JPWO2006090830A1 - プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質とを酸性溶液中で加熱して得られる、フロロ／レゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物、その製造方法、及びその組成物の健康食品及び医薬品等への用途に関する。本発明によれば、植物原料から高収量で得ることが困難であった、生物活性を有し、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合した生体に吸収される程度まで低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを効率よく簡単に得ることができる。

Description

本発明は、植物中のプロアントシアニジンポリマーを生体（の腸管から容易）に吸収できる程度まで容易に低分子化することのできるプロアントシアニジンオリゴマーの製造方法に関する。
さらに詳しく言えば、プロアントシアニジンポリマーを含有する原料を、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質と酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造が結合した、重合度が２〜４のプロアントシアニジンオリゴマーを含む組成物、その製造方法、その組成物の用途、及びフロログルシノール環またはレゾルシノール環が結合した、新規なプロアントシアニジンオリゴマーに関する。
本発明により得られるプロアントシアニジンオリゴマーを含む組成物は、食品、健康食品、特定保健用食品、化粧品、医薬品に使用することができ、特に活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用組成物及び医薬品組成物として有用である。

食生活の変化による脂肪摂取の過多や、環境の変化、オゾン層破壊等による紫外線への暴露量の増加、環境汚染物質の増加等により、高脂血症、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病、癌等のいわゆる生活習慣病が増加し、さらにアレルギー、痴呆症などの脳疾患の患者も増加しつつある。今後、高齢化社会の進展と共に痴呆、アルツハイマー症候群等の患者の増加も危惧されるが、これらの要因に生体内で生成する活性酸素種の関与が指摘されている（Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10 (2002),2497-2509 ；非特許文献１）。しかし活性酸素種の完全な生成抑制乃至制御技術は開発されていないため、現状では生活習慣病や脳疾患等に有効・確実な予防・治療技術は十分に確立されていない。

植物に存在して生理活性を示す天然物質、特にポリフェノール類の化合物に近年関心が集中している。ポリフェノール類は一般に茶、野菜、果実、ハーブ類等に含まれ、食品あるいは嗜好品として長期間の摂取経験のある、副作用のない治療・予防剤として期待できるものである。
ポリフェノール化合物は植物の二次代謝産物で、植物界に普遍的、かつ多量に存在し、多彩な生理活性を示すことが知られ、古くは薬学、植物化学等の分野で、近年も健康食品分野で注目を集めている。例えば、茶のポリフェノール、特にカテキン類は、抗菌、抗ウイルス、抗突然変異、抗酸化、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、抗う蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など、広範囲の生理活性を有することが知られている。

ポリフェノールの中でもプロアントシアニジン類は幅広い植物に含まれるポリフェノールである。プロアントシアニジン類が、多彩な生理活性を示すには、プロアントシアニジン化合物が腸管を通じて生体内に吸収される必要がある。しかしプロアントシアニジン類の分子量は一般に数千乃至数万のオーダーと言われている。このような分子の大きな物質は腸管を通じての吸収は困難で、摂取しても生体に吸収されずに利用されないことが多い。

プロアントシアニジンは、フラバン−３−オール（カテキンとも称される）、及びそれらに没食子酸がエステル結合したものを構成単位とする２量体、３量体、４量体さらに１０量体以上の高分子のプロシアニジン、プロデルフィニジン、プロペラルゴニジン等及びそれらの立体異性体の総称であり、酸処理によりアントシアニジンを生成するポリフェノール化合物群である。各構成単位は、炭素骨格の４位と８位または４位と６位の間の炭素炭素結合、時にはその結合に加えて２位と７位酸素との間のエーテル結合により結合している。

プロアントシアニジンは優れた抗酸化作用（Arch. Biochem. Biophys., 374巻, 347-355 頁, 2000年：非特許文献２）を有し、その他にも血流改善、抗ストレス、抗高血圧、抗菌、抗腫瘍、抗白内障、下痢止めなどの作用があることから、健康維持効果のある天然由来物質として応用されている。

プロアントシアニジンは松樹皮、未熟リンゴ果実、ブドウ種子などから混合物として分離され、飲料、菓子類、健康食品、化粧品、育毛剤などに配合されて市販されるに至っている。

プロアントシアニジンを含有する多くの植物では、重合度の大きいものから小さいものまで、さまざまなプロアントシアニジンが混合物として含まれており、柿、バナナ、カリンなどのように特に重合度の大きいものを主成分とする植物が多い。しかし、プロアントシアニジンの中でも重合度の大きいプロアントシアニジンポリマーは、腸からの吸収が悪いために薬理活性の点で重合度２〜４のプロアントシアニジンオリゴマーに劣るとされ、また、渋味が強く水溶性に乏しいことから食品などに応用する際には除去することが望ましいものである（Free Radical Res., 29 巻, 351-358 頁, 1998年：非特許文献３）。このようなことから、重合度が２〜４のプロアントシアニジンオリゴマーに特に優れた健康維持効果があるとして注目され、松樹皮由来のものが飲料、健康食品として使用されている。

植物エキスからプロアントシアニジンのみを得るには吸着法（例えば、特開平６−４９０５３号公報：特許文献１）などが使用されるが、重合度の異なるものを分離することは困難である。重合度が２〜４のプロアントシアニジンオリゴマーのみを得るためには、酢酸エチル溶媒分配法、酢酸メチル固相抽出法やクロマトグラフィー法（国際公開第００／６４８８３号パンフレット：特許文献２）、キチン吸着法（国際公開第０３／０９１２３７号パンフレット：特許文献３）などにより低分子プロアントシアニジンだけを抽出分離する手法が取られている。しかし、これらの手法では、多量の高分子プロアントシアニジンポリマーが廃棄されることになり収量が悪い。
プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料から、重合度２〜４のプロアントシアニジンオリゴマーを分離する方式に代わる方法として、本発明者らは先にプロアントシアニジンポリマー含有原料をシステイン等のＳＨ含有化合物と酸性溶液中で反応させてプロアントシアニジンオリゴマーを低分子量化する方法を提案している（国際公開第２００４／１０３９８８号パンフレット；特許文献４）。この方法によれば、システインが結合し低分子量化した、体内吸収性に優れたプロアントシアニジンオリゴマーが得られる。このシステインが結合したプロアントシアニジンオリゴマーは毒性がなく、安全に使用できることが確認されているが、現在、国（日本を含む）によっては天然化学物質でないシステイン等の結合したプロアントシアニジンの健康食品などへの利用については、当局の許認可を受けるための厳格な手続を要するという問題がある。

特開平６−４９０５３号公報 国際公開第００／６４８８３号パンフレット 国際公開第０３／０９１２３７号パンフレット 国際公開第２００４／１０３９８８号パンフレット Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10 (2002), 2497-2509 Arch. Biochem. Biophys., 374巻, 347-355 頁, 2000年 Free Radical Res., 29巻, 351-358 頁, 1998年

本発明はプロアントシアニジンポリマーとして広く天然に分布しているが、そのオリゴマーとしては天然由来原料が限られていたプロアントシアニジンオリゴマーを、プロアントシアニジンポリマー、それを含む植物またはその抽出物を原料とし、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質と結合させて低分子化する簡便かつ効率的な方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、カキ（渋柿）、バナナ、ブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カリン、ライチ、ヨウバイヒ、ケイヒなどのプロアントシアニジンポリマーを含有する果実、果皮、樹皮、葉など、またはその抽出物（エキス）を、低分子量のカテキンを多量に含む緑茶あるいは新鮮茶葉と共に酸性水溶液中で穏やかに２〜３時間煮沸することにより、プロアントシアニジンが断片化され低分子化すると共に、末端にカテキンが結合したプロアントシアニジンオリゴマーに変換されることを見出した。さらに本発明者らは緑茶あるいは新鮮茶葉に代えて、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、及びその物質を含有する他の植物原料（ブドウ種子、ブドウ果皮等）またはその抽出物を用いることにより、同様にプロアントシアニジンが断片化され低分子化し、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合したプロアントシアニジンオリゴマーに変換されることを見出し、これらの知見に基づいて本発明に到達した。

すなわち、本発明は、下記１〜１４に記載の通りの、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物またはそのエキスを緑茶または新鮮茶葉と酸性水溶液中加熱することにより、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物（１〜５）、その製造方法（６〜９）、その組成物の用途（１０〜１２）、及び新規なプロアントシアニジンポリマー（１３〜１４）に関する。
１．プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
２．プロアントシアニジンポリマーを含有する植物がブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カカオ、柿、バナナ、カリン、リンゴ、サンザシ、ライチ、ヨウバイヒ及びケイヒから選択される少なくとも１種である前記１に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
３．フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が、レスベラトロール、フロログルシノール、フラボノイド及びフラバノイド（カテキンのガロイルエステル）から選択される少なくとも１種類であるである前記１に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
４．フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質を含有する植物が、緑茶、新鮮茶葉、ブドウ種子、ブドウ種皮、アセンヤク、紅藻類及びこれらの抽出物から選択される少なくとも１種類である前記１に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
５．重合度が２〜４であるプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する前記１に記載の組成物。
６．プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱し、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする前記１乃至５のいずれか１項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
７．プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする前記１乃至５のいずれか１項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
８．無機酸、有機酸またはこれらの両方を用いて酸性条件とする前記６または７記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
９．塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種を使用する前記８に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
１０．活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用である前記１乃至５のいずれかに記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
１１．活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための医薬品用である前記１０に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
１２．活性酸素種の生成が原因となる老化の予防のための化粧品用である前記１０に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
１３．下記式（１）
（式中、ｎは０または１〜２の整数である）
で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。
１４．下記式（２）
（式中、ｎは０または１〜２の整数である）
で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。

本発明は、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、これを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱した反応液を濃縮、乾燥して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物及びその製造方法を提供したものである。本発明によれば、プロアントシアニジンポリマー含有原料から、活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用組成物及び医薬品組成物等として有用な末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを効率よく製造することができる。

以下本発明を詳細に説明する。
本発明の方法でプロアントシアニジンオリゴマーを製造する原料は、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物（果実、果皮、樹皮、葉など）またはその抽出物である。
ここで、プロアントシアニジンポリマーを含有する植物としては、渋柿、バナナ、リンゴ、ナシ、ブドウ、イチゴ、アボカド、コケモモ、サンザシ、レンコン、ソバ、ライチ、ヨウバイヒ等の果菜類、ハーブ・スパイス類、木材、ケイヒ、マツ樹皮等が挙げられる。これらの中でも、渋柿、バナナ、ブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カリン、ライチ及びヨウバイヒが好ましく用いられる。
本発明ではこれらのプロアントシアニジンポリマーを含む植物を、細切り（裁断）したもの、砕いたものが使用されるほか、これらを水系溶媒中で加熱し濃縮／乾燥した抽出物が用いられる。

本発明の反応で用いられるフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質としては、レスベラトロール、フロログルシノール、フラボノイド及びフラバノイド（カテキンのガロイルエステル等）またはそれらを含有する植物、抽出物を含有するものであれば、特に限定されない。具体例としては、緑茶、新鮮茶葉、ブドウ種子、ブドウ種皮、アセンヤク、紅藻類およびこれらの抽出物が挙げられる。これらの中でも、本発明で製造するプロアントシアニジンオリゴマーの主用途が健康食品、特定保健用食品素材、化粧品、医薬品であること、特に健康食品および医薬品に使用するものであることを考慮すると、古くから飲用に供され安全であることが確認されている、ブドウ種子、ブドウ種皮、緑茶あるいは新鮮茶葉、およびその抽出物が好ましい。

反応で使用するプロアントシアニジンポリマー含有植物原料とフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質の割合は任意であるが、低分子量化したプロアントシアニジンポリマー断片に結合するのに十分な量が好ましい。フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質の量を少なくした場合、高分子量のプロアントシアニジンが残留する可能性があるが、その場合は、カラムクロマトグラフィーにより残留高分子量プロアントシアニジンを容易に除くことが可能である。

プロアントシアニジン類を含有する植物またはその抽出物に含まれるプロアントシアニジンと、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質（以下、単に「フロロ／レゾルシノール環含有物質」ということがある。）との反応は溶媒中で加熱して行なわれる。
反応溶媒としては、水、メタノール、エタノール等の１種類または２種以上の混合物が用いられるが、食品、医薬品等の用途を考慮すれば、水、エタノールが好ましい。
反応は酸性条件で行なうのが好ましい。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類、あるいは酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸等の有機酸類から選ばれる適宜の酸が0.1Ｎ〜1.0Ｎ程度、好ましくは0.5Ｎ程度の濃度で用いられる。

プロアントシアニジン類を含む植物または植物抽出物とフロロ／レゾルシノール環含有物質との反応は、室温〜１００℃で0.5時間〜１週間、好ましくは９０〜１００℃で１〜４時間行なわれる。

反応後の反応液はろ過などの方法により固形分を除去分液し、プロアントシアニジンオリゴマーを含む抽出液（液体）を濃縮乾燥した濃縮液、乾燥粉末、ゲル状物、固形成形物など多種の形状で使用可能であるが、反応後の反応液を濃縮、乾燥し、あるいは、反応液を濃縮し、分画処理してもよく、これらの方法により目的物を反応液から分離濃縮し、常法により精製してもよい。例えば、反応液から残渣をろ別して、ろ液を濃縮した後、その抽出エキスを膜処理（限外ろ過、逆浸透等）、吸着剤で処理する等により、目的物を分離濃縮し、濃縮液の精製を行なうことができる。

吸着剤としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着剤、メタクリル酸系吸着剤、親水性ビニルポリマー、修飾デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、逆相系シリカゲル、イオン交換樹脂等が用いられる。これらの吸着剤を用いる場合には、これに吸着する画分（以下、吸着画分という。）にフロロ／レゾルシノール環含有物質と反応し低分子量化したプロアントシアニジンオリゴマーが含まれている。この吸着画分を含水アルコール、アルコール、アセトン等で溶出させることにより種々の分子量の成分を得ることができる。このとき、芳香族系合成吸着剤を使用するカラムクロマトグラフィーにより目的の重合度２〜４のプロアントシアニジンオリゴマーを反応液から分離すると分子量の大きいプロアントシアニジンを篩い分けることができ溶出液の濃縮も容易であるので好ましい。芳香族系合成吸着剤としては、セパビーズ等の架橋スチレン系の多孔質重合体が好ましい。

このようにして得られるプロアントシアニジンオリゴマーは、^１Ｈ−ＮＭＲ、ＵＶ、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ及びＴＬＣを使用した測定結果から、典型的なプロアントシアニジンオリゴマーの化学構造式が下記一般式（１）及び（２）で示されるプロアントシアニジンの２量体〜４量体を含むことが確認されている。
（式中、Ｒ_１は水素原子または水酸基を表わし、Ｒ_２は水素原子またはガロイル基
を表わし、ｎは０または１〜２の整数を表わす。）。
上記一般式（１）及び（２）では、４位と８位間で結合する構造のもののみを示したが、４位と６位間で結合するもの、２−Ｏ−７結合するものも存在する。

本発明に係るプロアントシアニジンポリマーとフロロ／レゾルシノール環含有物質との反応により、生体内に吸収できない高分子量（重合度で５程度以上）のプロアントシアニジンポリマーを容易に断片化して、吸収可能な低分子量体とすると共にフロロ／レゾルシノール環と結合した分子量が約1200以下の２量体から４量体程度のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分とする組成物が得られる。

本発明で得られる末端にフロロ／レゾルシノール環構造を有する物質が結合したプロアントシアニジンオリゴマーはＤＰＰＨ、ＴＥＡＣ、ＦＲＡＰの各抗酸化試験において強い抗酸化活性を示し、他のポリフェノール素材と比較して高い抗酸化能を有する。また、生活習慣病の動物モデル実験やヒトに対する抗酸化指標のモニター試験で、抗酸化効果に基づくと判断されるデータも得られている。

従って、本発明のプロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする製品は、生体の過酸化脂質生成抑制作用を有するだけでなく、活性酸素により起こる酸化障害に起因する疾病に効果を有するので、過酸化脂質あるいは活性酸素生成に起因する各種臓器の障害、老化の防止効果を有し、それにより生ずる各種疾病の治療及び防止に有効である。また脳の老化が原因と考えられる痴呆等の脳機能障害の抑制・防止・治療にも有効と考えられる。同時に脳機能の改善により、学習機能の向上、イライラ感の減少、不眠症解消、落着き回復等の効果も期待出来る。このため、本発明のプロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする製品は、健康食品、医薬ならびに化粧品等として利用することが出来る。

本発明のプロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする製品には毒性は全く認められず、十分安全に使用できる。これら製品は経口または非経口で用いられるが、経口的に使用される場合の投与量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当り、一回につき、５０〜1000ｍｇの範囲である。本発明の製品を経口投与する際には、経口投与として一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口投与として注射剤、塗布剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤とする際には、必要により適宜の補助資材（澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等）を使用することもできる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例１
プロシアニジンＢ４（１００ｍｇ）とエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（１００ｍｇ）を２％クエン酸水溶液４０ｍＬに溶かし、１００℃で２時間加熱した。放冷後、反応液をMCI-gel CHP20P（含水メタノール）カラムクロマト、ついでセファデックスＬＨ−２０（６０％メタノール）カラムクロマトにて分離し、原料のプロシアニジンＢ４（１０ｍｇ）、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（59.2ｍｇ）を回収すると共に、新たに生成した（−）−エピカテキン（25.4ｍｇ）、及び（＋）−カテキン−（４β→８）−（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを17.3ｍｇ得た。生成したカテキンとプロアントシアニジンは、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを文献記載のものと比較することによって同定した（上記構造式参照）。

実施例２
ビンロウジより抽出したプロシアニジンポリマー0.5ｇと（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（0.5ｇ）を２％クエン酸水溶液２００ｍＬに溶かし、３時間９５℃に加熱した。反応液は実施例１と同様のカラムクロマトにより分離して、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（４０３ｍｇ）、及び新たに生成した（＋）−カテキン（48.6ｍｇ）とプロアントシアニジンである（−）−エピカテキン−（４β→８）−（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（148.3ｍｇ）を得た（上記構造式参照）。

実施例３
カテキン・プロシアニジン混合物を含有するヒノキ樹皮５ｇと緑茶１ｇを２％クエン酸水溶液１００ｍＬに溶かし、３時間９５℃に加熱した。冷後エタノールを１００ｍＬ加えて吸引ろ過。ろ液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
カラム：Cosmosil 5C18 ARII（4.6×２５０ｍｍ）、
カラム温度：３５℃、
移動相：Ａ；５０ｍＭリン酸、Ｂ；ＣＨ_３ＣＮ、
Ｂ４％から３０％（３９分間）、３０％から７５％（１５分間）、
流速：0.8ｍＬ／ｍｉｎ、
検出：フォトダイオードアレイ検出。
ヒノキ樹皮５ｇと緑茶１ｇをそれぞれ別々に同じ条件でクエン酸水溶液中加熱処理後抽出し、同様にＨＰＬＣ分析した（図１のＨＰＬＣ参照）。ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸水溶液処理した抽出液には、ヒノキ樹皮や緑茶にはない多数の新しい化合物由来のピークが検出された。これらの化合物がいずれもプロアントシアニジン類であることは、各ピークの紫外吸収スペクトルを、実施例１及び２で得られたものと比較することにより推定した。

実施例３で得たヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸水溶液で加熱して得た抽出液を濃縮し、水５０ｍＬと酢酸エチル５０ｍＬで溶媒分配を５回繰り返した。得られた酢酸エチル層は合わせて濃縮し、酢酸エチル抽出物0.67ｇを得た。ヒノキ樹皮と緑茶それぞれ別々に処理して得たエキスについても同様に溶媒分配してヒノキ樹皮から酢酸エチル抽出物を0.30ｇ、緑茶から酢酸エチル抽出物を0.37ｇ得た。３つの酢酸エチル抽出物についてＴＬＣで分析した。ＴＬＣの条件は以下の通りである。
シリカゲル（Silica gel）６０、
展開溶媒：ベンゼン−ギ酸エチル−ギ酸（１：７：１、ｖ／ｖ）、
発色：バニリン塩酸試薬（図２のＴＬＣ参照）。
バニリン塩酸試薬は、カテキン及びプロアントシアニジン類の検出試薬であり、これらが存在すると特有の赤色を呈する。ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸水溶液処理したものには、あらたにプロアントシアニジン２量体、３量体由来のスポットが認められた。

実施例３において酢酸エチル分配した後に残った水層には、酢酸エチル層に移行するものに比べて分子量の大きいプロアントシアニジンが残留している。そこで、水層に含まれるプロアントシアニジン類のアセチル化物についてゲルパーミエーションクロマトグラフィー分析による分子量の比較を行なった。ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸処理した後の水層と、ヒノキ樹皮の水層を濃縮乾固し、無水酢酸−ピリジンに溶解後、室温で８時間放置した。反応液はそれぞれ氷水中に注ぎ、析出した不溶物をろ取して真空乾燥した。得られたアセチル化体について、TSK-GEL G4000H6カラム、溶媒テトラヒドロフラン、検出２５４ｎｍ紫外吸収の条件で分析し、ベンゼン及び分子量4000、25000、50000のポリスチレンを用いて作成した校正曲線をもとに分子量を推定したところ、ヒノキ樹皮と緑茶をクエン酸処理した後の水層に含まれるプロアントシアニジンのピークトップ分子量は約1300、ヒノキ樹皮の水層に含まれるプロアントシアニジンのピークトップ分子量は約2000となった。緑茶を加えクエン酸処理することで分子量が小さくなっていることが分った。

実施例４
新鮮なバナナ果皮１００ｇをアセトン水混液（４：１、ｖ／ｖ）３００ｍＬと共にワーリングブレンダーで破砕し、吸引ろ過した。ろ液はエバポレータでアセトンを留去して水溶液とし、不溶物をろ去して、ろ液は水を加えて全量を２００ｍＬとした。別に緑茶３ｇを水３００ｍＬで煮沸抽出し、吸引ろ過した後、ろ液は水を加えて３００ｍＬとした。バナナ抽出液１００ｍＬ（バナナ果皮５０ｇに相当）と緑茶抽出液１００ｍＬ（緑茶１ｇに相当）を混合し、クエン酸２ｇを溶解した後、３時間９５℃で加熱した。冷後、酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル抽出物0.312ｇを得た。同様にバナナ抽出液と緑茶抽出液を別々に酢酸エチルで分配して、それぞれ酢酸エチル抽出物0.015ｇ及び0.18ｇを得た。得られた酢酸エチル抽出物はＴＬＣで分析した（図３のＴＬＣ参照）。バナナ果皮抽出物のプロアントシアニジンは高分子量であるためＴＬＣ上では原点だけがバニリン塩酸試薬に陽性であるが、バナナ果皮抽出液と緑茶抽出液をクエン酸処理したものには、もとの抽出液には無い新しいプロアントシアニジン２量体、３量体由来のスポットが認められた。

実施例５
渋柿に大量に含まれる渋味成分は、茶の４種のカテキン類を構成成分とする非常に分子量の大きいプロアントシアニジンである（Tanaka et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans 1, 1013-1022, 1994）。新鮮な柿未熟果実１００ｇを１％クエン酸水溶液５００ｍＬと共にワーリングブレンダーで破砕し、さらに１％クエン酸水溶液５００ｍＬと緑茶２０ｇと合わせて、３時間穏やかに煮沸した。反応液は熱いうちに吸引ろ過し、ろ液９５０ｍＬを得た。ろ液の半分４７５ｍＬは酢酸エチルで４回分配し、酢酸エチル層2.56ｇを得た。残りの半分４７５ｍＬは、セパビーズSP850（２００ｍＬ）のカラムにかけ、水で洗浄し糖分を洗い出した後、吸着されたポリフェノール類を４０％から６０％エタノールで溶出した。溶出液を濃縮することで、カテキン及びプロアントシアニジン含有画分3.26ｇを得た。一方、柿未熟果実２００ｇをアセトン水混液（４：１、ｖ／ｖ）９００ｍＬと共に破砕して抽出し、ろ液のアセトンを完全に留去して得た抽出水溶液をセパビーズSP850（２００ｍＬ）のカラムにかけたところ、ほとんどの柿プロアントシアニジン（柿タンニン）は吸着されずに水だけで溶出してきた。カラムに吸着され含水アルコールで溶出されてきたポリフェノール画分はわずか0.76ｇであった。柿のプロアントシアニジンは、分子量が大きくおよそ1.38×１０４と推定されており（Mastuo, T. et al., Agric. Biol. Chem., 42, 1637-1643, 1978）、セパビーズの細孔に入ることが出来ない。一方、緑茶で処理した柿プロアントシアニジンは断片化されて分子量が小さくなっているため、セパビーズの細孔に入って吸着される。本実験によりセパビーズによって分子量の大きいプロアントシアニジンを篩い分けることが出来ることがわかった。本実験で得られた緑茶とクエン酸で処理した柿の酢酸エチル抽出物とセパビーズSP825吸着部を、緑茶エキス酢酸エチル抽出物及び、柿未熟果実含水アセトン抽出物とＴＬＣにより比較した（図４のＴＬＣ参照）。セパビーズSP825吸着部については順相ＨＰＬＣでの分析を行ない、ヒノキ熱水抽出物をダイヤイオンHP20SS カラムクロマトで分離して得たポリフェノール画分（カテキン単量体、プロシアニジン２量体、３量体、４量体及びさらに高分子量のプロシアニジンを含む）と比較した（図５のＨＰＬＣ参照）。順層ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：LiChroCART Superspher Si 60（4.6×２５０ｍｍ）、
カラム温度：２８℃、
移動相：ヘキサン：メタノール：テトラヒドロフラン：トリフルオロ酢酸（４５：４０：13.5：1.5）、
流速：1.0ｍＬ／ｍｉｎ、
検出：２５４ｎｍ。
標品としては、（−）−エピカテキン（単量体）、プロシアニジンＢ４（２量体）、プロシアニジンＣ１（３量体）、シンナムタンニンＡ２（４量体）を用いた。これらの標品はビワ種子より分離し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを文献記載の値と比較して同定したものである。ＨＰＬＣではカフェインのピークが認められるが、それ以外には４量体くらいまで存在することがわかり、ヒノキのプロアントシアニジンに比べてそれ以後のテーリングが少ない。

実施例６
新鮮な柿未熟果実１ｋｇを水２リットルと共に破砕し、緑茶２００ｇ及びクエン酸８０ｇと合わせた後、水を加えて総量８リットルとして３時間穏やかに煮沸した。加熱後、熱いうちにろ過し、ろ液は冷後、セパビーズSP825のカラムに付し水洗、吸着部は含水エタノールで溶出、濃縮後、凍結乾燥してカテキン・プロアントシアニジン混合物59.0ｇを得た。得られた混合物の６ｇを、セファデックスLH-20カラムにエタノールでかけて、８つのフラクション（Fr.）に分画した（図６参照）。Fr.１は主にエピカテキンとエピガロカテキンを含み0.79ｇ得られた。Fr.２は主にエピカテキン−３−Ｏ−ガレートを含み、0.15ｇ得られた。Fr.３は、主にエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを含み、0.87ｇ得られた。Fr.４はエピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートとプロアントシアニジン２量体の混合物で0.2ｇ得られた。Fr.５とFr.６はいずれもプロアントシアニジン２量体を含み、それぞれ0.25ｇと0.51ｇ得られた。Fr.７は主にプロアントシアニジン３量体を含み、0.88ｇ得られた。Fr.８はFr.７と同じかそれよりも大きい分子量のプロアントシアニジンを含み、1.63ｇ得られた。これらのフラクションのうち、Fr.５とFr.６はさらにMCI-gel CHP20PカラムクロマトとChromatorex ODS カラムクロマト（いずれも溶媒は含水メタノール）で精製して、（−）−エピカテキン−（４β→８）−（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを101.6ｍｇ、（−）−エピガロカテキン−（４β→８）−（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを121.1ｍｇ、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート−（４β→８）−（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを24.3ｍｇを得た（下記構造式参照）。他にも多種のプロアントシアニジン２量体類が存在するが、以上３種について純粋分離に成功し、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの比較によって構造を確定した。

実施例７：レスベラトロール結合体の製造例
ブドウ種子ポリフェノール末（Grape Seed P.E.，LAYN社製，プロアントシアニジン含量９５％以上））１００ｍｇおよびレスベラトロール２０ｍｇを１００ｍｇのクエン酸とともに１０ｍＬの水に溶解して３時間湯煎（８７〜９３℃）、反応させた後、室温まで放冷した。この液をセファデックスLH-20で調製したカラム（内径２ｃｍ、長さ１５ｃｍ、約５０ｍＬ、７０％メタノール）にチャージした。７０％メタノールを５０ｍＬ、次いで１００％メタノール５０ｍＬを通じて目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末（以下、発明物質Ａと略す）6.0ｍｇを得た。
この乾燥粉末を１ｍＬの７０％メタノールに溶解し、MCI-gel CHP-20で調製したカラム（内径２ｃｍ、長さ１５ｃｍ、約５０ｍＬ）にチャージした。同溶媒５０ｍＬを通じて目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末2.4ｍｇを得た。得られた粉末をＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ（高分解能高速原子衝撃法質量スペクトル）および^１Ｈ−ＮＭＲ（水素核磁気共鳴スペクトル、表１参照）に供した。得られた画分に主に含まれる化合物はＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳにおいて[Ｍ]^＋がｍ／ｚ：516.1404に観測され、分子式Ｃ_２９Ｈ_２５Ｏ_９に相当する計算値516.1420と3.1ｐｐｍの誤差で一致した。したがって、分子式Ｃ_２９Ｈ_２５Ｏ_９を有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンにレスベラトロールが炭素−炭素結合した化学構造が考えられた。
当該化合物の^１Ｈ−ＮＭＲ（表１参照）においてカテキンおよびエピカテキンに共通する芳香環上の５個のプロトンシグナルの他に、酸素原子を付け根に有するシグナル群がδ5.04（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，２−Ｈ）およびδ4.01（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，３−Ｈ）に認められ、エピカテキンの立体配置を有することを示唆している。δ4.64（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）のシグナルはエピカテキン部分の４ａ位に帰属され、レスベラトロール部分が４ｂ位に配置していると考えられた。別に、δ6.55に１のフロログルシノール部分で認められたシグナルと同型の２Ｈ分のenvelopeが0.56ｐｐｍ低磁場シフトして認められ、同様に、新たに形成したＣ−Ｃ結合が類似した立体環境であることを示唆している。その他、レスベラトロールのトランススチルベン構造に由来するＥ型共役二重結合上のＡＢシステム（δ6.79，6.97，each １Ｈ，Ｊ＝16.5Ｈｚ）、ならびに他方の芳香環上のＡ２Ｂ２シグナル（δ6.80，7.36．each ２Ｈ，Ｊ＝8.6Ｈｚ）が認められた。これらの情報に基づき、当該化合物の化学構造を下記式に示すように４ｂ−（４−レスベラトロイル）−（−）−エピカテキンと推定した。

実施例８：フロログルシノール結合体の製造例
ブドウ種子ポリフェノールおよびフロログルシノールの各1.00ｇを５００ｍｇのクエン酸とともに５０ｍＬの水に溶解して３時間湯煎（８７〜９３℃）、反応させた後、室温まで放冷した。この液をダイヤイオンHP20で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ１４ｃｍ、約１００ｍＬ）にチャージした後、約３００ｍＬの水で洗浄後、約２００ｍＬのメタノールで溶出して目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末（発明物質Ｂと略す）1.24ｇを得た。
発明物質Ｂを５ｍＬの７０％メタノールに溶解し、セファデックスLH-20で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ２５ｃｍ、約１８０ｍＬ）にチャージした。同溶媒５００ｍＬを通じて目的物の画分を濃縮、凍結乾燥して粉末62.2ｍｇを得た。得られた粉末をＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳおよび^１Ｈ−ＮＭＲに供した。得られた画分に主に含まれる化合物はＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳにおいて[Ｍ]^＋がｍ／ｚ：414.0941に観測され、分子式Ｃ_２１Ｈ_１８Ｏ_９に相当する計算値414.0950と2.2ｐｐｍ（１０ｐｐｍ以内は許容）の誤差で一致した。したがって、分子式Ｃ_２１Ｈ_１８Ｏ_９を有すると推定され、カテキンまたはエピカテキンにフロログルシノールが炭素−炭素結合した化学構造が考えられた。当該化合物の^１Ｈ−ＮＭＲ（表２参照）においてカテキンおよびエピカテキンに共通する芳香環上の５個のプロトンシグナルの他に、酸素原子を付け根に有するシグナル群が5.01（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，２−Ｈ）および3.96（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，３−Ｈ）に認められ、エピカテキンの立体配置を有することを示唆している。δ4.53（１Ｈ．ｂｒ．ｓ）のプロトンシグナルはエピカテキン部分の４位に帰属されフロログルシノール部分が４位に配置していると考えられた。別に、δ5.99にフロログルシノール由来Ｃ−４および−６に帰属される２Ｈ分のシグナルが等価なenvelopeとして認められ、新たに形成したＣ−Ｃ結合が回転障害を生じていることを示唆している。これらの情報に基づき、当該化合物の化学構造を下式に示すように４−（２−フロログルシノイル）−（−）−エピカテキンと推定した。化合物の^１３Ｃ−ＮＭＲ（炭素−１３核磁気共鳴スペクトル、表３参照）はこの化学構造を支持している。

実施例９：ブドウ種子由来エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）結合体の製造例
ブドウ種子ポリフェノール末（Grape Seed P.E.，LAYN社製，プロアントシアニジン含量９５％以上）5.00ｇを約１００ｍＬの水に分散・溶解後、セパビーズSP850で調製したカラム（内径3.8ｃｍ、長さ２０ｃｍ、約２３０ｍＬ）に付して水で溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥してポリマー末2.44ｇ（48.8％）を得た。
得られたブドウ種子ポリフェノールポリマー末およびＥＧＣＧの各1.00ｇを５００ｍｇのクエン酸とともに５０ｍＬの水に溶解して３時間湯煎（８７〜９３℃）、反応させた後、室温まで放冷した。この液をダイヤイオンHP20で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ１４ｃｍ、約１００ｍＬ）にチャージした後、約３００ｍＬの水で洗浄後、約２００ｍＬのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末（発明物質Ｃと略す）1.85ｇを得た。

実施例１０：ヨウバイヒポリフェノール（ＥＧＣＧポリマー）ＥＧＣＧ結合体の製造例
ヤマモモ（ヤマモモ科）、Myrica rubra (Myricaceae)樹皮片、すなわち生薬「楊梅皮（ヨウバイヒ）」を５〜１０倍量（Ｗ／Ｖ）の５０％アセトンに３〜７日間冷浸して得た暗褐色抽出液を濃縮後、析出するミリシトリン（myricitrin）（myricetin 3-O-α-Ｌ-rhamnopyranoside）の黄色結晶を繰り返しろ紙でろ去した。得られたろ液を更に濃縮後、凍結乾燥して濃褐色粉末を樹脂片から１４％の収率で得た。この粉末14.0ｇを約７０ｍＬの５０％メタノールに溶解し、セファデックスLH-20で調製したカラム（内径５ｃｍ、長さ２０ｃｍ、約４００ｍＬ）にチャージした。同溶媒を1.5Ｌ、次いで７０％メタノール0.7Ｌを通じた後に、７０％アセトン１Ｌを通じてＥＧＣＧポリマー画分を回収、濃縮後凍結乾燥してＥＧＣＧポリマー末を9.37ｇ（66.9％）得た。ヨウバイヒ由来のＥＧＣＧポリマー及びＥＧＣＧの各1.00gを５００ｍｇのクエン酸とともに５０ｍＬの水に溶解して３時間湯煎（８７〜９３℃）、反応させた後、室温まで放冷した。この液をＤＩＡＩＯＮ ＨＰ２０で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ１４ｃｍ、約１００ｍＬ）にチャージした後、約３００ｍＬの水で洗浄後、約２００ｍＬのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末（発明物質Ｄと略す）を1.85g得た。

実施例１１：柿皮由来茶ポリフェノール結合体の製造例
柿皮乾燥粉末1.00ｇおよび茶抽出物（ＰＦ−ＴＰ９０、株式会社ファーマフーズ研究所製、茶ポリフェノール含有量９０％以上、総カテキン含有量８０％以上うちＥＧＣＧ含量５０％以上）３００ｍｇを５００ｍｇのクエン酸とともに５０ｍＬの水に溶解して３時間湯煎（８７〜９３℃）、反応させた後、室温まで放冷した。この液をセパビーズSP850で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ１４ｃｍ、約１００ｍＬ）にチャージした後、約３００ｍＬの水で洗浄後、約２００ｍＬのメタノールで溶出した。この画分をダイヤイオンHP20で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ１４ｃｍ、約１００ｍＬ）にチャージした後、約３００ｍＬの水で洗浄後、約２００ｍＬのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末（発明物質Ｅと略す）４６４ｍｇを得た。

実施例１２：ライチ由来ポリフェノールエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）結合体の製造例
ライチ果実ポリフェノール末（Litchi P.E.，LAYN社製，プロアントシアニジン含量９０％以上）5.00ｇを約１００ｍＬの水に分散・溶解後、セパビーズSP850で調製したカラム（内径3.8ｃｍ、長さ２０ｃｍ、約２３０ｍＬ）に付して水で溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥してポリマー末3.02ｇ（60.4％）を得た。
得られたライチ果実ポリフェノールポリマー末およびＥＧＣＧの各1.00ｇを５００ｍｇのクエン酸とともに５０ｍＬの水に溶解して３時間湯煎（８７〜９３℃）、反応させた後、室温まで放冷した。この液をダイヤイオンHP20で調製したカラム（内径３ｃｍ、長さ１４ｃｍ、約１００ｍＬ）にチャージした後、約３００ｍＬの水で洗浄後、約２００ｍＬのメタノールで溶出して得た画分を濃縮、凍結乾燥して粉末（発明物質Ｆと略す）1.80ｇを得た。

試験例１：
実施例７〜１１で得た発明物質Ａ〜Ｅについて、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（ＤＰＰＨ）のラジカルの消去作用、及びＴＥＡＣ（Trolox Equivalent Antioxidant Capacity）法による抗酸化能評価試験を実施した。
［ＤＰＰＨアッセイ］
方法：
サンプルについて1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（ＤＰＰＨ）ラジカルの消去作用を以下の方法で測定測定した。９６穴のマイクロプレートに１００μＬのＤＰＰＨ溶液（６０μＭエタノール溶液）を入れ、試験試料のエタノール溶液１００μＬまたはコントロールとしてエタノールを１００μＬそれぞれ加え、静かに混合し室温で３０分間放置した後、５２０ｎｍの吸光度を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去能を下記の式で算出し、段階的に希釈した試験試料のＤＰＰＨラジカル消去能と濃度から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を算出した。

発明物質Ａについては比較物質として、エピカテキン（ＥＰ）及びレスベラトロール（ＲＳ）を使用し、発明物質Ｂについては比較物質として、エピカテキン及びフロログルシノール（ＰＬ）を使用し、発明物質Ｃ〜Ｅについては比較物質として、ブドウ種子ポリフェノールポリマー（ＧＰ）を使用した。比較物質についてのデータと共に結果を図７〜９に示す。
エピカテキンでは48.7％のＤＰＰＨ活性が認められたが、レスベラトロールでは23.1％とわずかな活性しか認められなかった。エピカテキンにレスベラトロールが結合した発明物質Ａでは76.1％と有意に優れた活性を示した（図７）。また、エピカテキンには43.0％のＤＰＰＨ活性が認められたが、フロログルシノールには活性がほとんど認められなかった。エピカテキンにフロログルシノールが結合した発明物質Ｂでは、両者よりも優位に高いスカベンジング活性を示した（図８）。
また、発明物質Ｃ（41.3％）及びＤ（35.1％）は比較物質（26.9％）に比べ高いスカベンジング活性を示した。発明物質Ｅ（26.8％）は比較物質と同等の活性を示した（図９参照）。
［ＴＥＡＣ］
方法：ＴＥＡＣ（Trolox Equivalent Antioxidant Capacity）法は、ある化合物が有する抗酸化活性をα−トコフェロール誘導体であるTroloxの抗酸化能に換算して抗酸化強度を相対評価する方法で、抗酸化指標として一般的に広く使用されている。
７０μＭのメトミオグロビン溶液３６μＬにＡＢＴＳ溶液３００μＬ及び５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を４８７μＭ加え、次いでサンプル溶液または1.25ｍＭのＴｒｏｌｏｘ溶液を加え、０℃で５分間静かに混和した。４５０μＭの過酸化水素水を１６７μＬ加えて１０秒間混和した後、室温で５分間反応させた。７３４ｎｍの吸光度を測定しサンプルの吸光度をＴｒｏｌｏｘ溶液の吸光度の比を算出し、1.00ｍＭのＴｒｏｌｏｘに対するサンプルのＴＥＡＣ値とした。
上記ＤＰＰＨアッセイと同様に発明物質Ａについては比較物質として、エピカテキン及びレスベラトールを使用し、発明物質Ｂについては比較物質として、エピカテキン及びフロログルシンールを使用し、発明物質Ｃ〜Ｅについては比較物質として、ブドウ種子ポリフェノールポリマーを使用した。比較物質についてのデータと共に結果を図１０〜１２に示す。
エピカテキンには1.2ｍＭのＴＥＡＣ活性が認められたが、レスベラトロールでは1.11ｍＭと低かった。エピカテキンにレスベラトロールが結合した発明物質Ａでは1.33ｍＭと有意に高い活性を示した（図１０）。フロログルシノールでは0.52ｍＭと低い活性であったのに対して、エピカテキンにフロログルシノールが結合した発明物質Ｂでは、1.44ｍＭと両者よりも優位に高い活性を示した（図１１）。
また、発明物質Ｃ（1.11）、Ｄ（1.11）、Ｅ（0.97）は比較物質（0.73）に比べ高いＴＥＡＣ値を示した（図１２）。

試験例２：
実施例１２で得た発明物質Ｆについてはライチ果実ポリフェノール（ＬＰ）及び茶抽出物（ＴＥ）を比較物質として比較試験を行った。
［ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験］
試験方法：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６穴プレートに播種し、３７℃で一晩培養する。翌日無血清培地に交換し、被検物質を添加し、さらに１時間培養後、２０分間ＵＶ照射した。血清入りの培地に交換して３７℃で一晩培養しＭＴＴ法により細胞生存率を測定した。無添加を対照群（Ｃ）とした。
結果を図１３に示す。対照群ではＵＶ照射に対する細胞の生存率は２０％程度であるのに対して発明物質Ｆでは生存率が最も高く、比較物質と比較して有意に細胞死が抑制され、発明物質ＦのＵＶ保護作用が示された。
［ｉｎ ｖｉｖｏ試験］
試験方法：９週齢の雄性Ｓｌｃ：ｄｄＹマウスに発明物質Ｆ、ＬＰ、ＴＥをそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で３週間連日強制経口投与した。対照群（Ｃ）には同用量の水道水を投与した。最終日の被検物質投与から２時間後にエーテル麻酔下で心臓採血を行い血清のＴＥＡＣによる抗酸化活性と過酸化脂質量を測定した。ＴＥＡＣは前述の通り測定した。過酸化脂質は市販のキット（過酸化脂質−テストワコー，和光純薬株式会社製）を用いて硫酸酸性化でのリンタングステン酸溶液中での過酸化脂質の沈殿と２−チオバルビツール酸試薬との反応を励起波長５１５ｎｍ、蛍光波長５５３ｎｍの蛍光を測定することにより測定した。
結果を図１４、図１５に示す。発明物質Ｆは対照群、比較物質に比べ有意に高い抗酸化活性を示した。また、血清中の過酸化脂質も比較物質に比べ有意な低値を示した。
［ｉｎ ｖｉｖｏ試験］
試験方法：６週齢の雄性Ｓｌｃ：ｄｄＹマウスに発明物質Ｆ、ＬＰ、ＴＥをそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で３日間連日強制経口投与した。対照群（Ｃ）には同用量の水道水を投与した。解剖前日に２−ＮＰ（７０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、２４時間後にエーテル麻酔下で心臓採血を行い血清のＧＯＴ及びＧＰＴを測定した。また、肝臓を摘出し臓器中の過酸化脂質量を測定した。
結果を図１６、１７に示す。２−ＮＰ投与により肝臓が障害され血清中のＧＯＴ及びＧＰＴ濃度が上昇したが、発明物質Ｆは対照群、比較物質に比べ有意にその上昇を抑制した。また、肝臓中の過酸化脂質も比較物質に比べ有意な低値を示した。

実施例３でヒノキ樹皮と緑茶を酸性条件下加熱処理したものについてのＨＰＬＣクロマトグラム図（Ａ）、ヒノキ樹皮及び緑茶を各々単独で同様に加熱処理したものについてのＨＰＬＣクロマトグラム図（Ｂ）及び（Ｃ）である。 実施例３でヒノキ樹皮と緑茶を酸性条件下加熱処理することにより原料の緑茶やヒノキ樹皮に無い新しいプロアントシアニジン類が生成していることを示す実施例４のＴＬＣ写真である。図中、Ａは緑茶処理後の酢酸エチル層、Ｂはヒノキ樹皮処理後の酢酸エチル層、Ｃはヒノキ樹皮と緑茶処理酢酸エチル層についての結果であり、スポットＭはガロイル化されていない単量体由来、ＭＧはガロイル化された単量体由来、Ｄは主にガロイル化されたプロアントシアニジン２量体由来、Ｔは主にガロイル化されたプロアントシアニジン３量体由来のものある。 バナナ果皮抽出物と緑茶を酸性条件下加熱処理することにより原料緑茶やバナナ果皮に無い新しいプロアントシアニジン類が生成していることを示す実施例６のＴＬＣ写真である。図中、Ａは緑茶単独、Ｂはバナナ果皮抽出物単独、Ｃはバナナ果皮抽出液と緑茶とを処理したものである。 柿未熟果実と緑茶を酸性条件下加熱処理することにより、原料の緑茶や柿に無い新しいプロアントシアニジン類が生成していることを示す実施例５のＴＬＣ写真である。図中、Ａは緑茶単独、Ｂは柿未熟果実単独、Ｃは柿未熟果実と緑茶とを処理したもの、Ｄは柿未熟果実と緑茶との処理物（抽出液）をセパビーズＳＰ８２５に通した吸着部を水エタノールで溶出したものについての結果であり、スポットＭ、ＭＧ、Ｄ及びＴは図２と同様である。 実施例５の柿未熟果実と緑茶との処理物（抽出液）をセパビーズＳＰ８２５に通した吸着部を水エタノールで溶出したものの順相ＨＰＬＣの分析結果（図５（Ａ））及びその比較例であるヒノキプロアントシアニジンヒノキプロアントシアニジンの順相ＨＰＬＣの分析結果（図５（Ｂ））である。 実施例６で柿未熟果実と緑茶を酸性条件下加熱処理して得られたカテキン類とプロアントシアニジン類をセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトで分離して得られた各フラクション（Ｆｒ１〜Ｆｒ８）及び分離前の混合物（Ｅ）のＴＬＣの図である。 実施例７で得た発明物質Ａについて、ＤＰＰＨのラジカルの消去作用を示す。 実施例８で得た発明物質Ｂについて、ＤＰＰＨのラジカルの消去作用を示す。 実施例９〜１１で得た発明物質Ｃ〜Ｅについて、ＤＰＰＨのラジカルの消去作用を示す。 実施例７で得た発明物質ＡについてのＴＥＡＣ法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例８で得た発明物質ＢについてのＴＥＡＣ法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例９〜１１で得た発明物質Ｃ〜ＥについてのＴＥＡＣ法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例１２で得た発明物質Ｆについて、ＵＶ保護効果試験結果を示す。 実施例１２で得た発明物質Ｆについて、ＴＥＡＣ法による抗酸化能評価試験結果を示す。 実施例１２で得た発明物質Ｆについて、抗酸化能評価試験における血清中ＬＰＯの測定結果を示す。 実施例１２で得た発明物質Ｆについて、抗酸化能評価試験における血清中ＧＯＴ及びＧＰＴの測定結果を示す。 実施例１２で得た発明物質Ｆについて、抗酸化能評価試験における肝臓中ＬＰＯの測定結果を示す。

Claims (14)

1. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
2. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物がブドウ、マツ、ヒノキ、クスノキ、ヤマモモ、カカオ、柿、バナナ、カリン、リンゴ、サンザシ、ライチ、ヨウバイヒ及びケイヒから選択される少なくとも１種である請求項１に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
3. フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が、レスベラトロール、フロログルシノール、フラボノイド及びフラバノイドから選択される少なくとも１種類であるである請求項１に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
4. フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質を含有する植物が、緑茶、新鮮茶葉、ブドウ種子、ブドウ種皮、アセンヤク、紅藻類及びこれらの抽出物から選択される少なくとも１種類である請求項１に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物。
5. 重合度が２〜４であるプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する請求項１に記載の組成物。
6. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱し、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
7. プロアントシアニジンポリマーを含有する植物原料またはその抽出物と、フロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質、それらを含有する植物またはその抽出物とを、酸性溶液中で加熱して得られる、末端にフロログルシノール環またはレゾルシノール環構造を有する物質が結合し低分子化したプロアントシアニジンオリゴマーを含有する反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主成分として含有する組成物の製造方法。
8. 無機酸、有機酸またはこれらの両方を用いて酸性条件とする請求項６または７記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
9. 塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種を使用する請求項８に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物の製造方法。
10. 活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための健康食品用である請求項１乃至５のいずれかに記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
11. 活性酸素種の生成が原因となる生活習慣病、脳疾患の治療あるいは予防、または老化の予防のための医薬品用である請求項１０に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
12. 活性酸素種の生成が原因となる老化の予防のための化粧品用である請求項１０に記載のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する組成物。
13. 下記式（１）
    （式中、ｎは０または１〜２の整数である）
    で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。
14. 下記式（２）
    （式中、ｎは０または１〜２の整数である）
    で示されるプロアントシアニジンオリゴマー。