cm、長さ14cm、約100mL)にチャージした後、約300mLの水で洗浄後、約200mLのメタノールで溶出した。この画分をダイヤイオンHP20で調製したカラム(内径3cm、長さ14cm、約100mL)にチャージした後、約300mLの水で洗浄後、約200mLのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末(発明物質Eと略す)464mgを得た。
実施例12:ライチ由来ポリフェノールエピガロカテキンガレート(EGCG)結合体の製造例
ライチ果実ポリフェノール末(Litchi P.E.,LAYN社製,プロアントシアニジン含量90%以上)5.00gを約100mLの水に分散・溶解後、セパビーズSP850で調製したカラム(内径3.8cm、長さ20cm、約230mL)に付して水で溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥してポリマー末3.02g(60.4%)を得た。
得られたライチ果実ポリフェノールポリマー末およびEGCGの各1.00gを500mgのクエン酸とともに50mLの水に溶解して3時間湯煎(87〜93℃)、反応させた後、室温まで放冷した。この液をダイヤイオンHP20で調製したカラム(内径3cm、長さ14cm、約100mL)にチャージした後、約300mLの水で洗浄後、約200mLのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末(発明物質Fと略す)1.80gを得た。
試験例1:
実施例7〜11で得た発明物質A〜Eについて、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)のラジカルの消去作用、及びTEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)法による抗酸化能評価試験を実施した。
[DPPHアッセイ]
方法:
サンプルについて1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)ラジカルの消去作用を以下の方法で測定測定した。96穴のマイクロプレートに100μLのDPPH溶液(60μMエタノール溶液)を入れ、試験試料のエタノール溶液100μLまたはコントロールとしてエタノールを100μLそれぞれ加え、静かに混合し室温で30分間放置した後、520nmの吸光度を測定した。DPPHラジカル消去能を下記の式で算出し、段階的に希釈した試験試料のDPPHラジカル消去能と濃度から50%有効濃度(EC50)を算出した。
発明物質Aについては比較物質として、エピカテキン(EP)及びレスベラトロール(RS)を使用し、発明物質Bについては比較物質として、エピカテキン及びフロログルシノール(PL)を使用し、発明物質C〜Eについては比較物質として、ブドウ種子ポリフェノールポリマー(GP)を使用した。比較物質についてのデータと共に結果を図7〜9に示す。
エピカテキンでは48.7%のDPPH活性が認められたが、レスベラトロールでは23.1%とわずかな活性しか認められなかった。エピカテキンにレスベラトロールが結合した発明物質Aでは76.1%と有意に優れた活性を示した(図7)。また、エピカテキンには43.0%のDPPH活性が認められたが、フロログルシノールには活性がほとんど認められなかった。エピカテキンにフロログルシノールが結合した発明物質Bでは、両者よりも優位に高いスカベンジング活性を示した(図8)。
また、発明物質C(41.3%)及びD(35.1%)は比較物質(26.9%)に比べ高いスカベンジング活性を示した。発明物質E(26.8%)は比較物質と同等の活性を示した(図9参照)。
[TEAC]
方法:TEAC(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)法は、ある化合物が有する抗酸化活性をα−トコフェロール誘導体であるTroloxの抗酸化能に換算して抗酸化強度を相対評価する方法で、抗酸化指標として一般的に広く使用されている。
70μMのメトミオグロビン溶液36μLにABTS溶液300μL及び5mMリン酸緩衝生理食塩水を487μM加え、次いでサンプル溶液または1.25mMのTrolox溶液を加え、0℃で5分間静かに混和した。450μMの過酸化水素水を167μL加えて10秒間混和した後、室温で5分間反応させた。734nmの吸光度を測定しサンプルの吸光度をTrolox溶液の吸光度の比を算出し、1.00mMのTroloxに対するサンプルのTEAC値とした。
上記DPPHアッセイと同様に発明物質Aについては比較物質として、エピカテキン及びレスベラトールを使用し、発明物質Bについては比較物質として、エピカテキン及びフロログルシンールを使用し、発明物質C〜Eについては比較物質として、ブドウ種子ポリフェノールポリマーを使用した。比較物質についてのデータと共に結果を図10〜12に示す。
エピカテキンには1.2mMのTEAC活性が認められたが、レスベラトロールでは1.11mMと低かった。エピカテキンにレスベラトロールが結合した発明物質Aでは1.33mMと有意に高い活性を示した(図10)。フロログルシノールでは0.52mMと低い活性であったのに対して、エピカテキンにフロログルシノールが結合した発明物質Bでは、1.44mMと両者よりも優位に高い活性を示した(図11)。
また、発明物質C(1.11)、D(1.11)、E(0.97)は比較物質(0.73)に比べ高いTEAC値を示した(図12)。
試験例2:
実施例12で得た発明物質Fについてはライチ果実ポリフェノール(LP)及び茶抽出物(TE)を比較物質として比較試験を行った。
[in vitro試験]
試験方法:NIH3T3細胞を96穴プレートに播種し、37℃で一晩培養する。翌日無血清培地に交換し、被検物質を添加し、さらに1時間培養後、20分間UV照射した。血清入りの培地に交換して37℃で一晩培養しMTT法により細胞生存率を測定した。無添加を対照群(C)とした。
結果を図13に示す。対照群ではUV照射に対する細胞の生存率は20%程度であるのに対して発明物質Fでは生存率が最も高く、比較物質と比較して有意に細胞死が抑制され、発明物質FのUV保護作用が示された。
[in vivo試験]
試験方法:9週齢の雄性Slc:ddYマウスに発明物質F、LP、TEをそれぞれ50mg/kg体重の用量で3週間連日強制経口投与した。対照群(C)には同用量の水道水を投与した。最終日の被検物質投与から2時間後にエーテル麻酔下で心臓採血を行い血清のTEACによる抗酸化活性と過酸化脂質量を測定した。TEACは前述の通り測定した。過酸化脂質は市販のキット(過酸化脂質−テストワコー,和光純薬株式会社製)を用いて硫酸酸性化でのリンタングステン酸溶液中での過酸化脂質の沈殿と2−チオバルビツール酸試薬との反応を励起波長515nm、蛍光波長553nmの蛍光を測定することにより測定した。
結果を図14、図15に示す。発明物質Fは対照群、比較物質に比べ有意に高い抗酸化活性を示した。また、血清中の過酸化脂質も比較物質に比べ有意な低値を示した。
[in vivo試験]
試験方法:6週齢の雄性Slc:ddYマウスに発明物質F、LP、TEをそれぞれ50mg/kg体重の用量で3日間連日強制経口投与した。対照群(C)には同用量の水道水を投与した。解剖前日に2−NP(70mg/kg)を腹腔内投与し、24時間後にエーテル麻酔下で心臓採血を行い血清のGOT及びGPTを測定した。また、肝臓を摘出し臓器中の過酸化脂質量を測定した。
結果を図16、17に示す。2−NP投与により肝臓が障害され血清中のGOT及びGPT濃度が上昇したが、発明物質Fは対照群、比較物質に比べ有意にその上昇を抑制した。また、肝臓中の過酸化脂質も比較物質に比べ有意な低値を示した。
実施例3でヒノキ樹皮と緑茶を酸性条件下加熱処理したものについてのHPLCクロマトグラム図(A)、ヒノキ樹皮及び緑茶を各々単独で同様に加熱処理したものについてのHPLCクロマトグラム図(B)及び(C)である。 実施例3でヒノキ樹皮と緑茶を酸性条件下加熱処理することにより原料の緑茶やヒノキ樹皮に無い新しいプロアントシアニジン類が生成していることを示す実施例4のTLC写真である。図中、Aは緑茶処理後の酢酸エチル層、Bはヒノキ樹皮処理後の酢酸エチル層、Cはヒノキ樹皮と緑茶処理酢酸エチル層についての結果であり、スポットMはガロイル化されていない単量体由来、MGはガロイル化された単量体由来、Dは主にガロイル化されたプロアントシアニジン2量体由来、Tは主にガロイル化されたプロアントシアニジン3量体由来のものある。 バナナ果皮抽出物と緑茶を酸性条件下加熱処理することにより原料緑茶やバナナ果皮に無い新しいプロアントシアニジン類が生成していることを示す実施例6のTLC写真である。図中、Aは緑茶単独、Bはバナナ果皮抽出物単独、Cはバナナ果皮抽出液と緑茶とを処理したものである。 柿未熟果実と緑茶を酸性条件下加熱処理することにより、原料の緑茶や柿に無い新しいプロアントシアニジン類が生成していることを示す実施例5のTLC写真である。図中、Aは緑茶単独、Bは柿未熟果実単独、Cは柿未熟果実と緑茶とを処理したもの、Dは柿未熟果実と緑茶との処理物(抽出液)をセパビーズSP825に通した吸着部を水エタノールで溶出したものについての結果であり、スポットM、MG、D及びTは図2と同様である。 実施例5の柿未熟果実と緑茶との処理物(抽出液)をセパビーズSP825に通した吸着部を水エタノールで溶出したものの順相HPLCの分析結果(図5(A))及びその比較例であるヒノキプロアントシアニジンヒノキプロアントシアニジンの順相HPLCの分析結果(図5(B))である。 実施例6で柿未熟果実と緑茶を酸性条件下加熱処理して得られたカテキン類とプロアントシアニジン類をセファデックスLH−20カラムクロマトで分離して得られた各フラクション(Fr1〜Fr8)及び分離前の混合物(E)のTLCの図である。 実施例7で得た発明物質Aについて、DPPHのラジカルの消去作用を示す。 実施例8で得た発明物質Bについて、DPPHのラジカルの消去作用を示す。 実施例9〜11で得た発明物質C〜Eについて、DPPHのラジカルの消去作用を示す。 実施例7で得た発明物質AについてのTEAC法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例8で得た発明物質BについてのTEAC法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例9〜11で得た発明物質C〜EについてのTEAC法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例12で得た発明物質Fについて、UV保護効果試験結果を示す。 実施例12で得た発明物質Fについて、TEAC法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例12で得た発明物質Fについて、抗酸化能評価試験における血清中LPOの測定結果を示す。 実施例12で得た発明物質Fについて、抗酸化能評価試験における血清中GOT及びGPTの測定結果を示す。 実施例12で得た発明物質Fについて、抗酸化能評価試験における肝臓中LPOの測定結果を示す。

Claims (14)

  1. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
  2. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物がブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カカオ、柿、バナナ、カリン、リンゴ、サンザシ、ライチ、ヨウバイヒ及びケイヒから選択される少なくとも1種である請求項1に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
  3. フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が、レスベラトロール、フロログルシノール、フラボノイド及びフラバノイドから選択される少なくとも1種類であるである請求項1に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
  4. フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質を含有する植物が、緑茶、新鮮茶葉、ブドウ種子、ブドウ種皮、アセンヤク、紅藻類及びこれらの抽出物から選択される少なくとも1種類である請求項1に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
  5. 重合度が2〜4であるプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する請求項1に記載の組成物。
  6. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱し、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
  7. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
  8. 無機酸、有機酸またはこれらの両方を用いて酸性条件とする請求項6または7記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
  9. 塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも1種を使用する請求項8に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
  10. 活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用である請求項1乃至5のいずれかに記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
  11. 活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための医薬品用である請求項10に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
  12. 活性酸素種の生成が原因となる老化の予防のための化粧品用である請求項10に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
  13. 下記式(1)
    (式中、nは0または1〜2の整数である)
    で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。
  14. 下記式(2)
    (式中、nは0または1〜2の整数である)
    で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。
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