JP5856728B2

JP5856728B2 - ポリフェノールを配合してなる経口投与用又は外用組成物、並びにその用途

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Publication number: JP5856728B2
Application number: JP2009170353A
Authority: JP
Inventors: 富久太田; 範人石橋; 真弓太田
Original assignee: Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC
Priority date: 2009-07-21
Filing date: 2009-07-21
Publication date: 2016-02-10
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Description

本発明は、イチゴ由来のポリフェノールを配合してなる経口投与用又は外用組成物、特に食品組成物、医薬組成物及び化粧品組成物に関する。

イチゴには、ビタミンＣ、エラグ酸、アントシアニン、ケルセチン、ケンフェロール、クエン酸、リンゴ酸などが含まれており、特許文献１には、イチゴ由来のアントシアニジンを含有する肥満防止改善組成物が記載されており、抽出物の調製方法について、イチゴを４℃の水で抽出して得られた抽出物を芳香族系合成吸着剤である合成吸着樹脂（ＨＰ２０）が充填されたカラムに通液することにより、色素成分をカラムに吸着させ、次いで、このカラムに水を通液して洗浄後、７０％エタノール水溶液を通液することにより、カラムに吸着された色素成分を溶出して得られた溶液から溶媒を除去することにより、アントシアニジン系化合物（色素成分）を９０％以上の高純度で含有する抽出物が得られたことが記載されている。

また、ペクチンは、食物繊維成分として健康食品に配合されることが知られている（特許文献２）。

特開２００２−１５３２４０号公報、請求項１、２及び段落００３３〜００３７特開２００７−３３０１２４号公報、請求項９

本発明者が、イチゴの熱水抽出物からポリフェノールを得る方法について鋭意研究を重ねた結果、ポリフェノールは芳香族系合成吸着剤に吸着し、５〜６０％エタノール水溶液によって溶離する画分から得られること、更にはエタノール濃度により、得られる成分の組成及び活性が異なることを見出した。

本発明は、イチゴ由来のポリフェノールを用いて、安全性が高く、かつ優れた効果を示す組成物を提供することを課題とする。

本発明の要旨は、以下のとおりである。
（１）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分を含有する経口投与用又は外用組成物。
（２）カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜１５％エタノール水溶液で溶出した画分を含有する前記（１）に記載の組成物。
（３）カラムを通過した画分、水で溶出した画分及び４０％未満のエタノール水溶液で溶出した画分を除去し、次いで４０〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分を含有する前記（１）に記載の組成物。
（４）更に、増粘多糖類を含有する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）イチゴ由来のポリフェノール、及び増粘多糖類を配合してなる組成物。
（６）食品組成物、医薬組成物又は化粧品組成物ある前記（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）抗肥満用組成物である前記（６）に記載の組成物。
（８）抗炎症用組成物である前記（６）に記載の組成物。
（９）メラニン産生阻害用組成物である前記（６）に記載の組成物。
（１０）増粘多糖類がイチゴ由来のペクチンである前記（４）〜（９）のいずれかに記載の組成物。

本発明の組成物は、安全性が高く、かつ優れた効果を示す。

図１は検体投与開始後の増加体重の推移を示す図である。図２は肝臓重量の測定結果を示す図である。図３は脾臓重量の測定結果を示す図である。図４はＯＶＡ−ＩｇＥの測定結果を示す図である。図５はＯＶＡ−ＩｇＧ１の測定結果を示す図である。図６はＩＬ−６産生量を示す図である。図７はＩＬ−８産生量を示す図である。図８はＨＭＶII細胞を用いたメラニン産生阻害試験の結果を示す図である。図９はＢ１６Ｆ１細胞を用いたメラニン産生阻害試験の結果を示す図である図１０はチロシナーゼ活性阻害試験の結果を示す図である。

本発明において、ポリフェノールの原料となるイチゴ（学名：Fragaria L.）の種類としては、特に制限はないが、好ましくはオランダイチゴ（学名：Fragaria ananassa、英名：garden strawberry）が挙げられ、その品種としては、例えばトチオトメ、ダナー、アイベリー、あまおう、ももいちご、あきひめ、さがほのか、あすかルビー、豊の香、宝交早生、福羽、女峰、久留米４９号、栃の峰、好ましくはトチオトメが挙げられる。イチゴの部分としては、例えば果実、葉、茎、根、好ましくは果実が挙げられる。

本発明において、イチゴ由来のポリフェノールとしては、好ましくは、イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分を用いる。

本発明の組成物を化粧品組成物等の外用組成物として用いる場合には、メラニン産生阻害活性、チロシナーゼ阻害活性の点から、前記画分として、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜１５％エタノール水溶液で溶出した画分を用いることが好ましい。一方、経口投与用組成物として用いる場合には、活性の点から、一般には、前記画分として、カラムを通過した画分、水で溶出した画分及び４０％未満のエタノール水溶液で溶出した画分を除去し、次いで４０〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分を用いることが好ましい。
前記画分は、そのまま、又は更に精製して、イチゴ由来のポリフェノールとして用いることができる。

イチゴからポリフェノールを抽出するために用いる抽出溶媒としては、ポリフェノール及びペクチンの収穫量向上の点で、熱水（９０〜１００℃の水）を用いることが好ましい。

本発明に用いる芳香族系合成吸着剤は、イオン交換基を有しない、多孔性構造を有する合成物質で、疎水性相互作用により、主に有機物の分離精製に使用されるものであり、種々のものが知られており、例えば、特許第２７８４６２７号公報、特許第３５２７６６１号公報、特許第３８９１７４６号公報に記載されているものが挙げられる。具体的には、スチレンとジビニルベンゼンを重合して製造された芳香族系合成吸着剤が挙げられ、市販品としては、ダイヤイオン^ＴＭＨＰ２０、同ＨＰ２１、セパビーズ^ＴＭＳＰ８２５Ｌ、同ＳＰ８５０、同ＳＰ７００、同ＳＰ７０（以上、三菱化学（株）製又は日本錬水（株）製）、アンバーライト^ＴＭＸＡＤ２、同ＸＡＤ４、同ＸＡＤ１６（米国、ロームアンドハース社製）が挙げられる。

本発明の組成物においては、イチゴ由来のポリフェノールに加えて、更に増粘多糖類を併用することにより、肥満作用等の効果が増強される。
増粘多糖類としては、特に制限はないが、例えばペクチン、アラビアゴム、グアーガム、プルラン、アルギン酸ナトリウム、好ましくはペクチン、アラビアゴムが挙げられる。ペクチンとしては、特に制限はないが、イチゴ由来のペクチンが好ましい。

また、イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分をエタノール水溶液、好ましくは６０〜８０％エタノール水溶液に溶解し、析出した不溶物を６０〜８０％エタノール水溶液で濾過洗浄したものをそのまま、又は更に精製して、イチゴ由来のペクチンとして用いることができる。

本発明の組成物において、イチゴ由来のポリフェノールと増粘多糖類を併用する場合、イチゴ由来のポリフェノールと増粘多糖類との質量比は、通常１：０．６〜１：２が望ましい。

本発明の組成物は、抗肥満作用、インターロイキン８産生阻害作用及びメラニン産生阻害作用を有し、抗肥満用、抗炎症用又はメラニン産生阻害用の食品組成物、医薬組成物又は化粧品組成物として用いることができる。

本発明の組成物は、イチゴ由来のポリフェノール、更に必要に応じて増粘多糖類を公知の食品用担体、医薬用担体又は化粧品用担体と組合せて製剤化することができる。本発明の組成物は、経口投与用に用いる場合、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の医薬組成物として、また食品、チューインガム、飲料等に添加して、一般食品、又はいわゆる特定保健用食品として用いることができる。

本発明の組成物の投与量は、患者の年令、体重、疾患の程度、投与経路により異なるが、イチゴ由来のポリフェノールとして通常１日５０〜５００ｍｇであり、増粘多糖類として通常１日５０〜５００ｍｇであり、投与回数は、通常、１日１〜３回である。

本発明の組成物は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。本発明の組成物には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。

結合剤の具体例としては、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴールが挙げられる。

崩壊剤の具体例としては、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントが挙げられる。

界面活性剤の具体例としては、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールが挙げられる。

滑沢剤の具体例としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコールが挙げられる。

流動性促進剤の具体例としては、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。

また、本発明の組成物は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤として投与する場合には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（製造例１）イチゴ熱水抽出物の調製及び分画
（１）抽出液の調製
イチゴ（トチオトメ；以下同様）の果実の絞りカス１．４ｋｇに蒸留水２．７Ｌを加え、オートクレーブ中、９０℃で６０分間処理することにより抽出を行った。冷却後、濾液と残渣とに分離して減圧濾過を行い、残渣や容器を洗浄した蒸留水を含めて４．７Ｌの抽出液を得た。

（２）分画
前記（１）で得られた熱水抽出液４．７Ｌをダイヤイオン^ＴＭＨＰ２０（日本錬水（株））カラムクロマトグラフィー（直径９．０ｃｍ×長さ１９ｃｍ）に付し、水６．０Ｌ、１０％エタノール水溶液３．６Ｌ、５０％エタノール水溶液３．６Ｌ、１００％エタノール３．６Ｌの順で溶出させ、減圧濃縮することにより、以下の極性画分（水溶出〜エタノール溶出画分）を得た。水溶出画分８０．７ｇ、１０％エタノール水溶液溶出画分１．９２ｇ、５０％エタノール水溶液溶出画分３．８３ｇ、１００％エタノール溶出画分０．１８ｇ。

前記５０％エタノール水溶液溶出画分又は１０％エタノール水溶液溶出画分の凍結乾燥品をイチゴポリフェノールとして用いた。
一方、前記水溶出画分の凍結乾燥品８０．７ｇを７０％エタノール水溶液に溶解し、析出した不溶物を７０％エタノール水溶液で濾過洗浄し、凍結乾燥したものをイチゴペクチンとして用いた。

（製造例２）イチゴ熱水抽出物の調製
イチゴの果実の絞りカス３０４ｇに蒸留水１．８Ｌを加え、オートクレーブ中、９０℃で６０分間処理することにより抽出を行った。冷却後、濾液と残渣とに分離して減圧濾過を行い、残渣や容器を洗浄した蒸留水を含めて抽出液を得た。得られた抽出液を凍結乾燥した。
イチゴ絞りカスの含水率及び抽出効率（イチゴ絞りカス１００ｇに対して６００ｍＬの蒸留水を加えて１回抽出した場合の値）を表１に示す。

（製造例３）イチゴ熱水抽出物の調製
イチゴの果実の絞りカス０．８ｋｇに１％クエン酸水溶液２．４Ｌを加え、オートクレーブ中、９０℃で６０分間処理することにより抽出を行った。冷却後、濾液と残渣とに分離して減圧濾過を行い、抽出液を得た。

（試験例１）ポリフェノールの定量
Folin-Denis法を用いて被検試料中のポリフェノールを定量した。被検試料を水又はエタノールを少量加えた水に溶かし、熱水抽出物（製造例２で得た凍結乾燥品）及び製造例１で得た水溶出画分は２００μｇ／ｍＬに、製造例１で得た１０％エタノール水溶液溶出画分及び５０％エタノール水溶液溶出画分は５０μｇ／ｍＬに調製した。調製液１．０ｍＬにフォーリン試薬１．０ｍＬを加えて混和し、３分間以上経った後に１０％炭酸ナトリウム水溶液１．０ｍＬを加えてよく混和した。遮光状態で１時間静置の後、７６０ｎｍの吸光度を測定した。これとは別に、フォーリン試薬の代わりに水を用いて同様の操作を行ったものを各被検試料のブランクとし、測定値より差し引いた。

また、ポリフェノール濃度が高すぎても低すぎても誤差が大きいため、吸光度が０．３〜０．５の範囲になかった水溶出画分及び５０％エタノール水溶液溶出画分はそれぞれ１５００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬに調製して再度測定した。

なお、値はクロロゲン酸を標準物質として予め作成した検量線より算出した。
ポリフェノール含有量（％）＝［検量線からの算出値（μｇ／ｍＬ）／被検試料濃度（μｇ／ｍＬ）］×１００
結果を表２に示す。

（実施例１）抗肥満試験
（目的）
（１）イチゴポリフェノール及びペクチンなどの増粘多糖類の抗肥満効果に対する相互作用の検証
（２）イチゴ熱水抽出物の抗肥満効果の有無の検討

（方法）
（１）被検試料
（ａ）イチゴ熱水抽出物
（ｉ）酵素処理なしイチゴを０．５％クエン酸水溶液に懸濁し、９０℃で６０分加熱後、濾過した。
（ii）酵素処理イチゴを９０℃で６０分加熱後、濾過した。
（ｂ）イチゴポリフェノール
製造例１（２）で得た５０％エタノール水溶液溶出画分を用いた。
（ｃ）イチゴペクチン
製造例１（２）で得たペクチンを用いた。
（ｄ）リンゴペクチン及びアラビアゴム
ペクチンリンゴ由来（和光純薬工業）及びアラビアゴム（ナカライテスク）を購入して用いた。
（２）動物及び飼育
ＩＣＲ／Ｋｗｌマウス（雄性、５週齢）を高脂肪・高カロリー飼料（日本クレア社製ＱｕｉｃｋＦａｔ）で飼育した。
（３）投与方法
飼育８日目に投与を開始した。連続経口強制投与を１４回実施した。
（４）試験区
以下の６群について各群１０個体使用した。
（ａ）コントロール群：水
（ｂ）酵素処理なしイチゴ熱水抽出物：１０００ｍｇ／ｋｇ
（ｃ）酵素処理イチゴ熱水抽出物：１０００ｍｇ／ｋｇ
（ｄ）イチゴポリフェノール＋リンゴペクチン：各１００ｍｇ／ｋｇ
（ｅ）イチゴポリフェノール＋アラビアゴム：１００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ
（ｆ）イチゴポリフェノール＋イチゴペクチン：各１００ｍｇ／ｋｇ
（５）測定
摂餌量、摂水量及び体重を毎日測定した。
（６）解剖及び生化学試験
解剖の前日から絶食させた。エーテル麻酔下で心臓から全身血を採取し、遠心後、血清を−８０℃で保存した。また、肝臓を摘出し、重量を測定した。血液成分として、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、トリグリセリド及び血糖値を測定した。
（７）統計処理
分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施後、ポストフック検定によりｐ＜０．０５を有意差ありとした。

（結論）
イチゴポリフェノールと増粘多糖類（ペクチン及びアラビアゴム）の投与により非常に強い抗肥満作用が認められた。
（１）体重の推移
イチゴポリフェノール＋増粘多糖類投与群において有意に体重増加が抑制された。イチゴポリフェノール＋増粘多糖類投与群において、投与開始４〜５日後でコントロールに対して有意に体重増加が抑制された。酵素処理なしイチゴ熱水抽出物においても体重増加の抑制傾向がみられた。酵素処理イチゴにおいては体重増加を抑制する傾向はなかった。結果を図１に示す。
（２）肥満パラメーター
イチゴポリフェノール＋増粘多糖類投与群において肝臓重量が有意に低下した。結果を図２に示す。

（考察）
イチゴポリフェノールと増粘多糖類を同時に摂取させると抗肥満効果があることが明らかになった。そのメカニズムに関しては、増粘多糖類によりイチゴポリフェノールが体内により多く吸収され、抗肥満効果を発現している可能性が高いと考えられた。

（実施例２）抗アレルギー試験
（目的）
イチゴポリフェノールに抗アレルギー作用があるか否かの検討

（方法）
（１）被検試料
（ａ）イチゴポリフェノール
製造例１（２）で得た５０％エタノール水溶液溶出画分を用いた。
（ｂ）イチゴペクチン
製造例１（２）で得たペクチンを用いた。
（２）動物及び飼育
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄性、５週齢）をラット・マウス・ハムスター用餌料ＣＲＦ−１で飼育した。
（３）群分け、初期免疫及び二次感作
（ａ）飼育開始から６日後及び１０日後に１個体あたり０．２ｍＬの０．１ｍｇ／ｍＬＯＶＡ−アラム溶液（０．２ｍｇ／ｍＬＯＶＡとアラムゲルを等量混合した溶液）を腹腔内投与（ＯＶＡ２０μｇ／マウス）した。
（ｂ）飼育開始から１８日後から７日間、被検試料投与の１時間後及び２時間後に３４ｍｇ／ｍＬのＯＶＡを１個体あたり１０μＬ経鼻感作した。
（ｃ）実験群
（ｉ）無感作コントロール
（ii）コントロール（蒸留水を経口投与）
（iii）イチゴポリフェノール１００ｍｇ／ｋｇ＋イチゴペクチン６０ｍｇ／ｋｇ
（iv）イチゴポリフェノール２００ｍｇ／ｋｇ＋イチゴペクチン６０ｍｇ／ｋｇ
（ii）、（iii）、（iv）の経口投与を飼育開始６日目から毎日実施した。
（４）解剖及び生化学試験
飼育開始から２７日後にエーテル麻酔下で心臓から採血した（ＥＤＴＡを使用）。血清のＯＶＡ特異的ＩｇＥ及びＩｇＧ１を測定した。脾臓を摘出し重量を測定した。
（５）統計処理
データはすべて平均値±標準誤差で表した。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ検定により有意水準５％未満の場合データを棄却した。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ検定により棄却した個体に関してその他の項目も分析しなかった。無感作コントロールとコントロール間でｔ検定を実施した。有意水準は５％未満とした。コントロールとサンプル間で分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。有意水準は５％未満とした。ＡＮＯＶＡで有意差が出た場合は、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を実施した。

（結果）
イチゴポリフェノール投与群で、脾臓重量が明らかに低い値になる傾向が認められた。イチゴポリフェノール１００ｍｇ／ｋｇ投与群で、ＯＶＡ−ＩｇＥがやや低い値になる傾向が認められた。イチゴポリフェノール１００ｍｇ／ｋｇ投与群で、ＯＶＡ−ＩｇＧ１が明らかに低い値になる傾向が認められた。
一方、イチゴポリフェノール２００ｍｇ／ｋｇ投与群においてはＯＶＡ−ＩｇＥがやや高い値になる傾向であり、またＯＶＡ−ＩｇＧ１に関しても１００ｍｇ／ｋｇ投与群より高い値になる傾向が認められた。
脾臓重量の測定結果を図３に、ＯＶＡ−ＩｇＥの測定結果を図４に、ＯＶＡ−ＩｇＧ１の測定結果を図５に示す。

（結論）
イチゴポリフェノールに抗アレルギー作用がある可能性があることが推定されたが、その効果には至適用量が存在すると考えられた。

（実施例３）サイトカイン産生試験
（概要）
正常ヒト表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte）に刺激物質であるホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Phorbol 12-myristate 13-acetate；ＰＭＡ）とイチゴ由来分画物を作用させてインターロイキン１β，６，８（ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−８）の３種のサイトカインの産生量を測定し、被検試料の抗炎症効果などを評価した。

（材料及び方法）
（１）細胞
アジア人由来正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫＤＳファーマバイオメディカル（株））は、正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオメディカル（株））で３継代以上培養したものを用いた。
（２）被検試料及び試薬
被検試料は製造例１（２）で得た１０％エタノール水溶液溶出画分を凍結乾燥して用いた。
細胞刺激物質としてホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Phorbol 12-myristate 13-acetate；ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、生存率の評価にＭＴＴ試薬（ナカライテスク（株））とＳＤＳ−ＨＣｌ試薬を用いた。また、サイトカインの産生能の評価には、ＲＥＡＤＹ−ＳＥＴ−ＧＯ！ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｂｅｔａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＲＥＡＤＹ−ＳＥＴ−ＧＯ！ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−８／ＮＡＰ−１ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＫｉｔ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いた。
（３）方法
（ａ）細胞生存試験（毒性試験）
フラスコで培養したＮＨＥＫを５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２００μＬ播種した（最終濃度１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。３７℃で２４時間培養し、１００ｎｇ／ｍＬに調製したＰＭＡ２５μＬ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）と１００，１０００μｇ／ｍＬに調製した被検試料２５μＬ（最終濃度１０，１００μｇ／ｍＬ）を添加した。４８時間培養後、培地を回収してＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ−Ｉｍｍｕｎｏ−ＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）用に−８０℃で保存した。細胞に新しい培地８０μＬとＭＴＴ試薬２０μＬを加えて３〜５時間培養し、ＳＤＳ−ＨＣｌ試薬１５０μＬを加えた。１８〜２０時間培養後に５７０ｎｍの吸光度を測定した。
（ｂ）サイトカイン産生量の測定ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）
−８０℃で保存していた培地は、ＥＬＩＳＡ法を用いてサイトカイン量を測定した。
（ｉ）Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（ＩＬ−８）ｐｒｅ−ｃｏａｔｅｄｔｙｐｅ
解凍した培地をＳｔａｎｄａｒｄＤｉｌｕｅｎｔＢｕｆｆｅｒで３倍希釈し、標準液と共にＩＬ−８抗体加工された９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに５０μＬ添加し、更にＢｉｏｔｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｅ５０μＬを添加して９０分間室温で反応させた。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰＷｏｒｋｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ１００μＬを添加し、３０分間反応させた。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、ＳｔａｂｉｌｉｚｅｄＣｈｒｏｍｏｇｅｎ１００μＬを添加して、１０〜１５分間反応させた。ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎ１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準液の吸光度より検量線を作成し、ＩＬ−８の産生量を算出した。
（ii）ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＬ−１β，６）ｎｏｎ−ｃｏａｔｅｄｔｙｐｅ
９６ｗｅｌｌｍａｘｉｓｏｒｐｐｌａｔｅに、ＣｏａｔｉｎｇＢｕｆｆｅｒで希釈したＣａｐｔｕｒｅＡｎｔｉｂｏｄｙを１００μＬ添加し、４℃で１晩培養した。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、ＡｓｓａｙＤｉｌｕｅｎｔ２００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、解凍して１０倍，５倍に希釈した培地を標準液と共に１００μＬ添加し、２時間室温で反応させた。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｔｉｂｏｄｙ１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ１００μＬを添加し、３０分間室温で反応させた。ｗｅｌｌの溶液を除き、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで７回洗浄した後、ＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｏｌｕｔｉｏｎ１００μＬを添加し、１０〜１５分間反応させた。ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎ１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０，５７０ｎｍの吸光度を測定した。標準液の吸光度より検量線を作成し、ＩＬ−１β，６の産生量をそれぞれ算出した。

（結果）
（１）サイトカイン産生量
測定したサイトカイン産生量は、細胞上清の希釈率をかけて産生量（ｐｇ／ｍＬ）で記載し、同細胞数で比較するために、その値に細胞生存試験の結果を算入してコントロール値を１００としたものを記載した。これでＰＭＡと被検試料の両方のサイトカイン産生への影響を検討した。
（ａ）インターロイキン１β
ＩＬ−１βは産生量が少なく、細胞上清を１０倍希釈した今回の方法では検出できなかった。
（ｂ）インターロイキン６
同細胞数で比較すると、ＰＭＡ（＋）条件下でわずかなＩＬ−６の産生が見られた（表３及び図６）。また、ＰＭＡ（−），（＋）の両方で被検試料による産生が見られた。

（ｃ）インターロイキン８
ＩＬ−１β，６に比べて２０倍以上のＩＬ−８の産生量が見られた（表４及び図７）。また、ＰＭＡの添加により顕著なＩＬ−８の産生が見られた。被検試料は濃度に依存して産生阻害を示した。

（考察）
今回検討した３種のサイトカインでは、ＩＬ−６は被検試料の添加により少量産生されたが、ＩＬ−８産生量に比べてごく僅かであることより、炎症作用は弱いものであると考えられた。反対に、ＩＬ−８は被検試料の添加により顕著な産生阻害を示した。この活性はＰＭＡ（−），（＋）のどちらの条件下でも見られるため、抗炎症又は消炎作用が高いと思われた。

（実施例４）メラニン産生阻害試験
（概要）
ヒト由来メラノーマ細胞ＨＭＶII細胞にイチゴ由来物質を作用させ、メラニンの産生量を陰性対照と比較してその産生阻害性（美白効果）を検討した。

（材料及び方法）
（１）細胞
ヒト由来メラノーマ細胞ＨＭＶIIは、１０％ＦＢＳを含むＨａｍＦ−１２培地（日水製薬）に０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した培養液で３継代以上培養したものを用いた。
（２）被検試料
被検試料は製造例１（１）で得た熱水抽出物と製造例１（２）で得た１０％エタノール水溶液溶出画分及び５０％エタノール水溶液溶出画分を凍結乾燥して用いた。
（３）方法
（ａ）メラニン産生量
１０％ＦＢＳ入りＨａｍＦ−１２培地で培養したヒト由来細胞ＨＭＶIIを２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに最終濃度１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（播種濃度１．０４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を９６０μＬ播種し、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（添加濃度５．０μｇ／ｍＬ）に調整したメラニン産生ホルモン（α−ＭＳＨ）と１０μｇ／ｍＬ（５００μｇ／ｍＬ）又は１００μｇ／ｍＬ（５０００μｇ／ｍＬ）に調整した被検試料をそれぞれ２０μＬ添加し、７２時間培養した。培地を除き、ＰＢＳで洗った後、トリプシンＥＤＴＡ溶液１００μＬを加えて細胞をプレートから剥がし、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液９００μＬを加えた。室温で２０〜２４時間静置して細胞を融解した後、４７５ｎｍの吸光度でメラニンを測定した。
（ｂ）細胞生存率
被検試料による細胞生存率（増殖率）への影響を補正するため、ＭＴＴ法でコントロールを基準とした生存率を算出し、メラニン測定値に算入した。９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１．２５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１６０μＬ播種し、２４時間培養した。最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（１．０μｇ／ｍＬ）に調整したメラニン産生ホルモン（α−ＭＳＨ）と１０μｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）又は１００μｇ／ｍＬ（１０００μｇ／ｍＬ）に調整した被検試料を各２０μＬ添加し、７２時間培養した。古い培地を除き、新しい培地８０μＬとＭＴＴ試薬２０μＬを加えて３〜５時間培養した。ＳＤＳ−ＨＣｌ試薬１５０μＬを加えて更に１８〜２０時間培養した後、５７０ｎｍの吸光度を測定した。

（結果）
ＭＴＴ試験結果より、ＨＭＶII細胞にイチゴ熱水抽出物及びその分画物を添加すると、そのほとんどで生存率が上昇し、増殖活性があることが分かった。このため、メラニン産生量を実測値で比較した場合にサンプル値がコントロール値を上回っていても、生存率で補正するとコントロールを下回り、メラニン産生阻害活性があることが分かった（表５及び図８）。

（実施例５）メラニン産生阻害試験
（概要）
マウス由来メラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１細胞にイチゴ由来物質を作用させ、メラニンの産生量を陰性対照と比較してその産生阻害性（美白効果）を検討した。

（材料及び方法）
（１）細胞
マウス由来メラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１は、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル（Ｄ−ＭＥＭ）培地（日水製薬）に０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した培養液で３継代以上培養したものを用いた。
（２）被検試料
被検試料は製造例１（１）で得た熱水抽出物と製造例１（２）で得た１０％エタノール水溶液溶出画分及び５０％エタノール水溶液溶出画分を凍結乾燥して用いた。
（３）方法
（ａ）メラニン産生量
１０％ＦＢＳ入りＤ−ＭＥＭ培地で培養したマウス由来細胞Ｂ１６Ｆ１を２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに最終濃度１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（播種濃度１．０４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を９６０μＬ播種し、ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した。最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（添加濃度５．０μｇ／ｍＬ）に調整したメラニン産生ホルモン（α−ＭＳＨ）と１０μｇ／ｍＬ（５００μｇ／ｍＬ）又は１００μｇ／ｍＬ（５０００μｇ／ｍＬ）に調整した被検試料をそれぞれ２０μＬ添加し、７２時間培養した。培地を除き、ＰＢＳで洗った後、トリプシンＥＤＴＡ溶液１００μＬを加えて細胞をプレートから剥がし、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液９００μＬを加えた。室温で２０〜２４時間静置して細胞を融解した後、４７５ｎｍの吸光度でメラニン含量を測定した。
（ｂ）細胞生存率
被検試料による細胞生存率（増殖率）への影響を補正するため、ＭＴＴ法でコントロールを基準とした生存率を算出し、メラニン測定値に算入した。９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１．２５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１６０μＬ播種し、２４時間培養した。最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ（１．０μｇ／ｍＬ）に調整したメラニン産生ホルモン（α−ＭＳＨ）と１０μｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）又は１００μｇ／ｍＬ（１０００μｇ／ｍＬ）に調整した被検試料を各２０μＬ添加し、７２時間培養した。古い培地を除き、新しい培地８０μＬとＭＴＴ試薬２０μＬを加えて３〜５時間培養した。ＳＤＳ−ＨＣｌ試薬１５０μＬを加えて更に１８〜２０時間培養した後、５７０ｎｍの吸光度を測定した。

（結果）
ＭＴＴ試験結果より、Ｂ１６Ｆ１細胞にイチゴ熱水抽出物及びその分画物を添加すると、いずれのサンプルにおいても陽性対照と同程度のメラニン産生阻害活性が認められた（表６及び図９）。

（実施例６）チロシナーゼ活性阻害試験
（概要）
細胞内でメラニンが産生される際にチロシナーゼを介する生化学反応を、被検試料が阻害するかを試験管内で評価した。

（材料及び方法）
（１）被検試料
被検試料は製造例１（１）で得た熱水抽出物と製造例１（２）で得た１０％エタノール水溶液溶出画分及び５０％エタノール水溶液溶出画分を凍結乾燥して用いた。
（２）方法
最終濃度０．０３％にリン酸バッファーで調整した基質ドパ溶液０．５ｍＬにリン酸バッファーで調製した被検試料溶液０．５ｍＬを加え、氷冷しておく。最終濃度４５Ｕ／ｍＬにリン酸バッファーで調整したチロシナーゼ溶液を０．５ｍＬ加え、２５℃で５分間インキュベートした後、４７５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の差からチロシナーゼの反応率（活性）を算出した。また、被検試料の色の影響を避けるため、チロシナーゼ溶液の代わりにリン酸バッファーを加えたものを測定し吸光度の補正を行った。

（結果）
熱水抽出物と５０％エタノール水溶液溶出画分は実施例５においてメラニン産生の抑制作用を示すのに対し、両者ともまったくチロシナーゼの阻害作用を示さなかった。この事実は、一般的にチロシナーゼの阻害作用によりメラニンの産生が抑制されるという認識を覆すものであり、新たな作用機序による美白剤の可能性を示唆している。一方、１０％エタノール溶液溶出画分は弱いチロシナーゼ阻害活性を示した（表７及び図１０）。実施例５に記すように、同画分はメラニン産生抑制作用も示したので、同画分には弱いチロシナーゼの阻害作用と同時にチロシナーゼの阻害以外の作用機序によるメラニン産生抑制作用も併せ持つことが示唆された。

ＰＰ：ポリフェノール
ＰＣ：ペクチン

Claims

次の成分（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分、
（ｂ）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜１５％エタノール水溶液で溶出した画分、及び
（ｃ）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分、水で溶出した画分及び４０％未満のエタノール水溶液で溶出した画分を除去し、次いで４０〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分
から選ばれるイチゴ由来のポリフェノールを含む画分、及びペクチンを配合してなる組成物（但し、苺ジャムを除く。）。
次の成分（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分、
（ｂ）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜１５％エタノール水溶液で溶出した画分、及び
（ｃ）イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分、水で溶出した画分及び４０％未満のエタノール水溶液で溶出した画分を除去し、次いで４０〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分
から選ばれるイチゴ由来のポリフェノールを含む画分、及びペクチンを配合することを含む、ポリフェノール含有組成物の製造方法。
前記イチゴ由来のポリフェノールを含む画分、及びペクチンを有効成分として配合する請求項２記載の製造方法。
ペクチンがイチゴ由来のペクチンである請求項２又は３記載の製造方法。
イチゴ由来のポリフェノールを含む画分が、イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分である請求項２〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
イチゴ由来のポリフェノールを含む画分が、イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分及び水で溶出した画分を除去し、次いで５〜１５％エタノール水溶液で溶出した画分である請求項２〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
イチゴ由来のポリフェノールを含む画分が、イチゴの熱水抽出物を、芳香族系合成吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィーに、負荷し、カラムを通過した画分、水で溶出した画分及び４０％未満のエタノール水溶液で溶出した画分を除去し、次いで４０〜６０％エタノール水溶液で溶出した画分である請求項２〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
イチゴ由来のポリフェノールを含む画分とペクチンとの質量比が１：０．６〜１：２である請求項２〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
前記組成物が食品組成物、医薬組成物又は化粧品組成物である請求項２〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
前記組成物が医薬組成物又は化粧品組成物である請求項２〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
前記組成物が抗肥満用組成物である請求項９又は１０記載の製造方法。
前記組成物が抗炎症用組成物である請求項９又は１０記載の製造方法。
前記組成物がメラニン産生阻害用組成物である請求項９又は１０記載の製造方法。